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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines nicht-verdaubaren
Kohlehydrats bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung
oder Prävention
pathogener Bakterien im Dickdarm eines Haustieres. Sie stellt auch
ein Verfahren zur Prävention
oder Behandlung pathogener Bakterien im Dickdarm eines Haustieres
zur Verfügung,
wobei das Verfahren die Verabreichung einer Zusammensetzung, die
ein nicht-verdaubares Kohlehydrat umfaßt, an besagtes Haustier umfaßt.
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Das
Vorhandensein pathogener Bakterien (einschließlich Infektion) des Dickdarms
in einem Haustier ist bedenklich. Besondere pathogene Bakterien,
die den Dickdarm infizieren, schließen Campylobacter und pathogene
Escherichia coli ein. Die Bakterienspezies, die für den Großteil menschlicher
bakterieller gastrointestinaler Infektionen verantwortlich ist,
ist Campylobacter jejuni. Diese Spezies ist auch der Hauptgrund
für Besorgnis
bei Katzen und Hunden. Die Spezies kann als ein Pathogen in jungen
Hunden und Katzen wirken und ist in älteren Tieren wahrscheinlich
opportunistisch. Klinische Erkrankung bei Hunden manifestiert sich
als Diarrhoe, die von milder bis schleimbeladener blutiger Diarrhoe
reicht, Tenesmus, Erbrechen, Anorexie und Depression.
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Eine
Hauptsorge im Hinblick auf Campylobacter-Infektion in Haustieren
ist das zoonotische Risiko, daß das
Tragen und die Ausscheidung des Organismus darstellt. Es ist geschätzt worden,
daß 5%
aller menschlichen durch Campylobacter jejuni induzierten Diarrhoe
aus der Exposition gegenüber
infizierten Katzen oder Hunden resultiert. Eine Reihe neuerer Studien
nennen den Besitz von Hunden als einen signifikanten Risikofaktor,
durch Campylobacter zu erkranken. Eine in Christchurch, Neuseeland,
durchgeführte
Studie hat herausgefunden, daß Haushaltskontakt
mit Hunden ein 1,25- bis 2-faches Risiko gegenüber normal beträgt, sich
Campylobacter zuzuziehen.
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E.
coli ist ein Gram-negatives fakultatives anaerobes Bacillus. Im
allgemeinen führt
es ein symbiotisches Leben mit seinem Wirt, wobei es ihm keinen
Schaden zufügt.
Von spezifischen Gruppen ist jedoch bekannt, daß sie gastrointestinale Erkrankungen
verursachen, und diese sind in Kategorien klassifiziert, wie definiert
durch ihre Virulenzmechanismen. Enteropathogene und verocytotoxigene
Stämme
von E. coli sind besonders wichtig bei der Verursachung akuter und
chronischer Diarrhoe in Hunden. Der verocytotoxigene E. coli wird
für wichtig
in diarrhoetischen sowie gesunden Katzen gehalten, und diese Tiere
wirken wahrscheinlich als ein Infektionsreservoir für Menschen.
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Salmonella-Organismen
sind Gram-negative fakultative anaerobe Bakterien, die in der Lage
sind, intrazellulär
zu überleben.
Salmonella kann klinische und subklinische Infektionen in Hunden
und Katzen sowie Menschen verursachen. Dies macht sie zu einem Schlüsselorganismus
von Interesse.
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Verschiedene
Studien haben festgestellt, daß Salmonella
von zwischen 1 und 30% der gesunden Haushunde und zwischen 1 und
18% der gesunden Hauskatzen getragen wird. Diese Daten sind abhängig von
der Erhebung und ob Salmonella aus den Faeces von Tieren sowohl
mit als auch ohne Diarrhoe kultiviert werden konnte.
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Klinische
Infektionen von Salmonella in Tieren zeigen oft Anzeichen von milder
bis schwerer Gastroenteritis. Bei Hunden sind die am häufigsten
berichteten Symptome Diarrhoe, Erbrechen, Fieber, Unwohlsein, Anorexie,
Scheidenausfluß und
manchmal Abort. Bei Katzen sind Diarrhoe, Erbrechen, Fieber, Unwohlsein und
Anorexie die vorherrschenden berichteten Symptome. Erholung von
akuter Salmonellosis tritt typischerweise innerhalb 1 Woche auf,
kann aber 3 bis 4 Wochen dauern. Ausscheidung von Salmonella in
Faeces kann sich für
3 bis 6 Wochen fortsetzen und kann eine Infektionsquelle für menschliche
Familienmitglieder sein.
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Aufgrund
der Langzeitausscheidung von Salmonella sind Tiere wichtige Vektoren
für nicht
durch Nahrungsmittel getragene Infektionen bei Menschen. Hunde haben
ein größeres zoonotisches
Potential als Katzen, obgleich sich gezeigt hat, daß Katzen
Organismen oral, konjunktival und fäkal ausscheiden. Kontakt mit Faeces
von infizierten Haustieren ist eine wichtige Infektionsquelle für junge
Kinder.
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Der
Ort der Salmonella-Infektion ist im Dünndarm, aber aufgrund des potentiellen
zoonotischen Risikos aus Langzeitausscheidung von Salmonella in
Faeces von Hunden ist ein Modell des Dickdarms für diese Untersuchung verwendet
worden. Wenn die Anzahl an lebensfähigen Salmonella vermindert
werden kann, während
sie im Dickdarm sind, kann die Dauer der Ausscheidung vermindert
werden. Verminderung der Zeit, über
die Salmonella in Hundefaeces ausgeschieden wird, vermindert auch
die Chance menschlichen Kontakts mit dem Pathogen.
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JP 08173055 offenbart die
Verwendung von Mannosepolysaccharid, um bakterielle Kontamination
mit Salmonella in Zuchttieren zu verhindern.
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Demgemäß besteht
ein Bedürfnis
nach einem Mittel zur Prävention
oder Behandlung pathogener Bakterien im Dickdarm von Haustieren,
um die vorgenannten Risiken zu eliminieren. Gegenwärtige Behandlungen für Infektionen
mit Campylobacter und pathogenen E. coli und das Vorhandensein von
Salmonella involviert die Verabreichung von Antibiotika an die Haustiere.
Es gibt Bedenken, daß die
fortgesetzte Verwendung von Antibiotika bei der Behandlung von Campylobacter-Infektionen
zum Auftreten von antibiotikaresistenten Stämmen des Organismus führen und
eine Wirkung auf die Langzeitgesundheit von Haustieren haben könnte (was Behandlungsoptionen
verringern oder eliminieren würde).
Ein Bedürfnis
besteht daher, eine Alternative zu Antibiotikabehandlung für infizierte
oder infizierbare Tiere zu finden. Die vorliegende Erfindung stellt
solch ein Mittel zur Verfügung.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird die Verwendung eines nicht-verdaubaren Kohlehydrats
bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Prävention oder Behandlung pathogener
Bakterien im Dickdarm eines Haustieres zur Verfügung gestellt.
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Im
allgemeinen umfassen nicht-verdaubare Kohlehydrate diejenigen Verbindungen,
die von Säugetieren
nicht verdaut werden, aber durch Darmbakterienspezies metabolisiert
werden können,
die zur normalen Mikroflora gehören,
zum Beispiel Bifidobakterien und Lactobazillen.
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Der
Begriff „nicht-verdaubares
Kohlehydrat" schließt Oligosaccharide
ein, wie etwa Galactooligosaccharid (GOS), Maltooligosaccharid,
Xylooligosaccharid und Raffinose, sowie eine Ballaststofffaserkomponente,
wie etwa Kokosnußendospermfaser,
ausgelaugte Rübenschnitzel
(wie etwa ausgelaugte Zuckerrübenschnitzel),
Zichorie (einschließlich
Zichorienpulpe), Reiskleie, Johannisbrotbohnen oder Talha-Gummi.
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Oligosaccharide
sind natürlich
vorkommende Verbindungen, die in einer Vielzahl von Früchten und Gemüsen anzutreffen
sind, wie etwa Bananen, Tomaten, Artischocken, Zwiebeln, Knoblauch
und Getreidearten (z.B. Weizen und Gerste). Künstliche Verknüpfung kann
verwendet werden, um GOS und andere Oligosaccharide zu synthetisieren.
GOS wird synthetisch hergestellt und vertrieben. Ein einzelnes oder
mehrere Oligosaccharide können
verwendet werden. Eines oder mehrere können aus einer natürlichen
Quelle stammen und können
synthetisch sein.
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Eine
einzelne oder mehrere Ballaststofffaserkomponenten können verwendet
werden. Die Ballaststofffaserkomponente kann eines oder mehrere
von folgenden umfassen oder aus einem oder mehreren von folgenden
gewonnen sein: Kokosnußendospermfaser,
ausgelaugte Rübenschnitzel,
Zichorie, Zitruspulpe, Reiskleie, Johannisbrotbohnen oder Talha-Gummi.
Eine einzelne oder mehrere Ballaststofffaserkomponenten können in
Kombination mit einem einzelnen oder mehreren Oligosaccharid verwendet
werden.
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Frisches
Kokosnußendosperm
ist ein Beispiel einer Ballaststofffaserkomponente der vorliegenden
Erfindung. Es hat eine typische Nährstoffverteilung aus Wasser
(35%), Öl
(44%), Protein (6%), Zuckern (7%), Faser (3%) und Asche (1%). Die
Form der Kokosnußendospermfaser
zur Verwendung gemäß allen
Aspekten der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht beschränkt. Die
Kokosnußendospermfaser
kann frisch sein oder in irgendeiner anderen Form, wie etwa Kopra,
entfettetes Kopra (unter anderem auch als Kokoskuchen, Kokospresskuchen
oder Kokoskuchenmehl bezeichnet), Kokosnußmehl, entfettetes Kokosnußmehl, vollständige oder
entfettete entwässerte
Kokosnuß,
Kopra.
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Kopra
ist eine besonders geeignete Quelle für Kokosnußendospermfaser zur Verwendung
gemäß der vorliegenden
Erfindung. Kopra ist getrocknetes Kokosnußendosperm (üblicherweise
in der Sonne getrocknet). Entfettetes Kopra ist ebenfalls besonders
geeignet. Entfettetes Kopra ist das typische Ergebnis von Kokosnußendosperm,
das getrocknet worden ist und bei dem das Kokosnußöl mechanisch
entfernt wurde. Entfetteter Kokoskuchen wird erhalten, indem man
zunächst
Kopra erhält,
dann das Kopra durch eine Presse oder eine Abpressvorrichtung hindurch
zerquetscht, um den Großteil
des Öls
zu entfernen. Der übrigbleibende
Rest wird Kokoskuchen, Kokospresskuchen oder Kokoskuchenmehl genannt.
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Eines
der Produkte komplexer Kohlehydratfermentation im Dickdarm durch
normale Mikroflora sind kurzkettige Fettsäuren (SCFAs). Die Erzeugung
von SCFAs durch die Darmmikroflora führt zu einem Absinken des pHs
des Lumens des Dickdarms/Enddarms. Nicht alle Darmbakterien können nicht-verdaubare
Kohlehydrate metabolisieren. Studien zeigen, daß pathogene Bakterien nicht
in der Lage sind, nicht-verdaubare Kohlehydrate zu verarbeiten.
Aus diesem Grund sind diese nicht-verdaubaren Kohlehydrate im Darm
bei der selektiven Stimulierung des Wachstums der Darmmikroflora
involviert, was eine gesündere
gastrointestinale Umgebung schafft.
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Das
nicht-verdaubare Kohlehydrat der Erfindung kann eines sein, das
(zusätzlich)
das Wachstum und/oder die Aktivität eines nützlichen Bakteriums oder einer
begrenzten Anzahl von nützlichen
Bakterien im Dickdarm eines Haustieres selektiv stimuliert. Der
Begriff „nützliche
Bakterien" bezieht
sich auf diejenigen Bakterienspezies, die eine nützliche Wirkung auf den Wirtsorganismus
haben. Die nützlichen
Bakterienspezies umfassen typischerweise Bifidobakterien und/oder
Lactobazillen.
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Ein
nicht-verdaubares Kohlehydrat der vorliegenden Erfindung kann ein „Präbiotikum" sein. Ein Präbiotikum
ist im Stand der Technik definiert als ein nicht-verdaubarer Nahrungsmittelinhaltsstoff,
der den Wirt durch selektive Stimulierung des Wachstums und/oder
der Aktivität
eines Bakteriums oder einer begrenzten Anzahl von Bakterien im Enddarm,
die das Potential haben, die Gesundheit zu verbessern, günstig beeinflußt.
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Es
ist gezeigt worden, daß Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung das Potential haben, den pH des Dickdarms
zu senken. Bei Verwendung eines Oligosaccharids wurde eine Absenkung
des pHs im Dickdarm-Modell von 7,25 auf 5,5 beobachtet. Im Dickdarm
beeinflußt
eine Absenkung des pHs das Überleben pathogener
Bakterien. In der vorliegenden Erfindung ist eine Absenkung des
pHs von 7,25 auf 5,5 als ein Ergebnis der Einbeziehung von FOS und/oder
GOS ausreichend, lebensfähige
Camphylobacter jejuni-Bakterien zu eliminieren. Im Gegensatz dazu
führt die
Einbeziehung von Kokosnußendospermfaser
im Dickdarm zur Eliminierung lebensfähiger Camphylobacter jejuni-Bakterien
ohne eine signifikante Veränderung
des pHs des Dickdarms (der pH wurde im Dickdarm-Modell von 7,0 auf
6,5 gesenkt).
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Fütterung von Haustieren mit
einer Zusammensetzung bereit, die ein nicht-verdaubares Kohlehydrat
umfaßt,
um lebensfähige
pathogene Bakterien im Dickdarm zu vermindern oder zu eliminieren.
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Die
pathogenen Bakterien der vorliegenden Erfindung schließen typischerweise
eines oder mehrere von Campylobacter, pathogenem Clostridium, Salmonella
und pathogenem Escherichia coli, wie etwa verocytotoxigenes E. coli,
zum Beispiel E. coli O157, ein. Von besonderem Interesse für die vorliegende
Erfindung sind die Spezies Campylobacter jejuni und Salmonella enterica
(einschließlich
S. enterica Serotyp Typhimurium). Camphylobacter jejuni kann klinische
Erkrankungen verursachen, einschließlich Diarrhoe, Tenesmus, Erbrechen,
Anorexie, Depression, entzündliche
Darmerkrankung und andere Darmstörungen.
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Das
Haustier der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Säugetier,
am bevorzugtesten ein Säugetier
mit einem einzigen Magen, wie anzutreffen bei einem Hund oder einer
Katze. Das Haustier ist vorzugsweise nicht ein Nagetier und nicht
ein Produktionstier (geeignet für
Fleischproduktion). Das Haustier ist vorzugsweise eine Katze oder
ein Hund. Katzen und Hunde gemäß der vorliegenden
Erfindung sind vorzugsweise Felis domesticus oder Canis domesticus.
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Die
Zusammensetzung für
die Prävention
oder Behandlung eines pathogenen Bakteriums im Dickdarm eines Haustieres
ist vorzugsweise ein Haustierfutterprodukt. Die Form oder Art des
Haustierfutterproduktes ist nicht beschränkend. Es kann abgepackt sein.
Auf diese Weise ist der Verbraucher in der Lage, von der Verpackung
die Inhaltsstoffe im Nahrungsmittelprodukt zu identifizieren und
zu bestätigen,
daß es
für das
fragliche bestimmte Haustier geeignet ist. Die Verpackung kann Metall
(üblicherweise
in der Form einer Dose oder Flexifolie), Kunststoff, Papier oder
Karton sein. Das Haustierfutterprodukt kann ein trockenes, halbfeuchtes oder
ein feuchtes (nasses) Produkt sein. Naßprodukt schließt Futtermittel
ein, das in Dosen verkauft wird, und hat einen Feuchtigkeitsgehalt
von 70 bis 90%. Trockenfutter schließt Futtermittel mit einer ähnlichen
Zusammensetzung, aber mit 5 bis 15% Feuchtigkeit und vorgelegt als
kleine keksähnliche
Kibbles, ein. Halbfeuchte Produkte haben ein Feuchtigkeitsgehalt
zwischen Naß-
und Trockenprodukten. Der Feuchtigkeitsgehalt liegt im Bereich von
15 bis 70%. Die Feuchtigkeitsmenge in irgendeinem Produkt kann die
Verpackungsart beeinflussen, die verwendet werden kann oder erforderlich
ist.
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In
Kombination mit dem nicht-verdaubaren Kohlehydrat sind die restlichen
Komponenten des Haustierfutterproduktes nicht wesentlich für die Erfindung,
und typische Standardprodukte können
mit dem erforderlichen nicht-verdaubaren Kohlehydrat kombiniert
werden. Am bevorzugtesten stellen die kombinierten Inhaltsstoffe
des Haustierfutterproduktes gemäß der Erfindung
alle empfohlenen Vitamine und Minerale für das fragliche bestimmte Haustier
bereit (ein vollständiges
und ausgewogenes Futtermittel), zum Beispiel wie beschrieben in
National Research Council, 1985, Nutritional Requirements for Dogs,
National Academy Press, Washington D. C. (ISBN; 0-309-03496-5);
National Research Council, 1986, Nutritional Requirements of Cats,
National Academy Press, Washington D. C. (ISBN: 0-309-03682-8) oder Association
of American Feed Control Officials, Official Publication 1996.
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Das
Haustierfutterprodukt gemäß der vorliegenden
Erfindung umfaßt
jedes Produkt, das ein Haustier in seiner Ernährung konsumiert. Die Erfindung
deckt somit Standardfutterprodukte sowie Haustierfuttersnacks (zum
Beispiel Snackriegel, Haustierkauprodukte, knusprige Leckerli, Getreideriegel,
Snacks, Kekse und süße Produkte)
ab. Das Futterprodukt ist vorzugsweise ein gegartes Produkt. Es
kann in der Form einer verkleisterten Stärkematrix vorliegen. Es kann
in der Form von Stücken
in Sauce, Gelee, Laib oder Wasser vorliegen. Es kann Fleisch oder
aus Tieren gewonnenes Material umfassen (wie etwa Rind, Hähnchen,
Truthahn, Lamm, Schwein, Fisch, Blutplasma, Knochenmark etc. oder
eines oder mehrere davon). Das Produkt kann alternativ fleischfrei
sein (wobei es vorzugsweise einen Fleischersatzstoff einschließt, wie
etwa Soja, Maiskleber oder ein Sojaprodukt), um eine Proteinquelle
bereitzustellen. Das Produkt kann zusätzliche Proteinquellen enthalten,
wie etwa Sojaproteinkonzentrat, Milchproteine, Kleber etc. Das Produkt
kann auch eine Stärkequelle
enthalten, wie etwa ein oder mehrere Getreide (z.B. Weizen, Mais,
Reis, Hafer, Gerste etc.), oder kann stärkefrei sein. Ein typisches
trockenes Hunde- oder Katzenfutter enthält etwa 20–30% Rohprotein und etwa 10–20% Fett,
wobei der Rest Kohlehydrat ist, einschließlich Ballaststofffaser und
Asche. Ein typisches nasses, halbfeuchtes oder feuchtes Produkt
enthält
(auf Trockensubstanzbasis) etwa 40% Fett (von 20 bis 50%), 50% Protein
(von 40 bis 60%) und den Rest Faser und Asche.
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Das
Haustierfutterprodukt ist vorzugsweise ein kommerzielles Haustierfutterprodukt.
Solch ein Produkt wird vorzugsweise als ein Produkt zum Verfüttern an
ein Haustier, insbesondere eine Hauskatze oder einen Haushund, verkauft.
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Der
Gehalt an nicht-verdaubarer Faser, der in ein Haustierfutterprodukt
einbezogen wird, wie etwa eine Ballaststofffaserkomponente, ist
nicht beschränkend.
Vorzugsweise liegt die Faserkomponente im Haustierfutterprodukt
in einem Gehalt von ungefähr
0,15 bis 8% auf einer Trockensubstanzbasis, vorzugsweise 0,15 bis
5% auf einer Trockensubstanzbasis vor, gemessen mit der Englyst-Methode
(wie definiert in Englyst H. N. und Cumming J. H. (1984), simplified
method for the measurement of total non-starch polysaccharides by gas-liquid
chromatography of constituent sugars as alditol acetates, Analyst.
109, 937–942,
und herein durch Bezugnahme miteinbezogen). Die Gehalte, wie berechnet
mit dieser Methode, können
von 0,15 bis zu 5%, 6%, 7% oder 8% gehen. Die untere Grenze kann
von 1,5%, 2% oder 3% sein. Eine Beschreibung der Englyst-Methode
ist in Anhang 1 beschrieben. Im Prinzip wird Stärke nach Löslichmachung enzymatisch entfernt und
NSP wird als die Summe der konstituierenden Zucker, die durch Säurehydrolyse
freigesetzt werden, gemessen. Die Stärkekomponente der Faserquelle
wird durch Kochen in heißem
Wasser verkleistert und wird dann mit Alpha-Amylase und Pullulanase
entfernt. Stärke
und modifizierte oder resistente Stärke werden in DMSO dispergiert.
Drei Proben werden dann komplementären Verfahren unterzogen, die
(I) Gesamt-NSP, (ii) wasserlösliches
NSP und (iii) Cellulose messen. Die Komponenten werden in jedem
Falle mit Schwefelsäure hydrolysiert.
Die konstituierenden Zucker werden in Alditole überführt und werden als deren Alditolacetate
unter Verwendung von Gas-flüssig-Chromatographie
(GLC) gemessen. Werte für
Gesamt-Ballaststofffaser
sowie unlösliche
und lösliche
Fraktionen können
erhalten werden. Cellulose kann getrennt gemessen werden, und die
Nicht-Cellulose-Polysaccharide werden durch Messung der einzelnen
Monosaccharide charakterisiert.
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Die
Einarbeitung des Gehaltes an Kokosnußendospermfaser als einem Beispiel
von Ballaststofffaser gemäß der Erfindung
(die sich entsprechend der Form des Kokosnußendosperms unterscheiden kann,
zum Beispiel Kopra oder entwässerte
Kokosnuß)
kann leicht durch Identifizieren der Menge an Ballaststofffaser
in der besonderen Form der Kokosnußendospermfaser bestimmt werden.
Gemäß der Englyst-Methode
(aaO) enthält
entfettetes Kopra zum Beispiel ungefähr 33,5% Gesamt-Ballaststofffaser.
Demgemäß liegt
die bevorzugte Menge an entfettetem Kopra in einem Haustierfutterprodukt,
um einen bevorzugten Fasergehalt von ungefähr 0,15 bis 5% auf einer Trockensubstanzbasis
gemäß dem ersten
Aspekt der Erfindung bereitzustellen, bei einem Gehalt von ungefähr 0,5 bis
15% auf einer Trockensubstanzbasis des Haustierfutterproduktes.
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Ohne
die vorliegende Erfindung zu beschränken, glaubt man, daß die Zugabe
eines nicht-verdaubaren
Kohlehydrats zu einem Haustierfutterprodukt gute Gesundheit des
Dickdarms aufrechterhält
oder diese verbessert, was im allgemeinen erreicht wird durch Optimieren
der Bedingungen für
das Wachstum und die Vermehrung unschädlicher Bakterien im Dickdarm
und/oder durch Senken des pHs des Lumens des Dickdarms, wodurch
die Menge an schädlichen
Bakterien im Dickdarm vermindert wird.
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Ein
zweiter Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren für die Prävention
oder Behandlung pathogener Bakterien im Dickdarm eines Haustieres
bereit, wobei das Verfahren die Verabreichung einer Zusammensetzung,
die ein nicht-verdaubares Kohlehydrat umfaßt, an besagtes Haustier umfaßt. Die
Verabreichung ist vorzugsweise Fütterung,
am bevorzugtesten Fütterung über das
Maul.
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Bevorzugte
Merkmale für
den zweiten Aspekt der Erfindung gelten wie für den ersten Aspekt mutatis mutandis,
wie etwa bevorzugte nicht-verdaubare Kohlehydrate, bevorzugte Gehalte
in einem Haustierfutterprodukt, bevorzugte Tiere und relevante pathogene
Bakterien.
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Im
zweiten Aspekt der Erfindung wird das Verfahren vorzugsweise bei
einem Haustier angewendet, das der Prävention oder Behandlung eines
pathogenen Bakteriums in seinem Dickdarm bedarf. Dies kann zum Beispiel
ein junges Haustier sein, wie etwa ein Welpe, oder ein älteres Haustier.
Wenn die Zusammensetzung ein Haustierfutterprodukt ist, kann das
Haustierfutterprodukt in einem Ernährungsregime gemäß dem üblichen Ernährungsregime
des Haustieres verabreicht werden. Das Haustierfutterprodukt kann
100% der Ernährung des
Haustieres oder einen geringeren Anteil umfassen, abhängig vom
erforderlichen Grad der Prävention
oder Behandlung. Das Haustierfutterprodukt erlaubt, das nicht-verdaubare Kohlehydrat
leicht zu verabreichen, wodurch die Notwendigkeit vermieden wird,
das Futter des Haustieres zu ergänzen.
Zusätzlich
kann das Haustierfutterprodukt vom Besitzer des Tieres verabreicht
werden, wodurch konstante Überwachung
durch einen Tierarzt vermieden wird. Das Haustierfutterprodukt kann
in jedem Geschäft
erhältlich
sein, das Haustierfutterprodukte verkauft, oder kann von einem Tierarzt
erhältlich
sein. Das Haustierfutterprodukt kann, wie oben gemäß dem ersten
Aspekt der Erfindung beschrieben, sein.
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Wie
hierin verwendet, schließt
der Begriff „Verabreichung" auch Fütterung
oder jedes andere Verfahren oraler Verabreichung ein. Andere Mittel
der Verabreichung können
Tabletten, Kapseln, Injektionen, Suppositorien oder jedes andere
geeignete Mittel einschließen.
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Ein
dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur
Herstellung eines Haustierfutterproduktes, wie hierin definiert,
bereit, welches das Zusammenmischen von Inhaltsstoffen mit dem nicht-verdaubaren
Kohlehydrat und fakultatives Bilden eines Haustierfutterproduktes
umfaßt.
Erhitzen/Garen kann auf irgendeines oder mehrere der Inhaltsstoffe
oder das nicht-verdaubare Kohlehydrat vor, während oder im Anschluß an das
Mischen angewendet werden.
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Bevorzugte
Merkmale für
den dritten Aspekt der Erfindung gelten wie für den ersten und zweiten Aspekt
mutatis mutandis.
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Die
Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die folgende nicht-beschränkenden
Figuren beschrieben werden, in denen:
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1 ein
Diagramm von C. jejuni-Zellen nach 0 und nach 24 Stunden Inkubation
mit oder ohne Kokosnußendospermfaser
ist.
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2 ist
ein Diagramm von S. typhimurium-Zellen nach 0 und nach 24 Stunden
Inkubation mit oder ohne GOS.
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Die
Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden, nicht-beschränkenden
Beispiele beschrieben werden:
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BEISPIEL 1
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Die Wirkung von Fructooligosaccharid
(FOS) auf das Überleben
von Campylobacter jejuni in einem Modell des Hundedarms.
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METHODE
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- 1. Campylobacter jejuni-Zellen wurden aus Vorratskulturen
gezüchtet
und bei 37°C
unter mikroaeroben Bedingungen (5% O2, 10%
CO2 und 85% N2)
kultiviert. Flüssigkulturen
wurden in 20 ml-Volumina in konischen 50 ml-Kolben gezüchtet, die
auf einem Orbitalrüttler
gerüttelt
wurden. Übernachtkulturen,
gezüchtet
in Mueller-Hinton(MH)-Brühe (Oxoid),
wurden vor Einbeziehung in den Test auf A600 1,0
eingestellt.
- 2. Kolben wurden angesetzt mit 200 ml MH-Brühe, 1 ml der eingestellten
Campylobacter jejuni-Kultur und 2 g frischen Faeces. Zu Testkolben
wurden 1,4 g FOS (CoSucra) zugegeben und für Vermischung verwirbelt. Kontrollkolben
hatten keine weiteren Zusätze.
- 3. Proben wurden aus den Kolben zu Beginn (0 Stunden) und am
Ende (24 Stunden) des Experiments entnommen, um lebensfähige Zahlen
an Campylobacter jejuni-Zellen zu bestimmen, durch Reihenverdünnung von
Proben aus den Kolben und Aufbringen von Verdünnungen auf Campylobacter-selektives
Agar (LabM). Die Platten wurden mikroaerob für 48 Stunden inkubiert und
die lebensfähigen
Zahlen wurden bestimmt.
- 4. Am Ende des Experimentes wurde der pH der Mischung in jedem
Kolben unter Verwendung von Multistix (Bayer) bestimmt.
- 5. Das Experiment wurde sechsmal unter Verwendung von einer
Fäkalprobe
von jeweils einem unterschiedlichen Hund durchgeführt. Alle
Hunde wurden für
die Dauer der Studie mit einer vollständigen und ausgewogenen Trockenhaustierfutterformel
gefüttert.
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ERGEBNISSE
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Nach
einer 24-stündigen
mikroaeroben Inkubation konnte keine lebensfähigen Campylobacter jejuni-Zellen
aus Kolben gewonnen werden, die zugesetztes FOS hatten. Im Gegensatz
dazu wurden Campylobacter jejuni-Zellen aus den Kolben gewonnen,
die kein FOS enthielten, mit ungefähr 107 Zellen
pro ml. Die Ergebnisse aus den 6 einzelnen Experimenten sind in
Tabelle 1 dargestellt.
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Tabelle
1 Anzahl lebensfähiger
Campylobacter jejuni-Zellen (log
10), gewonnen
aus dem Modell des Hundedickdarms, mit und ohne die Zugabe von FOS. ← log
10 koloniebildende Einheiten von Campylobacter
jejuni →
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Am
Ende der Inkubationsperiode wurde der pH der Lösungen in jedem Kolben gemessen
und es wurde festgestellt, daß er
ungefähr
7,25 betrug, wenn FOS aus dem System weggelassen wurde. Wenn FOS
im Modell eingeschlossen war, wurde festgestellt, daß der pH
ungefähr
5,5 betrug.
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SCHLUSSFOLGERUNGEN
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Einbeziehung
von FOS in ein Modell des Hundedickdarms führte zur Eliminierung lebensfähiger Campylobacter
jejuni-Zellen. Wenn dem System kein FOS zugesetzt wurde, waren Campylobacter
jejuni-Zellen in der Lage, für
die Dauer des Experimentes zu überleben,
ohne Absinken der Anzahl. Es ist wahrscheinlich, daß der Unterschied
im pH, der zwischen den zwei Bedingungen beobachtet wurde, für den Unterschied
verantwortlich war, der für
das Überleben
beobachtet wurde. Es ist wahrscheinlich, daß die nicht-pathogenen, saccharolytischen
Bakterien, die in den Faeces vorhanden sind, das FOS metabolisieren
und SCFA erzeugen, die den pH im Modell des Dickdarms senken, das
in dieser Studie verwendet wurde, und diese Senkung des pHs kann
von Campylobacter nicht toleriert werden.
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BEISPIEL 2
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Die Wirkung von Galactooligosaccharid
(GOS) auf das Überleben
von Campylobacter jejuni in einem Modell des Hundedarms.
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METHODE
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Die
verwendete Methode war wie für
Beispiel 1, wobei FOS durch GOS ersetzt wurde. Die Ergebnisse aus
den einzelnen Experimenten sind in Tabelle 2 dargestellt. GOS stammte
von Borculo Domo Ingredients (BDI).
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ERGEBNISSE
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Nach
einer 24-stündigen
mikroaeroben Inkubation konnten keine lebensfähigen Campylobacter jejuni-Zellen
aus Kolben gewonnen werden, die zugesetztes GOS hatten. Im Gegensatz
dazu wurden Campylobacter jejuni-Zellen aus den Kolben gewonnen,
die kein GOS enthielten, mit ungefähr 108 Zellen
pro ml. Die Ergebnisse aus den 6 einzelnen Experimenten sind in
Tabelle 2 dargestellt.
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Tabelle
2 Anzahl lebensfähiger
Campylobacter jejuni-Zellen (log
10), gewonnen
aus dem Modell des Hundedickdarms, mit und ohne die Zugabe von GOS. ← log
10 koloniebildende Einheiten von Campylobacter
jejuni →
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Am
Ende der Inkubationsperiode wurde der pH der Lösungen in jedem Kolben gemessen
und es wurde festgestellt, daß er
ungefähr
7 betrug, wenn GOS aus dem System weggelassen wurde (SD von 0,1).
Wenn GOS im Modell eingeschlossen war, wurde festgestellt, daß der pH
ungefähr
5 betrug (SD von 0,26).
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SCHLUSSFOLGERUNGEN
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Die
Einbeziehung von GOS in ein Modell des Hundedickdarms führte zur
Eliminierung lebensfähiger Campylobacter
jejuni-Zellen. Wenn dem System kein GOS zugesetzt wurde, waren Campylobacter
jejuni-Zellen in der Lage, für
die Dauer des Experimentes zu überleben.
Es ist wahrscheinlich, daß der
Unterschied im pH, der zwischen den zwei Bedingungen beobachtet
wurde, verantwortlich war für
den Unterschied, der für das Überleben
beobachtet wurde. Es ist wahrscheinlich, daß die nicht-pathogenen, saccharolytischen
Bakterien, die in den Faeces vorhanden sind, das GOS metabolisieren
und SCFA erzeugen, die den pH im Modell des Dickdarms, der in dieser
Studie verwendet wurde, senken, und diese Abnahme im pH kann von
Campylobacter nicht toleriert werden.
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BEISPIEL 3
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Die Wirkung von Kokosnußendospermfaser
auf das Überleben
von Campylobacter jejuni in einem Modell des Hundedarms.
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METHODE
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Untersuchung
der Wirkung von Kokosnußendospermfaser
auf das Überleben
von Campylobacter im Hundedarm.
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Zusammenfassung
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- • Campylobacter
ist eines der vorherrschenden gastrointestinalen Pathogene, das
sowohl klinische als auch nicht-klinische Infektionen in Hunden
verursacht.
- • Ein
in-vitro-Modell des Hundedickdarms ist entwickelt worden, um die
Wirkung neuartiger Fasern auf das Überleben von Bakterienpathogenen
des Hundes zu testen.
- • Einbeziehung
von Kokosnußendospermfaser
in dieses Modell führte
zur Eliminierung lebensfähiger
Campylobacter jejuni-Zellen aus dem System.
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Methoden
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- 1. Campylobacter jejuni-Zellen wurden aus Vorratskulturen
gezüchtet
und bei 37°C
unter mikroaeroben Bedingungen (5% O2, 10%
CO2 und 85% N2)
kultiviert. Flüssigkulturen
wurden in 20 ml-Volumina in konischen 50 ml-Kolben gezüchtet, die
auf einem Orbitalrüttler
gerüttelt
wurden. Übernachtkulturen,
gezüchtet
in Mueller-Hinton(MH)-Brühe (Oxoid),
wurden vor Einbeziehung in den Test auf A600 1,0
eingestellt.
- 2. Die Kolben wurden angesetzt mit 200 ml MH-Brühe, 1 ml
der eingestellten Campylobacter jejuni-Kultur und 2 g frische Faeces.
Zu Testkolben wurden 0,7% (w/v) Kokoskuchen zugegeben und für Durchmischung verwirbelt.
Kontrollkolben hatten keine weiteren Zusätze.
- 3. Aus den Kolben wurden zu Beginn (0 Stunden) und am Ende (24
Stunden) des Experimentes Proben entnommen, um lebensfähige Zahlen
von Campylobacter jejuni-Zellen
durch Reihenverdünnung
von Proben aus den Kolben und Aufbringen von Verdünnungen
auf Campylobacter-selektives Agar (LabM) zu bestimmen. Die Platten
wurden mikroaerob für
48 Stunden inkubiert, woraufhin die lebensfähigen Zahlen bestimmt wurden.
- 4. Am Ende des Experimentes wurde der pH der Mischung in jedem
Kolben unter Verwendung von Multistix (Bayer) bestimmt.
- 5. Das Experiment wurde sechsmal unter Verwendung einer Fäkalprobe
von jeweils einem unterschiedlichen Hund durchgeführt. Alle
Hunde wurden für
die Dauer der Studie mit einem kommerziell erhältlichen (vollständigen du
ausgewogenen) Premium-Trockenfutter gefüttert.
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ERGEBNISSE
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Nach
einer 24-stündigen
mikroaeroben Inkubation konnte keine lebensfähigen Campylobacter jejuni-Zellen
aus Kolben gewonnen werden, zu denen die Kokosnußendospermfaser zugegeben war.
Im Gegensatz dazu wurden Campylobacter jejuni-Zellen aus den Kolben gewonnen, die
keine Kokosnußendospermfaser
enthielten, mit ungefähr
108 Zellen pro ml. Die Ergebnisse aus den
6 einzelnen Experimenten sind in der Tabelle unten und im Diagramm
in 1 dargestellt.
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Tabelle
3 Anzahl lebensfähiger
Campylobacter jejuni-Zellen (log
10), gewonnen
aus dem Modell des Hundedickdarms, mit und ohne die Zugabe von Kokosnußendospermfaser. ← log
10 koloniebildende Einheiten von Campylobacter
jejuni →
-
1 zeigt
ein Diagramm der Wirkung der Einbeziehung von Kokosnußendospermfaser
in das Hundedickdarmmodell auf das Überleben von Campylobacter
jejuni. Die Buchstaben geben statistisch signifikanten Unterschied
an (p < 0,05).
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Aufgezeichneter
pH nach 24-stündiger
Inkubation, wobei Kokosnußendospermfaser
in das System einbezogen oder aus diesem weggelassen wurde, für jeden
Hund.
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Am
Ende der Inkubationsperiode wurde der pH der Lösungen in jedem Kolben gemessen,
und es wurde festgestellt, daß er
7,5 betrug, wenn Kokosnußendospermfaser
aus dem System weggelassen wurde (SD von 0). Wenn Kokosnußendospermfaser
im Modell eingeschlossen war, wurde festgestellt, daß der pH
6,42 betrug (SD von 0,26).
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SCHLUSSFOLGERUNG
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Einbeziehung
von Kokosnußendospermfaser
in ein Modell des Hundedickdarms führte zur Eliminierung lebensfähiger Campylobacter
jejuni-Zellen. Wenn keine Kokosnußendospermfaser zum System
zugegeben wurde, zeigten Campylobacter jejuni-Zellen keinen Verlust an Lebensfähigkeit
für die
Dauer des Experimentes. Da ein pH-Bereich von 6,5 bis 7,5 für Campylobacter
optimal ist, ist es unwahrscheinlich, daß der Unterschied im pH, der
zwischen den zwei Bedingungen beobachtet wurde, für den Unterschied
verantwortlich war, der für
das Überleben
beobachtet wurde. Stattdessen ist es wahrscheinlich, daß die nicht-pathogenen, saccharolytischen
Bakterien, die in den Faeces vorhanden sind, die Kokosnußendospermfaser
metabolisieren. Campylobacter jejuni ist nicht in der Lage, Kohlehydrate
zu fermentieren, somit verschafft die Kokosnußendospermfaser, die vorhanden
ist, den nicht-pathogenen, saccharolytischen Bakterien einen Vorteil.
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BEISPIEL 4
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Die Wirkung von Galactooligosaccharid
(GOS) auf das Überleben
von Salmonella enterica Serotyp Typhimurium in einem Modell des
Hundedickdarms.
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- • Salmonella
ist eines der vorherrschendsten gastrointestinalen Pathogene, das
sowohl klinische als auch nicht-klinische Infektionen in Hunden
verursacht.
- • Ausscheidung
von Salmonella in Faeces kann sich für 3 bis 6 Wochen fortsetzen,
was das zoonotische Risiko bei Menschen, insbesondere jungen Kindern,
erhöht.
- • Ein
in-vitro-Modell des Hundedickdarms ist entwickelt worden, um die
Wirkung nicht-verdaubarer Kohlehydrate auf das Überleben von bakteriellen Pathogenen
bei Hunden zu testen.
- • Einbeziehung
von GOS in dieses Modell führte
zur Eliminierung lebensfähiger
S. enterica-Zellen Serotyp Typhimurium aus dem System. Dies übersetzt
sich in eine Verringerung der Ausscheidungszeiten von Salmonella
in einem Wirtstier.
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Studien
wurden unternommen, um zu bestimmen, ob die Einbeziehung von präbiotischem
Galactooligosaccharid (GOS) in ein in-vitro-Modelldes Hundedickdarms
irgendeine Wirkung auf das Überleben
eines interessierenden Schlüsselpathogens
bei Hunden, Salmonella, haben würde.
GOS wurde von Borculo Domo Ingredients erhalten und der Produktname
ist Lactifit.
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METHODE
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- 1) Zellen von S. enterica Serotyp Typhimurium
(Stamm 7128) wurden aus Vorratskulturen gezüchtet und bei 37°C kultiviert.
Flüssigkulturen
wurden in 20 ml-Volumina
in konischen 50 ml-Kolben gezüchtet,
die auf einem Orbitalrüttler
gerüttelt
wurden. Übernachtkulturen,
gezüchtet
in Mueller-Hinton(MH)-Brühe
(Oxoid), wurden vor Einbeziehung in den Test auf A600 1,0
eingestellt.
- 2) Die Kolben wurden angesetzt mit 200 ml MH-Brühe, 1 ml
der eingestellten Salmonella-Kultur und 2 g frisches Faeces. Zu
den Testkolben wurden 1,4 g GOS (CG86) zugegeben und zur Vermischung
verwirbelt. Äquivalent
von 0,7% w/v. Kontrollkolben hatten keine weiteren Zusätze.
- 3) Aus den Kolben wurden zu Beginn (0 Stunden) und am Ende (24
Stunden) des Experimentes Proben entnommen, um lebensfähige Zahlen
von Salmonella-Zellen durch Reihenverdünnung der Proben aus den Kolben
und Aufbringen von Verdünnungen
auf Salmonella-selektives Agar (LabM) zu bestimmen. Die Platten
wurden für
48 Stunden inkubiert, woraufhin die lebensfähigen Zahlen bestimmt wurden.
- 4) Am Ende des Experimentes wurde der pH der Mischung in jedem
Kolben unter Verwendung von pH Boy (Camlab Limited, Nuffield Road,
Cambridge, CB4 1TH) bestimmt.
- 5) Das Experiment wurde sechsmal unter Verwendung einer Fäkalprobe
von jeweils einem unterschiedlichen Hund durchgeführt. Alle
Hunde wurden mit einem kommerziell erhältlichen (vollständigen und
ausgewogenen) Premium-Trockenfutter gefüttert.
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ERGEBNISSE
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Nach
einer 24-stündigen
mikroaeroben Inkubation konnten keine lebensfähigen Salmonella-Zellen aus den Kolben
gewonnen werden, die mit GOS supplementiert waren. Im Gegensatz
dazu wurden Salmonella-Zellen aus den Kolben gewonnen, die kein
GOS enthielten, mit um 107 Zellen pro ml.
Die Ergebnisse aus den 6 einzelnen Experimenten sind in der Tabelle
unten und in 2 dargestellt.
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Tabelle
4 Anzahl lebensfähiger
Zellen von S. enterica Serotyp Typhimurium (log
10),
gewonnen aus dem Modell des Hundedickdarms, mit und ohne den Zusatz
von GOS. ← log
10 koloniebildende Einheiten von S. enterica
Serotyp Typhimurium →
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2.
Diagramm, um die Wirkung der Einbeziehung von GOS in das Hundedickdarmmodell
auf das Überleben
von S. enterica Serotyp Typhimurium zu zeigen. Unterschiedliche
Buchstaben geben statistisch signifikanten Unterschied an (p < 0,05).
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Am
Ende der Inkubationsperiode wurde der pH der Lösung in jedem Kolben gemessen,
und es wurde festgestellt, daß er
7,2 betrug, wenn GOS aus dem System weggelassen wurde (SD von 0,26).
Wenn GOS in das Modell einbezogen wurde, wurde festgestellt, das
der pH 5,1 betrug (SD von 0,17).
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SCHLUSSFOLGERUNG
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Einbeziehung
von GOS in ein Modell des Hundedickdarms führte zur Eliminierung lebensfähiger Salmonella-Zellen.
Wenn man kein GOS zum System zugab, waren Salmonella-Zellen in der
Lage, für
die Dauer des Experimentes zu überleben.
Es ist wahrscheinlich, daß die
nicht-pathogenen, saccharolytischen Bakterien, die in den Faeces
vorhanden sind, das GOS metabolisieren und SCFA erzeugen, die den
pH im Modell des Dickdarms, das in dieser Studie verwendet wird,
senken, und dieses Absinken im pH kann von Salmonella nicht toleriert
werden. Somit ist es wahrscheinlich, daß der Unterschied im pH, der
zwischen den zwei Bedingungen beobachtet wird, verantwortlich war
für den
Unterschied, der für
das Überleben
beobachtet wurde. Salmonella ist in der Lage, Kohlehydrate zu fermentieren,
aber es ist unwahrscheinlich, daß es in der Lage ist, GOS zu
fermentieren, so verschafft das Vorhandensein von GOS den nicht-pathogenen
sacchorolytischen Bakterien einen Vorteil. Saccharolytische Bakterien
steigen in der Anzahl an und erzeugen Fermentationsendprodukte,
die das Wachstum von Salmonella hemmen.
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Anhang 1
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Die
Englyst-Methode, von Englyst und Cummings (aaO).
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Experimenteller
Teil
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Apparatur
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Das
Fraktionierungsverfahren wurde in 50–60 ml-Glaszentrifugenröhrchen mit
Schraubverschluß durchgeführt, wie
zuvor beschrieben. Gas-flüssig-Chromatographie
wurde mit einem Chromatographen Pye Unicam Series 204 durchgeführt, ausgestattet
mit einem Flammenionisationsdetektor. Eine Glassäule, 2,1 m × 2 mm Innendurchmesser, gepackt
mit Supelcoport (100–200
mesh), beschichtet mit 3% SP 2330, wurde verwendet. Die Säulentemperatur
betrug 215°C
(isotherm) und die Injektor- und Detektortemperaturen betrugen 250°C. Die Durchflußgeschwindigkeit
des Trägergases
(Stickstoff) betrug 20 ml·min–1.
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Reagentien
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Zertifizierte
Reagentien mit hoher Reinheit wurden für alle Analysen verwendet.
Enzymzubereitungen waren wie folgt: Schweinepankreas-α-Amylase,
E.C.3.2.1.1. (Sigma, Cat. No. A4268); Pullulanase, E.C.3.2.1.41.
(Boehringer, Cat. No. 108944).
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Methode
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Die
Abfolge von Schritten im Verfahren ist unten zusammengefaßt.
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Vorbehandlung
der Probe
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Soweit
wie möglich
sollten Nahrungsmittel ohne irgendeine Vorbehandlung analysiert
werden. Wenn es ein Problem bei der Entnahme einer repräsentativen
Probe gibt, können
Nahrungsmittel mit einem niedrigen Wassergehalt für 2–3 Minuten
kugelvermahlen und diejenigen mit einem höheren Wassergehalt homogenisiert oder
gefriergetrocknet und kugelvermahlen werden.
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Probenmasse
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Wiege
zwischen 50 und 1000 mg Probe, die nicht mehr als 150 mg Stärke und
50 mg NSP enthält,
in ein 50–60
ml-Zentrifugenröhrchen
mit Schraubverschluß genau
ein und füge
einen Rührer
hinzu.
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Fettextraktion
und Trocknung
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Proben
mit Trockenmasse zwischen 90 und 100% und mit weniger als 203% Fett
können
direkt analysiert werden. Ansonsten füge 40 ml Aceton hinzu, mische
für 30
Minuten durch Verwendung eines Magnetrührers, zentrifugiere und entferne
durch Ansaugung soviel des Überstands
wie nötig,
ohne den Rückstand zu
stören.
Gebe die Röhrchen
in ein Wasserbad bei 65°C
auf der heißen
Platte eines Magnetrührers
und mische den Rückstand
für ein
paar Minuten, bis er trocken zu sein scheint. Das Becherglas kann
abgedeckt und der Acetondampf durch Wasserpumpe abgezogen werden.
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Dispersion
der Stärke
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Gebe
2 ml DMSO hinzu, verschließe
das Röhrchen
mit einer Kappe und wärme
es in einem siedenden Wasserbad für 1 Stunde, gezählt von
dem Zeitpunkt, wenn der Rücklauf
beginnt, unter kontinuierlichem Rühren. Dann füge ohne
Abkühlung
8 ml 0,1 M Natriumacetat-Puffer pH 5,2 bei 50°C hinzu und vermische sofort durch
Verwirbelung.
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Verfahren zur Analyse
von Nicht-Stärke-Polysacchariden
(NSP)
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Enzymhydrolyse der Stärke
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Kühle das
Röhrchen
auf 45°C
ab und füge
sofort 0,1 ml Enzymlösung
hinzu, die 5000 Einheiten α-Amylase
und 5 Einheiten Pullulanase pro ml Acetat-Puffer bei pH 5,2 enthält. Inkubiere
die Proben bei 45°C für 16–18 Stunden,
vorzugsweise unter kontinuierlicher Vermischung, wie zuvor beschrieben.
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Füge im Anschluß an die
Enzymbehandlung 40 ml absoluten Ethanol hinzu, vermische gut und
lasse für
1 Stunde bei Raumtemperatur stehen. Zentrifugiere für 10 Minuten
oder bis eine klare überstehende
Flüssigkeit
erhalten wird. Entferne durch Ansaugung soviel der überstehenden
Flüssigkeit
wie möglich,
ohne den Rückstand
zu stören,
und verwerfe sie. Wasche den Rückstand
zweimal mit 50 ml 85% Ethanol durch Mischen, um eine Suspension
zu bilden, wobei zentrifugiert wird, bis sie klar ist, und die überstehende
Flüssigkeit
entfernt wird wie zuvor. Füge
40 ml Aceton zum gewaschenen Rückstand
hinzu, rühre
für 5 Minuten
und zentrifugiere dann. Entferne die überstehende Flüssigkeit
durch Ansaugung und trockne den Rückstand, wie unter Fettextraktion
und Trocknung beschrieben.
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Säurehydrolyse
des Rückstandes
aus der enzymatischen Verdauung
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Dispergiere
den getrockneten Rückstand
in 1 ml 12 M Schwefelsäure,
unter Verwendung eines Verwirbelungsmischers. Lasse bei 35°C für 1 Stunde
stehen, um die Cellulose löslich
zu machen, füge
dann schnell 11 ml Wasser hinzu und vermische.
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Erhitze
die Lösung
in einem siedenden Wasserbad für
2 Stunden vom Rückfluß an, unter
kontinuierlichem Rühren.
Kühle sie
auf Raumtemperatur ab, indem das Röhrchen in Wasser gegeben wird,
füge 2
ml internen Standard hinzu (2 mg Allose pro ml gesättigter
Benzoesäure-Lösung) und
vermische die Inhalte des Röhrchens.
Verwende 1 ml des Hydrolysats für
die Herstellung von Alditolacetaten und behalte den Rest für die Bestimmung
von Uronsäuren.
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Uronsäuren
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Die
verwendete Methode ist eine Modifikation von Scott. Vermische 0,3
ml Hydrolysat (falls nötig
verdünnt,
so daß es
zwischen 25 und 100 μg
Uronsäuren
pro ml enthält)
und 0,3 ml einer Mischung aus Natriumchlorid-Borsäure-Lösung (hergestellt
durch Hinzugeben von 2 g Natriumchlorid und 3 g Borsäure zu 100
ml Wasser). Füge
5 ml konzentrierte Schwefelsäure
hinzu und vermische durch Verwirbelung, gebe dann das Röhrchen in
einen Heizblock bei 70°C.
Belasse das Röhrchen
und die Inhalte für
40 Minuten und kühle
sie dann durch Einbringen in Wasser auf Raumtemperatur. Wenn kühl, füge 0,2 ml
3,5 Dimethylphenol-Lösung (0,1
g (CH3)2-C6H3OH in 100 ml Eisessig)
hinzu und vermische sofort. Lese die Extinktion bei 400 und 450
nm in einem Spektrophotometer gegen eine Wasser-Referenz zwischen
10 und 15 Minuten später
ab. Subtrahiere die Ablesung bei 400 nm von derjenigen bei 450 nm
für jede
Probe und trage den erhaltenen Unterschied für Glucuronsäure-Standards auf (über den
Bereich 25–125 μf·ml–1).
Lese die Probenkonzentrationen aus dem Diagramm ab.
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Herstellung
von Alditolacetaten
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Füge 0,2 ml
12 M Ammoniaklösung
und 5 μl
Octan-2-ol zu 1 ml Hydrolysat hinzu. Teste, daß die Lösung alkalisch ist, und gebe
dann 0,1 ml frisch zubereitete Lösung
von 100 mg Natriumtetrahydroborat (III)(Natriumborhydrid) pro ml
3 M Ammoniaklösung
hinzu. Mische, lasse die Mischung für 1 Stunde bei 40°C stehen und
füge 0,1
ml Eisessig hinzu. Füge
als nächstes
0,3 ml N-Methylimidazol und 2 ml Essigsäureanhydrid zu 0,2 ml angesäuerter Lösung hinzu
und vermische. Lasse sie für
10 Minuten bei 20°C
(Raumtemperatur) stehen, füge
5 ml Wasser hinzu, vermische und füge, wenn abgekühlt, 1 ml
Dichlormethan hinzu, rühre
die Inhalte kräftig
auf einem Verwirbelungsmischer und zentrifugiere für ein paar
Minuten, um die Mischung in zwei Phasen zu trennen. Entferne den
Großteil
der oberen Phase durch Ansaugung und verwerfe ihn, überführe dann die
untere Phase in eine kleine Phase in eine kleine Ampulle, versiegele
und lagere sie bei –20°C. Verwende 1–2 μl für Einspritzung
in den Chromatographen.
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Alternative
Herstellung von Alditolacetaten
-
Wenn
Dichlormethan als ein Lösemittel
für die
Alditolacetate verwendet wird, ist in einer Reihe von Laboratorien
ohne automatische GLC-Einspritzungsvorrichtungen beobachtet wurden,
daß die
Einspritztechnik kritisch für
das Erhalten reproduzierbarer Ergebnisse ist. Eine robustere Methode
kann erhalten werden, wenn Dichlormethan durch Ethylacetat als ein
Lösemittel
für Alditolacetate
ersetzt wird. Das Verfahren ist wie folgt:
Füge 0,1 ml
12 M Ammoniak-Lösung
und 5 μl
Octan-2-ol zu 1 ml Hydrolysat hinzu. Teste, daß die Lösung alkalisch ist, füge dann
0,1 ml einer frisch zubereiteten Lösung von 100 mg Natriumtetrahydroborat
(III) pro ml 3 M Ammoniak-Lösung
hinzu. Mische, lasse die Mischung für 1 Stunde bei 40°C stehen
und füge
0,1 ml Eisessig hinzu. Füge
0,5 ml N-Methylimidazol,
5 ml Essigsäure
zu 0,5 ml der angesäuerten
Lösung
hinzu und vermische. Lasse für
10 Minuten bei 20°C
(Raumtemperatur) stehen, füge
dann 0,6 ml Ethanol hinzu und vermische. Füge 5 ml Wasser nach 5 Minuten
hinzu, gebe in ein Wassrbad bei Raumtemperatur, füge 5 ml
7,5 M KOH und ein paar Minuten später weitere 5 ml 7,5 M KOH
hinzu. Vermische durch Umdrehen und lasse stehen, um sich in zwei
Phasen zu trennen. Überführe die
obere Phase in eine kleine Ampulle und lagere sie bei +5°C. Verwende
1–2 μl für Einspritzung
in den Chromatographen.