JP2742962B2 - 腸定着ラクトバシラス - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、経口投与後、インビボ（in vivo）で腸粘
膜にコロナイズし、定着するようになる（colonize and
become established）能力を有するラクトバシラスの
菌株（strains）を単離する方法、該方法によって得ら
れる菌株及びバクテリア感染の予防又は治療への該菌株
の使用、特に、該菌株の一種によって発酵されたオート
ミール（oatmeal）がベースの栄養分溶液を含む組成物
の形態での使用に関する。
膜にコロナイズし、定着するようになる（colonize and
become established）能力を有するラクトバシラスの
菌株（strains）を単離する方法、該方法によって得ら
れる菌株及びバクテリア感染の予防又は治療への該菌株
の使用、特に、該菌株の一種によって発酵されたオート
ミール（oatmeal）がベースの栄養分溶液を含む組成物
の形態での使用に関する。
多数の人々が、乱された腸内微生物叢（intestinal m
icroflora）を有している。即ち、有益な腸内バクテリ
アと有害な腸内バクテリアのバランスが乱されている。
例えば、ストレス、胆汁酸塩の発生、ダイエット等を含
むいくらかの因子が、バクテリア叢（bacterial flor
a）に影響を及ぼす。しかしながら、最も重要なこと
は、現在の抗生剤治療は長期間正常な叢を破壊すること
が可能で、その結果正常な発酵過程を除去することであ
る。発酵過程が妨げられ、有益なバクテリア数が減少す
ると、その結果、結腸の粘膜は、潜在的に悪性のバクテ
リア数が急激に増大すると同時に、衰えそして機能を停
止する。このようなバクテリアは、旨く機能していない
粘膜を貫通し、身体の器官に感染し、身体中の膿汁の病
巣（pus foci）を伴ういわゆる集中治療疾患（intensiv
e-care-disease）、更には、ひょっとすると、身体のほ
とんどの器官の機能破壊、器官の崩壊（collapse of or
gans）に至る。腹腔内の膿瘍（abscess）により惹起さ
れる血液中毒（blood poisoning）、敗血症は、尚、高
死亡率の腹部手術に関連する非常に一般的な外科的合併
症（surgical complication）である。このような患者
は、現在、抗生物質の投与及び膿瘍が存在し得る範囲の
外科的治療によって治療される。現在では、抗生物質
は、手術後の感染及びそれによって起こる病気の危険を
減少させるために、腸の外科手術以前に慣用的に投与さ
れている。しかしながら、抗生物質での処置は、高価で
あり、更にアレルギー、正常な腸内細菌叢（intestinal
flora）の破壊、病原性のより高いバクテリアの異常増
殖等の各種合併症の危険を伴う。
icroflora）を有している。即ち、有益な腸内バクテリ
アと有害な腸内バクテリアのバランスが乱されている。
例えば、ストレス、胆汁酸塩の発生、ダイエット等を含
むいくらかの因子が、バクテリア叢（bacterial flor
a）に影響を及ぼす。しかしながら、最も重要なこと
は、現在の抗生剤治療は長期間正常な叢を破壊すること
が可能で、その結果正常な発酵過程を除去することであ
る。発酵過程が妨げられ、有益なバクテリア数が減少す
ると、その結果、結腸の粘膜は、潜在的に悪性のバクテ
リア数が急激に増大すると同時に、衰えそして機能を停
止する。このようなバクテリアは、旨く機能していない
粘膜を貫通し、身体の器官に感染し、身体中の膿汁の病
巣（pus foci）を伴ういわゆる集中治療疾患（intensiv
e-care-disease）、更には、ひょっとすると、身体のほ
とんどの器官の機能破壊、器官の崩壊（collapse of or
gans）に至る。腹腔内の膿瘍（abscess）により惹起さ
れる血液中毒（blood poisoning）、敗血症は、尚、高
死亡率の腹部手術に関連する非常に一般的な外科的合併
症（surgical complication）である。このような患者
は、現在、抗生物質の投与及び膿瘍が存在し得る範囲の
外科的治療によって治療される。現在では、抗生物質
は、手術後の感染及びそれによって起こる病気の危険を
減少させるために、腸の外科手術以前に慣用的に投与さ
れている。しかしながら、抗生物質での処置は、高価で
あり、更にアレルギー、正常な腸内細菌叢（intestinal
flora）の破壊、病原性のより高いバクテリアの異常増
殖等の各種合併症の危険を伴う。
ラクトバシラス（lactobacilli）が腸の粘膜上で好ま
しい効果を有しているかもしれないという事は、再度持
ち出された古くからのアイデアである。しかしながら、
微生物が関与しているか否かに関して及び腸の生態学
（ecology）に関しては多くの不明な点がある。これに
関連する別の問題としては、ラクトバシラス属の分類が
完全でなく、腸の機能に好適な菌株を特定することが困
難であるという問題がある。結局、今日一般的に受け入
れられていると思われることは以下の通りである。
しい効果を有しているかもしれないという事は、再度持
ち出された古くからのアイデアである。しかしながら、
微生物が関与しているか否かに関して及び腸の生態学
（ecology）に関しては多くの不明な点がある。これに
関連する別の問題としては、ラクトバシラス属の分類が
完全でなく、腸の機能に好適な菌株を特定することが困
難であるという問題がある。結局、今日一般的に受け入
れられていると思われることは以下の通りである。
−ラクトバシラス属のバクテリアが、関係する栄養素
（foodstuff）又は腸に関係なく、種々の方法で、病原
性のバクテリアの定着を妨げる明白な能力を有してい
る。
（foodstuff）又は腸に関係なく、種々の方法で、病原
性のバクテリアの定着を妨げる明白な能力を有してい
る。
−ラクトバシラスの或る菌株は、腸を保護したり活性化
する点において、同種の他の菌株に比べて、より効果的
である。
する点において、同種の他の菌株に比べて、より効果的
である。
−ラクトバシラスによって発酵された食物が、コレステ
ロール減少効果を有することを証明されたが、これはお
そらく腸内でのコレステロール産生を抑止するからであ
り、更にはおそらく該バクテリアがステロイドの産生に
コレステロールを使用するからでもあろう。
ロール減少効果を有することを証明されたが、これはお
そらく腸内でのコレステロール産生を抑止するからであ
り、更にはおそらく該バクテリアがステロイドの産生に
コレステロールを使用するからでもあろう。
−大量のラクトバシラスの消費は、腸の運動性の活性を
向上させるが、この効果の原因は不明である。
向上させるが、この効果の原因は不明である。
−腸内にラクトバシラスが多くの割合で存在すると、癌
に対抗する。これは種々の根拠を有していると思われ
る。第１に、或るラクトバシラスは、酵素ナイトライト
リダクターゼ（nitritereductase）によって腸内のニト
ロソアミンの産生を阻害する。ニトロソアミンは発癌性
である。第２にラクトバシラスは、腸内で或る種のバク
テリアによって産生された酵素が、潜在的な発癌性物質
を活性化することを妨げる。最後に、ラクトバシラス
は、癌腫瘍に対し成長を制限する効果を有するとの徴候
があり、それはおそらく免疫防御システムのマクロファ
ージが、ラクトバシラスの存在により活性化されるため
であろう。今日最も慣用されている食糧中に使用されて
いるラクトバシラスの決定的な弱点は、胃及び十二指腸
を通過する間に、これらの微生物の生存率（survival）
が低いことである。このことから、“アシドフィルスフ
ィル”（acidofilusfil）と呼ばれる製品、即ち、ヒト
の糞便から直接単離されたラクトバシラスアシドフィル
スの菌株を用いて、ミルクを発酵させたアシドフィルス
サワーミルクの開発が行なわれた。エル．アシドフィル
ス（L.acidophilus）は、胃腸管の上部をうまく通過す
る。しかしながら、より長時間腸内で微生物叢（microf
lora）に対して効果を有するためには、ラクトバシラス
が腸内で定着するようにできるのが必須である。リドベ
ック（Lidbeck）らによると（Scand J Infect Dis,4,53
1-537頁,1987）、腸の微生物叢中のラクトバシラスの数
の増加は、ラクトバシラスアシドフィルスを含む調製物
の消費の後に起こり、その消費が終わると次第に減速
し、その結果、供給しない場合は９日後に、バクテリア
の叢は、その元の組成物に再度もどることとなる。
に対抗する。これは種々の根拠を有していると思われ
る。第１に、或るラクトバシラスは、酵素ナイトライト
リダクターゼ（nitritereductase）によって腸内のニト
ロソアミンの産生を阻害する。ニトロソアミンは発癌性
である。第２にラクトバシラスは、腸内で或る種のバク
テリアによって産生された酵素が、潜在的な発癌性物質
を活性化することを妨げる。最後に、ラクトバシラス
は、癌腫瘍に対し成長を制限する効果を有するとの徴候
があり、それはおそらく免疫防御システムのマクロファ
ージが、ラクトバシラスの存在により活性化されるため
であろう。今日最も慣用されている食糧中に使用されて
いるラクトバシラスの決定的な弱点は、胃及び十二指腸
を通過する間に、これらの微生物の生存率（survival）
が低いことである。このことから、“アシドフィルスフ
ィル”（acidofilusfil）と呼ばれる製品、即ち、ヒト
の糞便から直接単離されたラクトバシラスアシドフィル
スの菌株を用いて、ミルクを発酵させたアシドフィルス
サワーミルクの開発が行なわれた。エル．アシドフィル
ス（L.acidophilus）は、胃腸管の上部をうまく通過す
る。しかしながら、より長時間腸内で微生物叢（microf
lora）に対して効果を有するためには、ラクトバシラス
が腸内で定着するようにできるのが必須である。リドベ
ック（Lidbeck）らによると（Scand J Infect Dis,4,53
1-537頁,1987）、腸の微生物叢中のラクトバシラスの数
の増加は、ラクトバシラスアシドフィルスを含む調製物
の消費の後に起こり、その消費が終わると次第に減速
し、その結果、供給しない場合は９日後に、バクテリア
の叢は、その元の組成物に再度もどることとなる。
EP-A2-0199535は、ヒトの糞便から単離され、インビ
トロの試験で粘膜細胞に付着する事ができる、ラクトバ
シラスアシドフィルスATCCアクセッションNo.53103の生
理学的に純粋な培養物について記載している。しかしな
がら、インビボでの付着については立証されていない。
トロの試験で粘膜細胞に付着する事ができる、ラクトバ
シラスアシドフィルスATCCアクセッションNo.53103の生
理学的に純粋な培養物について記載している。しかしな
がら、インビボでの付着については立証されていない。
WO89/05849には、ブタの胃腸管から単離され、例え
ば、インビトロでブタ由来の胃腸表皮細胞への付着、酸
及び胆汁に対する耐性（tolerance）によって選択され
た乳酸バクテリアが記載されている。該バクテリアは、
ミルクの発酵に使用でき、これは、特に（i.a.）大腸菌
性の下痢を予防乃至治療するために子ブタに与えられ
る。
ば、インビトロでブタ由来の胃腸表皮細胞への付着、酸
及び胆汁に対する耐性（tolerance）によって選択され
た乳酸バクテリアが記載されている。該バクテリアは、
ミルクの発酵に使用でき、これは、特に（i.a.）大腸菌
性の下痢を予防乃至治療するために子ブタに与えられ
る。
今日商業的に使用されているラクトバシラスの菌株
は、結局、例えばミルクのような現在の一次産物中で一
応増殖できる能力について選択されたものである。もし
或る菌株が、任意の好ましい影響を及ぼすならば、それ
が腸内で定着されるようになり、且つ、存在する微生物
叢と競合することが、疑いもなく必要不可欠である。或
るラクトバシラス菌株が、この競合に耐えるために必要
な特性が何であるかという知見は、ほとんど知られてい
ない。
は、結局、例えばミルクのような現在の一次産物中で一
応増殖できる能力について選択されたものである。もし
或る菌株が、任意の好ましい影響を及ぼすならば、それ
が腸内で定着されるようになり、且つ、存在する微生物
叢と競合することが、疑いもなく必要不可欠である。或
るラクトバシラス菌株が、この競合に耐えるために必要
な特性が何であるかという知見は、ほとんど知られてい
ない。
本発明は、インビボでヒトの腸粘膜に定着乃至コロナ
イズ（colonize）し定着（established）するようにな
る能力を有するラクトバシラスの菌株を単離する方法で
あって、ラクトバシラスがヒト腸粘膜から単離され、適
当な栄養培地中で純粋培養され、（pure cultured）、
腸内でコロナイズし確立するようになる能力について選
択されることを特徴とする方法に関する。
イズ（colonize）し定着（established）するようにな
る能力を有するラクトバシラスの菌株を単離する方法で
あって、ラクトバシラスがヒト腸粘膜から単離され、適
当な栄養培地中で純粋培養され、（pure cultured）、
腸内でコロナイズし確立するようになる能力について選
択されることを特徴とする方法に関する。
腸内でコロナイズする該菌株の能力は、好ましくは、
経口投与、及びそれに続く投与完了後少なくとも10日で
腸粘膜上への出現（occurence）の確認によって、試験
される。
経口投与、及びそれに続く投与完了後少なくとも10日で
腸粘膜上への出現（occurence）の確認によって、試験
される。
単離された菌株の相補的な選択（complementary sele
ction）は、コロナイゼーション（colonization）の試
験の前後に、各種の機能的及び技術的特性、例えば、胆
汁耐性、pH耐性、要求される物質、好ましくはオートミ
ールの発酵能力、香味（flavour）を産生する能力、凍
結乾燥に耐える能力、抗生物質耐性等の評価によって行
うことができる。
ction）は、コロナイゼーション（colonization）の試
験の前後に、各種の機能的及び技術的特性、例えば、胆
汁耐性、pH耐性、要求される物質、好ましくはオートミ
ールの発酵能力、香味（flavour）を産生する能力、凍
結乾燥に耐える能力、抗生物質耐性等の評価によって行
うことができる。
胃腸管中をうまく通過するためには、選択された菌株
は、pH1.0で30分間生存し、且つ、0.1％胆汁の存在下で
育成することができるのが適切である。
は、pH1.0で30分間生存し、且つ、0.1％胆汁の存在下で
育成することができるのが適切である。
本発明は、また、上記記載の単離方法によって得られ
る、インビボでヒト腸粘膜にコロナイズする能力を有す
るラクトバシラス菌株にも関する。一つの理論による
と、通性的にヘテロ発酵性の（facultatively heterofe
rmentative）ラクトバシラスの菌株は、腸内での確立に
とって好ましい型を構成する。
る、インビボでヒト腸粘膜にコロナイズする能力を有す
るラクトバシラス菌株にも関する。一つの理論による
と、通性的にヘテロ発酵性の（facultatively heterofe
rmentative）ラクトバシラスの菌株は、腸内での確立に
とって好ましい型を構成する。
特に、本発明は、インビボでヒト腸粘膜にコロナイズ
する能力を有する新規なラクトバシラス菌株に関し、該
菌株は、ドイツのブラウンシュウェイグ（Braunschwei
g）の、デーエスエム（DSM）−ドイッチェ サムルング
フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクル
ツーレン ゲーエムベーハー（Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）に、ブタペ
スト条約に従って、1991年７日２日に寄託されており、
それは、 ラクトバシラス プランタラム 299 DSM 6595 （Lactobacillus plantarum） ラクトバシラス カセイ エスエスピー．ラムノサス 2
71 DSM 6594 （Lactobacillus casei ssp.rhamnosus）である。
する能力を有する新規なラクトバシラス菌株に関し、該
菌株は、ドイツのブラウンシュウェイグ（Braunschwei
g）の、デーエスエム（DSM）−ドイッチェ サムルング
フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクル
ツーレン ゲーエムベーハー（Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）に、ブタペ
スト条約に従って、1991年７日２日に寄託されており、
それは、 ラクトバシラス プランタラム 299 DSM 6595 （Lactobacillus plantarum） ラクトバシラス カセイ エスエスピー．ラムノサス 2
71 DSM 6594 （Lactobacillus casei ssp.rhamnosus）である。
本発明は、また、本質的に対応するREA−パターンを
有するその変異体（variant）にも関する。REA−パター
ンは、以下に記載した方法に従って制限酵素で分解され
た、DNAのアガーゲル上での電気泳動において形成され
るパターンである。それらのREA−パターンによる菌株
の特徴付けによって、使用された単離物の同定が、確立
され得る。これは、以前は不可能であったことである。
REA−パターンが異なる密接な関係のあるラクトバシラ
ス菌株は、腸の上皮への付着能力について相違点を示
す。
有するその変異体（variant）にも関する。REA−パター
ンは、以下に記載した方法に従って制限酵素で分解され
た、DNAのアガーゲル上での電気泳動において形成され
るパターンである。それらのREA−パターンによる菌株
の特徴付けによって、使用された単離物の同定が、確立
され得る。これは、以前は不可能であったことである。
REA−パターンが異なる密接な関係のあるラクトバシラ
ス菌株は、腸の上皮への付着能力について相違点を示
す。
本発明は、胃腸管中の感染の予防または治療のための
組成物にも関し、該組成物は、本発明の方法に従って得
られる、インビボでヒトの腸粘膜にコロナイズし定着す
る（established）ようになる能力を有するラクトバシ
ラスの菌株を、慣用されている担体と組合わせて含む。
組成物にも関し、該組成物は、本発明の方法に従って得
られる、インビボでヒトの腸粘膜にコロナイズし定着す
る（established）ようになる能力を有するラクトバシ
ラスの菌株を、慣用されている担体と組合わせて含む。
特に、本発明は菌株 ラクトバシラス プランタラム 299 DSM 6595 ラクトバシラス カセイ エスエスピー．ラムノセス 2
71 DSM 6594 のいずれかをまたは本質的に対応するREA−パターン
を有するその変異体を含有する組成物に関する。
71 DSM 6594 のいずれかをまたは本質的に対応するREA−パターン
を有するその変異体を含有する組成物に関する。
慣用されている担体としては、例えば、問題のバクテ
リアによって発酵された生理学的に許容される基質及
び、特にスターチやミルクをベースとする種々の種類の
食品（foodstuff）が挙げられるが、また、食塩水（sal
ine）や水のような不活性な固体または液体の物質も挙
げられる。適当な基質は、胃腸管で再吸収されず、ラク
トバシラスで発酵されたときに短鎖の脂肪酸（short fa
tty acids）を形成する液体または固体の繊維を含むの
がよい。適当なスターチ含有基質の例としては、オート
麦（oats）、小麦（wheat）のような穀類（cereals）、
とうもろこし、じゃがいものような根菜類及びグリーン
バナナのような或る種のフルーツが挙げられる。
リアによって発酵された生理学的に許容される基質及
び、特にスターチやミルクをベースとする種々の種類の
食品（foodstuff）が挙げられるが、また、食塩水（sal
ine）や水のような不活性な固体または液体の物質も挙
げられる。適当な基質は、胃腸管で再吸収されず、ラク
トバシラスで発酵されたときに短鎖の脂肪酸（short fa
tty acids）を形成する液体または固体の繊維を含むの
がよい。適当なスターチ含有基質の例としては、オート
麦（oats）、小麦（wheat）のような穀類（cereals）、
とうもろこし、じゃがいものような根菜類及びグリーン
バナナのような或る種のフルーツが挙げられる。
病気及び手術に関係する患者の現代の医科学的治療
は、大部分、静脈からの栄養素の供給に基づくものであ
って、それによって、その後の帰結として、腸には発酵
すべき物質が供給されない。結腸（colon）は、身体自
身の発酵タンクとして機能し、その目的は、結腸そのも
のの機能のためだけでなく、例えば、重金属、過剰量の
コレステロール等の有害な物質を減少させるためにも有
益な栄養素を産生することにある。結腸が機能するため
には、適当なバクテリア及び基質、特に、スターチ及び
食物繊維が供給されなければならない。結腸の内容量の
約半分はバクテリアであり、大半は嫌気性のタイプであ
る。最も重要なバクテリアは、結腸の粘膜上に存在する
バクテリアである。結腸のバクテリアの中で、少数の潜
在的に有害なタイプがある。有用なバクテリアが存在す
る限り、有害なバクテリア叢は、抑制される。最近の研
究によって、結腸の粘膜が発酵産物からその栄養素の多
くを、主に短鎖の脂肪酸の形態で得ることが判明した。
正常な発酵過程には、一日あたり約30gの食物繊維の供
給と、適当なバクテリアの存在が必要である。
は、大部分、静脈からの栄養素の供給に基づくものであ
って、それによって、その後の帰結として、腸には発酵
すべき物質が供給されない。結腸（colon）は、身体自
身の発酵タンクとして機能し、その目的は、結腸そのも
のの機能のためだけでなく、例えば、重金属、過剰量の
コレステロール等の有害な物質を減少させるためにも有
益な栄養素を産生することにある。結腸が機能するため
には、適当なバクテリア及び基質、特に、スターチ及び
食物繊維が供給されなければならない。結腸の内容量の
約半分はバクテリアであり、大半は嫌気性のタイプであ
る。最も重要なバクテリアは、結腸の粘膜上に存在する
バクテリアである。結腸のバクテリアの中で、少数の潜
在的に有害なタイプがある。有用なバクテリアが存在す
る限り、有害なバクテリア叢は、抑制される。最近の研
究によって、結腸の粘膜が発酵産物からその栄養素の多
くを、主に短鎖の脂肪酸の形態で得ることが判明した。
正常な発酵過程には、一日あたり約30gの食物繊維の供
給と、適当なバクテリアの存在が必要である。
本発明の組成物にとって好ましい基質は、優れた栄養
価（nutritional value）を組成物に与えるものであ
り、オートミールを基本とした栄養液である。穀類のオ
ート麦は、多くの態様において発酵にとって良い基質で
あることが示された：それは蛋白質、炭水化物、脂肪、
食物繊維及びいわゆるβ−グルカンと呼ばれる水溶性繊
維を豊富に含有する。加えて、オート麦またはオートミ
ール脂肪は非常に多くの量の表面活性を有する燐脂質を
有し、これは、胃粘膜バリアー“浸食インヒビター（co
rrosion inhibitors）”として機能し、粘膜の保護を行
う。最後に、オート麦の蛋白質のアミノ酸組成物は、非
常にヒトの身体に必要なものに相当する。WO 89/08405
において、栄養素組成物は、腸の摂食（enteral feedin
g）に適当である旨記載され、それは、オートミールの
αアミラーゼ、おそらくプロテアーゼ、及びβ−グルカ
ナーゼによる酵素的分解、熱処理、並びに自発的に腸に
付着する能力を有するラクトバシラスによる発酵の組み
合わせによって得られる。上記特許出願に記載されてい
る栄養素組成物は、本発明のラクトバシラス菌株を組み
合わせると、集中治療病（intensive-care-disease）又
は器官虚脱（organ collapse）の犠牲となった患者の特
別な治療、及び例えば潰瘍性の大腸炎のような各種の腸
の疾患の治療に、大手術後の通常治療に関連する患者へ
の栄養投与のための優れた組成物である。
価（nutritional value）を組成物に与えるものであ
り、オートミールを基本とした栄養液である。穀類のオ
ート麦は、多くの態様において発酵にとって良い基質で
あることが示された：それは蛋白質、炭水化物、脂肪、
食物繊維及びいわゆるβ−グルカンと呼ばれる水溶性繊
維を豊富に含有する。加えて、オート麦またはオートミ
ール脂肪は非常に多くの量の表面活性を有する燐脂質を
有し、これは、胃粘膜バリアー“浸食インヒビター（co
rrosion inhibitors）”として機能し、粘膜の保護を行
う。最後に、オート麦の蛋白質のアミノ酸組成物は、非
常にヒトの身体に必要なものに相当する。WO 89/08405
において、栄養素組成物は、腸の摂食（enteral feedin
g）に適当である旨記載され、それは、オートミールの
αアミラーゼ、おそらくプロテアーゼ、及びβ−グルカ
ナーゼによる酵素的分解、熱処理、並びに自発的に腸に
付着する能力を有するラクトバシラスによる発酵の組み
合わせによって得られる。上記特許出願に記載されてい
る栄養素組成物は、本発明のラクトバシラス菌株を組み
合わせると、集中治療病（intensive-care-disease）又
は器官虚脱（organ collapse）の犠牲となった患者の特
別な治療、及び例えば潰瘍性の大腸炎のような各種の腸
の疾患の治療に、大手術後の通常治療に関連する患者へ
の栄養投与のための優れた組成物である。
本発明のオートミールをベースとする栄養組成物（nu
trient composition）中で使用するためには、ラクトバ
シラス菌株は以下の条件を満たさなければならない： −オート麦の優れた発酵； −（胃のpHに相当する）pH1.0において30分間の生存； −胆汁酸塩（bile salts）の存在下での生存及び生育； −腸粘膜上に着定（settle）し残存（remain）する能
力。
trient composition）中で使用するためには、ラクトバ
シラス菌株は以下の条件を満たさなければならない： −オート麦の優れた発酵； −（胃のpHに相当する）pH1.0において30分間の生存； −胆汁酸塩（bile salts）の存在下での生存及び生育； −腸粘膜上に着定（settle）し残存（remain）する能
力。
また、発酵中のpH値が、他のバクテリアの生育を止め
るために、速く低下することも必須である。
るために、速く低下することも必須である。
腸内にコロナイズし又は付着（adhere）する能力を有
するラクトバシラスの投与により、異なるバクテリア叢
が腸でコロナイズすることを抑制することができ、その
結果、腹部の手術後の合併症のようなバクテリア感染に
関係する敗血症（sepsis）の危険を減少させることとな
る。この治療は、抗生物質の形態で今日使用されている
慣用的な治療と同様に有効であるように思われる。従っ
て、腸の手術を受けた患者が、抗生物質よりもむしろラ
クトバシラスで前処理されるほうが妥当であるように思
われる。これは、正常な腸内細菌叢を破壊しないので、
潜在的な二次的な効果の少ない治療のより安価な形態が
確立され得ることを意味する。
するラクトバシラスの投与により、異なるバクテリア叢
が腸でコロナイズすることを抑制することができ、その
結果、腹部の手術後の合併症のようなバクテリア感染に
関係する敗血症（sepsis）の危険を減少させることとな
る。この治療は、抗生物質の形態で今日使用されている
慣用的な治療と同様に有効であるように思われる。従っ
て、腸の手術を受けた患者が、抗生物質よりもむしろラ
クトバシラスで前処理されるほうが妥当であるように思
われる。これは、正常な腸内細菌叢を破壊しないので、
潜在的な二次的な効果の少ない治療のより安価な形態が
確立され得ることを意味する。
本発明は、また、外科手術、手術後のリハビリテーシ
ョン等に関するバクテリア感染の治療又は予防のため
に、抗生物質の代りに、本発明のラクトバシラス菌株に
よって発酵された栄養組成物を使用する用途にも関す
る。
ョン等に関するバクテリア感染の治療又は予防のため
に、抗生物質の代りに、本発明のラクトバシラス菌株に
よって発酵された栄養組成物を使用する用途にも関す
る。
それは、特に、ラクトバシラス プランタラム 299に
よって発酵された栄養素溶液をベースとするオートミー
ルに関する。
よって発酵された栄養素溶液をベースとするオートミー
ルに関する。
試験動物での実験では、同一種の動物の腸粘膜から単
離したラクトバシラス菌株を含む組成物で治療した動物
において、統計学的に有効な生存率を示した。ラットで
の試験では、腸内で実験的に誘発された大腸炎（coliti
s,colit）及び潰瘍の優れた予防とより迅速な治癒（hea
ling）を示した。
離したラクトバシラス菌株を含む組成物で治療した動物
において、統計学的に有効な生存率を示した。ラットで
の試験では、腸内で実験的に誘発された大腸炎（coliti
s,colit）及び潰瘍の優れた予防とより迅速な治癒（hea
ling）を示した。
本発明の組成物は、任意の適当な方法で投与すること
ができ、好ましくは経口又は直腸に、例えば浣腸の形態
で投与することができる。それはまた、胃を通して腸内
に挿入された又は直接腸内に挿入されたカテーテルを通
して腸投与（administered enterally）することができ
る。試験によって、例えばオートミール粥（oatmeal gr
uel）又はβ−グルカンの形態の食物繊維を供給すると
効果が改善されることが示された。この治療は、１−２
週間の期間一日１回又は数回行う。
ができ、好ましくは経口又は直腸に、例えば浣腸の形態
で投与することができる。それはまた、胃を通して腸内
に挿入された又は直接腸内に挿入されたカテーテルを通
して腸投与（administered enterally）することができ
る。試験によって、例えばオートミール粥（oatmeal gr
uel）又はβ−グルカンの形態の食物繊維を供給すると
効果が改善されることが示された。この治療は、１−２
週間の期間一日１回又は数回行う。
同封の図面Fig.1−２は、新規ラクトバシラス菌株299
及び271のREA−パターンを示し、Fig.3は、それぞれ、
ラクトバシラスによって発酵されたオートミール粥の経
口投与の前、直後及び数日後の回腸中のラクトバシラス
の濃度を示す。
及び271のREA−パターンを示し、Fig.3は、それぞれ、
ラクトバシラスによって発酵されたオートミール粥の経
口投与の前、直後及び数日後の回腸中のラクトバシラス
の濃度を示す。
実施例 ヒト由来のラクトバシラス菌株の単離 ヒト腸粘膜上にコロナイズし定着するようになる能力
を有する菌株を単離するために、ラクトバシラス菌株を
ヒト腸粘膜からサンプリングした。結腸からのバイオプ
シーは、エンテロスコピー（enteroscopy）によって行
い、小腸（空腸及び回腸）由来の腸粘膜片を、外科手術
に関連して取り外した。粘膜試料を、直ちに、特別の培
地（0.9％NaCl、0.1％ペプトン、0.1％Tween80及び0.02
％シスチン；すべて値は％重量／容量で示す。）に入
れ、２分間超音波浴でホモジナイズし、１分間攪拌し、
次いで、ロゴサアガー（Rogosa agar）（ディフコラボ
ラトリーズ、デトロイト、ミシガン、USA、Difco Labor
atories,Detroit,Michigan,USA）上に置いた。プレート
を37℃で２日間（2d）（ガスパックアンアエロビックシ
ステム、Gas Pak Anaerobic System,BBL）嫌気的にイン
キュベートした。１個から３個のコロニーを、それぞれ
のプレートからランダムにピックアップし、ロゴサアガ
ー上で５〜９回純粋培養して生育し、−80℃で凍結バッ
ファー中で濃縮培養物（dense culture）として保存し
た。総数209個のラクトバシラス菌株を、61種の異なっ
た患者（subjects）から単離した。単離物の全てを、49
種の異なった炭水化物を発酵する能力について、API、
モンタリュー、ベルスー、フランス（Montalieu Verce
u,France）から販売されているテストキット、API 50 C
Hによって特徴付けた。小腸と大腸との間でラクトバシ
ラス叢の組成において、重要な相違点は見られなかっ
た。
を有する菌株を単離するために、ラクトバシラス菌株を
ヒト腸粘膜からサンプリングした。結腸からのバイオプ
シーは、エンテロスコピー（enteroscopy）によって行
い、小腸（空腸及び回腸）由来の腸粘膜片を、外科手術
に関連して取り外した。粘膜試料を、直ちに、特別の培
地（0.9％NaCl、0.1％ペプトン、0.1％Tween80及び0.02
％シスチン；すべて値は％重量／容量で示す。）に入
れ、２分間超音波浴でホモジナイズし、１分間攪拌し、
次いで、ロゴサアガー（Rogosa agar）（ディフコラボ
ラトリーズ、デトロイト、ミシガン、USA、Difco Labor
atories,Detroit,Michigan,USA）上に置いた。プレート
を37℃で２日間（2d）（ガスパックアンアエロビックシ
ステム、Gas Pak Anaerobic System,BBL）嫌気的にイン
キュベートした。１個から３個のコロニーを、それぞれ
のプレートからランダムにピックアップし、ロゴサアガ
ー上で５〜９回純粋培養して生育し、−80℃で凍結バッ
ファー中で濃縮培養物（dense culture）として保存し
た。総数209個のラクトバシラス菌株を、61種の異なっ
た患者（subjects）から単離した。単離物の全てを、49
種の異なった炭水化物を発酵する能力について、API、
モンタリュー、ベルスー、フランス（Montalieu Verce
u,France）から販売されているテストキット、API 50 C
Hによって特徴付けた。小腸と大腸との間でラクトバシ
ラス叢の組成において、重要な相違点は見られなかっ
た。
異なった群の代表的な菌株を、pH耐性、胆汁の存在下
での生育能力及びオートミール粥を発酵する能力につい
て評価した。
での生育能力及びオートミール粥を発酵する能力につい
て評価した。
pH耐性は、0.1mlのバクテリア懸濁液（ロゴサブロス
（Rogosa broth）中で培養し、遠心後、生理食塩水に再
懸濁した109CFU/ml）を2mlの燐酸塩にバッファー、pH1.
0に加えて試験した。30分後、ロゴサアガープレートに
接種し、もし37℃で３日間インキュベーション後生育が
観察されたなら、試験は陽性と考える。試験した菌株の
数種のみがこの試験をパスした。
（Rogosa broth）中で培養し、遠心後、生理食塩水に再
懸濁した109CFU/ml）を2mlの燐酸塩にバッファー、pH1.
0に加えて試験した。30分後、ロゴサアガープレートに
接種し、もし37℃で３日間インキュベーション後生育が
観察されたなら、試験は陽性と考える。試験した菌株の
数種のみがこの試験をパスした。
胆汁存在下での生育は、ロゴサアガープレート中それ
ぞれ0.1％及び0.15％のビーフ胆汁（beef bile）存在下
37℃、３日間嫌気的に培養したラクトバシラスの単離物
を生育させることによって試験した。約80％の菌株が、
0.1％胆汁の存在下で生育したが、0.15％胆汁中ではわ
ずか18％が生育し得るに過ぎなかった。
ぞれ0.1％及び0.15％のビーフ胆汁（beef bile）存在下
37℃、３日間嫌気的に培養したラクトバシラスの単離物
を生育させることによって試験した。約80％の菌株が、
0.1％胆汁の存在下で生育したが、0.15％胆汁中ではわ
ずか18％が生育し得るに過ぎなかった。
これら試験結果に基づき、20種の異なるラクトバシラ
ス菌株を選択し、更に研究した。
ス菌株を選択し、更に研究した。
ヒトにおけるインビボでの腸のコロナイゼーション 健常被験者にある期間毎日、上記に従って注意深く選
択された20種の異なったラクトバシラス菌株の混合物を
含む発酵されたオートミール粥を与えた。その後、消費
された菌株のうちどの菌株が、小腸及び大腸からの粘膜
上に観察できるかを調査した。
択された20種の異なったラクトバシラス菌株の混合物を
含む発酵されたオートミール粥を与えた。その後、消費
された菌株のうちどの菌株が、小腸及び大腸からの粘膜
上に観察できるかを調査した。
発酵されたオートミール粥を、以下に記載のプロトコ
ールに従って作った。これは、以下の表１に示したよう
に、この実験では、ラクトバシラスのそれぞれ菌株で容
易に行なわれた。各調製物は、最終生成物が凍結乾燥品
1gあたり８×107CFUの割合になるように混合した。
ールに従って作った。これは、以下の表１に示したよう
に、この実験では、ラクトバシラスのそれぞれ菌株で容
易に行なわれた。各調製物は、最終生成物が凍結乾燥品
1gあたり８×107CFUの割合になるように混合した。
この研究には、31〜56歳の間の12人のボランティアが
参加し、各人が、水1mlあたり1gの凍結乾燥品をベース
にした100mlの液体オートミール粥の10ボトルを受取っ
た。オートミール粥の消費の開始前、被験者が10日間毎
日朝食として100mlのオートミール粥を消費した11日
後、及び更に10日後（即ち、オートミール粥消費完了後
11日である）に、腸粘膜から試料を採取した。腸の試料
は、ワトソンカプセル（Watson capsule）によって小腸
（回腸）から及びレクトスコープ（rectoscope）によっ
て直腸からバイオプシーとして採取した。バイオプシー
は、上述したように調製され、生存ラクトバシラスの量
を分析した。それぞれの試料から、約10個のコロニーを
ロゴサアガープレートからピックアップし、それらを純
粋培養後、同定されるまで−80℃で凍結保存した。
参加し、各人が、水1mlあたり1gの凍結乾燥品をベース
にした100mlの液体オートミール粥の10ボトルを受取っ
た。オートミール粥の消費の開始前、被験者が10日間毎
日朝食として100mlのオートミール粥を消費した11日
後、及び更に10日後（即ち、オートミール粥消費完了後
11日である）に、腸粘膜から試料を採取した。腸の試料
は、ワトソンカプセル（Watson capsule）によって小腸
（回腸）から及びレクトスコープ（rectoscope）によっ
て直腸からバイオプシーとして採取した。バイオプシー
は、上述したように調製され、生存ラクトバシラスの量
を分析した。それぞれの試料から、約10個のコロニーを
ロゴサアガープレートからピックアップし、それらを純
粋培養後、同定されるまで−80℃で凍結保存した。
全ての単離物を、上述のようにAPI 50 CH上で試験し
た。試験した菌株のいずれにも相当する又は大部分相当
すると考えられる単離物について、以下に示す方法に従
ってプラスミド分析及び制限エンドヌクレアーゼ分析に
よって、更に試験した。
た。試験した菌株のいずれにも相当する又は大部分相当
すると考えられる単離物について、以下に示す方法に従
ってプラスミド分析及び制限エンドヌクレアーゼ分析に
よって、更に試験した。
一般的な傾向として、腸粘膜上のラクトバシラスの量
は、発酵したオートミール粥の消費の間増加し、この増
加は、投与完了後11日間続いたのが観察された。図３に
おいて、回腸中のラクトバシラスの対数濃度（logarith
mic concentration）を、試験開始前（ｔ＝０）、試験
完了日（ｔ＝１）及び更に10日後（ｔ＝11）について、
カラムダイアグラムで示す。小腸において増加はより明
確であるが、一方、大腸においては、全体としてのラク
トバシラスの量がより大きい。更に、グラム陰性嫌気性
バクテリアの結腸での量が、発酵したオートミール粥の
消費後減少したのが観察できた。
は、発酵したオートミール粥の消費の間増加し、この増
加は、投与完了後11日間続いたのが観察された。図３に
おいて、回腸中のラクトバシラスの対数濃度（logarith
mic concentration）を、試験開始前（ｔ＝０）、試験
完了日（ｔ＝１）及び更に10日後（ｔ＝11）について、
カラムダイアグラムで示す。小腸において増加はより明
確であるが、一方、大腸においては、全体としてのラク
トバシラスの量がより大きい。更に、グラム陰性嫌気性
バクテリアの結腸での量が、発酵したオートミール粥の
消費後減少したのが観察できた。
以下の菌株がラクトバシラス投与完了後10日で腸粘膜
上に上位で観察された。
上に上位で観察された。
ラクトバシラス プランタラム（Lactobacillus plan
tarum） 299は、11被験者中で観察された（５被験者に
おいては小腸においてのみ、５被験者においては大腸に
おいてのみ。）。
tarum） 299は、11被験者中で観察された（５被験者に
おいては小腸においてのみ、５被験者においては大腸に
おいてのみ。）。
ラクトバシラス カセイ エスエスピー．ラムノサス
（Lactobacillus casei ssp.rhamnosus） 271は、４被
験者中で観察された（１被験者においては小腸において
のみ、他の２被験者においては大腸においてのみ。）。
（Lactobacillus casei ssp.rhamnosus） 271は、４被
験者中で観察された（１被験者においては小腸において
のみ、他の２被験者においては大腸においてのみ。）。
ラクトバシラス レウテリ（Lactobacillus reuter
i）108は、４被験者中で観察された（１被験者において
は小腸においてのみ、１被験者においては大腸において
のみ。）。
i）108は、４被験者中で観察された（１被験者において
は小腸においてのみ、１被験者においては大腸において
のみ。）。
ラクトバシラス ムリナス／カセイ エスエスピー．
トレランス（Lactobacillus murinus/casei ssp.tolera
nce）294は、２被験者中で観察された。
トレランス（Lactobacillus murinus/casei ssp.tolera
nce）294は、２被験者中で観察された。
完了した投与後11日に再単離した菌株は、小腸におい
て約３×103〜105CFU/g粘膜の濃度で、大腸において103
〜３×107CFU/g粘膜の濃度で、粘膜上で観察された。
て約３×103〜105CFU/g粘膜の濃度で、大腸において103
〜３×107CFU/g粘膜の濃度で、粘膜上で観察された。
オートミール粥の調製 発酵したオートミール粥を３段階で調製した： （ｉ）1295gのオートミール（MP-450、ノード−ミル
ズ、ジャーナ（Nord-Mills,Jrna）、蛋白量14.2％、
灰分量（ash content）2.1％）、129.5gの酵素混合物
（ノード モルト（Nord Malt）、ソーダーハム（Ｓd
erhamn））及び5390gの水道水（tap water）を混合し、
ゆっくり攪拌しながら95℃に加熱した。粥を、50℃に冷
やし、１％β−グルカナーゼ（重量／容量）を加え（GV
-L;グリンドステッドプロダクツ（Grindsted Product
s）A/S、ブラバンド（Brband）、デンマーク）、その後
２時間50℃でインキュベートした； （ii）粥に新鮮なラクトバシラスを接種し、37℃で15-2
0時間発酵させた。pHは、3.4〜3.9であった。発酵は、
異なった菌株を用いてそれぞれ別々に行い、生成物1ml
あたり、コロニーフォーミングユニット、CFUの数は、
ロゴサアガー上で６×106〜６×108であった（37℃で20
時間嫌気的に）。
ズ、ジャーナ（Nord-Mills,Jrna）、蛋白量14.2％、
灰分量（ash content）2.1％）、129.5gの酵素混合物
（ノード モルト（Nord Malt）、ソーダーハム（Ｓd
erhamn））及び5390gの水道水（tap water）を混合し、
ゆっくり攪拌しながら95℃に加熱した。粥を、50℃に冷
やし、１％β−グルカナーゼ（重量／容量）を加え（GV
-L;グリンドステッドプロダクツ（Grindsted Product
s）A/S、ブラバンド（Brband）、デンマーク）、その後
２時間50℃でインキュベートした； （ii）粥に新鮮なラクトバシラスを接種し、37℃で15-2
0時間発酵させた。pHは、3.4〜3.9であった。発酵は、
異なった菌株を用いてそれぞれ別々に行い、生成物1ml
あたり、コロニーフォーミングユニット、CFUの数は、
ロゴサアガー上で６×106〜６×108であった（37℃で20
時間嫌気的に）。
（iii）発酵した粥を、凍結乾燥した。各生成物を、す
べての菌株においてCFU/gの値が同じになるような割合
に混合した。その混合物に、20％（w/w）の大豆粉（蛋
白質51％、灰分量5.5％、脂肪１％）を追加した。この
強化混合物は、２×107CFU/gを含んでおり、−18℃で保
存した。発酵していないオートミール粥を、発酵するこ
と無く上記と同様な方法で作製した。
べての菌株においてCFU/gの値が同じになるような割合
に混合した。その混合物に、20％（w/w）の大豆粉（蛋
白質51％、灰分量5.5％、脂肪１％）を追加した。この
強化混合物は、２×107CFU/gを含んでおり、−18℃で保
存した。発酵していないオートミール粥を、発酵するこ
と無く上記と同様な方法で作製した。
オートミール粥を、上述した腸のコロナイゼーション
試験で選択された20菌株の全てについて作製し、凍結乾
燥前後での濃度及び香味（flavour）について評価し
た。結果を以下の表１に示した。
試験で選択された20菌株の全てについて作製し、凍結乾
燥前後での濃度及び香味（flavour）について評価し
た。結果を以下の表１に示した。
発酵によってオートミール粥に好ましい香味を与える
能力を、異なった菌株によって発酵したオートミール粥
を判断する４名からなる“エキスパートパネル（expert
panel）”によって判断した。香味は、５から１と下が
っていく等級で評価し、５は“とてもよい”との判断を
示し、１は“味気無い（unsavoury）”との判断を示
す。20種の選択した試験菌株の評値を上記の表１に示
す。
能力を、異なった菌株によって発酵したオートミール粥
を判断する４名からなる“エキスパートパネル（expert
panel）”によって判断した。香味は、５から１と下が
っていく等級で評価し、５は“とてもよい”との判断を
示し、１は“味気無い（unsavoury）”との判断を示
す。20種の選択した試験菌株の評値を上記の表１に示
す。
オートミール粥の発酵 優勢な量で腸粘膜で見つけられた４種の菌株を、オー
トミール粥を発酵させる能力、凍結乾燥に耐える能力及
びオートミール粥における香味の改善について更に調査
した。
トミール粥を発酵させる能力、凍結乾燥に耐える能力及
びオートミール粥における香味の改善について更に調査
した。
オートミール粥を発酵する能力は、pHを4.0未満に減
少させる能力及び＞108CFU/g湿重量のレベルでCFUを形
成する能力によって判断した。
少させる能力及び＞108CFU/g湿重量のレベルでCFUを形
成する能力によって判断した。
オートミール粥中凍結乾燥に耐える能力は、別の選択
基準である。この関係において、CFUの濃度を、凍結乾
燥後に測定した。
基準である。この関係において、CFUの濃度を、凍結乾
燥後に測定した。
オートミール粥での上記試験の結果を、以下の表２に
示す。
示す。
加えて、選択された４種の菌株の香味を、上述した同
じ評価記号を用いて、一方では市販されているヨーグル
ト培養物（ストレプトコッカス サーモフィラス（Stre
ptococcus thermophilus）及びラクトバシラスブルガリ
カス（Lactobacillus bulgaricus））及び他方では市販
されているアシドフィルスサワーミルク培養物（ラクト
バシラス アシドフィルス）との比較によって評価し
た。結果を以下の表３に示す。
じ評価記号を用いて、一方では市販されているヨーグル
ト培養物（ストレプトコッカス サーモフィラス（Stre
ptococcus thermophilus）及びラクトバシラスブルガリ
カス（Lactobacillus bulgaricus））及び他方では市販
されているアシドフィルスサワーミルク培養物（ラクト
バシラス アシドフィルス）との比較によって評価し
た。結果を以下の表３に示す。
これらの値を基にして、菌株299及び271が特別な重要
性があると判断し、更に以下に詳細に記載する。
性があると判断し、更に以下に詳細に記載する。
ラクトバシラス菌株299及び271の記載 菌株299及び271は、共に健康なヒト腸粘膜から単離さ
れ、ドイッチェ サムルング フォン ミクロオルガニ
スメン ウント ツェルクルツーレン ゲーエムベーハ
ーに、1991年７月２日に寄託され、寄託番号DSM6595（2
99）及びDSM6594（271）が付与されている。
れ、ドイッチェ サムルング フォン ミクロオルガニ
スメン ウント ツェルクルツーレン ゲーエムベーハ
ーに、1991年７月２日に寄託され、寄託番号DSM6595（2
99）及びDSM6594（271）が付与されている。
表現型の記載 菌株299及び271は、グラム陽性であり、pH5.5でのロ
ゴサアガー上で生育するカタラーゼ陰性かん菌（catala
se negative rods）である。異なった炭水化物を発酵す
る該菌株の能力を、表４に示す。試験は、製造業者の説
明書に基づき、API 50CHによって行った。
ゴサアガー上で生育するカタラーゼ陰性かん菌（catala
se negative rods）である。異なった炭水化物を発酵す
る該菌株の能力を、表４に示す。試験は、製造業者の説
明書に基づき、API 50CHによって行った。
表現型上は、菌株299はラクトバシラス プランタラ
ム（Lactobacillus plantarum）（ラフィノース（raffi
nose）のみがエル．プランタラムATCC14917Tの試験パタ
ーンから逸脱した。これは、種エル．プランタラムの代
表菌株（type strain）、即ち、種（species）を決定す
る菌株である。）として同定できる。271は、ラクトバ
シラスカセイ エスユービーエスピー．ラムノサス（La
ctobacillus casei subsp.rhamnosus）（この種の代表
菌株と完全に対応する）として同定できる。
ム（Lactobacillus plantarum）（ラフィノース（raffi
nose）のみがエル．プランタラムATCC14917Tの試験パタ
ーンから逸脱した。これは、種エル．プランタラムの代
表菌株（type strain）、即ち、種（species）を決定す
る菌株である。）として同定できる。271は、ラクトバ
シラスカセイ エスユービーエスピー．ラムノサス（La
ctobacillus casei subsp.rhamnosus）（この種の代表
菌株と完全に対応する）として同定できる。
遺伝子型（genotype）の記載 上記２種の菌株を、EcoRIでの切断に関して、制限−
エンドヌクレアーゼ分析−REA−（スタール エム.,モ
リン ジー.,パーソン エー.,アールネ エス.,及びス
タール エス.,（Sthl M.,Molin G.,Persson A.,Ahrn
S.,＆ Sthl S）インターナショナル ジャーナル
オブ システマティック バクテリオロジー（Journa
l of Systematic Bacteriology） 40:189-193,1990）に
より、染色体DNAの切断パターンについて試験した。概
要的にはREAは以下のように記載し得る： （１）染色体DNAは、試験に関与した菌株から単離され
る； （２）該DNAは、制限酵素によって切断される； （３）切断されたDNA断片は、アガロースゲル電気泳動
によってサイズ別に分離される。
エンドヌクレアーゼ分析−REA−（スタール エム.,モ
リン ジー.,パーソン エー.,アールネ エス.,及びス
タール エス.,（Sthl M.,Molin G.,Persson A.,Ahrn
S.,＆ Sthl S）インターナショナル ジャーナル
オブ システマティック バクテリオロジー（Journa
l of Systematic Bacteriology） 40:189-193,1990）に
より、染色体DNAの切断パターンについて試験した。概
要的にはREAは以下のように記載し得る： （１）染色体DNAは、試験に関与した菌株から単離され
る； （２）該DNAは、制限酵素によって切断される； （３）切断されたDNA断片は、アガロースゲル電気泳動
によってサイズ別に分離される。
（４）各菌株のバンドパターンは、レーザーデンシトメ
ーター及び関連するプログラムによって記録、解釈され
る。REA−パターンに関して、菌株間の違いは、主成分
分析（principal component analysis）によって数学的
に表される。1990） 更に、プラスミドの内容について、実験を行った（ア
ールネ エス.,モリン ジー.,及びスタール エス.,シ
ステマティック アンド アプライド マイクロバイオ
ロジー（Systematic and Applied Microbiology）11:32
0-325,1989に従った方法）。
ーター及び関連するプログラムによって記録、解釈され
る。REA−パターンに関して、菌株間の違いは、主成分
分析（principal component analysis）によって数学的
に表される。1990） 更に、プラスミドの内容について、実験を行った（ア
ールネ エス.,モリン ジー.,及びスタール エス.,シ
ステマティック アンド アプライド マイクロバイオ
ロジー（Systematic and Applied Microbiology）11:32
0-325,1989に従った方法）。
菌株299:この菌株は、大きさがそれぞれ4MDal、9MDa
l、20MDal及び35MDalの４種のプラスミドを含有する。
染色体DNAの切断パターンを図１に示す。299とマークさ
れたレーンは、菌株299のパターンを示し、ｖとマーク
されたレーンは、２種の異なった単離物由来の菌株299
の遺伝子的な変異体を示す；この変異体は、ヒトで試験
した20種の菌株の一つであり、表１にA1と記載した。レ
ーンｓは、スタンダードであり、高分子Mw DNAマーカー
（AEH;BRL,ベセスダリサーチ ラボラトリーズ（Bethes
da Research Laboratories）ライフ テクノロジーズ
インコーポレーティッド（Life Technologies Inc.
社））を示す。299の変異体は、一般的な表現型の試験
によっては、299と分離することができなかった。ま
た、遺伝子的に299と299vは、非常に近い。この変異体
が、ヒト腸粘膜中で定着する同じ能力を有していること
も、判明した。
l、20MDal及び35MDalの４種のプラスミドを含有する。
染色体DNAの切断パターンを図１に示す。299とマークさ
れたレーンは、菌株299のパターンを示し、ｖとマーク
されたレーンは、２種の異なった単離物由来の菌株299
の遺伝子的な変異体を示す；この変異体は、ヒトで試験
した20種の菌株の一つであり、表１にA1と記載した。レ
ーンｓは、スタンダードであり、高分子Mw DNAマーカー
（AEH;BRL,ベセスダリサーチ ラボラトリーズ（Bethes
da Research Laboratories）ライフ テクノロジーズ
インコーポレーティッド（Life Technologies Inc.
社））を示す。299の変異体は、一般的な表現型の試験
によっては、299と分離することができなかった。ま
た、遺伝子的に299と299vは、非常に近い。この変異体
が、ヒト腸粘膜中で定着する同じ能力を有していること
も、判明した。
菌株271:この菌株は、大きさがそれぞれ3MDal及び5MD
alの２種のプラスミドを含有する。該菌株の染色体DNA
の切断パターンを、レーンＡとして図２に示す。レーン
ｖは、菌株271の遺伝子的な変異体を示す；レーンｓ
は、図１に示したのと同じスタンダードを示す。271の
変異体は、一般的な表現型の試験によっては、271と分
離することができなかった。また、遺伝子的に、271と2
71vは、非常に近い。この変異体が、姉妹の菌株とし
て、ヒト腸粘膜にコロナイズする同じ能力を有している
ことも判明した。
alの２種のプラスミドを含有する。該菌株の染色体DNA
の切断パターンを、レーンＡとして図２に示す。レーン
ｖは、菌株271の遺伝子的な変異体を示す；レーンｓ
は、図１に示したのと同じスタンダードを示す。271の
変異体は、一般的な表現型の試験によっては、271と分
離することができなかった。また、遺伝子的に、271と2
71vは、非常に近い。この変異体が、姉妹の菌株とし
て、ヒト腸粘膜にコロナイズする同じ能力を有している
ことも判明した。
遺伝子的に、２つの実験した菌株は本質的に異なる。
それらは、それぞれの代表菌株とも有意に異なる。
それらは、それぞれの代表菌株とも有意に異なる。
ラクトバシラス299の培養 −−80℃のフリーザーからの接種物（inoculate）を、5
0mlのラクトバシラスキャリーング培地 （Lactobacillus Carrying Medium）（LCM、エフシミオ
ウおよびハンセン（Efthymiou ＆ Hansen）、J.Infect.
Dis.,110:258-267,1962）又はロゴサに加え、 −約40時間37℃インキュベートし、 −50mlを500mlのLCMに接種し、 −約40時間37℃でインキュベートし、 −500mlを５リットルに接種し、 −約25-30時間37℃でインキュベートし、 −10000rpmで10分間遠心し、 −生理食塩水で１度洗浄し、 −該ペレットを、約１リットルの生理食塩水に溶解す
る。
0mlのラクトバシラスキャリーング培地 （Lactobacillus Carrying Medium）（LCM、エフシミオ
ウおよびハンセン（Efthymiou ＆ Hansen）、J.Infect.
Dis.,110:258-267,1962）又はロゴサに加え、 −約40時間37℃インキュベートし、 −50mlを500mlのLCMに接種し、 −約40時間37℃でインキュベートし、 −500mlを５リットルに接種し、 −約25-30時間37℃でインキュベートし、 −10000rpmで10分間遠心し、 −生理食塩水で１度洗浄し、 −該ペレットを、約１リットルの生理食塩水に溶解す
る。
この量は、約400-500リットルのオートミール粥に十
分であると評価される。培養培地は最適化されていな
い。ロゴサはLCMより良く作用し、それは多分より良い
バッファー機能による。２％グルコースをLCMに加え
た。同じ操作を、他のラクトバシラス菌株を産生するの
に使用することができる。
分であると評価される。培養培地は最適化されていな
い。ロゴサはLCMより良く作用し、それは多分より良い
バッファー機能による。２％グルコースをLCMに加え
た。同じ操作を、他のラクトバシラス菌株を産生するの
に使用することができる。
ラットでの生物学的試験 250-300gの体重を有するラットに、標準的な手術を施
し、大腸の一部を単離し穴を開けることによって腹腔中
に膿瘍を発生させる。即ち、これにより、腸内容物が腹
腔内へ連続的に漏出し、これが24時間以内に膿瘍、腐敗
（sepsis）及び引き続く高率の死亡率を惹起する。各群
30匹からなる３グループの動物を使用した。グループ１
は、処理しない対照群、グループ２は、注射により抗生
物質で処理し、グループ３は、胃に発酵オートミール粥
の形態でラクトバシラスを供給した。使用したそのラク
トバシラス菌株は、ラット腸粘膜から単離されたもので
あり、試験においてラット腸にコロナイズし確立される
ようになることが証明されている。
し、大腸の一部を単離し穴を開けることによって腹腔中
に膿瘍を発生させる。即ち、これにより、腸内容物が腹
腔内へ連続的に漏出し、これが24時間以内に膿瘍、腐敗
（sepsis）及び引き続く高率の死亡率を惹起する。各群
30匹からなる３グループの動物を使用した。グループ１
は、処理しない対照群、グループ２は、注射により抗生
物質で処理し、グループ３は、胃に発酵オートミール粥
の形態でラクトバシラスを供給した。使用したそのラク
トバシラス菌株は、ラット腸粘膜から単離されたもので
あり、試験においてラット腸にコロナイズし確立される
ようになることが証明されている。
試験の評価は、血中のバクテリアの量、即ち敗血症と
同等のもの、及び腹腔および腸からの培養物の分析によ
り行った。結果は、グループ１の動物全てに血中にバク
テリアが検出され、高い死亡率につながった。グループ
２及び３において、30匹の動物中３匹にバクテリアが発
生するという同等の結果が得られたが、グループ１より
も程度ははるかに低かった。
同等のもの、及び腹腔および腸からの培養物の分析によ
り行った。結果は、グループ１の動物全てに血中にバク
テリアが検出され、高い死亡率につながった。グループ
２及び３において、30匹の動物中３匹にバクテリアが発
生するという同等の結果が得られたが、グループ１より
も程度ははるかに低かった。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:25） (72)発明者 ジェプソン ベングト スウェーデン国 エス−222 47 ルン ド マータレグランデン ８ (56)参考文献 特開 昭61−280433（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，70［１］（1987）, ｐ．１−12
Claims (7)
- 【請求項１】ラクトバシラス プランタラム（Lactobac
illus plantarum）299 DSM 6595、 ラクトバシラス カセイ エスエスピー．ラムノサス
（Lactobacillus casei ssp.rhamnosus）271 DSM 659
4、 又はそれらの菌の制限エンドヌクレアーゼ分析パターン
（REA−パターン）に対応するREA−パターンを有する変
異体のいずれかであることを特徴とする、インビボでヒ
ト腸粘膜にコロナイズ（colonize）する能力を有するラ
クトバシラス菌株。 - 【請求項２】インビボでヒト腸粘膜にコロナイズし定着
（established）するようになる能力を有する請求項１
記載のラクトバシラス菌株、すなわち ラクトバシラス プランタラム（Lactobacillus planta
rum）299 DSM 6595、ラクトバシラス カセイ エスエ
スピー．ラムノサス（Lactobacillus casei ssp.rhamno
sus）271 DSM 6594、 又はそれらの菌の制限エンドヌクレアーゼ分析パターン
（REA−パターン）に対応するREA−パターンを有する変
異体のいずれかを単離する方法であって、ラクトバシラ
スがヒト腸粘膜から単離され、栄養培地中で純粋培養
（pure cultured）され、腸内でコロナイズし定着する
ようになる能力について選択されることを特徴とする方
法。 - 【請求項３】コロナイズし定着するようになる該能力
が、経口投与、及び投与完了後少なくとも10日で腸粘膜
上に出現することを確認することによって、試験される
ことを特徴とする請求項２記載の方法。 - 【請求項４】選択が、胆汁耐性、pH耐性、オートミール
の発酵能力及び香味産生能力の評価によって行われるこ
とを特徴とする請求項２又は３記載の方法。 - 【請求項５】胃腸管中の感染の予防又は治療のための組
成物であって、請求項１記載の菌株、すなわち ラクトバシラス プランタラム（Lactobacillus planta
rum）299 DSM 6595、ラクトバシラス カセイ エスエ
スピー．ラムノサス（Lactobacillus casei ssp.rhamno
sus）271 DSM 6594、 又はそれらの菌の制限エンドヌクレアーゼ分析パターン
（REA−パターン）に対応するREA−パターンを有する変
異体のいずれか少なくとも一種と、慣用される担体とを
組合わせて含むことを特徴とする組成物。 - 【請求項６】ラクトバシラス菌株によって発酵された栄
養溶液をベースとするオートミールであることを特徴と
する、経口、小腸（enteral）又は直腸（rectal）投与
のための請求項５記載の組成物。 - 【請求項７】外科手術に関連するバクテリア感染の予防
又は治療のための組成物であって、請求項１記載の菌
株、すなわち ラクトバシラス プランタラム（Lactobacillus planta
rum）299 DSM 6595、ラクトバシラス カセイ エスエ
スピー．ラムノサス（Lactobacillus casei ssp.rhamno
sus）271 DSM 6594、 又はそれらの菌の制限エンドヌクレアーゼ分析パターン
（REA−パターン）に対応するREA−パターンを有する変
異体のいずれか少なくとも一種と、慣用される担体とを
組合わせて含むことを特徴とする組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9102238 | 1991-07-25 | ||
| SE9102238A SE469875C (sv) | 1991-07-25 | 1991-07-25 | Stam av tarmkoloniserande Lactobacillus samt komposition för profylax eller behandling av infektioner i magtarmkanalen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06501624A JPH06501624A (ja) | 1994-02-24 |
| JP2742962B2 true JP2742962B2 (ja) | 1998-04-22 |
Family
ID=20383375
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5502759A Expired - Lifetime JP2742962B2 (ja) | 1991-07-25 | 1992-07-24 | 腸定着ラクトバシラス |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5474932A (ja) |
| EP (1) | EP0554418B1 (ja) |
| JP (1) | JP2742962B2 (ja) |
| AT (1) | ATE164073T1 (ja) |
| AU (1) | AU659669B2 (ja) |
| CA (1) | CA2091557C (ja) |
| DE (1) | DE69224814T2 (ja) |
| DK (1) | DK0554418T3 (ja) |
| ES (1) | ES2114565T3 (ja) |
| FI (2) | FI109357B (ja) |
| NO (1) | NO306699B1 (ja) |
| SE (1) | SE469875C (ja) |
| WO (1) | WO1993001823A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP2789554B2 (ja) * | 1994-09-26 | 1998-08-20 | 全国農業協同組合連合会 | 免疫活性を有するアルカリ処理ヨーグルト粉末の製造法 |
| US5733540A (en) * | 1995-03-08 | 1998-03-31 | Lee; Peter Poon-Hang | Protection from viral infection via colonization of mucosal membranes with genetically modified bacteria |
| SE9501056D0 (sv) * | 1995-03-23 | 1995-03-23 | Probi Ab | Epithelial adherent lactobacilli |
| KR100376954B1 (ko) * | 1995-07-31 | 2003-07-18 | 프로비 에이비 | 장에서집락화하는유산간균 |
| AUPN907296A0 (en) * | 1996-04-02 | 1996-04-26 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Biocontrol agents for use in treatment of opportunistic infections |
| ES2243965T3 (es) * | 1996-07-09 | 2005-12-01 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Procedimiento de secado mediante pulverizacion. |
| GB9623068D0 (en) * | 1996-11-06 | 1997-01-08 | Cultech Limited | Microflora |
| SE511524C2 (sv) * | 1997-06-02 | 1999-10-11 | Essum Ab | Lactobacillus casei rhamnosus-stam samt farmaceutisk beredning för bekämpning av patogena tarmbakterier |
| RO112995B1 (ro) * | 1997-08-05 | 1998-03-30 | Rodica Teodorescu | Produs medicamentos pentru terapia colonului |
| SE510753C2 (sv) * | 1997-08-05 | 1999-06-21 | Probi Ab | Användning av en stam av Lactobacillus för tillverkning av ett läkemedel för reduktion av fibrinogenhalten i blod |
| SE511025C2 (sv) * | 1997-10-03 | 1999-07-26 | Probi Ab | Foderprodukt för häst omfattande Lactobacillus plantarum JI:1 samt Lactobacillus plantarum JI:1 och användning därav |
| DK0922391T3 (da) * | 1997-12-12 | 2007-03-26 | Mueller Karl Gmbh & Co | Sammensætning til modning af råpölse |
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