KR20080107556A - 신규 유산균 및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 내산성, 내담즙산성, 내열성 및 유해 세균에 대한 항균 효과가 우수한 신규 미생물 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 KFCC11389P에 관한 것이다. 본 발명의 신규 미생물 또는 이의 배양물은 항균용 조성물, 정장용 조성물, 생균제 조성물, 사료첨가용 조성물, 발효제품 등에 유용하게 사용될 수 있다.
락토바실러스 플란타룸 KFCC11389P, 천연유기산제, 내산성, 내담즙산성, 장내감염세균
Description
도 1은 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2를 그람 염색하여 광학현미경(배율 ×4,000)으로 관찰한 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2의 실온에서의 생장과 유산 생성을 도시한 것이다.
도 3은 MRS 및 다양한 배지를 이용하여 37℃에서의 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 생장과 유산 생성을 도시한 것이다.
도 4는 락토바실러스 플란타룸 두 균주인 ml-10hk2와 ml-10hk3에 대하여 recA 유전자 염기서열 분석을 하여 나타난 전기영동 결과이다.
도 5는 대조군과 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2를 4주 동안 식이한 후, 면양적혈구로 감작하고 두 군의 B 세포와 T 세포를 FACS system을 통하여 그 분포를 분석한 것이다(튜브 003: 대조구 B 세포, 튜브 007: 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 식이군 B 세포, 튜브 011: 대조구 T 세포, 및 튜브 015: 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 식이군 T 세포).
도 6은 유산균 식이 이전의 보통의 6주령 ICR계 수컷 생쥐의 분변에 존재하는 시트로박터 프룬디아이(SS 배지), 대장균(SS 배지) 및 살모넬라 티피뮤리움(SS 배지와 0.002% bromphenol blue를 포함하는 MRS 배지)을 순수분리하여 배양한 사진이다.
도 7은 살모넬라와 쉬겔라 균속 5종에 대한 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2의 항균 능력을 보여주는 것으로, 유산균 배지인 MRS가 아닌 일반배지 TSB에 혼합배양하여 배양 후 6시간 및 24시간 후의 유해균의 생육 저해를 도시한 것이다.
도 8은 생육 저해를 보이는 살모넬라 파라타이피, 쉬겔라 쏘네아이 및 쉬겔라 디센테리에의 초기 6시간(윗줄 사진)과 24시간 후(아랫줄 사진)를 1,000배로 희석하여 살모넬라 쉬겔라 선택배지인 SS 배지에 분주하여 비교한 것이다.
본 발명은 내산성, 내담즙산성, 내열성 및 유해 세균에 대한 항균능력이 우수한 신규 미생물 및 이러한 미생물로 농산물 폐기물을 발효시킨 천연 유기산제에 관한 것이다.
프로바이오틱스(probiotics)를 위해서는 주로 유산균이 사용되며, 특히 유기산, 항균물질 등을 생성하는 유산균으로는 락토바실러스속, 페디오코커스속, 엔테로코커스속 및 비피도박테리움속이 있다. 유기산을 생성하는 유산균의 경우 장관 내 미생물 균총의 정상화, 유해균에 의한 소화기성 질병 발생 경감, 일부 항생제 대체 효과 등이 있다.
이들 유산균은 장내로 유입된 후 장내 상피세포에 착생하게 되어 유해 미생 물의 장 정착을 방지하고 항균 물질을 분비함으로써 유해 미생물의 생육을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라, 면역활성 증진, 항암 작용 등의 효능을 가지고 있다. 특히 동물에게 먹이는 경우, 사료의 소화식이를 돕고, 면역력을 강화시켜 생균제로서 많이 사용되고 있다.
프로바이오틱스 유산균의 하나로도 잘 알려져 있는 락토바실러스속 균주 등은 균주 세포벽 성분이 대식세포 활성화, B 임파세포 활성화 등을 통하여 면역 활성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 이런 물질들이 장내 세균총의 항원이 되어 장관 면역을 주도하는 Peyer's patch 내 B 세포의 분화를 자극하여 항원에 대한 특이항체 생산 세포의 증식을 가져온다고 한다.
한편 산업적으로 널리 사용되고 있는 유기산은 유산, 초산, 구연산 등이며, 주로 화학합성, 효소반응 및 미생물의 발효공정을 이용해서 생산할 수 있으나, 주로 화학합성방법이 이용되고 있다. 그러나 환경친화적인 발효방법으로 이들의 생산공정을 대체하고자 하는 노력이 계속되었던 바, 해당 유기산의 생산능력을 가지는 미생물 및 값싼 기질의 발견은 점점 그 중요성이 커지고 있는 실정이다.
또 사료에 첨가되는 유기산제는 대부분 자유형태 또는 염과 결합한 형태로 분말이나 액상 형태이다. 여러 가지 성분들 중 개미산, 초산, 프로피오닉산, 젖산 등이 주로 쓰이는 산성화제이며, 이들은 세균의 세포벽을 뚫고 들어가 균을 사멸시킨다. 이런 유기산제들은 단일성분 형태로만 세포막을 통과할 수 있으나, 일반적으로는 여러 가지의 유기산제가 복합적으로 사용되는데 이를 통해 광범위한 효과와 각각의 유기산제의 장점을 결합할 수 있는 효과가 있다.
이러한 유기산 물질들은 사료의 세균 오염을 일차적으로 방지하며, 사료 내의 칼슘과 같이 소화하기 어려운 광물질들의 용해도를 높이고 위내의 pH를 낮춰줌으로써 펩신과 같은 효소의 작용을 도와 단백질 소화를 촉진하고 유해세균의 증식을 억제하는 등 사료첨가제로 사용할 경우 항생제를 대체 할만한 제품으로 각광받고 있다.
따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 내산성, 내담즙산성, 내열성 및 유해 세균에 대한 억제효능이 뛰어난 신규 유산균 및 이러한 유산균 또는 유산균 배양물을 포함하는 여러 용도의 유용한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 이미 발효식품 중에 존재하여 안정성이 확인된 유산균을 1차적으로 분리하고, 짧은 시간 동안 최대의 유산을 생성하는 유산균을 선발한 후 내산성, 내담즙산성, 내열성 및 병원균에 대한 항균능을 조사하고, 선발된 균주를 이용하여 정장제나 생균제로 사용하거나, 유산균의 유산발효를 통하여 농산폐기물을 자원화할 수 있는 방법 등을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 우수한 내산성, 내담즙산성, 내열성 및 항균활성을 갖는 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2(기탁번호 KFCC11389P)을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 신규 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물, 정장용 조성물, 생균제 조성물, 사료첨가용 조성물, 발효 제품 등을 제공한다.
본 발명은 또한 배추, 무 또는 이들의 혼합물을 준비하는 단계; 및 상기 배추, 무 또는 이들의 혼합물을 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2(기탁번호 KFCC11389P)로 발효시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유기산제의 제조방법을 제공하며, 보다 바람직하게는 상기 제조방법이 밀기울, 미강, 대두피, 소맥피 및 맥아박으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 다시 발효시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유기산제의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2(기탁번호 KFCC11389P) 및 이러한 유산균 또는 이의 배양물을 포함하는 여러 가지 용도의 유익한 조성물에 대해 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 살모넬라, 쉬겔라, 기회성 장내세균 등 유해한 병원균의 증식을 억제하고, 김치공장 폐기물인 배추, 무 등을 주요 탄소원으로 하여 다량의 유산을 생성하는 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2(기탁번호 KFCC11389P)에 관한 것이다.
락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2는 자연 숙성된 백김치에서 분리된 유산균으로, 내산성, 내담즙산성 및 내열성을 가지면서 살모넬라와 쉬겔라속 세균, 기회성 장내세균 등의 생육을 억제하며 김치부산물인 배추 및 무를 단시간에 발효시켜 대량의 유산을 생성한다.
본 발명의 신규 미생물은 16S rDNA 염기서열에 기초하여 99% 상동성을 보이 는 락토바실러스 플란타룸으로 최종 동정되었다. 본 균주의 정확한 분류를 위하여 그 후 더 실행된 recA 유전자 염기서열 분석, 당 이용성 분석 및 락토바실러스 플란타룸 ATCC 14917 균주와 내산성, 내담즙산성, 동결건조 시 수율을 비교하여 신균주임을 확인하였다. 본 발명의 신규 유산균인 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2는 락토바실러스 플란타룸 ATCC 14917 균주 및 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk3(본 발명에서 분류된 또 다른 락토바실러스 플란타룸 균주)과는 서로 다른 내산성, 내담즙산성, 면역세포에 대한 효과, 동결건조 시의 수율 등 서로 다른 특성이 있다. 상기 균주를 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2라 명명하고, 2007년 5월 3일자로 대한민국 서울시 서대문구 홍제1동 361-221 유림빌딩에 소재하는 한국미생물보존센터에 기탁번호 KFCC11389P로 기탁하였다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2를 이용한 살모넬라속 균, 쉬겔라속 균 및 장내 기회성 세균에 대한 in vivo 및 in vitro 실험을 통한 생육 억제 방법의 바람직한 예는 다음과 같다. 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2가 위의 세균에 대한 항균능을 보이기 위한 최적온도는 37℃가 가장 바람직하다.
본 발명의 신규 미생물은 in vitro 실험에서 대장균(Escherichia coli ATCC 53323), 시트로박터 프룬디아이(Citrobacter freundii ATCC 6750), 엔테로박터 클로씨(Enterobacter cloaceae ATCC 13047), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus ATCC 25923), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium ATCC 14028), 살모넬라 파라타이피(Salmonella paratyphi ATCC 11511), 쉬겔라 쏘네아이(Shigella sonnei ATCC 9290), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri ATCC 9199), 쉬겔라 디센테리 에(Shigella dysenteriae ATCC 9752) 등에 대한 항균 효과를 나타내었다.
또한 본 발명의 미생물은 in vivo 마우스 실험에서 사료에 0.5% 첨가하여 식이 하였을 경우, 장내에 존재하는 유산균의 수가 3.72 × 107 CFU/g이였던 것이 식이 2주 후부터는 7.42 × 107 내지 2.74 × 108 CFU/g으로 그 수가 늘어나는 것으로 나타났다. 혐기성 장내세균의 수도 식이 2주부터 실험기간 내내 대조구에 비해 32~45% 정도로 낮게 나타났다. 또한 살모넬라와 쉬겔라 속에 대해서는 그 선택배지인 SS 배지를 사용하여 수를 비교해본 결과 대조구는 4.52 × 106 CFU/g인데 반해, 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 식이군은 3.12 × 105 CFU/g으로 1.2 log 값의 감소를 보이며 역시 식이 2주 이후부터 대조구에 비해 30% 미만을 유지하는 것으로 나타났다.
본 발명에 따른 신규 미생물은 일반적인 락토바실러스 플란타룸 배양법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 일반적으로 유산균 일반배지인 MRS 배지에서 통성혐기적 조건을 만들어주면 15-45℃에서 10-72시간이면 충분히 배양이 가능하며 본 균주는 탄소원만 있어도 그 배양이 가능하다. 배양액에서 농축된 균체만을 회수하기 위해서는 원심분리 또는 여과과정을 통해 가능하며, 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 동결건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 미생물은 당업계에 공지된 통상적인 물리화학적 돌연변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 가지거나 또는 이보다 우수한 활성을 가 지도록 개선 또는 개량될 수 있다.
한편, 본 발명의 신규 미생물은 유해 세균에 대한 저해효능이 우수하고, 내산성, 내담즙산성 등이 있으므로 건강증진을 위한 정장용 조성물, 생균제, 항균용 조성물, 사료첨가용 조성물, 발효제품 등의 용도로 제공될 수 있다.
상기 '정장용'이란 동물의 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반증상을 치료 및 개선하는 용도를 말한다. 상기 증상으로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 유해 미생물에 의한 감염성 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장관 급이성 설사 등이 포함된다.
상기 '생균제'는 살아 있는 균 즉, 동물이 섭취했을 때 위장관에 머물러 생존할 수 있는 미생물로서 특정 병리 상태를 예방하거나 치료할 수 있는 효과가 있는 미생물 제제를 말한다. 일반적으로 생균제는 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반 증상을 치료하고 개선하는 효과가 있으며 체내에 투여되면 장내의 소화관 벽에 밀집, 정착하여 유해 미생물이 정착하지 못하게 하는 작용을 하고 유산을 생성하여 장내 pH를 낮추어서 유해 미생물의 증식을 억제한다. 또한, 투여된 생균제는 영양분의 흡수를 담당하는 장융모의 활동을 도와주는 역할을 수행한다.
상기 '항균용'이란 유해 세균의 생육을 저해 또는 억제하는 활성을 말한다. 바람직하게는 상기 유해 미생물로는 생체 내 소화기관에 존재하면서 소화기관과 관련된 여러 질환을 유발하는 미생물일 수 있다.
상술한 조성물들은 본 발명에 따른 유산균의 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균, 건조균 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유할 수 있으며, 적합한 부형제 또 는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 배양물은 본 발명에 따른 유산균을 적합한 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소(lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄액 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유산균 또는 이의 배양물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 정제(tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭시르(elixir), 시럽(syrup), 산제(powder), 현탁제(suspension), 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는, 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 산제는 본 발명의 유산균과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 유산균; 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제; 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 활택제화 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 신규 유산균 또는 이의 배양물은 사료 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 상기 사료 조성물은 기존 항생제의 대체용으로 사용되어 장내 유해균의 생육을 억제하며 장내 균총을 안정되게 유지하여 가축의 건강상태를 양호하게 하여 가축의 증체량과 육질을 개선시키고 산유량 및 면역력을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 이에 한정되지는 않으나 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태, 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 유산균과 여러 가지 미생물 또는 효소를 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 유산균을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명의 유산균으로 발효시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2는 배추, 무 또는 이들의 혼합물을 이용하여 우수한 천연 유기산제를 제조하는데 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 배추, 무 또는 이들의 혼합물을 준비하는 단계; 및 상기 배추, 무 또는 이들의 혼합물을 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2(기탁번호 KFCC11389P)로 발효시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유기산제의 제조방법을 제공하며, 보다 바람직하게는, 본 발명은 상기 발효시키는 단계 후에 밀기울, 미강, 대두피, 소맥피 및 맥아박으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 다시 발효시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유기산제의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 예를 들어, 김치공장에서 나오는 배추와 무 부산물을 이용하여, 바람직하게는, 그 비율을 약 8 : 2로 준비하고 세척한 후에, 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 배양액을 무게 대비 약 2 중량% 첨가하여 약 37℃에서 약 72시간 배양한 후에 밀기울, 미강, 대두피, 소맥피 및 맥아박 중에서 하나 또는 그 이상의 혼합물을 5 중량% 첨가하여 약 60℃에서 24시간 후발효시킨 후 건조 분말화하여 가축 등의 천연 유기산제로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위하여 하기 실시예 등을 들어 설명한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예 들에 한정되는 것으로 해석돼서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명의 구체적 이해를 돕기 위해 예시적으로 제공되는 것이다.
<실시예 1> 발효식품으로부터 유산균의 분리 및 선발
하기 표 1은 실험실에서 제조하여 25℃와 37℃에서 각각 숙성한 배추김치, 양배추김치 및 시판 중인 유산균 발효제품 및 부산물 발효를 통하여 유산생성이 뛰어난 균주를 선발하기 위한 표이다.
| 소스 | 명칭 | 콜로니 특성 | 형태(microscope) | pH | TA |
| emmental cheese | EC1 | 물색,납작,둥글,center볼록 | rod | 4.01 | 1.34% |
| EC2 | tiny,흰색 | long rod | 4.61 | 0.72% | |
| EC3 | 물색,전체지글,투명환,약간볼록 | long rod, thread | 4.80 | 0.61% | |
| lactosauce | LS-1 | 흰색,볼록,환없음 | coccus | 4.03 | 1.31% |
| LS-2 | 쌀색,광택,투명환 | cocobacillus | 3.72 | 1.92% | |
| LS-3 | 흰색,볼록,지글 | cocobacillus | 3.80 | 1.79% | |
| wheat bran | wb1 | 물색,투명,반짝,납작 | coccus | 5.72 | 0.31% |
| wb2 | 물색,투명,반짝,납작 | coccus | 5.92 | 0.28% | |
| wb3 | 우유색,반짝,soluble | cocobacillus | 5.70 | 0.32% | |
| amy | 무색,전체지글,center핵 | long rod, thread | 4.46 | 0.63% | |
| 홍김치 (25도-4D) | 4hk1 | 흰색,볼록 | coccus | 3.76 | 1.86% |
| 4hk2 | 흰색,볼록,투명환 | coccus | 3.79 | 1.83% | |
| 4hk3 | 흰색,볼록,투명환 | tiny cocobacillus | 4.49 | 0.89% | |
| 홍김치 (25도-6D) | 6hk1 | 흰색,large,sticky | coccus | 3.78 | 1.89% |
| 6hk2 | 흰색,small | cocobacillus | 4.49 | 0.86% | |
| 백김치 (25도-10D) | 10hk1 | 흰색,large,sticky | coccus | 3.79 | 1.87% |
| 10hk2 | 미색,볼록,환없음,광택 | rod | 3.78 | 1.90% | |
| 10hk3 | 흰색,볼록,환없음 | rod | 3.78 | 1.87% | |
| 양배추 (25도-6D) | cc1 | 물색,투명환,납작 | cocobacillus | 4.62 | 0.72% |
| cc2 | 흰색,볼록,환없음 | cocobacillus | 4.46 | 0.90% | |
| cc3 | 흰색,볼록,환없음 | cocobacillus | 4.47 | 0.91% | |
| cc4 | 레몬색,tiny,환없음 | tiny coccbacilus | 4.61 | 0.82% | |
| 25cc1 | 흰색,margin지글,center볼록 | cocobacillus | 4.52 | 0.86% | |
| 25cc2 | 우유색,환없음,볼록,광택 | cocobacillus | 4.49 | 0.90% | |
| 25cc3 | 우유색,환없음,볼록,광택 | cocobacillus | 4.47 | 0.90% | |
| 25cc4 | 흰색,margin지글,center볼록 | tiny coccbacilus | 4.52 | 0.85% | |
| 25cc5 | 레몬색,볼록,환없음 | tiny coccbacilus | 4.53 | 0.83% |
상기 실시예 1에서 다량의 유산을 생성하는 유산균 5종 선발한 다음 내산성과 내담즙산성을 보이는 락토바실러스 플란타룸 두 균주(10hk2와 10hk3)를 최종 선발하였다. 하기 표 2는 각각 pH 2.5와 pH 3.5 조건을 만들어주고 37℃에서 2시간 정치 배양한 후에 대조구와 비교하여 내산성을 측정한 결과이며, 산성 조건에서 2시간을 버틴 유산균을 다시 담즙산 0.3%와 3%에서 3시간 동안 37℃에서 배양하여 대조구와 비교함으로써 내 담즙산성 정도를 알아보았다(표 3). 또한 90℃ 오븐에서 10분 동안 그 배양액을 그대로 정치한 후 내열성에 대한 결과를 표 4에 나타내었다. 표 2, 3 및 4의 결과는 본 균주 2종과 비교하기 위하여 미국 세포주 은행 균주 Lactobacillus plantarum ATCC 14917을 분주받아 실험한 것을 나타내었다.
| control | pH 2.5 | pH 3.5 | |
| L. plantarum ATCC 14917 | 1.93 × 108 | 1.25 × 108 (64.8%) | 1.40 × 108 (72.5%) |
| L. plantarum 10hk2 | 1.33 × 108 | 1.94 × 108 (145.9%) | 1.68 × 108 (126.3%) |
| L. plantarum 10hk3 | 2.26 × 108 | 1.58 × 108 (69.9%) | 1.24 × 108 (54.9%) |
| control | pH 2.5 | pH 3.5 | |||
| 0.3% | 3% | 0.3% | 3% | ||
| L. plantarum ATCC 14917 | 2.28 × 107 | 9.80 × 106 (43.0%) | 6.70 × 106 (29.4%) | 2.12 × 107 (93.0%) | 1.38 × 107 (60.5%) |
| L. plantarum 10hk2 | 1.84 × 107 | 1.28 × 107 (69.6%) | 7.50 × 106 (40.8%) | 2.03 × 107 (110.3%) | 1.56 × 107 (84.8%) |
| L. plantarum 10hk3 | 2.63 × 107 | 1.31 × 107 (49.8%) | 7.40× 106 (28.1%) | 3.26 × 107 (124.0%) | 2.55 × 107 (97.0%) |
| control | 90도, 10분 | |
| L. plantarum ATCC 14917 | 1.18 × 108 | 7.85 × 107 (66.8%) |
| L. plantarum 10hk2 | 1.60 × 108 | 1.34 × 108 (83.8%) |
| L. plantarum 10hk3 | 1.74 × 108 | 9.60 × 107 (55.2%) |
내산성은 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2가 상당히 우수한 것으로 나타났으며, 내담즙산성에 있어서도 pH가 매우 낮은 조건(pH 2.5)에서 담즙산의 농도 3%를 견디는 능력이 더 높았다. 내열성에 있어서도 세 균주 모두 다르게 나타났으며 그 중에서도 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2가 가장 우수한 것으로 나타났다.
<실시예 2> 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2의 동정
락토바실러스 플란타룸으로 동정되었고, 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2으로 명명하였다.
2-1. 일반적인 특징
락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2는 그람 양성, 카탈라제 음성, 비운동성인 막대기형태(bacilli form)로 관찰되었다. 유산균 선택배지인 lactobacilli MRS에서의 콜로니 특징은 흰색을 띠며 환이 없고 볼록한 형태로 광택을 띠었으며 bromphoenol blue가 0.002% 첨가된 lactobacilli MRS에서는 유산을 과다 생성하여 배지의 색이 짙은 군청색에서 노란색으로 변하는 것이 관찰되었다.
2-2. 16S
rDNA
염기서열
선발된 두 락토바실러스 플란타룸 균주는 먼저 1차적으로 16S rDNA 염기서열을 증폭시켜 NCBI에서 제공하는 BLAST를 활용하여 동정하였다. 1차 동정 후 두 균주 간에 분자계통분류학적 분석을 통해서는 구별이 가지 않아 Torriani 등(Torriani et al., Appl . & Environ . Microbiol . 67(8): 3450-3454, 2001)의 방법에 따라 recA 유전자의 프라이머를 제작하여 PCR 산물을 얻은 후 겔에 걸어 전기영동으로 확인한 결과 두 균주 모두 Lactobacillus plantarum ATCC 14917 및 NCFB 340과 유사한 균으로 판명되었다. 선발된 두 락토바실러스 플란타룸 균주의 16S rDNA 분석결과를 서열번호 1 및 2에 나타내었다.
2-3. 당 이용성
API 50 CHL 키트(bioMerieux)를 사용하여 당 이용성을 조사하였다. 순수 분리가 확인된 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2를 2 Farland로 탁도를 적정한 후 37℃에서 24시간 배양하여 각각의 당 이용성을 확인하고(표 5), 판독 프로그램(API LAB PLUS)으로 해석한 결과 락토바실러스 플란타룸과 99.4% 일치하였다.
| 탄수화물 | 이용성 | 탄수화물 | 이용성 | 탄수화물 | 이용성 |
| 글리세롤 | - | 만니톨 | + | D-라피노스 | + |
| 에리트리톨 | - | 솔비톨 | + | 아미돈 | - |
| D-아라비노스 | - | a-메틸-D-마노사이드 | - | 글리코겐 | - |
| L-아라비노스 | + | a-메틸-D-글루코시드 | - | 자일리톨 | - |
| 리보스 | + | N-아세틸 글루코사민 | + | 베타제네티오비오스 | + |
| D-자일로스 | - | 아미그달린 | + | D-투라노스 | - |
| L-자일로스 | - | 알부틴 | + | D-리소스 | - |
| 아도니톨 | - | 에스큘린 | + | D-타가토스 | - |
| 베타메틸-자일로사이드 | - | 살리신 | + | D-푸코스 | - |
| 갈락토스 | + | 셀로비오스 | + | L-푸코스 | - |
| D-글루코스 | + | 말토스 | + | D-아라비톨 | - |
| D-프룩토스 | + | 락토스 | + | L-아라비톨 | - |
| D-만노스 | + | 멜리비오스 | + | 글루코네이트 | + |
| L-솔보스 | - | 사카로스 | + | 2-세토-글루코네이트 | - |
| 람노스 | + | 트레할로스 | + | 5-세토-글루코네이트 | - |
| 둘시톨 | - | 이눌린 | - | ||
| 이노시톨 | - | 멜리지토스 | + |
2-4. 동결건조
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2는 동결건조 후 1.1 × 109 CFU/g에서 3.0 × 1012 CFU/g으로 그 생균수가 3,000 배 가까이 농축된 균수를 보였으며, 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk3은 동결건조 시 50~60배 정도의 생균수만이 농축되어 1.7 × 1011 CFU/g으로 나타나 두 균주는 같은 균으로 동정은 되었으나 결과적으로 그 성질이 다른 것으로 판단되었다.
<실시예 3> 천연유기산제의 개발
배추와 무 부산물만을 그 유일한 기질로 하여 각각 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2와 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk3에 의해 생성되는 유기산 생산능력을 비교하여 표 6에 나타내었다. 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2는 ml-10hk3에 비해 5배 가까운 양의 젖산이 생성되었다.
| 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 | 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk3 | |
| 젖산(lactic) | 52.26% | 11.79% |
| 사과산(malic) | 1,108 ppm | 27,500 ppm |
| 초산(acetic) | 6,522 ppm | 311 ppm |
| 호박산(succinic) | 3,660 ppm | 1,300 ppm |
| pH(10% 수용액) | 4.18 | 3.44 |
<실시예 4> 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2의 in vivo와 in vitro 항균 작용
6주령의 ICR 마우스에게 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2와 ml-10hk3을 0.5 중량% 첨가하여 사료를 만든 후에 4주 동안 식이한 후에, 분변에서 나타나는 혐기적 상태의 장내세균의 수를 서로 비교해보았다. 식이 1주까지는 대조구와 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 및 ml-10hk3의 처리구가 차이를 보이지 않았으나, 식이 2주부터는 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2를 식이한 그룹은 대조구에 비해 30~45% 정도로 그 수가 줄어드는 것이 관찰되었다. 그 결과를 종합하여 하기 표 7에 나타내었다.
| 식이 | control | ml-10hk2 | ml-10hk3 |
| 1st week | 1.59 × 107 | 1.59 × 107 | 2.06 × 107 |
| 2nk week | 1.06 × 107 | 4.83 × 106 (46%) | 8.08 × 106 (76%) |
| 3rd week | 1.31 × 107 | 4.17 × 106 (32%) | 7.46 × 106 (57%) |
| 4th week | 1.82 × 107 | 8.19 × 106 (45%) | 1.23 × 107 (68%) |
ICR 마우스의 식이가 3주를 지났을 때, 살모넬라와 쉬겔라 선택배지인 SS 배지로 마우스의 분변에 존재하는 그 수를 비교해본 결과, 대조구는 4.52 × 106 CFU/g이었으나, 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2와 ml-10hk3 식이 그룹에서는 3.12 × 105과 1.52 × 106 CFU/g으로 대조군 대비 각각 7%와 34%로 서로 다르게 나타났다.
살모넬라와 쉬겔라 균속에 속하는 균주 5종을 준비하여 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2를 일반배지인 TSB에 각각 배양하여 그 생육정도를 확인한 후에, 각각 107 CFU/g이 되도록 TSB 배지에 접종하여 37℃ 배양 온도하에서 24시간 혼합배양하여 단독 배양한 것과 비교함으로써 그 생육억제 정도를 조사하였다. 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다. 살모넬라 균속에서는 파라티푸스를 일으키는 파라타이피가 1.25 로그 감소를 보였다. 쉬겔라 균속에서는 3종 모두 성장억제를 나타냈으나, 그 중에서도 최근 세균성 이질의 주원인균으로 알려진 쉬겔라 쏘네아이가 1.20 로그 감소를 보여 특히 쉬겔라 균속에 대해서는 그 생육저해가 우수한 것으로 나타났다.
| 단독배양 | 혼합배양 | |
| Salmonella typhimurium ATCC 14028 | 1.09 × 109 | 1.07 × 109 (98%) |
| Salmonella paratyphi ATCC 11511 | 2.11 × 108 | 1.20 × 107 (6%) |
| Shigella sonnei ATCC 9290 | 6.90 × 108 | 4.40 × 107 (6%) |
| Shigella flexneri ATCC 9199 | 9.60 × 108 | 5.60 × 108 (58%) |
| Shigella dysenteriae ATCC 9752 | 2.33 × 108 | 8.80 × 107 (38%) |
장내세균이면서 기회성 감염세균인 대장균, 시트로박터 프룬디아이, 엔테로박터 클로씨, 황색포도상구균과 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2를 각각 107 CFU/g이 되도록 MRS 배지에서 혼합배양한 것과 장내세균만을 역시 MRS 배지에서 37℃, 24시간 동안 단독 배양시킨 후 그 생육억제 정도를 조사하였다(표 9). 장내세균은 일반배지인 TSB와 유산균 선택배지인 MRS에서 그 생육의 차이가 없으며 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2와 혼합배양 시, 엔테로박터 클로씨는 2.5 로그, 황색포도상구균은 약 4 로그로 그 생장이 억제되었으며 대장균과 시트로박터 프룬디아이는 그 생장이 완전히 억제된 것으로 나타났다.
| 단독배양 | 혼합배양 | |
| Escherichia coli ATCC 53323 | 2.86 × 109 | 102 이하 |
| Citrobacter freundii ATCC 6750 | 3.70 × 108 | 102 이하 |
| Enterobacter cloaceae ATCC 13047 | 7.00 × 108 | 1.85 × 106 (1%) |
| Staphylococcus aureus ATCC 25923 | 1.56 × 109 | 4.20 × 105 (1%) |
대장균, 엔테로박터 클로씨 및 살로넬라 티피뮤리움을 MRS와 TSA 고체배지에 각각 도말한 다음, 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 배양액과 그 배양액을 pH 7.0으로 맞춘 배양액을 각각 점적하여 저해환 크기(mm)를 관찰하였다(표 10).
| 유산효과 | 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 | 유산 외 효과 | 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 | ||
| TSA | MRS | TSA | MRS | ||
| E. coli | 2 | 6 | E. coli | - | 1.5 |
| Ent. cloaceae | 2 | 8 | Ent. cloaceae | - | 4 |
| S. typhimurium | 1 | 8 | S. typhimurium | - | 7 |
락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2의 항균 작용이 MRS와 비교했을 때 TSA에서 작아지거나 소멸하는 원인을 알아보기 위해 TSA를 베이스로 하여 MRS의 각 성분을 한가지씩 첨가하여 modified TSA를 제조하였다. 항균실험에서 대장균과 엔테로박터 속 장내세균에 대해 효과적인 항균 작용을 위해서는 탄소원인 글루코스가, 살모넬라 속은 질소원인 효모 추출물(yeast extract)과 펩톤이 필요하다는 것이 밝혀졌다(표 11).
| MRS의 주요성분 | E. coli | Ent. cloaceae | S. typhimurium |
| sodium acetate | - | - | - |
| triammonium citrate | - | - | - |
| tween 80 | - | - | - |
| yeast extract | - | - | 1 |
| glucose | 1 | 1 | - |
| peptone | - | - | 1 |
| beef extract | - | - | - |
<실시예 5> 면역세포 활성화
4주 동안 대조군과 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 식이를 한 마우스에게 각각 T-의존성 항원인 면영적혈구를 2%로 만들어서 복강에 투여하여 감작한 후에 비장을 분리하여 B 세포와 T 세포의 분포를 FACS system을 통하여 분석하였다.
대조구에 비하여 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 처리구가 B 세포의 경우 8.6%에서 11.7%로, T 세포의 경우 15.5%에서 19.5%로 그 비율이 늘어나는 것으로 나타났다.
본 발명은 우수한 내산성, 내담즙산성 및 내열성을 가지면서 여러 유해 미생물에 우수한 항균능을 가지는 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2(기탁 번호 KFCC11389P)를 제공한다. 본 발명에 따른 신규 미생물은 항균용 조성물, 정장용 조성물, 생균제 조성물, 사료첨가용 조성물, 발효제품 등 여러 가지 용도로 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 신규 미생물은 김치공장의 폐기물인 배추와 무를 탄소원으로 사용할 수 있으므로 새로운 자원의 활용방법을 제공할 수 있다.
<110> MILAE RESOURCES ML. CO., LTD.
<120> New lactic acid bacteria and composition containing the same
<130> P07-193
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum ml-10hk2
<400> 1
tgcaagtcga acgaactctg gtattgattg gtgcttgcat catgatttac atttgagtga 60
gtggcgaact ggtgagtaac acgtgggaaa cctgcccaga agcgggggat aacacctgga 120
aacagatgct aataccgcat aacaacttgg accgcatggt ccgagtttga aagatggctt 180
cggctatcac ttttggatgg tcccgcggcg tattagctag atggtgaggt aacggctcac 240
catggcaatg atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc cacattggga ctgagacacg 300
gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacga aagtctgatg 360
gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa aactctgttg ttaaagaaga 420
acatatctga gagtaactgt tcaggtattg acggtattta accagaaagc cacggctaac 480
tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt 540
aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cttcggctca accgaagaag 600
tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg 660
tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact 720
gacgctgagg ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccatacc 780
gtaaacgatg aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gctaacgcat 840
taagcattcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagctac gcgaagaacc ttaccaggtc 960
ttgacatact atgcaaatct aagagattag acgttccctt cggggacatg gatacaggtg 1020
gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080
acccttatta tcagttgcca gcattaagtt gggcactctg gtgagactgc cggtgacaaa 1140
ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200
tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga actcgcgaga gtaagctaat ctcttaaagc 1260
cattctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat 1320
cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380
catgagagtt tgtaacaccc aaagtcggtg gggtaacctt ttaggaacca gccgcttaat 1440
1440
<210> 2
<211> 1446
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum ml-10hk3
<400> 2
tatacatgca agtcgaacga actctggtat tgattggtgc ttgcatcatg atttacattt 60
gagtgagtgg cgaactggtg agtaacacgt gggaaacctg cccagaagcg ggggataaca 120
cctggaaaca gatgctaata ccgcataaca acttggaccg catggtccga gtttgaaaga 180
tggcttcggc tatcactttt ggatggtccc gcggcgtatt agctagatgg tgaggtaacg 240
gctcaccatg gcaatgatac gtagccgacc tgagagggta atcggccaca ttgggactga 300
gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat ggacgaaagt 360
ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaaact ctgttgttaa 420
agaagaacat atctgagagt aactgttcag gtattgacgg tatttaacca gaaagccacg 480
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttatt 540
gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt gaaagccttc ggctcaaccg 600
aagaagtgca tcggaaactg ggaaacttga gtgcagaaga ggacagtgga actccatgtg 660
tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tgtctggtct 720
gtaactgacg ctgaggctcg aaagtatggg tagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780
cataccgtaa acgatgaatg ctaagtgttg gagggtttcc gcccttcagt gctgcagcta 840
acgcattaag cattccgcct ggggagtacg gccgcaaggc tgaaactcaa aggaattgac 900
gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agctacgcga agaaccttac 960
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tcacaccatg agagtttgta acacccaaag tcggtggggt aaccttttag gaaccagccg 1440
cttaat 1446
Claims (8)
- 내산성, 내담즙산성, 내열성 및 항균활성이 있는 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 (기탁번호 KFCC11389P).
- 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 (기탁번호 KFCC11389P) 또는 이의 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 대장균, 살모넬라 속 병원균 또는 쉬겔라 속 병원균에 대한 항균용인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 (기탁번호 KFCC11389P) 또는 이의 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 정장용 조성물.
- 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 (기탁번호 KFCC11389P) 또는 이의 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
- 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 (기탁번호 KFCC11389P) 또는 이의 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.
- 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2 (기탁번호 KFCC11389P) 또는 이의 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 발효제품.
- 배추, 무 또는 이들의 혼합물을 준비하는 단계;상기 배추, 무 또는 이들의 혼합물을 락토바실러스 플란타룸 ml-10hk2(기탁번호 KFCC11389P)로 발효시키는 단계; 및밀기울, 미강, 대두피, 소맥피 및 맥아박으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 다시 발효시키는 단계를포함하는 것을 특징으로 하는 유기산제의 제조방법.
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Cited By (3)
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2007
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