CN105400724A - 一株弯曲乳酸杆菌及其微生态制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株弯曲乳酸杆菌及其微生态制剂。本发明所提供的弯曲乳杆菌具体为弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159,本发明的弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159具有较强的产H2O2能力;同时又具有较强的对阴道上皮细胞的粘附作用,保证了菌株在阴道上皮的定植。本发明所提供的弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159在泌尿生殖道感染防治方面具有一定的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一株弯曲乳酸杆菌及其微生态制剂,特别涉及一株分离自人体的用于防治妇女泌尿生殖道感染的弯曲乳杆菌。
背景技术
泌尿生殖道感染是严重影响广大妇女身心健康的常见病,多是大肠杆菌或金黄色葡萄球菌感染,患病率高达40%;其治疗主要依靠抗生素,但治愈率偏低,复发率可达40%以上。
为了降低泌尿生殖道感染的复发率,临床上急需新的治疗方案。由于抗生素治疗泌尿生殖道感染效果欠佳和抗生素治疗引起的肝、肾损害等毒副作用,国内外一直在努力探索基于益生菌乳杆菌制剂的微生态疗法。微生态治疗是将以杀灭微生物为主要的治疗方法变为增加益生菌、恢复阴道正常微生态环境为目的的新型治疗理念。即在利用抗生素清除致病菌后,直接补充自健康妇女阴道分离的乳杆菌活菌制剂,使其粘附定植下来,促进其天然的抵抗致病菌生长的能力。
一个完善而有效的益生菌菌种,其本身至少必须具备下述标准:(1)须为宿主应用位置正常定植菌;(2)能在宿主应用位置存活并生长;(3)可提供宿主有益的作用;(4)相关产品制成及储存期间须可维持活性及存活能力。
目前,国内阴道益生菌菌剂只有一种,其主要成分是德氏乳杆菌活菌。虽然它是从健康妇女阴道分离出来的一种乳杆菌,但不是我国妇女阴道菌群中的正常定值菌。
妇女阴道内可存在多种细菌,其中,乳酸杆菌是维持阴道健康微生态环境最常见和最重要的有益菌,乳酸杆菌占健康妇女阴道细菌总量的90%以上。它们主要通过产酸、过氧化氢抑制病原菌和其他条件致病菌的生长。如果某些因素引起阴道内乳杆菌数量减少,甚至完全缺失,则可导致阴道内许多条件治病菌异常增殖,并移行至尿道引发泌尿生殖道感染。
健康妇女阴道内存在多种乳杆菌,近期研究证实健康妇女阴道菌群中具有保护作用的优势菌株是弯曲乳杆菌,弯曲乳杆菌各株间抗致病菌能力差异明显,具有个体差异性,因此,选择乳杆菌益生菌时,需要综合考虑乳杆菌的种类,其产酸、过氧化氢抑制病原菌,及与阴道上皮细胞粘附的能力,其中乳酸杆菌能否在阴道成功定植,是乳杆菌持续作用的基础,也是乳杆菌发挥疗效的关键因素。
由于不同的弯曲乳杆菌株对阴道上皮细胞有不同的粘附亲和力,亲和力强的菌株定植能力强,才能起到抑杀多种病原微生物的作用。如果乳杆菌活菌制剂不能定植在阴道上皮细胞,体外实验中再强的抑杀多种病原微生物的作用都无从谈起,变为空头支票。
从健康妇女阴道中分离了百余株弯曲乳杆菌,并从中筛选出既能过氧化氢抑制病原菌,又和阴道上皮细胞具有较高粘附能力的菌株;如用这些优选的菌株研制乳酸杆菌制品,将会克服目前临床使用的妇科乳酸杆菌制品的不足,改善妇女泌尿生殖道感染的治疗效果。
考虑到我国庞大的泌尿生殖道感染患病人群和阴道优势乳杆菌的扶正祛邪的作用,妇科用乳杆菌制剂开发的市场前景极其光明。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159。
本发明提供的一株弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159,其保藏号CGMCCNO.11345。
上述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备预防和/或治疗泌尿生殖道感染产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备产H2O2产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备粘附阴道上皮细胞产品中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种预防和/或治疗泌尿生殖道感染产品。
本发明提供了一种预防和/或治疗泌尿生殖道感染产品,其活性成分为上述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液。
本发明第三个目的是提供一种产H2O2产品。
本发明提供的产H2O2产品,其活性成分为上述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液。
本发明第四个目的是提供一种粘附阴道上皮细胞产品。
本发明提供的产品,其活性成分为上述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液。
上述产品为药物或菌剂。
IMC-159于2015年9月9日,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号),保藏编号为CGMCCNO.11345,分类命名为弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)。
本发明根据益生菌菌种的公认标准,从我国健康妇女体内离了阴道内优势菌群—弯曲乳杆菌,并从中筛选出了一株具有较高抑菌能力和与阴道上皮细胞粘附定植能力强的益生菌株—弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159。实验证明,将弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159,按照106cfu/ml的密度接种于MRS液体培养基,于厌氧环境下,37℃静置培养21h的发酵液,可有效抑制金黄色葡萄球菌等致病菌的生长;对阴道上皮细胞较强的粘附作用保证了菌株在阴道上皮的定植。
附图说明
图1为从健康人阴道分离的弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159菌落。
图2为弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159与阴道上皮细胞的粘附作用。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、弯曲乳杆菌菌株的分离和鉴定
一、弯曲乳杆菌菌株的分离
MRS培养基:蛋白胨10.0g;牛肉膏10.0g;酵母膏5.0g;柠檬酸氢二铵2.0g;葡萄糖20.0g;吐温80,1.0mL;乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g;磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g;硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58g;硫酸锰(MnSO4·H2O)0.25g;蒸馏水1000mL;调至pH6.2~6.6。
收集了200余例临床检测无阴道炎症状体征的健康妇女阴道分泌物样品,将样本依次编号,接种于MRS液体培养基,37℃厌氧培养24h。每个样本随机挑选5个单菌落于2mLMRS液体培养基中培养增菌24h,并对菌落依次编号。扩增细菌用于细菌保种与DNA制备。将分离到的数百株细菌分别进行菌种鉴定、抑制金黄色葡萄球生长及与阴道上皮细胞粘附作用的检测,把其中一株具有较强粘附作用且有效抑制金黄色葡萄球的生长的弯曲乳杆菌命名为IMC-159。
二、弯曲乳杆菌菌株的鉴定
1、形态学鉴定
在MRS乳酸杆菌培养基平板上,上述步骤一分离得到的菌株IMC-159表现为大小约1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落,且菌落边缘整齐、较湿润,大小形态稳定(图1)。
2、生理生化特征分析
菌株IMC-159兼性厌氧,生长最适温度37-42℃,最适pH5.8-6.2。根据API细菌鉴定标准利用API50CHL培养基和API50CH试剂条(bioMe′rieux,Inc.,Marcyl’Etoile,France)对检测菌株IMJ-1进行糖发酵反应判读检测菌株IMC-159的生理生化特征。API50CHL是由49种可发酵碳水化合物的API50CH试验条组成的简易培养基。以测定菌制成悬液接种试验条的每一个小管。当培养时,由于发酵碳水化合物产酸,pH下降,使指示剂变色。
结果显示,菌株IMC-159可发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖等多种糖。
3、16srDNA序列同源性分析
常规方法培养上述步骤一分离得到的菌株IMC-159,提取菌株的总DNA作为基因扩增模板,采用通用引物27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492r:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′扩增细菌16SrRNA基因保守区。25μL扩增体系包括:1×PCR反应缓冲液,200μmol/LdNTPs,上游及下游引物各0.2μmol/L,1UTaqDNA聚合酶,1μL模板DNA。反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火40s,72℃延伸30s,共25个循环;72℃延伸10min。PCR产物用1%凝胶电泳检测,阳性结果用27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492r:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行双向测序。序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成,序列比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线完成。
菌株IMC-159的16srDNA的序列详见序列表中序列1。
经过上述鉴定,IMC-159于2015年9月9日,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号),保藏编号为CGMCCNO.11345,分类命名为弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)。
实施例2、弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159的功能分析
1、弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159产H2O2的检测
H2O2标准曲线制作:首先用浓度为100mmol/L的哌嗪-N,N'-二-乙磺酸(Piperazine-N,N_-Bis2-ethanesulfonicacid,PIPES)将30%(v/v)H2O2(相当于9.128mol/L)储存液稀释成1mol/L,再用100mmol/LPIPES将1mol/LH2O2分别稀释成0μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L的工作液;然后分别取100μL上述H2O2工作液与100μL浓度为20mmol/L的TMB(四甲基联苯胺)、2μL辣根过氧化物酶(1mg/mL)混合,16℃孵育10min,测量OD630值。最终得到H2O2浓度标准曲线:y=0.0033x-0.0496,R2=0.992。
弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159液体培养H2O2浓度检测:挑取弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159菌落,接种1mL培养48h的菌液于10mLMRS液体培养基中,使培养液中菌株的浓度为105cfu/ml,于厌氧环境下,37℃静置培养21h后,转换为37℃振荡培养3h,转速为220r/min,旋转半径为2.54cm,培养结束后,收集发酵液,12000r/min离心2min,取100μL菌液上清测量OD630值,根据标准曲线,计算菌液上清中H2O2浓度。实验重复三次,结果取平均值。
结果如表1所示,弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159在发酵培养液中能够产生大量的H2O2,其浓度为248.1μM。
表1弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159产生H2O2的能力检测
单位:μM
重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值 | |
H2O2产量 | 268.4 | 263.5 | 212.5 | 248.1 |
2、弯曲乳杆菌对阴道上皮细胞的粘附作用
阴道上皮脱落细胞取自于20余例健康(临床检测显示无生殖系统感染)育龄期妇女,各细胞样品标号后分别加入MEM培养基(pH4.0),120g离心10分钟,再重复离心2次,洗掉表面细菌,用MEM培养基调整阴道上皮脱落细胞浓度为105个/mL;活化过夜培养弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159CGMCCNo.11345使其浓度为(108CFU/mL)。阴道上皮脱落细胞与所述弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159各500μL等体积混合后置于37℃摇床(转速为100r/min,旋转半径为2.54cm)孵育1h,然后用0.8μm滤膜过滤,去掉游离弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159,并将滤膜轻压于盖玻片上,固定细胞进行革兰氏染色后油镜观察,分别计数三个细胞粘附细菌数,计算每个细胞平均粘附细菌数。
同时将另外一株同样采用实施例1的方法分离鉴定得到的,但与阴道上皮细胞粘附定植力较弱的弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)作为负对照。
结果显示,弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159对分离自20余例健康育龄期妇女的阴道上皮细胞均具有较强的粘附作用。图2图左为分离于健康育龄期妇女的阴道上皮脱落细胞;图右为阴道上皮脱落细胞与弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159)较强的粘附作用。从20余例中,随机选取4例,进行统计分析,计算得到每个阴道上皮细胞平均粘附弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159的数量达115个。
表2阴道上皮细胞粘附弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159的数量统计
综合实施例1和实施例2的结果,本发明的弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159既具有较强的产H2O2能力,又具有较强的对阴道上皮细胞的粘附作用(保证了菌株在阴道上皮的定植),这就使得弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159成为有效防治泌尿生殖道感染的候选益生菌菌株。
Claims (8)
1.一株弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-159,其保藏号CGMCCNO.11345。
2.权利要求1所述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备预防和/或治疗泌尿生殖道感染产品中的应用。
3.权利要求1所述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备产H2O2产品中的应用。
4.权利要求1所述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备粘附阴道上皮细胞产品中的应用。
5.一种预防和/或治疗泌尿生殖道感染产品,其活性成分为权利要求1所述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液。
6.一种产H2O2产品,其活性成分为权利要求1所述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液。
7.一种粘附阴道上皮细胞产品,其活性成分为权利要求1所述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液。
8.根据权利要求2-4中任一所述的应用或权利要求5-7中任一所述的产品,其特征在于:所述产品为药物或菌剂。
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