JP4535554B2 - ２次胆汁酸産生抑制剤及び飲食品 - Google Patents
２次胆汁酸産生抑制剤及び飲食品 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4535554B2 JP4535554B2 JP2000066659A JP2000066659A JP4535554B2 JP 4535554 B2 JP4535554 B2 JP 4535554B2 JP 2000066659 A JP2000066659 A JP 2000066659A JP 2000066659 A JP2000066659 A JP 2000066659A JP 4535554 B2 JP4535554 B2 JP 4535554B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acid
- candida
- bile acid
- yeast
- saccharomyces
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Alcoholic Beverages (AREA)
- Non-Alcoholic Beverages (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Dairy Products (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は大腸癌、肝癌、膵臓癌、胆石症等の予防及び治療に有用な２次胆汁酸産生抑制剤及びその飲食品への利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの肝臓においてコール酸及びケノデオキシコール酸等（１次胆汁酸）がコレステロールから合成され、グリシン又はタウリンと抱合しグリシン又はタウリン抱合型胆汁酸として胆管を通って消化管に分泌される。胆汁酸は、その界面活性作用によって飲食品中の脂質を乳化分散させ、膵液の酵素・リパーゼによる分解と吸収を促進し、回腸から能動的に再吸収される。再吸収された胆汁酸は、門脈を通って肝臓に戻り、再度、消化管に分泌され腸肝循環を構成し、この循環を繰り返す。
【０００３】
回腸からの吸収を免れた胆汁酸は、腸内細菌によって脱抱合や７α−脱水酸化、酸化、還元、エピマー化等の修飾を受けて２次胆汁酸へと変換される。この過程で生じる主要な２次胆汁酸は、デオキシコール酸とリトコール酸であり、それぞれ１次胆汁酸であるコール酸とケノデオキシコール酸の７α−脱水酸化反応によって生じる。２次胆汁酸の一部は、大腸から受動的に吸収されて肝臓に移行し１次胆汁酸と同様に腸肝循環を繰り返すが、残りの胆汁酸は糞便中へと排泄される。
【０００４】
近年、大腸管腔内の腸内細菌によって産生されるデオキシコール酸やリトコール酸などの２次胆汁酸は、大腸癌、肝癌、膵臓癌、胆管癌などの発症に深く関与していることが明らかになっている。一般に、発癌の過程は、化学発癌剤や放射線、ウィルスなどによって遺伝子に突然変異が生じるイニシエーションと、その後、プロモーターに長期間、暴露されることによって増殖と分化に異常が生じるプロモーションの２段階から成り立つと考えられている。これまでに、デオキシコール酸やリトコール酸等の２次胆汁酸は、後者の過程においてプロモーターとして作用し、大腸癌、肝癌、膵臓癌、胆管癌の発症を促進することが報告されている（Narisawa, T., et. al., J. Natl. Cancer Inst, 53, 1093-1097, 1974、Tsuda, H., et. al., Gann, 75, 871-5, 1984, Makino, T., et. al., J. Natl. Cancer Inst., 76, 967-75, 1986）。また、２次胆汁酸の発癌プロモーター活性は、１次胆汁酸に比べてはるかに強いことも示されている（Narisawa, T., et. al., J. Natl. Cancer Inst., 53, 1093-1097, 1974、Reddy, BS., et. al., Cancer Res., 37, 3238-3242, 1977）。さらに、最近、デオキシコール酸に関しては、癌以外にも胆石症の発症に関係し得ることが示されている（Marcus, SN., Heaton, KW., Gut, 29, 522-533, 1988）。
【０００５】
このように、大腸管腔内において腸内細菌によって産生されるデオキシコール酸やリトコール酸などの２次胆汁酸は、強力な発癌プロモーター活性を有すると同時に、胆石症の原因にもなり得ることから、２次胆汁酸の産生を抑制することによって、大腸癌、肝癌、膵臓癌、胆管癌、胆石症などの疾患を予防あるいは治療することが可能である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
これまでに、ペニシリン系の抗生物質であるアンピシリン（Low-Beer, TS., Nutter, S., Lancet, 2(8099), 1063-1065, 1978）、３α，１２β−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−Ｎ−メチルアミン（Roda, A., et. al., J. Pharm. Sci., 81, 237-240, 1992）、オリゴ糖の一種であるラクツロース（Magengast, FM., Eur. J. Clin. Invest., 18, 56-61, 1988）あるいは小麦糠（Lampe, JW., et. al., Gut, 34, 531-536, 1993）については、効果は弱いものの２次胆汁酸の産生を抑制することが報告されている。
【０００７】
アンピシリン及び３α，１２β−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−Ｎ−メチルアミンは、大腸管腔内において７α−脱水酸化反応を触媒する細菌を排除することによって２次胆汁酸の産生を抑制するが、長期間服用した際には耐性菌の出現や副作用の発現が問題となる。また、抗生物質を用いて、２次胆汁酸の産生に関わる細菌のみを特異的に排除することは事実上不可能であり、乳酸菌やビフィズス菌などのヒトの健康維持に重要な役割を果たしている腸内細菌も同時に排除してしまうといった重大な問題を生ずる欠点がある。
【０００８】
一方、ラクツロースや小麦糠は、主に大腸管腔内のｐＨを低下させることよって至適ｐＨが中性付近である７α−脱水酸化酵素の活性を抑制し、２次胆汁酸の産生量を低下させると考えられている。しかし、これらの物質は、有効性の面で未だ十分ではなく、疾病の予防及び治療に寄与し得る程の効果を示していない。
【０００９】
従って、本発明は、大腸癌、肝癌、膵臓癌、胆管癌、胆石症なとの疾患の予防あるいは治療に有用な、有効性及び安全性の優れた２次胆汁酸産生抑制剤を提供するものであり、また、それを利用した飲食品を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
斯かる実情に鑑み本発明者は、鋭意研究を行った結果、酵母が１次胆汁酸の２次胆汁酸への変換を抑制する作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、酵母を有効成分とする２次胆汁酸産生抑制剤及びこれを含有する飲食品を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において酵母には、酵母を培養して得られる生菌体、加熱菌体及びそれらの構成物が含まれる。
【００１３】
本発明で使用する酵母が、コール酸等の７α−水酸基を脱離する反応を阻害し、２次胆汁酸であるデオキシコール酸等の生成を阻害するということは今迄報告されていない。本発明は、酵母の１次胆汁酸の２次胆汁酸への変換を抑制阻害する作用を利用したもので、特にコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、ケノデオキシコール酸等の１次胆汁酸吸着能、あるいは酢酸、プロピオン酸、酪酸等の短鎖脂肪酸の腸内濃度上昇能に優れた酵母は、７α−水酸基脱離反応を阻害する効果が優れ好ましい。
【００１４】
酵母のうち、好ましいものとしてはイサチェンキア属、クルイベロマイセス属、ハンセニアスポラ属、サッカロミセス属、ヒポピチア属、キャンジダ属、トルラスポラ属、ピチア属及びチゴサッカロマイセス属に属する酵母が挙げられ、これらは１種又は２種以上を混合して用いることができる。
【００１５】
具体的には、イサチェンキア・オリエンタリス、クルイベロマイセス・マルキシアナス、クルイベロマイセス・ラクチス、クルイベロマイセス・サーモトレランス、ハンセニアスポラ・ウヴァラム、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ダイレンシス、サッカロミセス・エキシグース、サッカロミセス・ユニスポラス、サッカロミセス・バヤナス、ヒポピチア・ブルトニ、キャンジダ・ケフィア、キャンジダ・エチェルシー、キャンジダ・ゼイラノイデス、キャンジダ・ソラニ、キャンジダ・マルトーサ、キャンジダ・トロピカリス、キャンジダ・シリンドラシエ、キャンジダ・ユチリス、トルラスポラ・デルブルエッキー、ピチア・アノマラ、ピチア・ホルスチー及びチゴサッカロマイセス・ロキシーが好ましいものとして挙げられ、更にこれらのうち次の酵母が最適である。
【００１６】
イサチェンキア オリエンタリス（Issatchenkia orentalis）ＹＩＴ８２６６（生命工学工業技術研究所菌寄託第１７４８１号）、クルイベロマイセス マルキシアナス（Kluyveromyces marxianus）ＹＩＴ８２９２（生命工学工業技術研究所菌寄託第１７４８３号）、クルイベロマイセス ラクチス（Kluyveromyces lactis）ＹＩＴ８２６３（生命工学工業技術研究所菌寄託第１７４８２号）、クルイベロマイセス サーモトレランス（Kluyveromyces thermotolerans）ＹＩＴ８２９４（ＡＴＣＣ ２０３０９）、ハンセニアスポラ ウヴァラム（Hanseniaspora uvarum）ＹＩＴ８１６４（生命工学工業技術研究所菌寄託第１７４７８号）、サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＹＩＴ８１１６（ＡＴＣＣ ４８５５４）、サッカロミセス ダイレンシス（Saccharomyces dairensis）ＹＩＴ８１９１（ＣＢＳ ３００７）、サッカロミセス エキシグース（Saccharomyces exiguus）ＹＩＴ８１０９（ＣＢＳ ３０１９）、サッカロミセス ユニスポラス（Saccharomyces unisporus）ＹＩＴ８２２６（生命工学工業技術研究所菌寄託第１６１５１号）、サッカロミセス バヤナス（Saccharomyces bayanus）ＹＩＴ８１２８（ＣＢＳ ３８０）、ヒポピチア ブルトニ（Hyphopichia burtonii）ＹＩＴ８２９９（ＣＢＳ ２３５２）、キャンジダ ケフィア（Candida kefyr）ＹＩＴ８２３７（生命工学工業技術研究所菌寄託第１７４８０号）、キャンジダ エチェルシー（Candida etchellsii）ＹＩＴ８２７８（ＡＴＣＣ ６０１１９）、キャンジダ ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）ＹＩＴ８０１８（ＩＦＯ ０７１９）、キャンジダ ソラニ（Candida solani）ＹＩＴ８０２３（ＣＢＳ １９０８）、キャンジダ マルトーサ（Candida maltosa）ＹＩＴ８２８３（ＡＴＣＣ ２８１４０）、キャンジダ トロピカリス（Candida tropicalis）ＹＩＴ８２８６（ＣＢＳ ９４）、キャンジダ シリンドラシエ（Candida cylindracea）ＹＩＴ８２７６（ＡＴＣＣ １４８３０）、キャンジダ ユチリス（Candida utilis）ＹＩＴ８２０４（ＡＴＣＣ ９９５０）、トルラスポラ デルブルエッキー（Torulaspora delbrueckii）ＹＩＴ８３１３（ＪＣＭ ２２０４）及びＹＩＴ８１３３（ＩＦＯ １１７２）、ピチアアノマラ（Pichia anomala）ＹＩＴ８２９８（ＪＣＭ ３５８７）及びＹＩＴ８２９７（ＪＣＭ ３５８３）、ピチア ホルスチー（Pichia holstii）ＹＩＴ８０３８（ＡＴＣＣ ５８０４８）、及びチゴサッカロマイセス ロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）ＹＩＴ８１２９（ＣＢＳ ７３２）。
【００１７】
なお、これらの酵母は古くから食品（ワイン、チーズ）の製造に使用されており、人体に対して極めて安全な微生物である。また、これらの菌体は、数ミクロンの粒子なので、食感に影響する２０ミクロン以上の粒子に比べてはるかに服用し易いという特徴を有している。上記酵母の性状として、イサチェンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis）ＹＩＴ８２６６（生命工学工業技術研究所菌寄託第１７４８１号）の性状を具体的に示すと、表１の通りであって、「ザ イースト（The yeast）、第３版 N. J. W. Kreger-Van Rij, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, 1984」に記載の同種酵母の性状と同様である。
【００１８】
【表１】
【００１９】
本発明で用いる酵母は、通常の方法、例えば酵母エキスやポリペプトンを含む複合培地又は無機塩を主体とする合成培地で培養することによって製造することができる。
【００２０】
このようにして得られた酵母は、培養液をそのまま使用してもよく、遠心分離、限外濾過等の手段により回収した生菌もしくはその凍結乾燥物、又は加熱処理等を施した死菌体、更にはそれらの菌体粉砕物やその水溶性画分（菌体内容物）として使用することも可能である。また、本発明に用いる酵母は、市販のものであってもよい。
【００２１】
これらは、２次胆汁酸の産生を効果的に抑制するため、大腸癌、肝癌、膵臓癌、胆管癌等の癌疾患や胆石症等の予防もしくは治療を目的とした医薬品又は飲食品に用いることができる。
【００２２】
上記酵母は、常法に従って薬学的に許容される担体とともに種々の剤型に医薬組成物とすることができる。例えば、経口用固形製剤を調製する場合には、上記酵母に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、塩化ナトリウム、硅酸等を、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム等を、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等を、滑沢剤としては、ステアリン酸塩、ポリエチレングリコール、精製タルク、ホウ砂等を、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が例示できる。
【００２３】
経口用液体製剤を調製する場合は、上記酵母に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合、矯味剤としては上記に挙げたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００２４】
また、本発明の飲食品は、上記酵母を種々の飲食品に添加せしめることにより製造することができる。ここで好ましい飲食品としては、発酵乳、果汁飲料、スープ、せんべい、クッキー等が例示される。なお、飲食品には動物の飼料も含まれる。
【００２５】
上記の各製剤中に配合されるべき酵母の量は、これを服用すべき患者の症状によりあるいはその剤型等により一定ではないが、一般に製剤中１〜１００ｇ重量％とするのが好ましい。また、上記製剤又は飲食品の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、酵母は乾燥菌体として通常成人１日あたり約１０mg〜３０ｇ、好ましくは約１〜５ｇとすれば良く、これを１日１回又は２〜４回程度に分け投与するのが好ましい。
【００２６】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。なお、「％」は「重量％」を示す。
【００２７】
酵母の調製
ポテトデキストロース寒天スラントで保存している酵母の１白金耳を、表２に示す培地１００mLを含む坂口フラスコ（５００mL）に植菌し、３０℃で振盪培養（１２０spm）した。
２日後に１０Ｌ発酵槽（実働容積７Ｌ）に坂口フラスコ２本分を接種して３０℃にて、通気速度０．５vvm、回転速度２５０rpm、ｐＨ６．０（５Ｎの水酸化ナトリウムで自動制御）の条件下で２日間、通気攪拌培養した。
培養終了後、冷却遠心分離機を使用して菌体と上清を分けたのち、菌体を蒸留水で２度洗浄した。この洗浄菌体を２Ｌの三角フラスコに入れ、蒸留水１Ｌを加えた後、１１５℃にて１０分間オートクレーブで加熱した。この加熱菌体をそのまま凍結乾燥した。
【００２８】
【表２】
【００２９】
実施例１ 胆汁酸吸着能
試験方法；
コール酸（ＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）、ケイデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、又はデオキシコール酸（ＤＣＡ）のナトリウム塩（シグマ社製）を、最終濃度が１mMとなるようにｐＨ６．７の０．１Ｍリン酸緩衝液あるいはｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸緩衝液に溶かした。
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の凍結乾燥菌体、１００mgを１５mLの遠心チューブに取り、そこに、上で作製した胆汁酸溶液、３．５mLを加えて、３７℃で振盪（１２０spm）した。１時間後に、酵母菌体を遠心分離（１２，０００rpm、１０分間）によって沈殿させて、上清を分取した。この上清中の胆汁酸を、エンザバイルII（第一化学薬品社製）で定量し、下式から、胆汁酸吸着率を求めた。胆汁酸吸着率とは、添加した全胆汁酸に対する酵母に吸着した胆汁酸の割合（％）であり、酵母と胆汁酸の吸着の強さを示す。
【００３０】
【００３１】
表３に胆汁酸吸着率を示す。イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６は、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸及びケノデオキシコール酸を吸着し、優れた１次胆汁酸吸着能を示した。また、酵母とコール酸の吸着率は、ｐＨ６．７とｐＨ７．２の反応液においてほぼ同等の値であった。これらの結果から、酵母は大腸管腔内において１次胆汁酸と強固に結合し、腸内細菌による脱抱合や７α−脱水酸化反応を妨害することによって２次胆汁酸の産生を阻害し得ることが示された。
また、２次胆汁酸であるデオキシコール酸とも強固に結合した。このことから、酵母は、２次胆汁酸の産生を抑制すると同時に、生じた２次胆汁酸を吸着、非動化することによって、その毒性を軽減させる作用も有する。
【００３２】
【表３】
【００３３】
実施例２
実施例１と同方法で種々の酵母の胆汁酸吸着率を測定した結果を表４に示す。いずれの酵母も胆汁酸、１次胆汁酸のケノデオキシコール酸及び２次胆汁酸のデオキシコール酸の良い吸着性を示した。
【００３４】
【表４】
【００３５】
実施例３ イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の凍結乾燥菌体による２次胆汁酸産生抑制
予備試験
５週齢のWistar系雄ラット（日本クレア製）を、オリエンタル酵母社製Ｆ−２粉末飼料で７日間飼育した後、１群８匹ずつ各群間で体重差が出ないよう群分けし、表５の試験飼料を１４日間投与した。ラットは金属製ケージで個別飼いし、飼料及び水は自由に摂取させた。
【００３６】
【表５】
【００３７】
１４日間飼育後の普通食群、高胆汁酸食群の間では、摂取量及び体重増加量には有意な差は認められなかった。
【００３８】
胆汁酸量
２５mgの１２〜１４日目の凍結乾燥糞便をスクリューキャップ付試験管（１５mL）に量り取り、０．１５μmolの内部標準物質（５−β−プレグナン−３α，１７α，２０α−トリオール）と５mLのエタノールを加えて、７０℃のブロックヒーターで２時間加熱した。不溶物を遠心分離（３０００rpm、１５分間）によって沈殿させた。上清は別の試験管に移して、窒素ガス送風下で乾固した。抽出物を０．５mLのメタノールに溶かした後、０．４５μｍのフィルター（日本ミリポア社製）を通して不溶物を除いた。１０μＬのサンプルをＨＰＬＣシステム（ジャスコ社製）で以下の条件下で分離した。
【００３９】
【表６】
【００４０】
分離カラムを通過した溶出液に、反応液（０．３mM β−ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（β−ＮＡＤ+）、１mMエチレンジアミン四酢酸及び０．０５％２−メルカプトエタノールを含む１０mMリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．８）を１．０mL／分の流速で混合した。この混液を、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを充填した酵素カラム、Enzymepak（４．６mm i.d.×３５mm、ジャスコ社製）に送り、胆汁酸の脱水酸化反応に伴って生じるＮＡＤＨ（β−ＮＡＤ+の還元型）を蛍光検出器でモニターした（励起波長３４５nm、発光波長４７０nm）。
各胆汁酸は、標準品の保持時間から同定した。また、胆汁酸の濃度は、各ピークの面積から求めた。この際、内部標準物質のピーク面積から回収率を補正した。
【００４１】
測定結果を表７に示すが、コール酸を投与することによって、大腸へ到達する１次胆汁酸の量が増大し、２次胆汁酸の産生量が亢進することが明らかとなり、２次胆汁酸産生抑制剤の効果を感度良く評価できることが判明した。
【００４２】
【表７】
【００４３】
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の凍結乾燥菌体による２次胆汁酸産生抑制
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の凍結乾燥菌体を高胆汁酸食に添加して１４日間投与（５％混餌投与）した（表８）。尚、この際、エネルギー価が同等となるよに、カゼイン、蔗糖、脂質及びセルロース量で調整した。酵母菌体の投与は、試験期間中の体重増加量及び摂餌量にほとんど影響を与えなかった（表９）。
【００４４】
【表８】
【００４５】
【表９】
【００４６】
表１０及び１１に示すように、イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６を投与することによって、２次胆汁酸の糞便排泄量は約８２％、また糞中の２次胆汁酸濃度は約８４％低下した。この傾向は、特にデオキシコール酸とリトコール酸で顕著であった。一方、１次胆汁酸の糞便排泄量及び糞中濃度は、当該菌体の投与によって有意に上昇した。
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６は、１次胆汁酸から２次胆汁酸への変換を強力に抑制する作用を有していた。
【００４７】
【表１０】
【００４８】
【表１１】
【００４９】
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の凍結乾燥菌体による盲腸内ｐＨ低下
０．５ｇの１４日目の盲腸内容物を４．５mLの精製水に懸濁し、０．５mLの１０％過塩素酸水溶液を添加して４℃で一晩保存した。この懸濁液を遠心分離（９，０００rpm、１０分）して上清を分取した後、０．４５μｍのフィルター（日本ミリポア社製）を通してから、ＨＰＬＣ分析に供した。
短鎖脂肪酸は、東亜電波工業社製のＨＰＬＣシステムを用いて以下の条件で解析した。なお、ｐＨ緩衝溶液は、検出器の直前で溶離液に混合した。
【００５０】
【表１２】
【００５１】
【表１３】
【００５２】
その結果、高胆汁酸食群はｐＨ６．６５、全短鎖脂肪酸量５５．９mMであったのに対し、酵母イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６添加高胆汁酸食群は、ｐＨ６．４６（有意水準５％）、全短鎖脂肪酸量は８５．６mM（有意水準１％）と盲腸内ｐＨの低下が見られ、大腸管腔内を酸性化し腸内細菌の７α−脱水酸化酵素の活性を低下させた。
【００５３】
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の凍結乾燥菌体によるコレステロール代謝抑制
２５mgの１４日目の糞便をスクリューキャップ付試験管（１５mL）に量り取り、０．１μmolの内部標準物質（５β−コレスタン）と１Ｎ水酸化ナトリウムを含む９０％エタノール溶液、１mLを加えて、８０℃のブロックヒーターで加熱した。１時間後に、０．５mLの蒸留水を加え、中性ステロールを２．５mLの石油エーテルで２回抽出した。抽出液は、７．５mLの蒸留水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで脱水し、窒素ガス送風下で乾固した。抽出した中性ステロールは、トリメチルシリル化した後、ガスクロマトグラフィーを用いて表１４の条件で測定した。
【００５４】
【表１４】
【００５５】
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の投与によって、コレステロールの腸内代謝産物であるコプロスタノールやコプロスタノンの糞便中の濃度が有意に低下した（表１５）。これらのコレステロールの腸内代謝産物については、大腸癌等の疾患の発症に関係していることから（Suzuki, K.,et. al., Cancer Lett., 33, 307-316, 1986）、イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６は、コレステロール代謝産物の産生を抑制し、種々の疾病を予防、治療し得る。
【００５６】
【表１５】
【００５７】
実施例４ イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の菌体内容物による２次胆汁酸産生抑制
菌体内容物の調製
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の凍結乾燥菌体を０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁して、ダイノミル（シンマルエンタープライゼス社製）を用いて機械的に破砕した。この際、０．４５mm径のガラスビーズを磨砕剤として使用し、磨砕操作は、顕微鏡観察により９５％以上の菌体が破砕されるまで繰り返した。菌体破砕液を９，０００ｇで１５分間遠心分離して、上清中に菌体内容物を分離した。この菌体内容物を採集し、凍結乾燥した。
【００５８】
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の菌体内容物による２次胆汁酸産生抑制
実施例３と同方法でイサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６から調製した菌体内容物の２次胆汁酸産生抑制効果を検証した。
本試験の飼料組成は、表１６に示した。酵母菌体内容物の投与は、試験期間中の体重増加量や摂取量にほとんど影響を与えなかった。（表１７）。
【００５９】
【表１６】
【００６０】
【表１７】
【００６１】
表１８及び表１９に示すように、イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の菌体内容物を投与することによって、２次胆汁酸の糞便排泄量は約７６％、また糞中の２次胆汁酸濃度は約７０％低下した。
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の菌体内容物は、凍結乾燥菌体と同様に、１次胆汁酸から２次胆汁酸への変換を強力に抑制する作用を有していた。
【００６２】
【表１８】
【００６３】
【表１９】
【００６４】
盲腸内の全短鎖脂肪酸量及びｐＨは、高胆汁酸食群が５４．０mM、ｐＨ６．６５であったのに対し、酵母菌体内容物添加高胆汁酸食群では、６８．３mM（有意水準５％）、ｐＨ６．４６（有意水準５％）であった。よって、酵母菌体内容物は、短鎖脂肪酸量を増大させることによって大腸管腔内を酸性化し、腸内細菌の７α−脱水酸化酵素の活性を低下させる作用を有していた。
【００６５】
【表２０】
【００６６】
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の菌体内容物の投与によって、コレステロールの腸内代謝産物であるコプロスタノールやコプロスタノンの糞便中濃度が有意に低下した。このことから、イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の菌体内容物は、凍結乾燥菌体と同様、コレステロール代謝産物の産生を抑制することによっても種々の疾病の予防や治癒に寄与し得る。
【００６７】
【表２１】
【００６８】
実施例５
実施例１及び２で使用した各種酵母菌体を用いて、次の組成の飲食品を製造した。
１）健康向け食品（錠剤）
次の添加物を含有する組成物を打錠し、錠剤とした。
【００６９】
【表２２】
【００７０】
２）健康向け飲料
次の処方により健康飲料を製造した。
【００７１】
【表２３】
【００７２】
３）果汁飲料
次の処方により果汁飲料を製造した。
【００７３】
【表２４】
【００７４】
４）発酵乳
次の処方により加熱酵母菌体入り発酵乳を製造した。
１０％の脱脂粉乳と５％のグルコースを滅菌し、ラクトバチルス属細菌を植菌してヨーグルトを製造した。これに実施例１で得た加熱酵母菌体を０．１〜２０％混合し、発酵乳を製造した。
【００７５】
５）乳酒
次の処方により乳酒を製造した。
１０％の脱脂粉乳と５％のグルコースを滅菌し、ラクトバチルス属細菌を植菌すると同時に実施例１で得た酵母を植菌し、４８時間３７℃で静置培養して乳酒を製造した。
【００７６】
【発明の効果】
胆汁酸の吸着及び大腸管腔内の酸性化等を介して、２次胆汁酸の産生を強力に抑制し、本発明の２次胆汁酸産生抑制剤は、大腸癌、肝癌、膵臓癌、胆管癌、胆石症などの予防及び治療に極めて有効なものである。
【００７７】
また、本発明に用いる酵母は、古くからチーズや馬乳酒、ワイン製造等に使用されていることから明らかなように病原性のない安全な菌株である。実際に、酵母の本発明の２次胆汁酸産生抑制剤をラットに８ｇ／kg／dayで投与しても死亡例は認められず、長期間服用しても安全性には問題がない。
【００７８】
従って、本発明の２次胆汁酸産生抑制剤は、経口摂取する医薬として利用するほか、食品に混合して日常的に摂取させ、大腸癌、肝癌、膵臓癌、胆管癌、胆石症などの予防と健康増進に役立たせるのにも適した極めて有効なものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は大腸癌、肝癌、膵臓癌、胆石症等の予防及び治療に有用な２次胆汁酸産生抑制剤及びその飲食品への利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの肝臓においてコール酸及びケノデオキシコール酸等（１次胆汁酸）がコレステロールから合成され、グリシン又はタウリンと抱合しグリシン又はタウリン抱合型胆汁酸として胆管を通って消化管に分泌される。胆汁酸は、その界面活性作用によって飲食品中の脂質を乳化分散させ、膵液の酵素・リパーゼによる分解と吸収を促進し、回腸から能動的に再吸収される。再吸収された胆汁酸は、門脈を通って肝臓に戻り、再度、消化管に分泌され腸肝循環を構成し、この循環を繰り返す。
【０００３】
回腸からの吸収を免れた胆汁酸は、腸内細菌によって脱抱合や７α−脱水酸化、酸化、還元、エピマー化等の修飾を受けて２次胆汁酸へと変換される。この過程で生じる主要な２次胆汁酸は、デオキシコール酸とリトコール酸であり、それぞれ１次胆汁酸であるコール酸とケノデオキシコール酸の７α−脱水酸化反応によって生じる。２次胆汁酸の一部は、大腸から受動的に吸収されて肝臓に移行し１次胆汁酸と同様に腸肝循環を繰り返すが、残りの胆汁酸は糞便中へと排泄される。
【０００４】
近年、大腸管腔内の腸内細菌によって産生されるデオキシコール酸やリトコール酸などの２次胆汁酸は、大腸癌、肝癌、膵臓癌、胆管癌などの発症に深く関与していることが明らかになっている。一般に、発癌の過程は、化学発癌剤や放射線、ウィルスなどによって遺伝子に突然変異が生じるイニシエーションと、その後、プロモーターに長期間、暴露されることによって増殖と分化に異常が生じるプロモーションの２段階から成り立つと考えられている。これまでに、デオキシコール酸やリトコール酸等の２次胆汁酸は、後者の過程においてプロモーターとして作用し、大腸癌、肝癌、膵臓癌、胆管癌の発症を促進することが報告されている（Narisawa, T., et. al., J. Natl. Cancer Inst, 53, 1093-1097, 1974、Tsuda, H., et. al., Gann, 75, 871-5, 1984, Makino, T., et. al., J. Natl. Cancer Inst., 76, 967-75, 1986）。また、２次胆汁酸の発癌プロモーター活性は、１次胆汁酸に比べてはるかに強いことも示されている（Narisawa, T., et. al., J. Natl. Cancer Inst., 53, 1093-1097, 1974、Reddy, BS., et. al., Cancer Res., 37, 3238-3242, 1977）。さらに、最近、デオキシコール酸に関しては、癌以外にも胆石症の発症に関係し得ることが示されている（Marcus, SN., Heaton, KW., Gut, 29, 522-533, 1988）。
【０００５】
このように、大腸管腔内において腸内細菌によって産生されるデオキシコール酸やリトコール酸などの２次胆汁酸は、強力な発癌プロモーター活性を有すると同時に、胆石症の原因にもなり得ることから、２次胆汁酸の産生を抑制することによって、大腸癌、肝癌、膵臓癌、胆管癌、胆石症などの疾患を予防あるいは治療することが可能である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
これまでに、ペニシリン系の抗生物質であるアンピシリン（Low-Beer, TS., Nutter, S., Lancet, 2(8099), 1063-1065, 1978）、３α，１２β−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−Ｎ−メチルアミン（Roda, A., et. al., J. Pharm. Sci., 81, 237-240, 1992）、オリゴ糖の一種であるラクツロース（Magengast, FM., Eur. J. Clin. Invest., 18, 56-61, 1988）あるいは小麦糠（Lampe, JW., et. al., Gut, 34, 531-536, 1993）については、効果は弱いものの２次胆汁酸の産生を抑制することが報告されている。
【０００７】
アンピシリン及び３α，１２β−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−Ｎ−メチルアミンは、大腸管腔内において７α−脱水酸化反応を触媒する細菌を排除することによって２次胆汁酸の産生を抑制するが、長期間服用した際には耐性菌の出現や副作用の発現が問題となる。また、抗生物質を用いて、２次胆汁酸の産生に関わる細菌のみを特異的に排除することは事実上不可能であり、乳酸菌やビフィズス菌などのヒトの健康維持に重要な役割を果たしている腸内細菌も同時に排除してしまうといった重大な問題を生ずる欠点がある。
【０００８】
一方、ラクツロースや小麦糠は、主に大腸管腔内のｐＨを低下させることよって至適ｐＨが中性付近である７α−脱水酸化酵素の活性を抑制し、２次胆汁酸の産生量を低下させると考えられている。しかし、これらの物質は、有効性の面で未だ十分ではなく、疾病の予防及び治療に寄与し得る程の効果を示していない。
【０００９】
従って、本発明は、大腸癌、肝癌、膵臓癌、胆管癌、胆石症なとの疾患の予防あるいは治療に有用な、有効性及び安全性の優れた２次胆汁酸産生抑制剤を提供するものであり、また、それを利用した飲食品を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
斯かる実情に鑑み本発明者は、鋭意研究を行った結果、酵母が１次胆汁酸の２次胆汁酸への変換を抑制する作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、酵母を有効成分とする２次胆汁酸産生抑制剤及びこれを含有する飲食品を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において酵母には、酵母を培養して得られる生菌体、加熱菌体及びそれらの構成物が含まれる。
【００１３】
本発明で使用する酵母が、コール酸等の７α−水酸基を脱離する反応を阻害し、２次胆汁酸であるデオキシコール酸等の生成を阻害するということは今迄報告されていない。本発明は、酵母の１次胆汁酸の２次胆汁酸への変換を抑制阻害する作用を利用したもので、特にコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、ケノデオキシコール酸等の１次胆汁酸吸着能、あるいは酢酸、プロピオン酸、酪酸等の短鎖脂肪酸の腸内濃度上昇能に優れた酵母は、７α−水酸基脱離反応を阻害する効果が優れ好ましい。
【００１４】
酵母のうち、好ましいものとしてはイサチェンキア属、クルイベロマイセス属、ハンセニアスポラ属、サッカロミセス属、ヒポピチア属、キャンジダ属、トルラスポラ属、ピチア属及びチゴサッカロマイセス属に属する酵母が挙げられ、これらは１種又は２種以上を混合して用いることができる。
【００１５】
具体的には、イサチェンキア・オリエンタリス、クルイベロマイセス・マルキシアナス、クルイベロマイセス・ラクチス、クルイベロマイセス・サーモトレランス、ハンセニアスポラ・ウヴァラム、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ダイレンシス、サッカロミセス・エキシグース、サッカロミセス・ユニスポラス、サッカロミセス・バヤナス、ヒポピチア・ブルトニ、キャンジダ・ケフィア、キャンジダ・エチェルシー、キャンジダ・ゼイラノイデス、キャンジダ・ソラニ、キャンジダ・マルトーサ、キャンジダ・トロピカリス、キャンジダ・シリンドラシエ、キャンジダ・ユチリス、トルラスポラ・デルブルエッキー、ピチア・アノマラ、ピチア・ホルスチー及びチゴサッカロマイセス・ロキシーが好ましいものとして挙げられ、更にこれらのうち次の酵母が最適である。
【００１６】
イサチェンキア オリエンタリス（Issatchenkia orentalis）ＹＩＴ８２６６（生命工学工業技術研究所菌寄託第１７４８１号）、クルイベロマイセス マルキシアナス（Kluyveromyces marxianus）ＹＩＴ８２９２（生命工学工業技術研究所菌寄託第１７４８３号）、クルイベロマイセス ラクチス（Kluyveromyces lactis）ＹＩＴ８２６３（生命工学工業技術研究所菌寄託第１７４８２号）、クルイベロマイセス サーモトレランス（Kluyveromyces thermotolerans）ＹＩＴ８２９４（ＡＴＣＣ ２０３０９）、ハンセニアスポラ ウヴァラム（Hanseniaspora uvarum）ＹＩＴ８１６４（生命工学工業技術研究所菌寄託第１７４７８号）、サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＹＩＴ８１１６（ＡＴＣＣ ４８５５４）、サッカロミセス ダイレンシス（Saccharomyces dairensis）ＹＩＴ８１９１（ＣＢＳ ３００７）、サッカロミセス エキシグース（Saccharomyces exiguus）ＹＩＴ８１０９（ＣＢＳ ３０１９）、サッカロミセス ユニスポラス（Saccharomyces unisporus）ＹＩＴ８２２６（生命工学工業技術研究所菌寄託第１６１５１号）、サッカロミセス バヤナス（Saccharomyces bayanus）ＹＩＴ８１２８（ＣＢＳ ３８０）、ヒポピチア ブルトニ（Hyphopichia burtonii）ＹＩＴ８２９９（ＣＢＳ ２３５２）、キャンジダ ケフィア（Candida kefyr）ＹＩＴ８２３７（生命工学工業技術研究所菌寄託第１７４８０号）、キャンジダ エチェルシー（Candida etchellsii）ＹＩＴ８２７８（ＡＴＣＣ ６０１１９）、キャンジダ ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）ＹＩＴ８０１８（ＩＦＯ ０７１９）、キャンジダ ソラニ（Candida solani）ＹＩＴ８０２３（ＣＢＳ １９０８）、キャンジダ マルトーサ（Candida maltosa）ＹＩＴ８２８３（ＡＴＣＣ ２８１４０）、キャンジダ トロピカリス（Candida tropicalis）ＹＩＴ８２８６（ＣＢＳ ９４）、キャンジダ シリンドラシエ（Candida cylindracea）ＹＩＴ８２７６（ＡＴＣＣ １４８３０）、キャンジダ ユチリス（Candida utilis）ＹＩＴ８２０４（ＡＴＣＣ ９９５０）、トルラスポラ デルブルエッキー（Torulaspora delbrueckii）ＹＩＴ８３１３（ＪＣＭ ２２０４）及びＹＩＴ８１３３（ＩＦＯ １１７２）、ピチアアノマラ（Pichia anomala）ＹＩＴ８２９８（ＪＣＭ ３５８７）及びＹＩＴ８２９７（ＪＣＭ ３５８３）、ピチア ホルスチー（Pichia holstii）ＹＩＴ８０３８（ＡＴＣＣ ５８０４８）、及びチゴサッカロマイセス ロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）ＹＩＴ８１２９（ＣＢＳ ７３２）。
【００１７】
なお、これらの酵母は古くから食品（ワイン、チーズ）の製造に使用されており、人体に対して極めて安全な微生物である。また、これらの菌体は、数ミクロンの粒子なので、食感に影響する２０ミクロン以上の粒子に比べてはるかに服用し易いという特徴を有している。上記酵母の性状として、イサチェンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis）ＹＩＴ８２６６（生命工学工業技術研究所菌寄託第１７４８１号）の性状を具体的に示すと、表１の通りであって、「ザ イースト（The yeast）、第３版 N. J. W. Kreger-Van Rij, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, 1984」に記載の同種酵母の性状と同様である。
【００１８】
【表１】
本発明で用いる酵母は、通常の方法、例えば酵母エキスやポリペプトンを含む複合培地又は無機塩を主体とする合成培地で培養することによって製造することができる。
【００２０】
このようにして得られた酵母は、培養液をそのまま使用してもよく、遠心分離、限外濾過等の手段により回収した生菌もしくはその凍結乾燥物、又は加熱処理等を施した死菌体、更にはそれらの菌体粉砕物やその水溶性画分（菌体内容物）として使用することも可能である。また、本発明に用いる酵母は、市販のものであってもよい。
【００２１】
これらは、２次胆汁酸の産生を効果的に抑制するため、大腸癌、肝癌、膵臓癌、胆管癌等の癌疾患や胆石症等の予防もしくは治療を目的とした医薬品又は飲食品に用いることができる。
【００２２】
上記酵母は、常法に従って薬学的に許容される担体とともに種々の剤型に医薬組成物とすることができる。例えば、経口用固形製剤を調製する場合には、上記酵母に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、塩化ナトリウム、硅酸等を、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム等を、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等を、滑沢剤としては、ステアリン酸塩、ポリエチレングリコール、精製タルク、ホウ砂等を、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が例示できる。
【００２３】
経口用液体製剤を調製する場合は、上記酵母に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合、矯味剤としては上記に挙げたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００２４】
また、本発明の飲食品は、上記酵母を種々の飲食品に添加せしめることにより製造することができる。ここで好ましい飲食品としては、発酵乳、果汁飲料、スープ、せんべい、クッキー等が例示される。なお、飲食品には動物の飼料も含まれる。
【００２５】
上記の各製剤中に配合されるべき酵母の量は、これを服用すべき患者の症状によりあるいはその剤型等により一定ではないが、一般に製剤中１〜１００ｇ重量％とするのが好ましい。また、上記製剤又は飲食品の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、酵母は乾燥菌体として通常成人１日あたり約１０mg〜３０ｇ、好ましくは約１〜５ｇとすれば良く、これを１日１回又は２〜４回程度に分け投与するのが好ましい。
【００２６】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。なお、「％」は「重量％」を示す。
【００２７】
酵母の調製
ポテトデキストロース寒天スラントで保存している酵母の１白金耳を、表２に示す培地１００mLを含む坂口フラスコ（５００mL）に植菌し、３０℃で振盪培養（１２０spm）した。
２日後に１０Ｌ発酵槽（実働容積７Ｌ）に坂口フラスコ２本分を接種して３０℃にて、通気速度０．５vvm、回転速度２５０rpm、ｐＨ６．０（５Ｎの水酸化ナトリウムで自動制御）の条件下で２日間、通気攪拌培養した。
培養終了後、冷却遠心分離機を使用して菌体と上清を分けたのち、菌体を蒸留水で２度洗浄した。この洗浄菌体を２Ｌの三角フラスコに入れ、蒸留水１Ｌを加えた後、１１５℃にて１０分間オートクレーブで加熱した。この加熱菌体をそのまま凍結乾燥した。
【００２８】
【表２】
実施例１ 胆汁酸吸着能
試験方法；
コール酸（ＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）、ケイデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、又はデオキシコール酸（ＤＣＡ）のナトリウム塩（シグマ社製）を、最終濃度が１mMとなるようにｐＨ６．７の０．１Ｍリン酸緩衝液あるいはｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸緩衝液に溶かした。
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の凍結乾燥菌体、１００mgを１５mLの遠心チューブに取り、そこに、上で作製した胆汁酸溶液、３．５mLを加えて、３７℃で振盪（１２０spm）した。１時間後に、酵母菌体を遠心分離（１２，０００rpm、１０分間）によって沈殿させて、上清を分取した。この上清中の胆汁酸を、エンザバイルII（第一化学薬品社製）で定量し、下式から、胆汁酸吸着率を求めた。胆汁酸吸着率とは、添加した全胆汁酸に対する酵母に吸着した胆汁酸の割合（％）であり、酵母と胆汁酸の吸着の強さを示す。
【００３０】
表３に胆汁酸吸着率を示す。イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６は、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸及びケノデオキシコール酸を吸着し、優れた１次胆汁酸吸着能を示した。また、酵母とコール酸の吸着率は、ｐＨ６．７とｐＨ７．２の反応液においてほぼ同等の値であった。これらの結果から、酵母は大腸管腔内において１次胆汁酸と強固に結合し、腸内細菌による脱抱合や７α−脱水酸化反応を妨害することによって２次胆汁酸の産生を阻害し得ることが示された。
また、２次胆汁酸であるデオキシコール酸とも強固に結合した。このことから、酵母は、２次胆汁酸の産生を抑制すると同時に、生じた２次胆汁酸を吸着、非動化することによって、その毒性を軽減させる作用も有する。
【００３２】
【表３】
実施例２
実施例１と同方法で種々の酵母の胆汁酸吸着率を測定した結果を表４に示す。いずれの酵母も胆汁酸、１次胆汁酸のケノデオキシコール酸及び２次胆汁酸のデオキシコール酸の良い吸着性を示した。
【００３４】
【表４】
実施例３ イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の凍結乾燥菌体による２次胆汁酸産生抑制
予備試験
５週齢のWistar系雄ラット（日本クレア製）を、オリエンタル酵母社製Ｆ−２粉末飼料で７日間飼育した後、１群８匹ずつ各群間で体重差が出ないよう群分けし、表５の試験飼料を１４日間投与した。ラットは金属製ケージで個別飼いし、飼料及び水は自由に摂取させた。
【００３６】
【表５】
１４日間飼育後の普通食群、高胆汁酸食群の間では、摂取量及び体重増加量には有意な差は認められなかった。
【００３８】
胆汁酸量
２５mgの１２〜１４日目の凍結乾燥糞便をスクリューキャップ付試験管（１５mL）に量り取り、０．１５μmolの内部標準物質（５−β−プレグナン−３α，１７α，２０α−トリオール）と５mLのエタノールを加えて、７０℃のブロックヒーターで２時間加熱した。不溶物を遠心分離（３０００rpm、１５分間）によって沈殿させた。上清は別の試験管に移して、窒素ガス送風下で乾固した。抽出物を０．５mLのメタノールに溶かした後、０．４５μｍのフィルター（日本ミリポア社製）を通して不溶物を除いた。１０μＬのサンプルをＨＰＬＣシステム（ジャスコ社製）で以下の条件下で分離した。
【００３９】
【表６】
分離カラムを通過した溶出液に、反応液（０．３mM β−ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（β−ＮＡＤ+）、１mMエチレンジアミン四酢酸及び０．０５％２−メルカプトエタノールを含む１０mMリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．８）を１．０mL／分の流速で混合した。この混液を、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを充填した酵素カラム、Enzymepak（４．６mm i.d.×３５mm、ジャスコ社製）に送り、胆汁酸の脱水酸化反応に伴って生じるＮＡＤＨ（β−ＮＡＤ+の還元型）を蛍光検出器でモニターした（励起波長３４５nm、発光波長４７０nm）。
各胆汁酸は、標準品の保持時間から同定した。また、胆汁酸の濃度は、各ピークの面積から求めた。この際、内部標準物質のピーク面積から回収率を補正した。
【００４１】
測定結果を表７に示すが、コール酸を投与することによって、大腸へ到達する１次胆汁酸の量が増大し、２次胆汁酸の産生量が亢進することが明らかとなり、２次胆汁酸産生抑制剤の効果を感度良く評価できることが判明した。
【００４２】
【表７】
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の凍結乾燥菌体による２次胆汁酸産生抑制
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の凍結乾燥菌体を高胆汁酸食に添加して１４日間投与（５％混餌投与）した（表８）。尚、この際、エネルギー価が同等となるよに、カゼイン、蔗糖、脂質及びセルロース量で調整した。酵母菌体の投与は、試験期間中の体重増加量及び摂餌量にほとんど影響を与えなかった（表９）。
【００４４】
【表８】
【表９】
表１０及び１１に示すように、イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６を投与することによって、２次胆汁酸の糞便排泄量は約８２％、また糞中の２次胆汁酸濃度は約８４％低下した。この傾向は、特にデオキシコール酸とリトコール酸で顕著であった。一方、１次胆汁酸の糞便排泄量及び糞中濃度は、当該菌体の投与によって有意に上昇した。
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６は、１次胆汁酸から２次胆汁酸への変換を強力に抑制する作用を有していた。
【００４７】
【表１０】
【表１１】
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の凍結乾燥菌体による盲腸内ｐＨ低下
０．５ｇの１４日目の盲腸内容物を４．５mLの精製水に懸濁し、０．５mLの１０％過塩素酸水溶液を添加して４℃で一晩保存した。この懸濁液を遠心分離（９，０００rpm、１０分）して上清を分取した後、０．４５μｍのフィルター（日本ミリポア社製）を通してから、ＨＰＬＣ分析に供した。
短鎖脂肪酸は、東亜電波工業社製のＨＰＬＣシステムを用いて以下の条件で解析した。なお、ｐＨ緩衝溶液は、検出器の直前で溶離液に混合した。
【００５０】
【表１２】
【表１３】
その結果、高胆汁酸食群はｐＨ６．６５、全短鎖脂肪酸量５５．９mMであったのに対し、酵母イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６添加高胆汁酸食群は、ｐＨ６．４６（有意水準５％）、全短鎖脂肪酸量は８５．６mM（有意水準１％）と盲腸内ｐＨの低下が見られ、大腸管腔内を酸性化し腸内細菌の７α−脱水酸化酵素の活性を低下させた。
【００５３】
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の凍結乾燥菌体によるコレステロール代謝抑制
２５mgの１４日目の糞便をスクリューキャップ付試験管（１５mL）に量り取り、０．１μmolの内部標準物質（５β−コレスタン）と１Ｎ水酸化ナトリウムを含む９０％エタノール溶液、１mLを加えて、８０℃のブロックヒーターで加熱した。１時間後に、０．５mLの蒸留水を加え、中性ステロールを２．５mLの石油エーテルで２回抽出した。抽出液は、７．５mLの蒸留水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで脱水し、窒素ガス送風下で乾固した。抽出した中性ステロールは、トリメチルシリル化した後、ガスクロマトグラフィーを用いて表１４の条件で測定した。
【００５４】
【表１４】
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の投与によって、コレステロールの腸内代謝産物であるコプロスタノールやコプロスタノンの糞便中の濃度が有意に低下した（表１５）。これらのコレステロールの腸内代謝産物については、大腸癌等の疾患の発症に関係していることから（Suzuki, K.,et. al., Cancer Lett., 33, 307-316, 1986）、イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６は、コレステロール代謝産物の産生を抑制し、種々の疾病を予防、治療し得る。
【００５６】
【表１５】
実施例４ イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の菌体内容物による２次胆汁酸産生抑制
菌体内容物の調製
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の凍結乾燥菌体を０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁して、ダイノミル（シンマルエンタープライゼス社製）を用いて機械的に破砕した。この際、０．４５mm径のガラスビーズを磨砕剤として使用し、磨砕操作は、顕微鏡観察により９５％以上の菌体が破砕されるまで繰り返した。菌体破砕液を９，０００ｇで１５分間遠心分離して、上清中に菌体内容物を分離した。この菌体内容物を採集し、凍結乾燥した。
【００５８】
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の菌体内容物による２次胆汁酸産生抑制
実施例３と同方法でイサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６から調製した菌体内容物の２次胆汁酸産生抑制効果を検証した。
本試験の飼料組成は、表１６に示した。酵母菌体内容物の投与は、試験期間中の体重増加量や摂取量にほとんど影響を与えなかった。（表１７）。
【００５９】
【表１６】
【表１７】
表１８及び表１９に示すように、イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の菌体内容物を投与することによって、２次胆汁酸の糞便排泄量は約７６％、また糞中の２次胆汁酸濃度は約７０％低下した。
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の菌体内容物は、凍結乾燥菌体と同様に、１次胆汁酸から２次胆汁酸への変換を強力に抑制する作用を有していた。
【００６２】
【表１８】
【表１９】
盲腸内の全短鎖脂肪酸量及びｐＨは、高胆汁酸食群が５４．０mM、ｐＨ６．６５であったのに対し、酵母菌体内容物添加高胆汁酸食群では、６８．３mM（有意水準５％）、ｐＨ６．４６（有意水準５％）であった。よって、酵母菌体内容物は、短鎖脂肪酸量を増大させることによって大腸管腔内を酸性化し、腸内細菌の７α−脱水酸化酵素の活性を低下させる作用を有していた。
【００６５】
【表２０】
イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の菌体内容物の投与によって、コレステロールの腸内代謝産物であるコプロスタノールやコプロスタノンの糞便中濃度が有意に低下した。このことから、イサチェンキア オリエンタリスＹＩＴ８２６６の菌体内容物は、凍結乾燥菌体と同様、コレステロール代謝産物の産生を抑制することによっても種々の疾病の予防や治癒に寄与し得る。
【００６７】
【表２１】
実施例５
実施例１及び２で使用した各種酵母菌体を用いて、次の組成の飲食品を製造した。
１）健康向け食品（錠剤）
次の添加物を含有する組成物を打錠し、錠剤とした。
【００６９】
【表２２】
２）健康向け飲料
次の処方により健康飲料を製造した。
【００７１】
【表２３】
３）果汁飲料
次の処方により果汁飲料を製造した。
【００７３】
【表２４】
４）発酵乳
次の処方により加熱酵母菌体入り発酵乳を製造した。
１０％の脱脂粉乳と５％のグルコースを滅菌し、ラクトバチルス属細菌を植菌してヨーグルトを製造した。これに実施例１で得た加熱酵母菌体を０．１〜２０％混合し、発酵乳を製造した。
【００７５】
５）乳酒
次の処方により乳酒を製造した。
１０％の脱脂粉乳と５％のグルコースを滅菌し、ラクトバチルス属細菌を植菌すると同時に実施例１で得た酵母を植菌し、４８時間３７℃で静置培養して乳酒を製造した。
【００７６】
【発明の効果】
胆汁酸の吸着及び大腸管腔内の酸性化等を介して、２次胆汁酸の産生を強力に抑制し、本発明の２次胆汁酸産生抑制剤は、大腸癌、肝癌、膵臓癌、胆管癌、胆石症などの予防及び治療に極めて有効なものである。
【００７７】
また、本発明に用いる酵母は、古くからチーズや馬乳酒、ワイン製造等に使用されていることから明らかなように病原性のない安全な菌株である。実際に、酵母の本発明の２次胆汁酸産生抑制剤をラットに８ｇ／kg／dayで投与しても死亡例は認められず、長期間服用しても安全性には問題がない。
【００７８】
従って、本発明の２次胆汁酸産生抑制剤は、経口摂取する医薬として利用するほか、食品に混合して日常的に摂取させ、大腸癌、肝癌、膵臓癌、胆管癌、胆石症などの予防と健康増進に役立たせるのにも適した極めて有効なものである。
Claims (1)
- イサチェンキア・オリエンタリス、クルイベロマイセス・マルキシアナス、クルイベロマイセス・サーモトレランス、ハンセニアスポラ・ウヴァラム、サッカロミセス・ダイレンシス、サッカロミセス・エキシグース、サッカロミセス・ユニスポラス、サッカロミセス・バヤナス、ヒポピチア・ブルトニ、キャンジダ・ケフィア、キャンジダ・エチェルシー、キャンジダ・ゼイラノイデス、キャンジダ・ソラニ、キャンジダ・マルトーサ、キャンジダ・トロピカリス、キャンジダ・シリンドラシエ、キャンジダ・ユチリス、トルラスポラ・デルブルエッキー、ピチア・アノマラ、ピチア・ホルスチー及びチゴサッカロマイセス・ロキシーから選ばれる１種又は２種以上の酵母を有効成分とする２次胆汁酸産生抑制剤。
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000066659A JP4535554B2 (ja) | 2000-03-10 | 2000-03-10 | ２次胆汁酸産生抑制剤及び飲食品 |
| EP00946404A EP1206939B1 (en) | 1999-07-21 | 2000-07-19 | Cholesterol-lowering agents, secondary bile acid procuction inhibitors and foods and drinks |
| US10/031,569 US7101544B1 (en) | 1999-07-21 | 2000-07-19 | Cholesterol-lowering agents, secondary bile acid production inhibitors, and foods and drinks |
| AU60205/00A AU774978B2 (en) | 1999-07-21 | 2000-07-19 | Cholesterol-lowering agents, secondary bile acid procuction inhibitors and foods and drinks |
| DE60040548T DE60040548D1 (de) | 1999-07-21 | 2000-07-19 | Mittel zur senkung von cholesterin, mittel zur hemmung der produktion von sekundären gallensäuren, nahrungsmittel und getränke |
| KR1020027000570A KR100717742B1 (ko) | 1999-07-21 | 2000-07-19 | 콜레스테롤 저하제，2차 담즙산 생산 억제제 및 음식품 |
| CNB008106746A CN100356927C (zh) | 1999-07-21 | 2000-07-19 | 降胆固醇剂,胆酸次级产生抑制剂,以及食品和饮料 |
| PCT/JP2000/004843 WO2001005412A1 (fr) | 1999-07-21 | 2000-07-19 | Agents de reduction du cholesterol, inhibiteurs de production d'acide biliaire secondaire, aliments et boissons |
| US11/176,398 US7413740B2 (en) | 1999-07-21 | 2005-07-08 | Cholesterol-lowering agents, secondary bile acid production inhibitors and foods and drinks |
| US12/125,545 US7754204B2 (en) | 1999-07-21 | 2008-05-22 | Cholesterol-lowering agents, secondary bile acid production inhibitors and foods and drinks |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000066659A JP4535554B2 (ja) | 2000-03-10 | 2000-03-10 | ２次胆汁酸産生抑制剤及び飲食品 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001253829A JP2001253829A (ja) | 2001-09-18 |
| JP2001253829A5 JP2001253829A5 (ja) | 2006-06-15 |
| JP4535554B2 true JP4535554B2 (ja) | 2010-09-01 |
Family
ID=18585985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000066659A Expired - Fee Related JP4535554B2 (ja) | 1999-07-21 | 2000-03-10 | ２次胆汁酸産生抑制剤及び飲食品 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4535554B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004244365A (ja) * | 2003-02-13 | 2004-09-02 | Hokkaido Technology Licence Office Co Ltd | 二次胆汁酸の生成抑制剤 |
| JP6133005B2 (ja) * | 2010-02-25 | 2017-05-24 | 富士フイルム株式会社 | 一次胆汁酸及び二次胆汁酸生成調節剤 |
| JP6261031B2 (ja) * | 2012-10-30 | 2018-01-17 | 興人ライフサイエンス株式会社 | トルラ酵母由来グルコシルセラミドの大腸癌抑制剤としての利用 |
| US9856507B2 (en) | 2013-02-12 | 2018-01-02 | Japanese Foundation For Cancer Research | Method for screening food ingredients and food compositions |
| WO2014126044A1 (ja) * | 2013-02-12 | 2014-08-21 | 公益財団法人がん研究会 | 発がんリスクの検査方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0465360B2 (ja) * | 1981-06-30 | 1992-10-19 | Tokyo Shibaura Electric Co | |
| JPH08242812A (ja) * | 1995-03-09 | 1996-09-24 | Rikagaku Kenkyusho | 機能性食品 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2992945B2 (ja) * | 1994-03-11 | 1999-12-20 | カルピス株式会社 | ラクトバチルス・アシドフィルス乳酸菌 |
| JP3572103B2 (ja) * | 1994-07-29 | 2004-09-29 | 株式会社ヤクルト本社 | 二次胆汁酸低下剤 |
-
2000
- 2000-03-10 JP JP2000066659A patent/JP4535554B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0465360B2 (ja) * | 1981-06-30 | 1992-10-19 | Tokyo Shibaura Electric Co | |
| JPH08242812A (ja) * | 1995-03-09 | 1996-09-24 | Rikagaku Kenkyusho | 機能性食品 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001253829A (ja) | 2001-09-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6284243B1 (en) | Physiologically functional food having brain function-improving, learning ability-enhancing, and memory-enhancing functions | |
| JP6479768B2 (ja) | 新規ラクトバチラス・パラカゼイ株 | |
| JP4336992B2 (ja) | 血中コレステロール低減作用を有する新規乳酸菌 | |
| US7754204B2 (en) | Cholesterol-lowering agents, secondary bile acid production inhibitors and foods and drinks | |
| JPS615022A (ja) | 腸内細菌叢改善剤 | |
| AU2019260952B2 (en) | Composition for inhibiting fat accumulation | |
| AU2005232497A1 (en) | Preventive and/or therapeutic agent for inflammatory bowel diseases | |
| JP6990303B2 (ja) | Ｍｅｇａｍｏｎａｓ ｆｕｎｉｆｏｒｍｉｓ及びその適用 | |
| JPH09194384A (ja) | ミネラル吸収促進剤 | |
| KR100435168B1 (ko) | 내산성 유산균을 함유하는 발효음료 | |
| JP2003306436A (ja) | 血清コレステロール上昇抑制剤 | |
| JP4535554B2 (ja) | ２次胆汁酸産生抑制剤及び飲食品 | |
| EP3511406A1 (en) | Faecalibacterium longum and application thereof | |
| EP2419506B1 (en) | Bacterial strains having an outstanding ability to produce menaquinone | |
| CN110062806B (zh) | 粪厌氧棒杆菌(Anaerostipes caccae)及其应用 | |
| KR20090043758A (ko) | 지방간 개선제 조성물 | |
| JP4011938B2 (ja) | 脂質代謝改善剤及びそれを含有する食品 | |
| JP5451703B2 (ja) | Ｉｉ型肺胞上皮細胞活性剤 | |
| JPH0899888A (ja) | グルタチオンペルオキシダーゼ活性化剤 | |
| JP4065360B2 (ja) | コレステロール低下剤及び飲食品 | |
| KR100930251B1 (ko) | 혈중 콜레스테롤 저하능을 갖는 비피도박테리움 롱검 균주 | |
| JP2002053472A (ja) | 脂質過酸化抑制剤 | |
| KR101120670B1 (ko) | 산약 발효물을 포함하는 혈류 개선용 조성물, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 건강기능식품 | |
| AU2022237933A1 (en) | Glycoside inhibitors of yeast | |
| JP2847204B2 (ja) | 生産体としてのフサリウム菌類株の利用及びその適応原及び免疫変成効果を有する塩基に基づいた製法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060421 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060421 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20060421 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091013 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091210 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100525 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100615 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130625 Year of fee payment: 3 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |