CN103555604A

CN103555604A - 能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌及其分离方法

Info

Publication number: CN103555604A
Application number: CN201310096605.0A
Authority: CN
Inventors: 李兰娟; 吕龙贤; 胡新俊; 钱贵荣
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-03-25
Filing date: 2013-03-25
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2033-03-25
Also published as: CN103555604B

Abstract

本发明公开了一种能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌及其分离方法。所述唾液乳酸杆菌拉丁名为LactobacillussalivariusLI01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.7045。本发明公开了该菌的形态学特征为：菌体杆状，不产孢子，无运动性，革兰氏染色呈阳性。本发明公开了该菌的全细胞脂肪酸主要成份为：16:0约38.48%，18:1w9c约8.29%，19:0cyclow10c/19w6约14.68%，18:0约5.94%，19:0cyclow10c/19w6约12.75%，19:0cyclow8c约11.55%，19:1w6c约12.75%，18:1w7c约14.68%。本发明还公开了该菌的16S核糖体DNA(16SrDNA)全序列。本发明公开的分离筛选方法包括三个步骤：MRS营养培养基富集培养，以白色念珠菌覆盖层初筛，以液体共培养复筛。该方法快捷有效，所得菌种抗白念能力强。

Description

能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌及其分离方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌及其分离方法。

背景技术

白色念珠菌又称白假丝酵母菌（candida Albicans），广泛存在于自然界和人的皮肤、口腔、上呼吸道、肠道及阴道，是一种条件致病性真菌。健康状态下，人体表或体内的白色念珠菌数量较少，不引起疾病。当机体免疫力下降或微生态受到破坏等特殊情况下，白色念珠菌大量生长，引起急性、亚急性或慢性感染，是最常见的真菌病。可能诱发白色念珠菌感染的因素有：获得性免疫缺陷综合症（AIDS），基因缺陷，抗生素和免疫抑制剂的使用，肿瘤及肿瘤放化疗，器官移植等。

皮肤念珠菌病好发于皮肤皱褶处（腑窝、腹股沟，乳房下，肛门周围及甲沟，指间），表现为皮肤潮红、潮湿、发亮，有时盖上一层白色或呈破裂状物，病变周围有小水泡。粘膜念珠菌病以鹅口疮、口角炎、阴道炎最多见，在粘膜表面盖有凝乳大小不等的白色薄膜，剥除后，留下潮红基底，并产生裂隙及浅表溃疡。念珠菌疹是念珠菌及其代谢产物引起的皮肤变态反应，主要损害为成群的无菌性水疱，多见于手指间，也可见到银屑病样、玫瑰糠疹样、脂溢性皮炎样、荨麻疹样、离心性环状红斑样损害。白色念珠菌经血液入侵并扩散到全身时，可导致严重的感染，常见的有肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑膜炎、脑炎等，偶尔也可发生败血症，在院内感染中十分常见，且不易诊断治疗，致死率极高。近年来随着大剂量抗生素、激素、免疫抑制剂的应用，以及器官移植术的开展，白色念珠感染发病率渐趋增高，常可危及生命造成严重后果。

抗真菌药物是目前治疗白色念珠菌感染最常用的手段。同时，使患者远离可能含有白色念珠菌的食品，并禁食有利于酵母菌生长的食物，也是需要采取的措施之一。如有可能，抗生素或免疫抑制剂应该被停用，或者减少到不得不使用的最低剂量。然而，很多请况下，即使三种治疗手段同时应用，也不能使病人完全摆脱白色念珠菌的困扰。一旦停用抗真菌药物，白色念珠菌感染就会复发。因此，造成相关感染的根本原因并不在白色念珠菌本身，提高人体免疫力并恢复微生态平衡才是解决问题的根本途径。

益生菌尤其是乳酸杆菌在维护微生态平衡、防治感染中具有重要作用。乳酸杆菌在生长过程中，需要大量的营养物质，从而减少了可供有害微生物生长的营养成分；能够分泌过氧化氢、硫化氢和抗菌肽等物质，直接抑制或杀灭有害菌生长；通过分泌乳酸等有机酸降低环境pH值，减少白色念珠菌等滋生；与表皮细胞的黏膜黏附占位，避免条件致病菌对机体接触与侵袭；调节增强免疫能力，主动杀灭有害菌；促进表皮细胞增生等重要功能。不同乳酸杆菌的抗菌能力和抗菌谱差别很大，筛选具有抗白色念珠菌功能的乳酸杆菌，对于防治感染，保护和促进人类健康都具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌及其分离方法。

能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius Li01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7045，保藏时间2012年12月26日，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码100101。

所述的能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌形态学特征为：菌体为杆状，不产孢子，无运动性。革兰氏染色呈阳性，在营养琼脂培养基上形成白色群落。理化的特征如下：能发酵葡萄糖，果糖，蜜二糖，海藻糖，乳糖，甘露糖醇，甘露糖，棉子糖，蔗糖，半乳糖，鼠李糖，麦芽糖和山梨糖醇产酸，不能利用阿拉伯糖，木糖，纤维二糖，松三糖，甲基AD-葡萄糖苷，甲基AD-甘露糖苷，水杨苷，甘油或山梨糖发酵产酸。

能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌的16S核糖体DNA(16S rDNA)全序列为SEQ ID NO：1所示。

能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌的全细胞水解脂肪酸含量为：

一种能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌的分离方法包括如下步骤：

1）分别取少量来自不同健康人不同部位含微生物样本，加入到0.5～10毫升富集培养基中，20～37⁰C、厌氧条件下，富集培养24～72小时；

2）将上述样本富集培养基，稀释后100～10000倍后，取50～300微升涂布到筛选平板上，20～37⁰C厌氧培养24～72小时；

3）取对数生长期的白色念珠菌，加入到灭菌后冷却到40～60⁰C的半固体培养基，混合均匀，最终浓度10⁷～10⁸个；

4）将3-10毫升上述40～60⁰C新鲜配置的含有白色念珠菌的半固体培养基，铺到筛选平板上，37⁰C好氧培养12～48小时，观察抑菌圈；

5）从筛选平板中，菌斑上方有白色念珠菌抑菌圈的菌斑中挑取菌落，在复筛液体培养基中培养12～36小时，离心、过滤去除微生物，接入0.5%～5%的对数生长期的白色念珠菌，比较并选取能较好抑制白色念珠菌生长的菌株。

所述的富集培养基的成份为：蛋白胨5～10克,牛肉膏 5～10克,酵母提取物2～5克,葡萄糖5～10克,乳果糖2～5克，吐温80 0.5～1克,磷酸氢二钾1～2克,三水乙酸钠2～5克,柠檬酸二铵1～2克,七水硫酸镁0.2～0.5克, 四水硫酸锰 0.03～0.07克，pH6.0～7.0，蒸馏水 900～100毫升。

所述的筛选平板培养基的成份为：酵母提取物3～8克，胰蛋白胨8～12克，葡萄糖5～15克，磷酸二氢钾4～8克，硫酸亚铁0.02～0.05克，七水硫酸镁0.4～0.8克，三水乙酸钠20～30克，柠檬酸二铵1～3克，四水硫酸锰0.1～0.2克，琼脂 15～25克，吐温80 0.5～1克，pH值5.0～6.0。

所述的半固体培养基的成份为：琼脂粉3～10克，蛋白胨5～10克,酵母提取物3～5克,葡萄糖15～20克,吐温80 0.5～1克,磷酸氢二钾1～2克,醋酸钠2～5克, pH5.5～6.5，蒸馏水 900～100毫升。

所述的复筛液体培养基的成份为：蛋白胨5～10克,牛肉膏 5～10克,酵母提取物3～5克,葡萄糖15～20克,吐温80 0.5～1克,磷酸氢二钾1～2克,醋酸钠2～5克,柠檬酸二铵1～2克,七水硫酸镁0.2～0.5克, 四水硫酸锰 0.03～0.07克，pH6.0～7.0，蒸馏水 900～100毫升。

经与其他菌种和分离方法比较、反复试验验证，本发明的优点是：

1）所述的能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌所需的发酵周期短、抑菌性能强、操作过程简便、发酵成本低、后处理步骤简单。

2）所述的唾液乳酸杆菌自身生长过程中能够抑制白色念珠菌生长，且不含菌体的发酵液也具有良好的抑制白色念珠菌生长功能。

3)所述的能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌具有较广泛的抗菌谱，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、志贺氏菌、肺炎链球菌等都具有良好的抑制效果。

4）所述的能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌具有良好的耐酸、耐胆汁等能力，是一种潜在的益生菌，在治疗皮肤、阴道、消化道等的白色念珠菌感染等方面有着广泛的应用前景。

5）所述的分离方法具有简单有效，针对性强，假阳性结果少的优点。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是唾液乳酸杆菌Lactobacillus salivarius LI01的16SrDNA序列的系统进化分析图。

具体实施方式

实施例1

1）取0.5克来自不同健康人的新鲜粪便样本，分别加入到10毫升富集培养基中， 37⁰C、厌氧条件下，富集培养24小时；富集培养基的成份为：蛋白胨5克,牛肉膏 5克,酵母提取物2克,葡萄糖8克,乳果糖2克，吐温80 0.5克,磷酸氢二钾2克,三水乙酸钠2克,柠檬酸二铵2克,七水硫酸镁0.2克, 四水硫酸锰 0.03克，蒸馏水 950毫升，pH6.2。

2）将上述样本富集培养基稀释1000倍后，取100微升涂布到筛选平板上， 37⁰C厌氧培养48小时；筛选平板培养基的成份为：酵母提取物5克，胰蛋白胨8克，葡萄糖10克，磷酸二氢钾4克，硫酸亚铁0.02克，七水硫酸镁0.4克，三水乙酸钠20克，柠檬酸二铵1克，四水硫酸锰0.2克，琼脂 15克，吐温80 0.5克，蒸馏水 950毫升，pH值5.5。

3）取对数生长期的白色念珠菌，加入到灭菌后冷却到45⁰C的半固体培养基，混合均匀，最终浓度5x10⁷个；半固体培养基的成份为：琼脂粉7克，蛋白胨5克,酵母提取物3克,葡萄糖15克,吐温80 0.5克,磷酸氢二钾2克,醋酸钠3克, 蒸馏水 900～100毫升，pH6.5。

4）将7毫升上述45⁰C新鲜配置的含有白色念珠菌的半固体培养基，铺到筛选平板上，37⁰C好氧培养24小时，观察抑菌圈。

5）从筛选平板中，菌斑上方有白色念珠菌抑菌圈的菌斑中挑取菌落，在复筛液体培养基中培养24小时，离心、过滤去除微生物，接入1%的对数生长期的白色念珠菌，比较并选取能较好抑制白色念珠菌生长的菌株。复筛液体培养基的成份为：蛋白胨10克,牛肉膏 5克,酵母提取物5克,葡萄糖15克,吐温80 1克,磷酸氢二钾2克,醋酸钠2克,柠檬酸二铵2克,七水硫酸镁0.5克, 四水硫酸锰 0.07克，蒸馏水 960毫升，pH6.0。

实施例2

1）分别取0.2克来自不同健康女性的阴道分泌物样本，加入到5毫升富集培养基中，37⁰C、厌氧条件下，富集培养24小时；富集培养基的成份为：蛋白胨8克,牛肉膏 6g,酵母提取物4克,葡萄糖6克,乳果糖3克，吐温80 0.7克,磷酸氢二钾1.5克,三水乙酸钠4克,柠檬酸二铵1克,七水硫酸镁0.3克, 四水硫酸锰 0.04克，蒸馏水 950毫升，pH6.2。

2）将上述样本富集培养基，稀释后5000倍后，取200微升涂布到筛选平板上，37⁰C厌氧培养24小时；筛选平板培养基的成份为：酵母提取物4克，胰蛋白胨10，葡萄糖8克，磷酸二氢钾48克，硫酸亚铁0.04克，七水硫酸镁0.6克，三水乙酸钠25克，柠檬酸二铵3克，四水硫酸锰0.2克，琼脂 18克，吐温80 0.6克，蒸馏水 950毫升，pH值5.6。

3）取对数生长期的白色念珠菌，加入到灭菌后冷却到50⁰C的半固体培养基，混合均匀，最终浓度10⁸个；半固体培养基的成份为：琼脂粉5克，蛋白胨9克,酵母提取物3克,葡萄糖15克,吐温80 0.9克,磷酸氢二钾2克,醋酸钠3克, pH5.8，蒸馏水 970毫升。

4）将8毫升上述50⁰C新鲜配置的含有白色念珠菌的半固体培养基，铺到筛选平板上，37⁰C好氧培养48小时，观察抑菌圈；复筛液体培养基的成份为：蛋白胨5克,牛肉膏 6克,酵母提取物5克,葡萄糖16克,吐温80 0.7克,磷酸氢二钾1.5克,醋酸钠3克,柠檬酸二铵2克,七水硫酸镁0.3克, 四水硫酸锰 0.04克，蒸馏水 950毫升，pH6.4。

5）从筛选平板中，菌斑上方有白色念珠菌抑菌圈的菌斑中挑取菌落，在复筛液体培养基中培养18小时，离心、过滤去除微生物，接入1.2%的对数生长期的白色念珠菌，比较并选取能较好抑制白色念珠菌生长的菌株。

实施例3

1）分别取200微升来自不同健康人的唾液样本，加入到5毫升富集培养基中， 37⁰C、厌氧条件下，富集培养48小时；富集培养基成份为：蛋白胨6克,牛肉膏5.5克,酵母提取物3克,葡萄糖7克,乳果糖3克，吐温80 0.7克,磷酸氢二钾1.5克,三水乙酸钠2.5克,柠檬酸二铵1.5克,七水硫酸镁0.3克, 四水硫酸锰 0.04克，pH6.5，蒸馏水 960毫升。

2）将上述样本富集培养基，稀释后4000倍后，取100微升涂布到筛选平板上， 37⁰C厌氧培养48小时；筛选平板培养基的成份为：酵母提取物4克，胰蛋白胨9，葡萄糖10克，磷酸二氢钾5克，硫酸亚铁0.05克，七水硫酸镁0.8克，三水乙酸钠25克，柠檬酸二铵2克，四水硫酸锰0.2克，琼脂 18克，吐温80 0.8克，pH值6.0, 蒸馏水 950毫升。

3）取对数生长期的白色念珠菌，加入到灭菌后冷却到46⁰C的半固体培养基，混合均匀，最终浓度5x10⁷个；半固体培养基的成份为：琼脂粉6克，蛋白胨7克,酵母提取物4克,葡萄糖16克,吐温80 0.8克,磷酸氢二钾2克,醋酸钠3克, pH5.5，蒸馏水 950毫升。

4）将7毫升上述46⁰C新鲜配置的含有白色念珠菌的半固体培养基，铺到筛选平板上，37⁰C好氧培养24小时，观察抑菌圈；复筛液体培养基的成份为：蛋白胨7克,牛肉膏 6克,酵母提取物4克,葡萄糖15克,吐温80 0.7克,磷酸氢二钾1.5克,醋酸钠3克,柠檬酸二铵2克,七水硫酸镁0.3克, 四水硫酸锰 0.05克，pH6.5，蒸馏水 960毫升。

5）从筛选平板中，菌斑上方有白色念珠菌抑菌圈的菌斑中挑取菌落，在复筛液体培养基中培养20小时，离心、过滤去除微生物，接入1.2%的对数生长期的白色念珠菌，比较并选取能较好抑制白色念珠菌生长的菌株。

实施例4

1）取唾液乳酸杆菌Lactobacillus salivarius LI01单克隆，加入到5毫升富集培养基中， 37⁰C、厌氧条件下，富集培养24小时；富集培养基的成份为：蛋白胨6克,牛肉膏 6克,酵母提取物3克,葡萄糖7克,乳果糖4克，吐温80 0.6克,磷酸氢二钾1.5克,三水乙酸钠3克,柠檬酸二铵1.5克,七水硫酸镁0.3克, 四水硫酸锰 0.05克，蒸馏水 950毫升，pH6.2。

2）取唾液乳酸杆菌Lactobacillus salivarius LI01富集培养基2微升，无菌条件下滴种到筛选平板上，37⁰C厌氧培养24小时；筛选平板培养基的成份为：酵母提取物6克，胰蛋白胨10克，葡萄糖7克，磷酸二氢钾6克，硫酸亚铁0.04克，七水硫酸镁0.4克，三水乙酸钠25克，柠檬酸二铵2克，四水硫酸锰0.2克，琼脂 15克，吐温80 0.6克，蒸馏水 950毫升，pH值5.5。

3）取对数生长期的白色念珠菌，加入到灭菌后冷却到45⁰C的半固体培养基，混合均匀，最终浓度8x10⁷个；半固体培养基的成份为：琼脂粉6克，蛋白胨7克,酵母提取物7克,葡萄糖5克,吐温80 0.6克,磷酸氢二钾1.6克,醋酸钠4克, 蒸馏水 900～100毫升，pH6.5。

4）将6毫升上述45⁰C新鲜配置的含有白色念珠菌的半固体培养基，铺到滴种唾液乳酸杆菌Lactobacillus salivarius LI01的筛选平板上，37⁰C好氧培养24小时，抑菌圈大小在8～20mm。

实施例5

1）取唾液乳酸杆菌Lactobacillus salivarius LI01单克隆，加入到6毫升富集培养基中， 37⁰C、厌氧条件下，富集培养24小时；富集培养基的成份为：蛋白胨6克,牛肉膏 7克,酵母提取物4克,葡萄糖8克,乳果糖3克，吐温80 0.5克,磷酸氢二钾1.4克,三水乙酸钠2克,柠檬酸二铵克,七水硫酸镁0.4克, 四水硫酸锰 0.03克，蒸馏水 950毫升，pH6.2。

2）取唾液乳酸杆菌Lactobacillus salivarius LI01富集培养基，8000rpm离心5分钟，取上清过滤除菌，用上述富集培养基分别稀释到40%、60%、80%和100%的浓度。

3）分别取2微升对数生长期的白色念珠菌，加入到198微升上述40%、60%、80%和100%浓度的唾液乳酸杆菌Lactobacillus salivarius LI01发酵液中，37⁰C好氧培养24小时，抑菌率分别在30%、50%、70%和100%左右。

实施例6

唾液乳酸杆菌Lactobacillus salivarius LI01的16SrDNA序列的系统进化分析实例见附图1：

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。

本发明可用其他的不违背本发明的精神和主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims

1.一种能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌Lactobacillus salivarius LI01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7045。

2.根据权利要求1所述的一种能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌，其特征在于所述的唾液乳酸杆菌形态学特征为：菌体杆状，不产孢子，无运动性，革兰氏染色呈阳性，在MRS琼脂培养基上形成乳白色群落。

3.根据权利要求1所述的一种能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌，其特征在于所述唾液乳酸杆菌的16S核糖体DNA全序列如SEQ ID NO：1所示。

4.根据权利要求1所述的一种能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌，其特征在于所述的唾液乳酸杆菌的全细胞水解脂肪酸组成为：

。

5.一种根据权利要求1所述的一种能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌的分离方法，其特征在于包括如下步骤：

2）将上述样本富集培养基，稀释100～10000倍后，取50～300微升涂布到筛选平板上，20～37⁰C厌氧培养24～72小时；

3）取对数生长期的白色念珠菌，加入到灭菌后冷却到40～60⁰C的半固体培养基，混合均匀，最终浓度10⁷～10⁸个/毫升；

5）从筛选平板中，菌斑上方有白色念珠菌抑菌圈的菌斑中挑取菌落，在复筛液体培养基中培养12～36小时，离心、过滤去除微生物，接入1%～5%的对数生长期的白色念珠菌，比较并选取能较好抑制白色念珠菌生长的菌株。

6.根据权利要求5所述的一种能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌的分离方法，其特征在于所述的富集培养基的成份为：蛋白胨5～10克,牛肉膏 5～10克,酵母提取物2～5克,葡萄糖5～10克,乳果糖2～5克，吐温80 0.5～1克,磷酸氢二钾1～2克,三水乙酸钠2～5克,柠檬酸二铵1～2克,七水硫酸镁0.2～0.5克, 四水硫酸锰 0.03～0.07克，pH6.0～7.0，蒸馏水 900～100毫升。

7.根据权利要求5所述的一种能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌的分离方法，其特征在于所述的筛选平板培养基的成份为：酵母提取物3～8克，胰蛋白胨8～12，葡萄糖5～15克，磷酸二氢钾4～8克，硫酸亚铁0.02～0.05克，七水硫酸镁0.4～0.8克，三水乙酸钠20～30克，柠檬酸二铵1～3克，四水硫酸锰0.1～0.2克，琼脂 15～25克，吐温80 0.5～1克，pH值5.0～6.0。

8. 根据权利要求5所述的一种能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌的分离方法，其特征在于所述的半固体培养基的成份为：琼脂粉3～10克，蛋白胨5～10克,酵母提取物3～5克,葡萄糖15～20克,吐温80 0.5～1克,磷酸氢二钾1～2克,醋酸钠2～5克, pH5.5～6.5，蒸馏水 900～100毫升。

9.根据权利要求5所述的一种能够抑制白色念珠菌生长的唾液乳酸杆菌的分离方法，其特征在于所述的复筛液体培养基的成份为：蛋白胨5～10克,牛肉膏 5～10克,酵母提取物3～5克,葡萄糖15～20克,吐温80 0.5～1克,磷酸氢二钾1～2克,醋酸钠2～5克,柠檬酸二铵1～2克,七水硫酸镁0.2～0.5克, 四水硫酸锰 0.03～0.07克，pH6.0～7.0，蒸馏水 900～100毫升。