KR20180081034A - 락토바실러스 플란타룸 kcc-30 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 KCC-30(KACC92134P) 및 이를 이용한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 락토바실러스 플란타룸 KCC-30(KACC92134P)의 지방 생성 억제 활성을 이용하여 생균제로서 다양한 지방 생성 억제용 조성물을 제공하며, 바람직하게 총체보리 사일리지 제조용 미생물 첨가제를 제공한다. 본 발명의 균주를 이용하여 제조된 식물체 사일리지는 가축의 불필요한 지방 생성을 억제할 수 있어 가축의 품질을 높일 수 있다. 또한, 본 발명의 균주는 사일리지 내 유해균의 생장을 억제하여, 효과적인 항균용 조성물로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 지방 생성 억제 활성이 우수한 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이를 이용한 품질이 개선된 사일리지에 관한 것이다.
락토바실러스는 일반적인 위장관 내 존재하는 미생물이며, 이들은 적절한 양으로 투여될 때 숙주에 지속적인 건강상 이익을 제공한다. 생균제로 분류될 수 있는 다양한 미생물들 가운데, 락토바실러스는 가장 일반적으로 사용되는 생균제이다. 락토바실러스는 독소의 제거, 미생물 성장의 억제, 면역계의 촉진 및 잠재적 병원체와 경쟁하는 등을 포함하는 많은 메카니즘을 통해, 생균제로서의 역할을 수행할 수 있다. 락토바실러스의 균주 특이적인 가변성은 기능적인 생균제 특성에 잠재적인 역할을 부여한다. 단, 모든 젖산 박테리아 균주가 숙주에 건강상 유익함을 주는 것은 아니므로, 사용 전 락토바실러스의 특성을 분석하는 것이 필수적이다. 따라서, 이상적인 생균제로써 활용하기 위해 사용 전 락토바실러스 균주의 특성을 분석하는 것은 필수적이다.
오늘날 독성 곰팡이에 의한 식품의 오염은 심각한 문제이다. 사상 곰팡이 및 효모균과 같은 주요 부패 미생물들은 빵, 요거트, 치즈, 건초 사료, 저장 작물 또는 사일리지 등과 같은 다양한 식품 및 농산품을 오염시킨다. 나아가 곰팡이의 성장은 식품의 질감 및 외관을 나쁘게 변화시키고 경제적인 손실을 야기한다. 따라서, 작물 질병을 감소시키고, 식품 및 환경의 안전성을 증가시킬 수 있는 항균제로 사용될 수 있는 미생물의 개발이 요구된다.
비만은 제2형 당뇨 및 심혈관 질환과 같은 심각한 건강상 문제를 발생시킨다. 게다가 비만은 간지방증을 유도하는 당흡수 장애를 일으킨다. 지방 저장과 함께 지방 조직의 성장 및 확장은 비만을 일으킨다. 내분비 기관의 지방 조직은 에너지 항상성에 주요한 역할을 수행한다. 지방분화전구세포 성장, 지방조직 분화 및 지방 세포 생성을 조절하는 항상성 분자 메커니즘의 주요 부분은 대규모 실험을 통해 확인할 수 있다. 지방조직의 분화 시, 섬유아세포 유사 지방전구세포의 지질 함유 세포 및 인슐린 반응성 성숙지방조직으로의 분화는 지방 축적을 증가시키는 것과 강하게 연관된다. 지방 생성은 퍼옥시좀 증식체-활성 수용체 감마(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ2), CCAAT-인헨서 결합 단백질(CCAAT-enhancer binding protein, C/EBPα) 및 지방산 합성효소(FAS)와 같은 다양한 전사 인자를 통해 조절된다. 이들 단백질의 하향 조절(down regulation)은 지방 생성을 현저하게 억제하는 것으로 보고되었다. 따라서, 식품 또는 사료에 생균제 또는 항균제로써 안전하게 사용할 수 있으면서, 지방 생성 억제 효과를 갖는 신규 미생물을 개발하는 것이 필요한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여, 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30(KACC92134P) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 포함하는 지방 생성 억제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30(KACC92134P) 균주를 포함하는 식물체 사일리지 제조를 위한 미생물 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30(KACC92134P) 균주를 포함하는 식물체 사일리지 제조방법을 제공한다.
본 발명의 신규 균주는 지방 생성 억제용 조성물로 제조될 수 있으며, 상기 지방 생성 억제용 조성물은 식품, 화장품, 의약품, 건강식품, 음료 등의 다양한 형태로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30(KACC92134P) 균주를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30(KACC92134P) 균주를 제공한다.
상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30(KACC92134P) 균주는 2016년 7월 5일자로 국립농업과학원 농업유전자자원센터에 기탁하였으며, 수탁번호 KACC92134P를 부여받았다.
본 발명의 발명자들은 신규 락토바실러스 플란타룸 KCC-30 균주의 활성을 연구하던 중, KCC-30 균주의 세포외 분비물이 3T3-L1 세포에 지방 세포 분화를 현저하게 억제하는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 상기 3T3-L1 세포는 마우스 3T3 세포로부터 유래된 세포 라인으로 섬유아세포와 유사한 형태를 가지며, 적절한 조건 하에 지방 세포와 같은 형태로 분화될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 락토바실러스 플란타룸 균주를 동물의 배설물로부터 분리하는 단계; 상기 분리한 락토바실러스 플란타룸 균주의 세포외 분비물의 활성능을 검정하는 단계; 상기 분리한 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸 균주의 동정 단계; 및 상기 분리된 락토바실러스 플란타룸 균주를 이용하여 생균제 특성을 검정하는 단계를 거쳐, 지방 생성 억제 활성이 우수한 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30 (KACC92134P) 균주를 얻었다.
본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30 (KACC92134P) 균주는 3T3-L1 세포의 지방 세포로의 분화를 억제하여 지방 생성 억제 활성을 나타낼 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KCC-30 (KACC92134P) 균주 또는 이를 포함하는 지방 생성 억제용 조성물은 PPARγ2, C/EBPα, FAS, 및 아디포넥틴(adiponectin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 지방 생성 유전자의 발현을 현저하게 억제시킴으로써, 지방 생성을 효과적으로 억제할 수 있다.
상기와 같은 우수한 지방 생성 억제 효과로 인해 상기 균주는 지방 생성 억제용 조성물의 제조에 이용할 수 있으며, 특히, 우수한 생균제 효과로 인해서 다양한 지방 생성 억제용 조성물을 포함하는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조에 이용될 수 있다.
본 발명의 지방 생성 억제용 조성물이 포함되는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조는 업계에서 일반적으로 실시하는 방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 본 발명의 신규 균주가 독성이 없으면서, 지방 생성 억제 활성이 뛰어나, 우수한 생균제로 이용될 수 있다는 것을 실험을 통해서 밝혀내었다. 본 발명의 균주를 사일리지 제조 시 첨가하고 가축에 급여할 때, 본 발명의 균주의 우수한 지방 생성 억제 활성으로 인해 가축의 불필요한 지방 생성을 억제하여 가축의 품질을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30 (KACC92134P) 균주를 포함하는 항균용 조성물을 제공한다. 상기 항균용 조성물은 KCC-30 균주의 항균 효과에 의해 유해균의 생장을 억제시킬 수 있다. 상기 유해균은 후자리움 옥시스포럼(Fusarium Oxysporum), 아스퍼질러스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 스코풀라리옵시스 브레비카울리스(Scopulariopsis brevicaulis) 및 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus Flavus) 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 항균용 조성물은 식품, 화장품, 의약품 또는 사료 등에 사용될 수 있으나, 바람직하게 사료에 사용될 수 있으며, 유해균의 생장을 억제시켜 사료의 품질을 현저하게 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 KCC-30 균주를 사일리지에 처리하면 사일리지 내 젖산 및 초산의 함량은 현저하게 증가되며, 그에 따라 pH가 감소되어, KCC-30 균주는 우수한 사료용 젖산균 첨가제로써 활용될 수 있다.
본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30 (KACC92134P) 균주를 포함하는 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30 (KACC92134P) 균주를 포함하는 항균용 미생물 첨가제를 제공한다. 바람직하게 상기 사일리지 발효용 또는 항균용 미생물 첨가제는 사일리지에 사용될 수 있다. 본 발명의 KCC-30 균주는 사일리지에 처리할 경우, 사일리지 내 유해균의 생장을 효과적으로 억제하고 사일리지의 품질을 향상시킬 수 있다.
상기 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 첨가하는 대상이 되는 식물체는, 예를 들어 볏짚, 라이그라스(ryegrass), 총체보리, 총체벼, 호밀 또는 옥수수일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사료로 이용될 수 있는 식물체라면 모두 이용될 수 있으나, 바람직하게는 이탈리안 라이그라스 또는 총체보리에 이용할 수 있다.
상기 식물체 사일리지 발효용 또는 항균용 미생물 첨가제는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30 (KACC92134P) 균주를 포함하는 배양원액, 또는 상기 배양원액의 희석액의 형태로 첨가할 수 있다.
또한 본 발명은 식물체에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30 (KACC92134P) 균주를 첨가하는 것을 특징으로 하는 식물체 사일리지 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 식물체 사일리지 제조방법은 당업계에서 사용되는 일반적인 방법으로서, 예를 들어 식물체의 발효를 위한 복수의 발효 단계들을 포함할 수 있다. 상기 복수의 발효 단계들은, 예를 들어 혐기성균인 초산균의 발효 단계 및 이후 젖산균의 발효 단계 등을 포함할 수 있으며, 당업자에 의해 적절한 조건으로 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30 (KACC92134P) 균주를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다. 본 발명의 사료 첨가제는 업계에서 일반적으로 이용되는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 신규 균주는 독성이 없으면서, 지방 생성 억제 활성이 뛰어나, 우수한 생균제로 이용될 수 있고, 이러한 신규 균주는 우수한 지방 생성 억제 활성으로 인해 사료 첨가제로 제조하여 사일리지에 첨가함으로써, 가축의 불필요한 지방 생성을 억제하여 가축의 품질을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30(KACC92134P) 균주로부터 분리된 세포외 분비물을 포함하며, 지방 생성 억제 활성을 나타내는 지방 생성 억제용 식품 조성물 또는 화장품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물 또는 화장품 조성물은 불필요한 지방의 생성을 효과적으로 억제하는 기능성 식품 조성물 또는 화장품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 KCC-30은 우수한 지방 생성 억제 활성을 가진다. 본 발명에 따른 상기 균주를 이용하여 다양한 지방 생성 억제용 조성물을 제조할 수 있다. 본 발명의 균주를 이용하여 제조된 식물체 사일리지는 가축의 불필요한 지방 생성을 억제함으로써 가축의 품질과 생산성을 높일 수 있다. 본 발명의 지방 생성 억제용 조성물은 독성이 없어 우수한 생균제 효과를 가지므로, 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등 다양한 형태로 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 균주는 사일리지 내 유해균의 생장을 억제하여, 효과적인 항균용 조성물로 사용될 수 있다.
도 1은 락토바실러스 KCC-30 균주의 항진균 효과의 실험 결과를 나타낸다. 항진균의 백분율은 3회 반복 ± SD의 평균으로 나타내었다.
도 2는 락토바실러스 KCC-30 균주의 생균제 분석이다. (A) KCC-30의 낮은 pH 내성, (B) KCC-30의 유도된 유액에서 자가 응집 분석, (C) 담즙염 내성 분석, (D) KCC-30의 소수성 및 자가 응집 분석. 상기 결과는 3회 반복 ± STD의 평균으로 나타내었다.
도 3은 WST 방법을 통해 KCC-30의 FECS의 세포 증식을 확인한 것을 나타낸다. FECS는 24시간에 모든 농도에서 세포 증식을 억제하였다.
도 4는 오일 레드 O 염식된 지질 방울의 현미경 관찰(20배)한 결과이다. A-대조군 지방 세포, B-KCC-30의 FECS의 250 μg으로 처리된 지방 세포, C-마이크로플레이트 리더를 사용한 지질 정량. 데이터는 3회 반복의 mean±SEM으로 주어졌다. 10일째에 대조군 지방 세포 분화와 함께 * P<0.05.
도 5는 지방 세포 mRNA 발현의 qPCR 분석을 나타낸다. 대조군 및 실험군 지방 세포 내 A- PPARγ2, B- C/EBPα, C- FAS 및 D- 아디포넥틴(adiponectin). 데이터는 3회 반복의 mean±SEM으로 주어졌다. 10일째에 대조군 지방 세포 분화와 함께 * P<0.05. 각각의 지방 세포 전사체의 일반적인 PCR 증폭 결과는 각 도면의 상단에 나타내었다.
도 2는 락토바실러스 KCC-30 균주의 생균제 분석이다. (A) KCC-30의 낮은 pH 내성, (B) KCC-30의 유도된 유액에서 자가 응집 분석, (C) 담즙염 내성 분석, (D) KCC-30의 소수성 및 자가 응집 분석. 상기 결과는 3회 반복 ± STD의 평균으로 나타내었다.
도 3은 WST 방법을 통해 KCC-30의 FECS의 세포 증식을 확인한 것을 나타낸다. FECS는 24시간에 모든 농도에서 세포 증식을 억제하였다.
도 4는 오일 레드 O 염식된 지질 방울의 현미경 관찰(20배)한 결과이다. A-대조군 지방 세포, B-KCC-30의 FECS의 250 μg으로 처리된 지방 세포, C-마이크로플레이트 리더를 사용한 지질 정량. 데이터는 3회 반복의 mean±SEM으로 주어졌다. 10일째에 대조군 지방 세포 분화와 함께 * P<0.05.
도 5는 지방 세포 mRNA 발현의 qPCR 분석을 나타낸다. 대조군 및 실험군 지방 세포 내 A- PPARγ2, B- C/EBPα, C- FAS 및 D- 아디포넥틴(adiponectin). 데이터는 3회 반복의 mean±SEM으로 주어졌다. 10일째에 대조군 지방 세포 분화와 함께 * P<0.05. 각각의 지방 세포 전사체의 일반적인 PCR 증폭 결과는 각 도면의 상단에 나타내었다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실험 방법
샘플의 수집
동물 분변 샘플을 대한민국, 천안에서 수집하였다. 샘플의 1 그램을 멸균수를 사용하여 108배로 계열 희석하였다. 샘플을 패트리디쉬의 MRS 배지에 따르고, 플레이트를 24-48시간 동안 37℃에서 배양하였다. 분리물을 무작위적으로 선택하고 항균 및 생균제 스크리닝을 수행하였다. KCC-30으로 명명된 단일 균주는 항균제 및 생균제 특성을 나타내었으며, 추가적인 실험을 위해 사용되었다.
생화학 및 생리학적 분석
락토바실러스 KCC-30 균주를 하룻밤 배양한 후, 생화학 및 생리학적 특성을 분석하기 위해 사용하였다. 발효성 산의 정량을 위해 메가자임 분석 키트(Bray, Co. WIcklow, Ireland)를 사용하였다. 탄수화물 발효 및 효소 생산의 분석을 위해 API 50 CH 및 API-ZYM 키트(Marcy-I’ Etoile, France)를 사용하였다.
16s rRNA 시퀀싱을 사용하여 분리된 락토바실러스 균주의 분자적 동정
16s rRNA 유전자 시퀀싱은 솔젠트사(Solgent Co)에서 수행하였다. 락토바실러스 KCC-30의 유전체 DNA는 QIAquick® 키트(Qiagen Ltd., Crawley, UK)를 사용하여 분리 및 정제하였다. 앰플리콘은 공통 프라이머 27 F(5’ AGA GTT TGA TCG TGG CTC AG 3’) 및 1492 R(3’ GCT TAC CTT GTT ACG ACT T 5’)을 사용하여 분석하였다. LAB KCC-30의 정렬된 16s rRNA 서열은 NCBI 유전자 은행의 데이터베이스로 BLAST 분석하였다. 수득한 KCC-30의 16s rRNA 서열은 NCBI 유전자 은행에 기탁번호 KP091746.1로 기탁하였다.
KCC-30의 항균성 실험 및 항진균 분석
항균성 스크리닝은 Valan Arasu M et al에서 설명된 디스크 확산법을 통해 수행하였다. Fusarium Oxysporum, Aspergillus clavatus, Penicillium chrysogenum, Scopulariopsis brevicaulis 및 Aspergillus Flavus와 같은 진균 균주는 대한민국, 전주의 KACC로부터 수득하였다. 항진균 스크리닝은 Ilavenil et al에 약간 변형된 푸어-플레이트(pour-plate) 방법을 통해 수행하였다. 독성 진균의 성장 및 LAB 균주에 의한 진균 생중량의 억제는 Valan Arasu M et al에 약간 변형하여 분석하였다. 실험 결과는 진균 성장의 억제 백분율로 나타내었다.
KCC-30의 프로바이오틱 분석 방법
낮은 pH에 대한 내성 분석 방법
락토바실러스 KCC-30의 낮은 pH에 대한 내성은 Tambekar and Bhutada에서 설명된 방법을 통해 실험하였다. 배양된 락토바실러스 KCC-30을 다양한 pH(2, 3, 4 및 6.2)에 멸균된 MRS 배지로 접종하였다. 상기 배지를 48시간 동안 37℃에서 배양하였다. 48시간 이후, 각각 튜브로부터 접종원 100 μL를 푸어 플레이트 방법을 통해 MRS 배지에 따랐다. 상기 플레이트를 48시간 동안 37℃에서 배양하고 콜로니 수를 세었다.
자극된 위액에 대한 내성 분석 방법
자극된 위액에 대한 락토바실러스 KCC-30의 내성은 Charteris et al에 설명된 방법을 통해 실험하였다. 위액은 펩신(3 mg/mL), 0.5% w/v 소듐 클로라이드 및 물을 사용하여 제조하였고, pH는 1 mol/L HCl을 사용하여 2 및 3으로 조정하였다. 락토바실러스 KCC-30의 신선 배양물의 30 ml를 4℃에서 20분 동안 6000 Xg로 원심분리하였고, 펠렛을 수집한 후 K2HPO4(50 mmol/L, 6.5 pH)로 3회 세척하였다. 상기 펠렛을 동일한 용액에서 재현탁시켰다. 상기 현탁액의 1 ml를 다른 pH의 위액의 9 ml에 혼합하고 3시간 동안 37℃에서 배양하였다. 전체 생균 세포를 배양 기간 전후에 세었다.
담즙 내성 분석 방법
KCC-30의 신선 배양물은 0.5% 소듐 디옥시콜레이트 및 0.3% 우담(oxgall) (DCA Sigma, St Louis, MO, USA)과 같은 담즙염을 포함하는 멸균된 MRS 배지로 접종하고 37℃에서 배양하였다. 부분 표본은 다른 시간 간격(24 및 48 시간)으로 수집하였고 흡광도는 600 nm에서 측정하였다. 담즙염 배지가 없는 MRS 배지는 대조군으로 사용되었다. 실험 결과는 대조군에 비해 담즙염의 존재에서, 600 nm에서 광학 밀도로 측정된 박테리아의 성장 백분율로 나타내었다.
자가 응집 분석 방법
상호작용 표면을 갖는 세포막의 응집은 Del Re et al에 약간의 변형을 통해 실험되었다. KCC-30 및 CB의 소수성은 Rosenberg et al1980에 의해 설명된 방법을 통해 분석되었다. 락토바실러스 KCC-30의 신선 배양물을 10분간 8000 X로 원심분리한 후, 펠렛을 약 108 CFU/mL의 농도로 PBS(pH 7)에 재현탁시켰다. 세포 현탁액 4 ml를 10초 동안 볼텍싱하여 혼합하고, 자가 응집은 실온에서 3시간 배양 동안 분석하였다. 각 시간 동안, 세포 현탁액 상층부 100 mL를 3.9 mL의 PBS와 혼합하고, 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 자가 응집은 하기 방정식에 따라 계산됨:
1-(At/A0) x 100,
상기 At는 시간 t=1, 2 또는 3에서 흡광도, A0는 t=0일 때 흡광도를 나타냄.
세포 표면 소수성 분석 방법
락토바실러스 KCC-30의 소수성은 Rosenberg et al에 설명된 방법을 통해 분석하였다. 세포 표면 소수성은 인산염 버퍼 용액으로부터 탄화수소와 함께 결합하는데 미생물의 능력과 관련된다. 하루 배양한 박테리아 배양물을 15분 동안 5000 Xg로 원심분리하였다. 세포 현탁액을 수집한 후 PBS(pH 7)로 세척하였다; 흡광도는 540 nm에서 측정하였다. 세포 현탁액의 1 ml를 탄화수소(자일렌 및 클로로폼)의 동일 부피와 혼합하였고, 흡광도를 540 nm에서 측정하였다. 30초 이후 수용성 용액을 측정하였고 초기 측정 값과 비교하였다. 소수성은 하기 식을 사용하여 계산됨:
소수성% = (OD초기-OD최종)/OD초기 X 100
지방 세포 분화 실험 방법
무세포 상청액의 제조 방법
락토바실러스 KCC-30은 48시간 동안 37℃에서 MRS 배지에 배양하고, 세포 외 이차 대사물질 생산을 위해 충분한 시간을 제공하였다. 이후, 배양된 박테리아 세포를 15분 동안 5000 g에서 원심분리하였고; 상청액 내 상기 박테리아 균주를 0.22 μm 박테리아 필터를 사용하여 제거하였다. 무세포 상청액을 동결 건조한 후, 여러가지 농도를 3T3-L1 세포에 대한 추가적인 실험을 위해 제조하였다.
3T3-L1 지방 세포의 배양 방법
마우스 3T3-L1 전구 지방 세포를 American Type Culture Collection (ATCC, USA)으로부터 수득하였다. 추가적인 단계는 Choi et al. 2007에 설명된 프로토콜에 약간의 변형을 가하여 수행되었다. 3T3-L1 전구 지방 세포를 3 x 104 세포/웰의 농도로 6개의 웰 플레이트에 놓았다. 지방 세포 분화는 100% 융합(confluence)이 달성된 이후에(즉 3일 후) 시작되었다. 10% 소태아 혈청(FBS), 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX), 0.25 μM 덱사메타손, 및 1 μg/ml 인슐린을 포함하는 DMEM 배지를 지방 세포 분화의 유도를 위해 사용하였다. 48시간 이후 배지를 10% (FBS) 및 1 μg/ml 인슐린만으로 다시 변경하였다. 48시간 이후 배지를 10% FBS만을 포함하는 것으로 다시 변경하였다. 지방 세포 생성의 FECS의 역할을 밝히기 위해, 10% FBS를 포함하는 전구 지방 세포를 수용한 DMEM 배지를 실험 기간(10일)의 종료까지 매 48시간마다 FECS의 다른 농도(250 μg, 500 μg, 1 mg, 2 mg 및 3 mg/ ml)로 혼합하였다.
세포 증식 분석 방법
세포 증식의 분석에 수용성 테트라졸리움(Water soluble tetrazolium, WST); 2(2-메톡시-4-니트로페닐)-3(-니트로페닐)-5-(2,4-디설포페닐)-2-H-테트라졸리움 모노소듐염(2(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3(-nitrophenyl)-5-(2, 4-disulfophenyl)-2-H-tetrazolium monosodium salt)을 사용하였다. 전구 지방 세포를 96 웰 내 1x105 세포/웰의 밀도로 시드하였다. 3T3-L1 세포는 KCC-30의 동결 건조된 세포 외 분비물(FECS)의 다양한 농도(250 μg, 500 μg, 1 mg, 2 mg 및 3 mg/ml)로 처리하였다. 이후, 96 웰 플레이트는 24시간 동안 5% CO2 농도에서 37℃로 유지된 CO2 배양기 내 저장하였다. 배양 이후, 배양물은 WST 시약으로 처리하였고 2-4 시간 동안 배양하였다. 그 다음 세포 생존은 스펙트럼 카운트 ELISA 리더기를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.
지방 정량을 위한 오일 레드 염색 방법
FECS로 지방 세포 분화 이후(10일에), 세포를 1시간 동안 10% 포르말린으로 고정하였고 이후 60% 이소프로판올과 함께 두 번 알콜 세척하였다. 이후 0.35% 오일 레드 O를 사용하여 세포를 실온에서 10분간 염색하였고 증류수로 두 번 세척하였다. 염색된 세포는 EVOS® XL 현미경을 사용하여 사진을 찍었다. 추가로, 오일 레드 염색은 100% 이소프로판올을 사용하여 지방 세포로부터 제거하였고 490 nm의 광학 밀도에서 정량하였다.
지방 생성 전사 인자의 qPCR 측정 방법
전체 RNA는 RNA 지방 조직 미니 키트(Qiagen, USA)를 사용하여 추출하였다. 이후 RNA를 UVS-99 마이크로 볼륨 UV/Vis 분광 광도계-ACT 유전자를 사용하여 정량하였다. 이후 cDNA는 제조자의 지시(Superscript III RT-PCR을 위한 첫 번째 가닥 합성 시스템-Invitrogen Life Technology)에 따라 합성되었다. Real-time PCR 실험은 ABI 7500 Real-Time PCR 시스템을 사용하여 수행하였다. 특정한 유전자의 발현은 SYBR 그린 real-time PCR 마스터 믹스를 사용하여 결정하였다. 이후, 20μl 반응물은 10μl SYBR green (Applied biosystems, Foster City, CA), 1μl cDNA, 1 μl 10 pmole 포워드(FP) 및 리버스 프라이머(RP)를 포함한다. 각각의 프라이머는 하기와 같다. PPARγ2-FP: gtgctccagaagatgacagac; RP: ggtgggactttcctgctaa, C/EBPα- FP: gcaggaggaagatacaggaag; RP: acagactcaaatcccaaca, Adiponectin- FP: ccgttctcttcacctacgac; RP: tccccatccccatacac, FAS- FP: cccagcccataagagttaca; RP: atcgggaagtcagcacaa. 일반적인 PCR (Gene Amp PCR system 9700)은 Maxime PCR mix kit (i-Taq) 제조자의 프로토콜에 약간의 변형을 가하여 수행되었다. 프로토콜은 94℃에서 5분, 45초 동안 95℃, 45초 동안 57-59℃, 1분 동안 72℃의 29-35 사이클, 5분 동안 72℃ 및 4℃에서 유지하였다. 최종적으로 PCR 증폭된 생산물을 1.2% 아가로스 겔에서 용해시키고, DNA는 세이프 뷰 핵산 염색(ABM- applied biological Material)을 사용하여 확인하였다. DNA 발현은 GADPH 전사 신호에 대하여 일반화하였다.
통계적 분석 방법
모든 수치 데이터는 세 번의 독립적인 실험을 통해 수득하였다. 상기 데이터의 분석은 SPSS 소프트웨어(SPSS-16 Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행하였다. 실험 결과는 평균(mean) ± 평균의 표준오차(SEM)로 나타내었다. 평균 사이의 현저한 차이는 P < 0.05의 현저한 수준으로 다변량 분석을 사용하여 분석하였다.
실험 결과
동정 및 형태학적 특성
락토바실러스 KCC-30의 생리화학적 특성은 자연상태에서 그람 양성, 원형, 부동모(non-motile) 및 중온성이다. 선택된 락토바실러스 KCC-30 균주는 16sRNA 시퀀싱하였고, 서열 정보는 NCBI 데이터베이스를 사용하여 비교하였다. 블라스트(BLAST) 결과는 동정된 락토바실러스 KCC-30 균주가 다른 L.plantarum 균주와 99% 이상의 상동성을 보여 L.plantarum에 속하는 것으로 확인하였다. 16s rRNA 시퀀싱 결과는 기탁번호 KP091746.1로 NCBI 유전자은행 데이터베이스에 제출되었다. 락토바실러스 균주는 발효 식품 생산에 오랫동안 안전하게 사용되어 왔다. 식품 제조에 있어서, 락토바실러스는 생균제 또는 생보존제로 사용될 수 있다.
생리학적 및 생화학적 특성
L. Plantarum은 숙주에 대해 비독성인 것으로 잘 알려져 있다. 결과적으로, 락토바실러스 균주는 다양한 음식물의 생산 증진에 기여하고 유제품의 생산에 주요한 역할을 수행한다. 그러나, 일반적으로 변형된 락토바실러스 균주의 사용은 사용이 제한될 수 있다. 이런 이유로, 자연으로부터 새로운 야생 균주는 새로운 젖산 박테리아를 생산하는데 필요하다. 동정된 락토바실러스 KCC-30의 탄수화물 발효는 D-아라비노스, L-아라비노스, D-리보스 및 D-자일로스 등을 잠재적으로 발효시키는 것으로 확인되었다. 또한, KCC-30는 메틸-βD-자일로피라노시드, N-아세틸글루코사민 및 알부틴 등은 발효시키지 않았다. 이러한 KCC-30 균주의 생화학적 활성은 하기 표 1에 나타내었다. 게다가 KCC-30 균주는 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 산업적으로 유용한 갈락토시다제, 글루쿠로니다제 및 글루코시다제 등과 같은 일부 세포외 효소를 생산한다.
| 번호 | 탄수화물 명칭 | KCC-30 |
| 1 | Glycerol | - |
| 2 | Erythritol | + |
| 3 | D-Arabinose | + |
| 4 | L-Arabinose | + |
| 5 | D-Ribose | + |
| 6 | D-Xylose | + |
| 7 | L-Xylose | + |
| 8 | D-Adonitol | - |
| 9 | Methyl-βD-Xylopyranoside | - |
| 10 | D-Galactose | + |
| 11 | D-Glucose | + |
| 12 | D-Fructose | - |
| 13 | D-Mannose | + |
| 14 | L-Sorbose | + |
| 15 | L-Rhamnose | + |
| 16 | Dulcitol | + |
| 17 | Inositol | + |
| 18 | D-Mannitol | + |
| 19 | D-Sorbitol | + |
| 20 | Methyl-αD-Mannopyranoside | + |
| 21 | Methyl-αD-Glucopyranoside | + |
| 22 | N-Acetylglucosamine | - |
| 23 | Amygdalin | + |
| 24 | Arbutin | - |
| 25 | Esculinferric citrate | + |
| 26 | Salicin | - |
| 27 | D-Cellobiose | + |
| 28 | D-Maltose | + |
| 29 | D-Lactose | + |
| 30 | D-Melibiose | - |
| 31 | D-Saccharose | + |
| 32 | D-Trehalose | + |
| 33 | Inulin | - |
| 34 | D-Melezitose | + |
| 35 | D-Raffinose | + |
| 36 | Amidon | - |
| 37 | Glycogen | - |
| 38 | Xylitol | + |
| 39 | Gentiobiose | + |
| 40 | D-Turanose | + |
| 41 | D-Lyxose | + |
| 42 | D-Tagatose | + |
| 43 | D-Fucose | + |
| 44 | L-Fucose | + |
| 45 | D-Arabitol | + |
| 46 | L-Arabitol | - |
| 47 | Potassium gluconate | + |
| 48 | Potassium2-keto gluconate | + |
| 49 | potassium 5-keto gluconate | - |
+: 양성 반응, -: 음성 반응
| Extracellular enzymes | KCC-30 | |
| 1 | Alkaline phosphatase | ++ |
| 2 | Esterase (C4) | +++ |
| 3 | Esterase lipase (C8) | ++ |
| 4 | Lipase (C14) | ++ |
| 5 | Leucine arylamidase | ++ |
| 6 | Valine arylamidase | ++ |
| 7 | Cystine arylamidase | + |
| 8 | Trypsin | +++ |
| 9 | -Chymotrypsin | ++ |
| 10 | Acid phosphatase | +++ |
| 11 | Naphthol-AS-biphosphohydrolase | +++ |
| 12 | -Galactosidase | ++ |
| 13 | -Galactosidase | +++ |
| 14 | -Glucuronidase | ++ |
| 15 | -Glucosidase | +++ |
| 16 | -Glucosidase | +++ |
| 17 | N-Acetyl--glucosaminidase | + |
| 18 | -Mannosidase | ++ |
| 19 | -Fucosidase | ++ |
+: 약한 생산, ++: 보통 생산, +++: 강한 생산
항생제 내성 실험
식품 발효에 생균제로써 락토바실러스의 사용은 지난 수십년간 증가되었다. 그에 따라 락토바실러스 균주의 사용은 항생제 내성에 대한 이슈가 제기되었다. KCC-30 균주의 항균성은 테트라사이클린, 니트로퓨란토인, 스트렙토마이신, 세퓨로심, 클로사실린, 암피실린, 세폭시틴, 카나마이신 및 클로람페니콜 등과 같이 일반적으로 사용되는 항생제에 대하여 실험하였다. 항생제 내성은 디스크 주위의 억제존의 직경을 측정하여 계산하였다. 락토바실러스 KCC-30 균주는 카나마이신 및 클로람페니콜 등과 같은 실험된 항생제의 대부분에 감수성을 보였다(표 3). 그러나, 이는 니트로푸란토인 및 디클로사실린 등과 같은 항생제에 대해서는 일부 내성을 보였다.
| S. No | Name of Antibiotics | Concentration(μg) | KCC-30 |
| 1 | Chloramphenicol (C) | 50 | S |
| 2 | Kanamycin (K) | 30 | S |
| 3 | Nitrofurantoin (NIT) | 50 | R |
| 4 | Tetracycline (TE) | 100 | S |
| 5 | Streptomycin (S) | 25 | S |
| 6 | Sulphafurazole (SF) | 300 | S |
| 7 | Colistin methane sulphonate (CL) | 100 | S |
| 8 | Dicloxacillin (D/C) | 1 | R |
| 9 | Ampicillin (AMP) | 10 | S |
| 10 | Amikacin (AK) | 30 | S |
| 11 | Gentamicin (GEN) | 10 | S |
| 12 | Cefoxitin (CX) | 30 | R |
| 13 | Cefalexin (CN) | 30 | S |
| 14 | Cefuroxime (CXM) | 30 | S |
| 15 | Co-Trimoxazole (COT) | 25 | R |
<8mm: 보통(Moderate)=M, >10mm: 감수성(Susceptibility)=S, R=내성(Resistant)
미량희석법(Microdilution method)을 통한 항균 활성의 측정
락토바실러스 KCC-30 균주는 F. oxysporum, A. clavatus , P. chrysogenum , S. brevicaulis 및 A. Flavus와 같은 실험된 진균 모두에 잠재적 항균 활성을 보였다(도 1). 이러한 결과는 락토바실러스 KCC-30의 세포외 생산물이 잠재적인 항균 활성을 갖는 것을 의미한다. 따라서, KCC-30 균주가 생산하는 분비물은 우수한 항균제, 농약 및 항종양제로 사용될 수 있다. 이러한 결과는 락토바실러스 KCC-30에 의한 세포외 생산물이 발효물에서 항균제로 효과적으로 사용될 수 있음을 의미한다.
생균제 특성의 측정
생균제는 장내 병원균의 수를 감소시킴으로써 위장관 질병의 위험을 감소시키는 유익한 효과를 가진다. 따라서, 생균제는 반드시 위장관 내 낮은 pH 및 담즙염에서 생존할 수 있는 능력을 가져야 한다. 도 2A에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 KCC-30 균주는 위장관 내 환경에서 낮은 pH에 대한 안정성이 우수함을 보였다. 유사하게, 락토바실러스 KCC-30 균주를 pH 2 및 pH 3의 위액에 처리하였을 때, 우수한 내성을 보였다(도 2B). 마찬가지로, 락토바실러스 KCC-30은 낮은 pH 조건에 대하여 보다 우수한 내성을 보였다. 낮은 pH 및 0.03-0.3%의 담즙염 농도에서 생존하는 미생물은 우수한 생균제로 사용될 수 있다. 마찬가지로, 락토바실러스 KCC-30 균주는 담즙염(0.3%) 및 소듐 디옥시콜레이트(0.5%)에 내성을 보였다(도 2C). 상기와 같은 결과들은 락토바실러스 KCC-30이 장내 생리학적 기능을 방해하지 않음을 나타낸다.
세포 표면 소수성 및 퇴적 속도의 측정
장내 접착은 세포 표면 및 미생물의 세포막 사이에 상호작용을 의미하며, 이는 생균제의 중요한 특성이다. 추가적으로 높은 표면 소수성 및 퇴적은 장내 생균제의 콜로니화에 필요하다. 락토바실러스 KCC-30은 탄화수소 클로로폼 및 자일렌에 우수한 접착성을 보였다. 특히 KCC-30은 탄화수소 자일렌에 대한 보다 우수한 접착성을 보였다(도 2D). 게다가 자가 응집은 바이오필름 형성으로부터 병원성 박테리아를 예방하고 장관내에서 제거한다. 실험 결과, KCC-30은 우수한 자가 응집 특성이 지속적으로 나타나는 것으로 확인되었다. 자가 응집 속도는 시간이 흐름에 따라 증가하며, 최대 3시간에 68.3%로 나타났다. 이러한 결과로부터 장관 내 환경에서 락토바실러스 KCC-30의 잠재적인 상호작용 능력을 확인할 수 있다. 따라서, 상기 결과는 KCC-30의 장내 응집 능력을 나타낸다.
3T3-L1 지방 세포(adipocyte) 증식에 FECS의 역할
미생물 이차 대사산물은 후기 생장 상(late growth phase)에서 낮은 분자량을 갖는 이차 대사의 생산물이다. 이들 이차 대사물질은 미생물의 생장 속도에는 중요하지 않으나, 자연 상태에서 다양한 생존 기능을 수행한다. 우선적으로, 미생물 이차 대사산물은 항감염 약물로 사용된다. 그러나, 이러한 대사산물들이 지방 세포의 분화에 역할을 한다는 증거는 없다. 따라서 특히 생균제 특성을 갖는 미생물 이차 대사산물이 지방 세포 분화에 역할을 하는지 밝히는 것은 매우 중요하다. 3T3-L1 지방 세포 증식에 FECS의 효과를 실험하기 위해, 6개의 웰 플레이트에(10일) 배양된 지방 전구세포를 여러 농도의 FECS(250μg, 500μg, 1mg, 2mg 및 3mg)와 함께 24시간 동안 처리하였다. 실험 결과는 지방 세포 증식의 억제가 250 μg/ml의 초기 농도에서부터 시작되는 것으로 나타났다(도 3). 최대 억제는 3 mg/ml의 농도에서 확인되었다. 게다가, 지방 세포 증식의 억제는 사용량 의존적으로 지속적으로 증가하였다. 추가적인 실험을 위해 250 μg/ml를 최소 농도로 선택하였다.
FECS에 의한 지방 축적 및 분화의 억제
지방 세포 내 지방 축적의 기초적인 메커니즘은 비만을 조절하기 위한 의학적 연구의 주요한 과제이다. 지방 세포 유사 3T3-L1 세포의 분화는 세포질 내 트리글리세라이드의 증가된 합성 및 저장에 기초한다. 오일 레드 O는 지방 세포 분화 및 트리글리세라이드 축적을 정량하는데 사용하였다. 본 실험에서는 오일 레드로 염색된 지방 세포를 현미경으로 관찰하였으며, FECS(250 μg/ml)로 처리된 지방 세포에 비해 대조군 지방 세포에서 지질 방울(lipid droplets)의 수가 보다 많은 것을 확인하였다(도 4A 및 4B). 이러한 결과는 FECS가 지방을 감소시키는 특성을 갖는 것을 나타낸다. 이러한 지방 정량 결과는 또한 지방 생성 억제자로써 FECS의 역할을 뒷받침한다(도 4C).
대조군 및 실험 지방 세포에서 유전자 발현의 Real-time PCR 분석
핵 수용체 PPARγ는 비만 및 다른 대사 질환과 관련된 지방 세포 형성에 중요한 조절자이다. 지방 세포 분화는 C/EBP, FAS 및 지방 세포 결정 및 분화 의존 인자와 같은 많은 다른 전사 인자에 의해 조절된다. 지방 세포 형성동안 PPARγ2의 활성화는 C/EBPα에 의해 조절된다. 본 실험에서는 실험 10일째 PPARγ2 및 C/EBPα의 mRNA 발현을 측정하였으며, FECS 처리된 지방 세포에서 현저한 하향 조절을 보였다(도 5A 및 5B). 이러한 실험 결과는 본 실험의 오일 레드 O 염색의 결과를 뒷받침한다. 이러한 결과는 락토바실러스 KCC-30의 FECS가 PPAR-γ 신호전달경로를 통해 지방 세포 분화를 강하게 억제함을 나타낸다.
지방 세포 분화 동안, PPARγ2 및 C/EBPα는 협동하여 지방 세포 특이적 유전자 FAS의 하나를 발현시킨다. FAS는 지방 세포 형성의 조절 및 아세틸-CoA 및 말로닐 CoA로부터 팔미테이트의 데노보(de novo) 합성을 촉진함에 주요한 역할을 수행한다. 게다가, 지방산 합성은 지방산 대사 및 세포를 통한 글루코스 흡수를 통해 지방 세포 분화를 증진시킨다. 본 실험에서는 FECS 처리가 FAS의 발현을 하향 조절함을 확인하였으며(도 5C), 이는 지방산 대사뿐만 아니라 C/EBPα의 억제를 통해 지방 형성을 현저하게 억제함을 의미한다. 아디포넥틴은 지방 세포 조직에 의해 특이적으로 생산되는 호르몬이며, 이의 발현은 지방 세포 분화의 마커로써 사용될 수 있다. 일반적으로 아디포넥틴 발현은 지방 세포 내 지질 축적의 증가와 관련된다. 본 실험에서는, FECS에 노출된 지방 세포가 아디포넥틴 mRNA 발현을 지연시키는 것으로 나타났다(도 5D). 이러한 결과는 KCC-30의 FECS가 PPARγ2 및 C/EBP-α 신호전달경로를 통해 항-지방 세포생성 특성을 나타냄을 명확하게 나타낸다.
KCC-30 균주 처리 시 사일리지의 pH 및 유기산 함량의 변화 측정
락토바실러스 KCC-30 균주를 이탈리안 라이그라스 사일리지에 처리할 때, pH 및 유기산의 함량을 대조군과 비교하여 하기 표 4에 나타내었다.
| Treatment | pH | Lactic acid (DM1)%) | Acetic acid (DM%) |
Butyric acid (DM%) |
Flieg′s score |
| Control | 4.82 | 3.106 | 0.327 | 0.971 | 58 |
| L. Plantarun KCC-30 | 3.69 | 5.547 | 0.393 | 0.093 | 100 |
1)DM: Dry matter
상기 표 4에 나타난 결과를 볼 때, 대조군(무접종구)에 비해 KCC-30 접종구는 사일리지 내 pH가 현저하게 감소되었으며, 젖산의 함량은 현저하게 증가하였다. 또한 KCC-30 접종구에서 사일리지 내 초산 함량이 증가하였으며, 부틸산의 함량은 감소하였다. 상기 실험군의 이탈리안 라이그라스 사일리지의 등급을 평가할 때, 무접종구의 등급은 보통인 반면, KCC-30 처리구의 등급은 우수로 향상되었다. 이러한 결과로부터, KCC-30 균주는 사일리지 제조 시 우수한 젖산균 첨가제로써 활용 가능성이 있는 것으로 확인되었다.
[참고문헌]
1. Valan Arasu M, Jung W, Ilavenil S, Jane1 M, Kim DH, Lee KD et al. Isolation and characterization of antifungal compound from Lactobacillus plantarum KCC-10 from forage silage with potential beneficial properties. J Appl Microbiol. 2013;15 (5);11721185.
2. Ilavenil S, Vijayakumar M, Kim DH, Arasu MV, Park HS, Ravikumar S, Choi KC. Assessment of probiotic, antifungal and cholesterol lowering properties of Pediococcus pentosaceus KCC-23 isolated from Italian ryegrass. J Sci Food Agric. 2016;96(2); 593-601.
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7. Choi KC, Lee SY, Yoo HJ, Ryu OH, Lee KW, Kim SM, Baik SH, Choi KM. Effect of PPAR-delta agonist on the expression of visfatin, adiponectin, and resistin in rat adipose tissue and 3T3-L1 adipocytes. Biochem Biophys Res Commun.2007;357 (1);62-67.
Claims (11)
- 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30(KACC92134P) 균주를 포함하는 지방 생성 억제용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 PPARγ2, C/EBPα, FAS, 및 아디포넥틴으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 지방 생성 유전자의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 지방 생성 억제용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 3T3-L1 세포가 지방 세포로 분화되는 것을 억제하는 것을 특징으로 하는 지방 생성 억제용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물, 화장품 조성물 또는 약학 조성물의 제조에 이용되는 것을 특징으로 하는 지방 생성 억제용 조성물.
- 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30(KACC92134P) 균주를 포함하며,
후자리움 옥시스포럼(Fusarium Oxysporum), 아스퍼질러스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 스코풀라리옵시스 브레비카울리스(Scopulariopsis brevicaulis) 및 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus Flavus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 병원균에 대한 항균용 조성물. - 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30(KACC92134P) 균주를 포함하는 사료용 조성물.
- 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30(KACC92134P) 균주를 포함하는 사일리지 발효용 미생물 첨가제.
- 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30(KACC92134P) 균주의 배양액을 식물체의 발효 단계에 첨가하는 것을 특징으로 하는 사일리지 제조방법.
- 제8항에 있어서, 상기 사일리지는 총체보리 또는 이탈리안 라이그라스 사일리지인 것을 특징으로 하는 사일리지 제조방법.
- 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30(KACC92134P) 균주를 포함하는 지방 생성 억제용 식품 조성물.
- 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-30(KACC92134P) 균주를 포함하는 지방 생성 억제용 화장품 조성물.
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| KR20160076171A (ko) * | 2014-12-22 | 2016-06-30 | 재단법인 베리앤바이오식품연구소 | 복분자로부터 분리한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이를 포함하는 식품 조성물 |
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