KR20220045692A - 알파-글루코시다아제 저해제를 생산하는 신규한 바실러스 코아귤란스 cc 균주 - Google Patents

알파-글루코시다아제 저해제를 생산하는 신규한 바실러스 코아귤란스 cc 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 신규한 바실러스 코아귤란스 CC (Bacillus coagulans CC)(KCTC14267BP) 균주는, 혐기성 조건에서도 서식이 가능한 신균주로서, 장내에서 알파-글루코시다아제 저해제를 생산하여 공급하므로 알파-글루코시다아제 및 이의 주된 성분인 1-데옥시노지리마이신 (1-deoxynojirimycin)가 작용하는 소장내에서 유효 농도를 일정하게 유지하여 단당류의 흡수 저해를 극대화 할 수 있어 체중 감량 및 혈당 강하 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명의 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (KCTC14267BP)는 장내에 고착하지 않고 일시적으로 서식하는 특성을 나타내 필요에 따라 투여된 균주 또는 균주가 생산한 알파-글루코시다아제 저해제 및 이의 주된 성분인 1-데옥시노지리마이신 (1-deoxynojirimycin)는 일정 시간 후 배출이 가능하여 안전하게 사용할 수 있다. 미생물을 이용한 알파-글루코시다아제 저해제 생산의 경우 발효비용, 정제비용 등 생산비의 부담이 크고 많은 노동력을 필요로 하나 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (KCTC14267BP)를 사용하면 알파-글루코시다아제 저해제 및 이의 주된 성분인 1-데옥시노지리마이신 (1-deoxynojirimycin)를 장에서 생산하여 공급하므로 포자 생산비용 이외의 별도의 발효비용 및 가공비가 필요하지 않아 생산비용을 절감 할수 있고, 발효취 등의 문제가 발생하지 않아 다양한 형태의 식품, 사료 및 약학 조성물에 적용이 가능하다.

Description

알파-글루코시다아제 저해제를 생산하는 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 균주{A novel Bacillus coagulans CC strain having high productivity for alpha glucosidase inhibitor}
본 발명은 장내에서 알파-글루코시다아제 (α-glucosidase) 저해제를 다량 생산하는 신균주인 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (Bacillus coagulans CC)(KCTC14267BP) 및 이의 용도에 관한 것이다.
탄수화물은 체내에서 소화가 되면서 맥아당과 같은 이당류로 분해가 되고 이어서 알파-글루코시다아제라는 효소에 의해 포도당과 같은 단당류로 분해가 되어 혈관으로 흡수가 된다. 이 과정에서 알파-글루코시다아제의 작용을 저해하면 이당류의 분해가 지연되어 당류의 흡수를 제어 할 수 있게 된다. 따라서 알파-글루코시다아제 저해제는 식후의 과혈당을 현저하게 억제하므로 당뇨병, 비만 등의 예방 또는 개선에 유효하다.
알파-글루코시다아제 저해제는 일부의 식물이나 미생물 등에 분포한다. 식물 기원의 알파-글루코시다아제 저해제로는 뽕잎에 함유된 아자당 (aza sugar)류, 콩에 함유된 이소플라본 (isoflavone) 및 플라본 배당체 (flavone glycoside) 등이 알려져 있으며 (비특허문헌 001), 미생물 기원의 알파-글루코시다아제 저해제로는 악티노플라네스속 (Actinoplanes) 균주 기원의 유사올리고당 (pseudooligosaccharide), 스트렙토미세스속 (Streptomyces) 또는 바실러스속 (Bacillus) 등의 미생물이 생산하는 1-데옥시노지리마이신 (1-deoxynojirimycin), 트리스 염 (tris base) 등이 알려져 있으며 (비특허문헌 002, 003), 의약품으로는 수종의 알파-글루코시다아제 저해제들이 이미 당뇨병 치료제로서 시판되고 있다 (비특허문헌 004).
최근, 1-데옥시노지리마이신으로 대표되는 뽕잎 추출물이나 낫토 등 천연물 기원의 알파-글루코시다아제 저해제의 효능 검정을 위한 연구가 다수 진행되고 있다 (비특허문헌 005). 이와 더불어 이들의 1차 가공품 또는 추출물이 대량으로 생산이 되고 있으나 공통적으로 냄새, 색택과 같은 기호성을 떨어뜨리는 인자를 가지고 있으므로 제품의 다양화에 제한이 있다 (특허문헌 001, 002, 003). 또한, 이들은 식물 또는 미생물이 생산한 이차대사산물을 이용하는 경우이므로 유효성분의 농도가 낮아 하루에 수회 일정량을 복용하여야 소기의 목적을 달성할 수 있는 단점이 있다 (특허문헌 003, 004).
한편, 통성 혐기성균은 동물의 장내와 같은 혐기적인 조건에서 증식할 수 있다. 따라서 알파-글루코시다아제 저해제를 생산하는 능력이 있는 통성 혐기성균은 장내에서 증식하며 끊임없이 장내 환경에 알파-글루코시다아제 저해제를 생산하여 공급할 것으로 예상된다. 미생물을 이용한 알파-글루코시다아제 제해제의 생산에 이용되는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)균주는 호기성 균으로 장내에서 증식하기 힘들기 때문에 알파-글루코시다아제 저해제를 장내에서 공급하기는 어려운 실정이다 (비특허문헌 002). 지금까지의 알파-글루코시다아제 저해제를 둘러싼 기술을 예의 주시하여 안전성이 높고 포자를 형성하여 장내에 도달능력이 높으며 장내에서 알파-글루코시다아제 저해제를 다량 생산하는 것을 목표로 연구를 거듭한 결과 장내에서 다량의 알파-글루코시다아제 저해제를 생산하는 균주를 분리하는데 성공하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
한국등록특허 1007082860000 한국공개특허 1020170142635 한국공개특허 1020120107254 일본공개특허 P2020-68671A
α-glucosidase inhibitors from plants: A natural approach to treat diabetes; Pharmacogn. Rev. 2011 Jan-Jun; 5(9): 19-29 Enhanced production of α-glucosidase inhibitor by a newly isolated strain of Bacillus subtilis B2 using response surface methodology; FOOD AND BIOPRODUCTS PROCESSING 2013 Vol. 91 No. 3 264p-270p 알파글루코시다아제저해제 1-deoxynojirimycin을 생산하는 Bacillus 균주의 분리 및 동정; Korean J. Microbiol. Biotechnol. 2011 Vol. 39, No. 1, 49-55 α-Glucosidase inhibitors and their use in clinical practice; Arch. Med. Sci. 2012 8(5): 899-906 Intake of mulberry 1-deoxynojirimycin prevents diet-induced obesity through increases in adiponectin in mice; Food Chemistry, 2013 Vol. 139, 16-23
본 발명의 발명자들은 알파-글루코시다아제 저해 활성이 강하고 장내에서 생육 가능한 미생물을 선발하고자 광범위한 자연계의 시료로부터 주의 깊게 탐색하였다. 그 결과, 알파-글루코시다아제 저해 활성을 나타내는 미생물들 중에서 통성 혐기성이고 포자를 형성하며 안전한 균으로서 동물의 장내에서 알파-글루코시다아제 저해제 및 이의 주된 성분인 1-데옥시노지리마이신 (1-deoxynojirimycin)를 다량으로 생산하는 신규한 바실러스 코아귤란스 CC (Bacillus coagulans CC)(KCTC14267BP) 균주를 분리 및 동정하였다. 상기 미생물의 발효물 또는 포자를 포함한 영양세포는 체중 감량, 혈당 강하, 당뇨 및 변비 해소 등의 목적으로 식품, 의약품 및 사료 등에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 이에, 본 발명에서는 알파-글루코시다아제 저해제를 다량 생산하는 신규한 균주인 바실러스 코아귤란스 CC (Bacillus coagulans CC)(KCTC14267BP)균주에 관한 기술 내용을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기한 바와 같은 기술적 과제를 달성하기 위해서 본 발명은, 알파-글루코시다아제 저해제를 생산하는 능력이 향상된 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (Bacillus coagulans CC, 수탁번호 KCTC14267BP)를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 혐기성인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 균주가 투여된 후 생물체로부터 2 내지 4주 이내에 배설되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 장내에서 알파-글루코시다아제 저해제를 생산하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 장내에서 생산된 알파-글루코시다아제 저해제는 균주가 투여된 후 생물체로부터 2 내지 4주 이내에 배설되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 알파-글루코시다아제 저해제는 1-데옥시노지리마이신 (1-deoxynojirimycin)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (Bacillus coagulans CC, 수탁번호 KCTC14267BP) 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는, 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (Bacillus coagulans CC, 수탁번호 KCTC14267BP) 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 균 (Bacillus coagulans CC, 수탁번호 KCTC14267BP) 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 균 (Bacillus coagulans CC, 수탁번호 KCTC14267BP) 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 고혈당 또는 당뇨의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (Bacillus coagulans CC, 수탁번호 KCTC14267BP) 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 고혈당 또는 당뇨의 예방 및 개선용 사료 조성물을 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (Bacillus coagulans CC, 수탁번호 KCTC14267BP) 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 고혈당 또는 당뇨의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 바실러스 코아귤란스 CC (Bacillus coagulans CC)(KCTC14267BP)균주는, 혐기성 조건에서도 서식이 가능한 신균주로서, 장내에서 알파-글루코시다아제 저해제를 생산하여 공급하므로 알파-글루코시다아제 및 이의 유효성분인 1-데옥시노지리마이신 (1-deoxynojirimycin)이 작용하는 소장내에서 유효 농도를 일정하게 유지하여 단당류의 흡수 저해를 극대화 할 수 있어 체중 감량 및 혈당 강하 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명의 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (KCTC14267BP)는 장내에 고착하지 않고 일시적으로 서식하는 특성을 나타내 필요에 따라 투여된 균주 또는 균주가 생산한 알파-글루코시다아제 저해제 및 이의 유효성분인 1-데옥시노지리마이신 (1-deoxynojirimycin)는 일정 시간 후 배출이 가능하여 안전하게 사용할 수 있다.
미생물을 이용한 알파-글루코시다아제 저해제 생산의 경우 발효비용, 정제비용 등 생산비의 부담이 크고 많은 노동력을 필요로 하나 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (KCTC14267BP)를 사용하면 알파-글루코시다아제 저해제 및 이의 유효 성분인 1-데옥시노지리마이신 (1-deoxynojirimycin)를 장에서 생산하여 공급하므로 포자 생산비용 이외의 별도의 발효비용 및 가공비가 필요하지 않아 생산비용을 절감 할수 있고, 발효취 등의 문제가 발생하지 않아 다양한 형태의 식품, 사료 및 약학 조성물에 적용이 가능하다.
도 1은 바실러스 코아귤란스 CC 균주가 생산하는 알파-글루코시다아제 저해제의 주된 성분인 1-데옥시노지리마이신을 HPLC로 분석 확인한 결과이다.
도 2는 고탄수화물 식이의 급여시 바실러스 코아귤란스 CC 균주 포자의 투여가 마우스의 체중에 미치는 영향을 보여주는 그래프이며, 표준식이군 ( ○ ), 고탄수화물식이군 ( □ ) 및 고탄수화물식이 + CC포자 투여군 ( ■ )을 각각 나타낸다.
도 3은 도 2의 11주 시점에서 표준식이군 (Normal-Diet), 고탄수화물식이군 (HC-Diet) 및 고탄수화물식이 + CC포자 투여군 (HC-Diet + CC Spore)의 마우스를 CT 촬영을 통하여 각각 흉부와 복부의 지방 분포를 관찰한 결과이다.
도 4은 고지방 식이의 급여시 바실러스 코아귤란스 CC 균주 포자의 투여가 마우스의 체중에 미치는 영향을 보여주는 그래프이며, 표준식이군 ( ○ ), 고지방식이군 ( □ ) 및 고지방식이 + CC포자 투여군 ( ■ )을 각각 나타낸다.
도 5는 도 4의 11주 시점에서 표준식이군 (Normal-Diet), 고지방식이군 (HF-Diet) 및 고지방식이 + CC포자 투여군 (HF-Diet + CC Spore)의 마우스를 CT 촬영을 통하여 각각 흉부와 복부의 지방 분포를 관찰한 결과이다.
도 6는 마우스의 분변 1g에 포함된 알파-글루코시다아제의 저해 활성을 보여주는 그래프이며, 고탄수화물식이 + CC포자투여군 (
Figure pat00001
) 및 고지방식이 + CC포자투여군 (
Figure pat00002
)을 각각 나타낸다. CC포자는 7주간 투여하였으며 이후는 포자가 없는 고탄수화물식이 또는 고지방식이를 급여하였다. 화살표는 CC포자 투여를 중지한 시점이다.
도 7은 마우스의 분변으로 배설되는 바실러스 코아귤란스 CC 균주의 분포를 보여주는 그래프이며, 고탄수화물식이 + CC포자투여군 (
Figure pat00003
) 및 고지방식이 + CC포자투여군 (
Figure pat00004
)을 각각 나타낸다. CC포자는 7주간 투여하였으며 이후는 포자가 없는 고탄수화물식이 또는 고지방식이를 급여하였다. 화살표는 CC포자 투여를 중지한 시점이다.
도 8은 바실러스 코아귤란스 CC 균주의 분류학상 위치를 나타낸 개략도이다.
본 발명은, 알파-글루코시다아제 저해제를 생산하는 능력이 향상된 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (Bacillus coagulans CC, 수탁번호 KCTC14267BP)를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 건초를 시료로 하여 내열성 포자를 형성하는 균을 분리하고, 통성 혐기적으로 생육이 가능하며 알파-글루코시다아제 저해제를 고생산하는 균주를 선별함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 16s rRNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 알파-글루코시다아제 저해제를 장내에서 고수율로 생산하는 혐기성 특성과 생체외에서도 알파-글루코시다아제 저해제를 생산하는 호기적 특성을 동시에 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 포자를 형성할 수 있으며, 장내에 고착하지 않고 일시적으로 서식하는 특성을 나타내, 필요에 따라 투여된 균주를 장내로부터 배출이 가능해 안전하게 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 균주는 생물체에 투여된 후, 2주 내지 4주 경과하는 시점부터 생물의 체외 (體外)로 배설될 수 있고, 보다 바람직하게는 1주를 경과하는 시점에 배설될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기한 균주는 장내에서 상기 알파-글루코시다아제 저해제를 생산할 수 있어, 알파-글루코시다아제 저해제의 유효 농도를 장내에서 일정하게 유지할 수 있으며, 장내에서 생산한 상기 알파-글루코시다아제 저해제는 배설이 가능해 안전하게 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 알파-글루코시다아제 저해제는 균주가 생물체에 투여된 후, 2주 내지 4주 경과하는 시점부터 생물의 체외 (體外)로 배설될 수 있다.
이에 따라, 상기 균주를 포함하는 조성물을 섭취하는 방법에 의해 투여하여 장내에서 알파-글루코시다아제 저해제를 고수율로 생산할 수 있고 일정기간 후 생물체외로 배출이 가능해 체중 감량과 혈당강하의 목적으로 효과적으로 사용할 수 있다. 장내에서 다량으로 생산된 α-글루코시다아제 저해제의 작용에 의해 분해되지 않은 올리고 탄수화물은 대장까지 도달하여 장내 미생물의 먹이가 되어 프리바이오틱스로서의 역할을 하여 변비를 해소 할 수 있어 변비 완화의 목적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주가 포자의 형태로 포함될 수 있고, 1 g 당 106 내지 1014 개의 포자로 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주가 생성하는 알파-글루코시다아제 저해제는 1-데옥시노지리마이신 (1-deoxynojirimycin)일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서의 용어 '발효물'은 액체/고체 배지에서 배양한 발효물 자체, 상기 발효물을 여과 또는 원심분리 하여 균주를 제거한 여액 (원심분리한 상등액) 또는 균을 함유한 침전물 등의 발효물 자체로부터 파생되는 가공물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.
상기 바실러스 코아귤란스 CC 균주는 통상의 배지에서 생육 가능하며, 일 예로 뉴트리엔트 브로스 (Nutrient broth) 배지에서 배양할 수 있다. 상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 상기 균주는 통상의 배양방법에 따라 배양할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 포도당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두박(분) 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인산원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인산원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은, 신규한 바실러스 코아귤란스 CC (Bacillus coagulans CC)(KCTC14267BP) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 사료 조성물 및 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨,소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능성 식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 비만 억제, 혈당 강하 등의 효과를 나타내는 바, 동물체의 건강상태를 양호하게 하는 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 바실러스 코아귤란스 CC를 첨가함으로서 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 바실러스 코아귤란스 CC 균주의 포자 및 발효물을 혼합하여 제조할 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 배합사료 등을 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예 사료를 본 발명에 따른 미생물로 발효시킴으로써 제조할 수 있다. 습식발효사료는 음식물 쓰레기 등과 같은 유기물을 수집 및 운반하여 살균과정과 수분조절을 위한 부형제를 일정비율로 혼합한 후, 발효에 적당한 온도에서 24시간 이상 발효하여, 수분함량이 약 70%으로 포함되도록 조절하여 제조할 수 있다. 발효건조사료는 습식 발효 사료를 건조과정을 추가로 거쳐 수분함량이 30% 내지 40% 정도 함유되도록 조절하여 제조할 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 종래 사료에 첨가되는 성분을 더 포함할 수 있다. 이러한 사료에 첨가되는 성분의 일예로서 곡류분말, 고기분말, 및 두류 등을 포함할 수 있다. 상기에서 곡류분말은 쌀가루, 밀가루, 보리가루, 및 옥수수가루 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기에서 고기분말은 닭고기, 소고기, 돼지고기, 및 타조고기 중에서 선택된 어느 하나 이상을 분말화한 고기분말을 사용할 수 있다. 상기에서 두류는 대두, 강낭콩, 완두콩, 및 검정콩 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 상기에서 언급한 종래 사료에 첨가되는 성분인 곡류분말, 고기분말, 및 두류 이외에도 사료의 영양성을 증대시키기 위해 영양제, 및 무기물 중에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가할 수 있으며, 사료 품질의 저하를 막기 위해 항곰팡이제, 항산화제, 항응고제, 유화제, 및 결착제 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물은 다양한 경구 투여 형태로 제형화될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제 (예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제 (예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은, 신규한 바실러스 코아귤란스 CC (Bacillus coagulans CC)(KCTC14267BP) 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 고혈당 및 당뇨의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 사료 조성물 및 약학적 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물, 사료 조성물 및 약학적 조성물은 상술한 바실러스 코아귤란스 CC (Bacillus coagulans CC)(KCTC14267BP) 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 고혈당 및 당뇨의 예방 또는 개선용 식품 제제를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 조성물과 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
<실시예 1> 균주의 탐색
한국내 각지에서 수집한 약 800여점의 건초를 시료로 하여 미생물을 분리하였다. 각 시료에 멸균 식염수를 소량 가하여 현탁시킨 다음 80℃ 항온 수조에서 20분간 열처리하여 얻은 포자액을 1.5% 한천을 함유하는 BCP Plate Count Agar 평판배지에 도말하고, 55℃ 배양기에서 2일간 혐기적으로 배양하여 균 집락을 형성하는 균체를 분리하였다. 알파-글루코시다아제 저해제의 생산량을 조사하기 위하여, 분리된 균주는 5% 콩가루를 현탁한 배지 5ml에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리하여 상등액으로부터 알파-글루코시다아제 저해 활성을 측정하였다.
<실시예 2> 알파-글루코시다아제 저해 활성 측정
알파-글루코시다아제는 돼지의 소장으로부터 추출하여 부분 정제한 것을 효소원으로 사용하였다. 알파-글루코시다아제 효소액은 24unit/ml가 되게 0.5M 인산염 완충용액 (pH 7.0)으로 적당히 희석하여 사용하였으며, 기질은 p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside (pNPG)를 이용하였다. 시험관에 배양 상등액 30μl와 효소 50μl를 섞어 37℃에서 10분간 예비 보온을 한 후, 3mM pNPG 50μl를 첨가하고 37℃에서 20분간 반응시켰다. 반응액에 0.1M Na2CO3를 가하여 반응을 정지하고, 분광광도계로 405nm에서 흡광도를 측정함으로써 알파-글루코시다아제 저해활성을 측정하였다. 이때 저해제 대신 물을 넣은 것을 대조구로 하여 하기 수학식 1에 따라 저해율을 계산하였다.
[수학식 1]
저해율(%) = [(A-B)/A] × 100
상기 식에서, A는 대조구의 흡광도이고, B는 저해제를 넣은 시료의 흡광도이다.
이때, 알파-글루코시다아제 저해단위 (α-glucosidase inhibition unit, AGI unit)는 활성 측정에 사용된 α-glucosidase를 1% 저해할 때의 저해제의 양으로 정의하였다.
<실시예 3> 균주의 선발
상기의 실시예 2의 과정으로 약 50종의 세균을 알파-글루코시다아제 저해제 생산균으로 1차 선발한 후, 55℃에서 혐기적으로 생육이 가능하고 프로피온산 (propionic acid)이 함유된 배지에서 생육하지 못하는 균주의 배양액을 원심분리하여 상등액으로부터 알파-글루코시다아제 저해 활성을 측정하여 알파-글루코시다아제 저해 활성이 높은 3종을 2차 선발하였다. 상기한 3종의 균주중 버지스 매뉴얼 (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2002)에 의한 분류학적 특성 분석 방법에 따라 바실러스 코아귤란스 (Bacillus coagulans)로 분류되고 알파-글루코시다아제 저해제 생산성이 높고 포자 형성이 수월한 DH-128 균을 최종 선발하였다 (표 1참조).
균주 AGI (unit/ml) 포자 형성 수월성
DH-128 2986 +++
DH-204 1824 +
HS-061 2075 +++
<실시예 4> DH-128 균주의 돌연변이 유발
<4.1> 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 선발 및 특징 확인
DH-128 균주를 니트로소구아니딘 (nitrosoguanidine, 100μg/ml)으로 사멸율이 99.9%가 되게 처리하여 돌연변이를 유발한 후 BCP Plate Count Agar 평판배지에 1장당 200~300마리가 되게 도말하고 40℃에서 2일간 배양하였다. 생성된 콜로니는 무작위하게 5% 콩가루 배지에 접종하고 40℃에서 2일간 진탕 배양한 후 상등액을 원심분리하여 알파-글루코시다아제 저해 활성을 측정하였다. 알파-글루코시다아제 저해 활성이 상승한 5 균주를 선발하여 포자형성 능력과 알파-글루코시다아제 저해 활성을 고려하여 DH-128-46Y93을 선발하였다. DH-128-46Y93균주는 상기와 같은 방법으로 돌연변이를 반복하여 알파-글루코시다아제 저해 활성이 높고 포자 형성능력이 좋은 균주를 선발하여 바실러스 코아귤란스 CC (Bacillus coagulans CC)로 명명하고 한국생명공학 연구원 생물자원센터 (KCTC)에 2020.08.06. 일자로 기탁하였다 (수탁번호 KCTC14267BP).
대조 균주로서 알파-글루코시다아제 제해제 생산 낫토 균주인 바실러스 서브틸리스 DC-15와 알파-글루코시다아제 제해제 무생산 균주인 바실러스 코아귤란스 ATCC 7050를 사용하였으며 돌연변이 균주인 DH-128, DH-128-46Y93 및 바실러스 코아귤란스 CC (Bacillus coagulans CC)를 5% 콩가루 배지에서 각각 40℃에서 2일간 호기적 또는 혐기적으로 배양하여 생성된 알파-글루코시다아제 저해 활성을 하기 표 2에 나타내었다.
균주 AGI (unit/ml) 포자 형성 수월성
호기적 혐기적
Bacillus subtilis DC-15 83,257 0 +++
Bacillus coagulans ATCC 7050 0 0 +++
DH-128 2,986 2,012 +++
DH-128-46Y93 5,873 4,113 +++
바실러스 코아귤란스 CC
(Bacillus coagulans CC)		 19,478 12,879 +++
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 선발 균주인 DH-128로부터 순차적인 돌연변이 육종에 의해 알파-글루코시다아제 저해 활성이 대폭적으로 증가한 바실러스 코아귤란스 CC 균주가 육종되었다. 대조 균주인 바실러스 서브틸리스 DC-15는 낫토 생산에 사용되는 호기성균으로 호기적인 조건에서는 상당량의 알파-글루코시다아제 제해제를 생산하나 혐기적인 조건에서는 전혀 생산을 하지 못하고 있으며 바실러스 코아귤란스 ATCC 7050은 호기적이거나 혐기적이거나 알파-글루코시다아제 제해제를 생산하지 않는다. 따라서 바실러스 코아귤란스 CC 균주는 장내와 같은 혐기적 환경에서도 알파-글루코시다아제 제해제를 생산하는 능력을 보여줌으로서 알파-글루코시다아제 제해제를 생산하는 기타 호기성 균과는 매우 다른 특징이 있다.
<4.2> 분리된 바실러스 코아귤란스 CC 균주의 형태학적 및 생화학적 특성 규명
상기의 분리과정을 거쳐 육종된 바실러스 코아귤란스 CC 균주의 L-broth 한천 평판배지에서 형성된 균 집락은 작고 평평하며 가장자리는 매끈한 둥근 형태이고 표면은 광택이 없는 흰색의 외형을 나타내었다. 균의 성장에 미치는 온도의 영향은 25℃ 이상 40℃ 이하의 범위에서 성장이 양호하였으며, 60℃ 이상에서는 균체의 성장이 확인되지 않았다. 질산염의 환원력은 양성이며, 구연산 이용, Voges-Proskauer 시험은 음성이었다. 또한, 카제인, 젤라틴, 전분을 분해하며, 포도당으로부터 산을 생성하며 아라비노스, 자일로스, 만니톨로부터는 산을 생성하지 않으며 카탈라아제 양성이며, 호기적 조건 및 혐기적 조건에서 성장한다. L-broth 액체배지를 이용한 균체 성장의 대수기에서 현미경 관찰한 결과, 짧은 막대모양의 외형으로서 비교 균주인 바실러스 코아귤란스와 유사하였으며 그람 양성이었다.
또한 API50CHB 키트 (BioMerieux사, France)를 사용하여, 분리된 균주의 생화학적 특성 등을 조사한 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같은 생화학적 특성 (API test 결과)을 가짐을 확인할 수 있었다.
　Test Result Test　 Result
0 - Esculin +
Glycerol - Salicin +
Erythrol - Cellobiose +
D-Arabinose - Maltose +
L-Arabinose + Lactose -
Ribose + Melibiose +
D-Xylose + Sucrose -
L-Xylose - Trehalose +
Adonitol - Inulin -
β-Methylxyloside - Melezitose -
Galactose + D-Raffinose -
D-Glucose + Starch +
D-Fructose + Glycogen +
D-Mannose + Xylitol -
L-Sorbose - β-Gentiobiose +
Rhamnose + D-Turanose -
Duicitol - D-Lyxose -
Inositol - D-Tagatose -
Mannitol + D-Fructose -
Sorbitol - L-Fructose -
α-Methyl-D-mannoside - D-Arabitol -
α-Methyl-D-glucoside + L-Arabitol -
N-Acetylglucosamine + Gluconate +
Amygdalin + 2-Ketogluconate -
Arbutin + 5-ketogluconate -
버지스 매뉴얼 (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2002)에 의한 바실러스 속 균주의 분류학적 특성 분석을 한 결과는 하기 표 4에 요약하였으며 바실러스 코아귤란스 CC (Bacillus coagulans CC)는상기 균주가 하기 서열번호 1의 16s rRNA서열을 갖는 다는 것을 확인하였다.
Gram staining +
55℃ growth +
Aerobic growth +
Anaerobic growth +
Citrate utilization -
Nitrate redued to nitrite +
Voges-Proskauer test -
Acid from
D-Glucose +
L-Arabinose -
D-Xylose -
D-mannitol -
Hydrolysis of
Casein +
Gelatin +
Starch +
[서열번호 1]
CCGTTGGGGTCTCCCAGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGCCTCCCAGTTTCCAATGACCGCTTGCGGTTGAGCCGCAAGATTTCACATCAGACTTAAGAAGCCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGCCGGGTACCGTCAAGGCGCCGCCCTGTTCGAACGGCACTTGTTCTTCCCCGGCAACAGAGTTTTACGACCCGAAGGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCCCATCTGTAAGTGACAGCCGAAGCCGTCTTTCCTTTTTCCTCCATGCGGAGGAAAAAACTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGCGTTATCCCGATCTTACAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACCTTTTAAAAGCAAGCTTTTAAAAGGTCCGCACGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCAGAGAACAAAACCCAAAAAAAGGGGCCAATACCGGGAAAGTTTATTCCTCCGCCTGGGAGGAGAAAGGAAAGACGGCATCGGCGGGCCCCTACAGAAGGGCCCGCGGCGCAATAGCCAGTTGGGCGGGGAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCCGAGAAGGGGAGCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCCACCGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTCGGGGCGTAAAAACTCCGTTGCCGGGGGAAGAACAAGGGCCGTTCCAACAGGGCGGGGCCTTTGGCGGTACCGGGCCAAAAAGGCCCGGGTCACCTCCTGTCCCCACAAGCCGCGCGTAATACTGAGGGGGGAAAGGGTTTCTCGCGAAAATTTGGGGGTGAAAAAGCGGCCCCGCGGCGGGGTTTTTAAATATGTGTGGGTTAAAATTTTTGGCGCCCCCCCCCGGCGGGCGTTTTTTAAAACGGGGGGGGGCTGTGTGGAAAAAAGAGAAAGGGTATAAATCTCCCGTATTGTTGTGGAAAAAGTATATAAAATGTGGGAAAAACACAAGGGCGGAGGGGGCCTCGGTGGAAA
<실시예 5> 바실러스 코아귤란스 CC 균주가 생산하는 1-데옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin) 분석
바실러스 코아귤란스 CC 균주를 5% 콩가루 배지에서 37℃, 48시간 배양한 배양액을 원심분리하고 상등액을 TLC로 전개한 후 0.5cm 간격으로 긁어낸 후 물로 추출하여 알파-글루코시다아제 제해 활성을 측정하였다. 알파-글루코시다아제 제해 저해 활성은 1-데옥시노지리마이신과 같은 위치 한 곳에서 나타나 잠정적으로 알파-글루코시다아제 제해제의 주된 성분은 1-데옥시노지리마이신 (1-deoxynojirimycin)으로 판정하였다. 1-데옥시노지리마이신 (1-deoxynojirimycin)의 추가적인 확인을 위해 HPLC로 분석하였다. 바실러스 코아귤란스 CC 균주를 5ml의 5% 콩가루 배지에 접종한 후 37℃에서 48시간 혐기적으로 배양하였다. 이중 1ml를 취하여 0.4M potassuim borate buffer (pH 8.5) 20μl, acetonitrile에 용해한 5mM 9-flurenylmethyl chloroformate 20μl를 가하고 실온에서 30분간 차광하여 반응하여 표준품인 1-데옥시노지리마이신 (1-deoxynojirimycin)의 유도체와 비교하였다. 0.1M glycine 20μl를 가하여 반응 정지하여 HPLC 분석 시료로 하였다. HPLC 분석을 위한 컬럼은 Agilent TC-C18 column (250 x 4.60 mm, 5μm)를 사용하였으며 mobile phase는 acetonitrile : 0.1% acetic acid = 35 : 65이고 flow rate는 1.2ml/min, 컬럼 oven 온도는 40℃, 254nm에서 검출하였다. 도 1에서 보여 지듯이 바실러스 코아귤란스 CC 균주의 생성물과 1-데옥시노지리마이신 (1-deoxynojirimycin)은 동일한 retention time을 보여 같은 물질임을 확인하였다.
<실시예 6> 바실러스 코아귤란스 CC 균주의 식이 실험
바실러스 코아귤란스 CC 균주가 동물의 장관내에서 알파-글루코시다아제 제해제를 효율적으로 생산하는지 여부를 확인하기 위해, 마우스를 사육하면서 바실러스 코아귤란스 CC 균주의 포자를 경구투여하여 균주의 장내 증식 및 체외 배출 여부, 장내에서의 알파-글루코시다아제 저해제의 생산 여부, 체중변화 등을 검토하였다. 이를 위해, 시판되는 표준사료와 물을 자유로 급여하며 수컷 마우스 (3주령)를 1주일간 예비 사육한 후 사용하였다. 명암 사이클은 08:00시에서 20:00시를 명기, 20:00시에서 08:00시를 암기로 하였으며, 22.5±0.5℃의 온도 및 50 내지 60%의 습도가 유지되는 환경하에서 사육하였다. 식이는 하기 표 5의 조성으로 각각 조제하였다. 마우스는 표준식이군, 고탄수화물 식이군, 고탄수화물 식이 + CC 포자군, 고지방 식이군, 고지방 식이 + CC 포자군 등 5개의 군 (각 8마리)으로 나누어 12주간 사육하였다. 바실러스 코아귤란스 CC 균주 포자는 고탄수화물 식이 + CC 포자군, 고지방 식이 + CC 포자군에 대하여 109cell/kg 체중이 되도록 생리 식염수 100μl에 희석하여 격일로 투여 하였으며 나머지 표준식이군, 고탄수화물 식이군, 고지방 식이군은 포자 희석액 대신 생리 식염수를 100μl를 격일로 투여하였다. 사육을 진행하며 분변을 정기적으로 채집하여 분변 중의 알파-글루코시다아제 제해 활성과 배출되는 바실러스 코아귤란스 CC 균주를 측정하기 위한 시료로 하였다.
조성　 표준 식이
g (%)		 고탄수화물 식이
g (%)		 고지방 식이
g (%)
casein 150 (55.5) 150 (24.1) 150 (39.2)
corn starch 10 (3.7) 100 (16.1) 10 (2.6)
dextrose 0 (0.0) 100 (16.1) 0 (0.0)
sucrose 0 (0.0) 100 (16.1) 0 (0.0)
cellulose 50 (18.5) 50 (8.0) 50 (13.1)
soybean oil 10 (3.7) 30 (4.8) 100 (26.1)
salt mix 35 (12.9) 70 (11.2) 50 (13.1)
vitamin mix 10 (3.7) 15 (2.4) 15 (3.9)
L-cysteine 3 (1.1) 5 (0.8) 5 (1.3)
choline bitartrate 2.5 (0.9) 3 (0.5) 3 (0.8)
total 271 (100) 623 (100) 383 (100)
kcal/100g 270 332 402
<6.1> 고탄수화물식이의 급여 시 바실러스 코아귤란스 CC 균주 포자의 투여가 마우스의 체중에 미치는 영향 분석
고탄수화물식이가 급여된 마우스의 체중에 바실러스 코아귤란스 CC 균주 포자의 투여가 미치는 영향을 분석한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 고탄수화물식이군은 표준식이군에 비하여 뚜렷한 체중 증가를 보이나 고탄수화물식이 + CC포자 투여군에서는 고탄수화물식이군 보다 현저히 감소된 체중 증가 양상을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이 실험의 11주에서 각 군별로 마우스의 CT를 촬영하여 체내의 지방 분포를 관찰하였다. 도 3은 그 결과로서 사진에서 화살표로 표시한 밝은 부분은 지방층을 나타내는 것으로 표준식이에 비하여 고탄수화물식이에서는 흉부 및 복부에 많은 량의 지방이 축적되어 있음을 알 수 있다. 반면 바실러스 코아귤란스 CC 균 포자를 투여한 고탄수화물식이군에서는 체내 지방 축적이 현저하게 감소하여 표준식이에 비슷한 경향을 보여 바실러스 코아귤란스 CC 균 포자의 투여에 의해 체중 증가 및 체지방 축적을 효율적으로 억제함을 보여주고 있다.
<6.2> 고지방 식이의 급여시 바실러스 코아귤란스 CC 균주 포자의 투여가 마우스의 체중에 미치는 영향
고지방식이가 급여된 마우스의 체중에 바실러스 코아귤란스 CC 균주 포자의 투여가 미치는 영향을 분석한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 고지방식이군은 표준식이군에 비하여 뚜렷한 체중 증가를 보이나 고탄수화물식이 + CC포자 투여군에서와 같은 양상으로 고지방식이군 보다 현저히 감소된 체중 증가 양상을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 고지방식이군 역시 실험의 11주에서 각 군별로 마우스의 CT를 촬영하여 체내의 지방 분포를 관찰하였다. 도 5는 그 결과로서 고탄수화물식이보다는 지방 축적이 덜하나 표준식이에 비하여 고지방식이에서 흉부 및 복부에 많은 량의 지방이 축적되어 있으나 바실러스 코아귤란스 CC 균주 포자의 투여에 의해 체중 증가 및 체지방 축적을 효율적으로 억제함을 보여주고 있다.
<실시예 7> 분변의 분석
상기 바실러스 코아귤란스 CC 균주의 식이 실험을 진행하면서 정기적으로 분변을 채집하여 분변으로 배설되는 알파-글루코시다아제 저해제와 바실러스 코아귤란스 CC 균주의 양을 측정하였다. 알파-글루코시다아제 저해제는 알파-글루코시다아제 저해 활성을 측정하였으며 바실러스 코아귤란스 CC 균주 균수는 분변 일정량에 멸균수를 가하여 잘 현탁하여 상등액을 BCP 평판 배지에 도말 한 후 55℃에서 2일간 혐기적으로 배양한 후 나타나는 콜로니의 수를 측정하였다.
<7.1> 분변으로 배설되는 바실러스 코아귤란스 CC 균주의 변화
바실러스 코아귤란스 CC 균주 포자가 투여된 마우스의 변에 포함된 포자수를 측정하여 변으로 배설되는 균주의 변화를 분석한 결과 도 6에 나타난 바와 같이 5주 까지는 배설되는 균의 양이 꾸준히 증가하여 그 이후에는 분변 1g 당 107개를 유지하므로 투여된 바실러스 코아귤란스 CC 균주은 장내에서 증식하여 그 일부가 체외로 배출되는 것으로 판단 할 수 있다. 한편 균의 투여를 중지한 시점인 8주부터 완만히 감소하므로 바실러스 코아귤란스 CC 균주가 장내에서 고착되지 않고 체류하는 시간이 그다지 길지 않음을 보여준다. 따라서, 본 균주의 투여를 중단하면 장내 균총의 변화가 예상되므로 필요에 따라 장내에서 본 균주의 제거도 가능한 장점이 있음을 확인할 수 있었다. 표준식이를 급여한 마우스의 분변에서는 콜로니의 생성이 관찰 되지 않으므로 나타난 콜로니는 바실러스 코아귤란스 CC 균주임을 특정 할 수 있다.
<7.2> 분변으로 배설되는 알파-글루코시다아제 저해 활성의 변화
바실러스 코아귤란스 CC 균 포자가 투여된 마우스의 변으로 배설되는 알파-글루코시다아제의 저해 활성을 분석하였다. 도 7에 나타난 바와 같이 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (KCTC14267BP)는 변으로 배출될 정도로 장내에서 왕성하게 증식하며 알파-글루코시다아제 저해제를 생산하는 것을 확인할 수 있다. 도 6에 나타나듯이 5주차 부터 7주까지는 배출되는 바실러스 코아귤란스 CC 균주의 양이 안정화되는 시기로 배출되는 알파-글루코시다아제 저해제의 양도 일정한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 알파-글루코시다아제 저해제는 항상 장내에서 생산되므로 장내에서의 농도가 일정량 유지되며 효율이 높게 작용하는 장점을 가지며 생산된 저해제의 일정량이 배출되는 것임을 알 수 있다.
상기의 결과를 보면 공업적 과정으로 발효하여 생성된 생리활성물질을 체내로 투여하는 방식이 아니라 본 발명에 따른 바실러스 코아귤란스 CC 균주가 체내에서 생리활성물질을 연속적으로 만들어 공급하는 것이 가능하다는 것을 보여주고 있다. 이는 알파-글루코시다아제 저해제의 생성을 위한 별도의 발효비용 및 가공비가 필요하지 않아 생산비용을 절감할 수 있으며 체내에서 연속적으로 생산하므로서 알파-글루코시다아제 저해제의 작용점인 소장에서 유효한 농도를 일정하게 유지할 수 있는 장점이 있음을 확인할 수 있다. 또한 바실러스 코아귤란스 CC 균주의 포자를 이용함으로써 제품가공에서 발효취, 부피 및 색택 등의 문제가 발생하지 않으므로 다양한 형태의 식품에 적용할 수 있는 장점이 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC14267BP 20200806
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Claims (13)

  1. 알파-글루코시다아제 저해제를 생산하는 능력이 향상된 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (Bacillus coagulans CC, 수탁번호 KCTC14267BP).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바실러스 코아귤란스 CC 균주.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 혐기성인 것을 특징으로 하는, 바실러스 코아귤란스 CC 균주.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 균주가 투여된 후 생물체로부터 2 내지 4주 이내에 배설되는 것을 특징으로 하는, 바실러스 코아귤란스 CC 균주.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 장내에서 알파-글루코시다아제 저해제를 생산하는 것을 특징으로 하는, 바실러스 코아귤란스 CC 균주.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 장내에서 생산된 알파-글루코시다아제 저해제는 균주가 투여된 후 생물체로부터 2 내지 4주 이내에 배설되는 것을 특징으로 하는, 바실러스 코아귤란스 CC 균주.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 알파-글루코시다아제 저해제는 1-데옥시노지리마이신 (1-deoxynojirimycin)인 것을 특징으로 하는, 바실러스 코아귤란스 CC 균주.
  8. 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (Bacillus coagulans CC, 수탁번호 KCTC14267BP) 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는, 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  9. 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (Bacillus coagulans CC, 수탁번호 KCTC14267BP) 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  10. 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 균 (Bacillus coagulans CC, 수탁번호 KCTC14267BP) 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 균 (Bacillus coagulans CC, 수탁번호 KCTC14267BP) 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 고혈당 또는 당뇨의 예방 및 개선용 식품 조성물.
  12. 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (Bacillus coagulans CC, 수탁번호 KCTC14267BP) 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 고혈당 또는 당뇨의 예방 및 개선용 사료 조성물.
  13. 신규한 바실러스 코아귤란스 CC 균주 (Bacillus coagulans CC, 수탁번호 KCTC14267BP) 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 고혈당 또는 당뇨의 예방 및 치료용 약학 조성물.
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