CN104232537A

CN104232537A - 一株弯曲乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN104232537A
Application number: CN201410446067.8A
Authority: CN
Inventors: 朱宝利; 张瑞芬; 李晶; 王江
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Beijing Yisheng Garden Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2014-09-03
Filing date: 2014-09-03
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2034-09-03
Also published as: CN104232537B

Abstract

本发明公开了一株弯曲乳杆菌及其应用。本发明公开一株弯曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，其保藏编号为CGMCC No.9388。本发明公开的弯曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)IMC-12，具有较强的产生H₂O₂的能力，可有效抑制外来的病原菌和其他条件致病菌的生长，同时又具有较强的对阴道上皮细胞的粘附作用，保证了菌株在阴道上皮的定植，弯曲乳杆菌IMC-12在泌尿生殖道感染防治方面具有一定的应用前景。

Description

一株弯曲乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株弯曲乳杆菌及其应用，属于微生物领域。

背景技术

泌尿生殖道感染为妇女最为常见但又未受到重视的多发病,发病率仅次于呼吸道感染，可高达40％；女性泌尿生殖道感染是尿路感染和生殖道感染的总称，它不仅直接影响妇女的身心健康,而且也会影响众多家庭的幸福和稳定,进而影响全社会的人口质量和经济发展。女性尿路感染常见的病原是革兰氏阴性杆菌,其中以大肠埃希菌最多见,葡萄球菌次之；这些多数为人体肠道及皮肤黏膜上的正常菌群,由于机体免疫力下降,这些细菌可由肠道及皮肤粘膜等寄居部位迁移至泌尿系统并大量繁殖引起尿路感染。女性常见的生殖道感染病原包括滴虫、霉菌和衣原体等，生殖道感染绝大多数先由阴道感染而起；因病情迁延扩散可引起盆腔炎,并导致不孕症。泌尿生殖道感染是“小疾病，大麻烦”，还可增加艾滋病和淋病等性病的危险；患者生活质量明显下降，精神负担很重。妊娠妇女可出现一系列妊娠并发症，如早产及绒毛膜羊膜炎等不良妊娠结局；分娩时由产道还可直接使新生儿受同类病原体感染而致病。

目前，泌尿生殖道感染的治疗主要依靠各种抗生素,但治疗效果不佳，治愈率在40％以下，而且复发的比例很高，可达40％以上。原因主要是患者生殖道内耐药性病原菌的存在致使抗生素失效；另外，抗生素治疗即使可以杀死病原菌，但同时也杀死了有益菌(益生菌)，因此，难以恢复健康状态下的泌尿生殖道优势菌群。

健康育龄妇女泌尿生殖道内存在着大量的细菌，总称为泌尿生殖道菌群，其中包括多种不同种类的细菌，可粗略分为“有益菌”和“致病菌”两大类，其中乳酸杆菌是维持泌尿生殖道健康最常见和最重要的有益菌(“正义菌”)，大肠埃希菌、葡萄球菌、滴虫、霉菌和衣原体则为致病菌(“邪恶菌”)。某些因素导致某一种致病菌异常增殖，引起泌尿生殖道感染。阴道内细菌种类的变化与妇女和胎儿的健康密切相关，其中的弯曲乳杆菌和詹氏乳酸杆菌是维持阴道健康微生态环境的主要优势“正义菌”，可占健康泌尿生殖道菌群细菌总量的90％以上。它们主要通过抑制外来的病原菌和其他条件致病菌(“邪恶菌”)的生长和侵入来维持泌尿生殖道菌群的健康环境，“正义菌(有益菌)”战胜“邪恶菌”的作用机制主要包括以下几方面：(1)通过分解阴道黏膜上皮中贮存的糖原产生乳酸、乙酸等酸性物质，维持阴道的酸性环境,以抑制病原菌的的生长；(2)产生过氧化氢和乳酸菌素等多种抑菌物质,用以杀死入侵的病原菌；(3)乳酸杆菌类有益菌通过在阴道黏膜上皮定植后,会形成先入为主的占位保护作用,阻止病原微生物的入侵。

育龄妇女随年龄增长,阴道内弯曲乳杆菌或詹氏乳酸杆菌数量会逐渐减少。绝经后,卵巢雌激素分泌逐渐停止,阴道上皮细胞糖原储备缺乏,阴道pH上升,弯曲乳杆菌或詹氏乳酸杆菌会进一步减少,致病菌因而增多。所以，弯曲乳杆菌或詹氏乳酸杆菌对老年妇女的泌尿生殖健康也具有重要作用。

微生态学理论认为,通过生态制剂调整疗法,扶正和保护阴道内的优势菌群的组成和比例,可以驱除外来“邪恶的”致病菌的侵扰,提高妇女本身固有的“扶正祛邪”的自我保护作用。乳杆菌是健康妇女阴道菌群的优势菌群，占阴道细菌总量90％以上，泌尿生殖道感染患者阴道乳酸杆菌明显减少，有的甚至完全检测不到，因此，丧失了抵御外来病原菌感染的能力。而通过补充缺失的乳杆菌，则有利于重建女性泌尿生殖道的优势菌群，恢复其固有的“扶正祛邪”的保护作用。

泌尿生殖道感染是妇女的常见病、多发病、易于复发,用抗生素虽有较好的短期疗效,但却有40％的复发率。研究证明：有保护作用的优势菌株—弯曲乳杆菌或詹氏乳酸杆菌的制剂将更容易在阴道内定居和增殖,并产生抗菌物质,发挥持久的作用。因此，开发适应我国妇女特点的特异性阴道乳杆菌制剂市场前景广阔，改变以往在治疗泌尿生殖道感染上的纯粹杀菌的用药指导思想，避免由于大量应用抗生素作为治疗所带来的一系列不良反应和弊端，有利于恢复女性泌尿生殖道的优势菌群并重建其微生态平衡；从而有效降低泌尿生殖道感染的复发率，真正治愈女性泌尿生殖道感染。

目前，国内女性泌尿生殖道感染用益生菌菌剂只有一种，其主要成分是德氏乳杆菌活菌。虽然它是从健康妇女阴道分离出来的一种乳杆菌，但不是我国妇女阴道菌群中的主要有益菌，我国健康妇女阴道细菌以弯曲乳杆菌为主。

发明内容

本发明的目的是提供一株弯曲乳杆菌及其应用。

本发明提供一株弯曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，其保藏编号为CGMCCNo.9388；

所述弯曲乳杆菌的菌落直径大小约1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落，菌落边缘整齐、较湿润，大小形态稳定；革兰染色阳性；处于对数生长期的所述弯曲乳杆菌经鉴定为无芽胞的杆菌，无鞭毛；兼性厌氧，生长最适温度37-42℃，最适pH5.8-6.2，可发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖等多种糖。

一种菌剂也属于本发明的保护范围，含有上述弯曲乳杆菌和/或上述弯曲乳杆菌的发酵物。

上述弯曲乳杆菌或上述菌剂在制备维持酸性环境的产品中的应用也属于本发明的保护范围；

所述酸性环境具体为泌尿生殖道的酸性环境，再具体为人的泌尿生殖道的酸性环境；

所述泌尿生殖道具体为阴道。

上述弯曲乳杆菌或上述菌剂在制备抑制病原菌和/或条件致病菌的生长和/或繁殖的产品中的应用也属于本发明的保护范围；

所述病原菌和/或条件致病菌具体为泌尿生殖道的病原菌和/或条件致病菌，再具体为人的泌尿生殖道的病原菌和/或条件致病菌；

所述泌尿生殖道具体为阴道。

上述弯曲乳杆菌或上述菌剂在制备对泌尿生殖道的上皮细胞具有粘附定植能力的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述弯曲乳杆菌或上述菌剂在制备预防和/或治疗泌尿生殖道感染的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述弯曲乳杆菌或上述菌剂在制备预防和/或治疗泌尿生殖道感染进而引发的疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述的应用中，所述泌尿生殖道为阴道。

本发明提供的弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-12，具有较强的产生H₂O₂的能力，可有效抑制外来的病原菌和其他条件致病菌的生长，同时又具有较强的对阴道上皮细胞的粘附作用，保证了菌株在阴道上皮的定植。弯曲乳杆菌IMC-12在泌尿生殖道感染防治方面具有一定的应用前景。

附图说明

图1为弯曲乳杆菌IMC-12菌落。

图2为弯曲乳杆菌IMC-12与阴道上皮细胞的粘附作用。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

健康妇女阴道分泌物样品由瀚思维康健康管理机构提供。

MRS液体培养基的制备：将蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)5.0g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)2.0g，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.58g，硫酸锰(MnSO₄·H₂O)0.25g溶于蒸馏水，并用蒸馏水定容至1000mL，调至pH至6.2-6.6。

实施例1、弯曲乳杆菌菌株的分离和鉴定

一、弯曲乳杆菌菌株的分离

将收集的200余例临床检测无阴道炎症状体征的健康妇女阴道分泌物样品依次编号，并接种于MRS液体培养基，37℃厌氧培养24h。每个样本随机挑选5个单菌落于2mL MRS液体培养基中培养增菌24h，并对菌落依次编号。将分离到的数百株细菌分别进行菌种鉴定、产过氧化氢及与阴道上皮细胞粘附作用的检测，把其中一株具有较强粘附作用且产过氧化氢的弯曲乳杆菌命名为IMC-12。

二、弯曲乳杆菌菌株的鉴定

(一)形态学鉴定

在MRS乳酸杆菌培养基平板上，上述步骤一分离得到的菌株IMC-12表现为菌落直径大小约1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落，且菌落边缘整齐、较湿润，大小形态稳定(如图1所示)。

处于对数生长期的所述弯曲乳杆菌经鉴定为：革兰染色阳性，无芽胞的杆菌，无鞭毛。

(二)生理生化特征分析

菌株IMC-12兼性厌氧，生长最适温度37-42℃，最适pH5.8-6.2。根据API细菌鉴定标准，利用API 50 CHL培养基和API 50 CH试剂条(购自bioMe′rieux,Inc.,Marcy l’Etoile,France)对检测菌株IMC-12进行糖发酵反应判读检测菌株IMC-12的生理生化特征。API 50 CHL是由49种可发酵碳水化合物的API 50 CH试验条组成的简易培养基。以检测菌株IMC-12制成悬液接种试验条的每一个小管。当培养时，由于发酵碳水化合物产酸，pH下降，使指示剂变色。

结果显示，菌株IMC-12可发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖等多种糖。

(三)16s rDNA序列同源性分析

提取菌株IMC-12的总DNA作为模板，采用通用引物27f和1492r进行PCR扩增，得到含有菌株IMC-1216S rRNA基因保守区的片段。

27f(上游引物)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID No.1)；

1492r(下游引物)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID No.2)。

PCR体系(25μL)：PCR扩增缓冲液，终浓度为200μmol/L dNTPs，终浓度均为0.2μmol/L的上游及下游引物，1 U Taq DNA聚合酶，1μL模板DNA，余量为ddH₂O。

PCR条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸30s，共25个循环；72℃延伸10min。

PCR扩增得到的菌株IMC-12的16s rDNA的序列如SEQ ID No.3所示。

菌株IMC-12的分类命名为弯曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，该菌株已于2014年6月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.9388。

实施例2、弯曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)IMC-12的功能分析

一、弯曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)IMC-12产H₂O₂的检测

(一)H₂O₂标准曲线的制作：首先用浓度为100mmol/L的哌嗪-N,N'-二-乙磺酸(Piperazine-N,N_-Bis 2-ethanesulfonic acid，PIPES)的水溶液将体积百分含量为30％的H₂O₂水溶液(相当于9.128mol/L)储存液稀释成1mol/L，再用100mmol/LPIPES的水溶液将上述1mol/L的H₂O₂分别稀释成20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L，将上述各稀释液以及100mmol/L PIPES的水溶液记作H₂O₂工作液；然后分别取100μL上述H₂O₂工作液与100μL浓度为20mmol/L的TMB(四甲基联苯胺)的水溶液、2μL浓度为1mg/mL的辣根过氧化物酶(购自TaKaRa公司)混合，16℃孵育10min，测量OD₆₃₀值。以H₂O₂的浓度(单位：μmol/L)为横坐标，OD₆₃₀为纵坐标，制作标准曲线，得到标准曲线公式y＝0.0033x-0.0496，R²＝0.992。

(二)弯曲乳杆菌IMC-12液体培养H₂O₂浓度检测：挑取弯曲乳杆菌IMC-12菌落，将其接种于MRS液体培养基，在厌氧条件下进行培养48h，取1mL接种于10mL MRS液体培养基中，使培养液中菌的浓度为10⁵cfu/ml，于厌氧环境下，37℃静置培养21h后，转换为37℃振荡培养3h，转速为220r/min，旋转半径为2.54cm。培养结束后，收集培养液，12000r/min离心2min，得上清。取100μL上清与100μL浓度为20mmol/L的TMB(四甲基联苯胺)的水溶液、2μL浓度为1mg/mL的辣根过氧化物酶(购自TaKaRa公司)混合，16℃孵育10min，测量OD₆₃₀值，将其带入步骤(一)得到的标准曲线公式，计算上清中的H₂O₂浓度。实验重复三次，结果取平均值。

结果如表1所示。

表1 弯曲乳杆菌IMC-12产生H₂O₂的能力检测

	重复1	重复2	重复3	平均值
					H₂O₂产量(μM)	1216.3	960.5	494.1	890.3

表1表明，弯曲乳杆菌IMC-12在发酵培养液中能够产生大量的H₂O₂，其浓度高达890.3μM。

二、弯曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)IMC-12对阴道上皮细胞的粘附作用

(一)阴道上皮细胞取自于100余例健康(临床检测显示无生殖系统感染)育龄期妇女，将各细胞样品标号后分别加入MEM培养基(pH 4.0)，120g离心10分钟，再重复离心2次，洗掉表面细菌，用MEM培养基调整阴道上皮细胞浓度为10⁵个/mL。

(二)活化过夜培养的弯曲乳杆菌IMC-12使其浓度为10⁸CFU/mL。

(三)将步骤(一)得到的浓度为10⁵个/mL的阴道上皮细胞与步骤(二)得到的浓度为10⁸CFU/mL的弯曲乳杆菌IMC-12各500μL等体积混合后置于37℃摇床(转速为100r/min，旋转半径为2.54cm)孵育1h，然后用0.8μm滤膜过滤，去掉游离的弯曲乳杆菌IMC-12，并将滤膜轻压于盖玻片上，固定细胞进行革兰氏染色后油镜观察，分别计数三个阴道上皮细胞粘附的弯曲乳杆菌IMC-12细菌数，计算每个阴道上皮细胞平均粘附的弯曲乳杆菌IMC-12细菌数。

同时对阴道上皮细胞进行革兰氏染色后油镜观察，作为对照。

结果如图2所示。

图2中，A为粘附弯曲乳杆菌IMC-12的阴道上皮细胞；B为分离于健康育龄期妇女的阴道上皮细胞(对照)。

图2表明，弯曲乳杆菌IMC-12对分离自100余例健康育龄期妇女的阴道上皮细胞均具有较强的粘附作用。

从100余例中，随机选取4例，进行统计分析，结果如表2所示。表2表明，每个阴道上皮细胞平均粘附弯曲乳杆菌IMC-12的数量达214个。

表2阴道上皮细胞粘附弯曲乳杆菌IMC-12的数量统计

综合以上结果，弯曲乳杆菌IMC-12既具有较强的产生H₂O₂的能力(可有效抑制病原菌和其他条件致病菌的生长)，又具有较强的对阴道上皮细胞的粘附作用(保证了菌株在阴道上皮的定植)，这就使得弯曲乳杆菌IMC-12成为有效防治泌尿生殖道感染的候选益生菌菌株。

Claims

1.一株弯曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，其保藏编号为CGMCC No.9388。

2.一种菌剂，含有权利要求1所述的弯曲乳杆菌和/或权利要求1所述的弯曲乳杆菌的发酵物。

3.权利要求1所述的弯曲乳杆菌或权利要求2所述的菌剂在制备维持酸性环境的产品中的应用。

4.权利要求1所述的弯曲乳杆菌或权利要求2所述的菌剂在制备抑制病原菌和/或条件致病菌的生长和/或繁殖的产品中的应用。

5.权利要求1所述的弯曲乳杆菌或权利要求2所述的菌剂在制备对泌尿生殖道的上皮细胞具有粘附定植能力的产品中的应用。

6.权利要求1所述的弯曲乳杆菌或权利要求2所述的菌剂在制备预防和/或治疗泌尿生殖道感染的产品中的应用。

7.权利要求1所述的弯曲乳杆菌或权利要求2所述的菌剂在制备预防和/或治疗泌尿生殖道感染进而引发的疾病的产品中的应用。

8.根据权利要求5-7任一所述的应用，其特征在于：所述泌尿生殖道为阴道。