CN107794236A - 一种卷曲乳杆菌及其应用 - Google Patents

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明属于益生菌制剂领域，本发明涉及一株卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)SQ1505，其具有较强的产酸、产过氧化氢能力、具有较强的生物膜形成能力，并对人的阴道上皮细胞具有粘附能力，能对阴道致病菌起抑菌作用，可用于预防与治疗阴道炎，是新一代可替代抗生素的防治女性生殖道感染益生菌。

Description

一种卷曲乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种乳杆菌属的新菌株及其应用，更准确地说，本发明描述了卷 曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)的一个新菌株SQ1505，其具有较强的产酸、产过 氧化氢能力、具有较强的生物膜形成能力，并对人的阴道上皮细胞具有粘附能力， 对阴道致病菌具有抑菌作用，从而具备预防与治疗阴道炎的功能。
背景技术
健康妇女阴道内存在多种微生物，它们与宿主、环境之间构成了相互制约、 相互协调、动态平衡的阴道微生态系统。健康妇女的阴道菌群主要由乳杆菌构成， 包括卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌和格氏乳杆菌等。正常情况下乳杆菌对阴道可以起 到保护作用，而以乳杆菌占优势的阴道微生态的紊乱或者减少可以导致阴道炎。
细菌性阴道炎(BV)是妇科的常见病、多发病。它是由于阴道内微生态平衡 失调、厌氧菌和阴道加德纳菌过盛生长、兼性厌氧乳杆菌受抑制所引起的一种阴 道粘膜炎症性表现的综合征。应用抗生素治疗，虽然可暂时缓解BV的症状，但 也使本已减少的乳杆菌进一步减少，加重阴道微生态失调，从而使BV复发。
产H2O2乳杆菌是健康妇女阴道内的优势菌，是保护女性阴道免受病原体感 染的重要因素。另外乳杆菌代谢产生的酸也可有效地抑制其他细菌的生长繁殖。 卷曲乳杆菌为主要定植于人体阴道中的一种乳杆菌，也可定植于人体口腔和肠道。 卷曲乳杆菌属于健康妇女阴道中主要产H2O2的菌之一。研究表明，卷曲乳杆菌 不但可改变阴道pH值(通过发酵产生乳酸)，而且可以对阴道pH值变化做出反 应。健康阴道pH值在4.0左右，受到微生物感染后，其环境pH值会上升至中性 左右。卷曲乳杆菌主要有以下三种生理作用:一、产生乳酸，降低阴道内环境的 pH值，抑制非嗜酸性微生物的生成；二、产生H2O2，防止外籍菌侵入引起的感染；三、粘附抑制，卷曲乳杆菌能够粘附于阴道上皮细胞表面，同时抑制病源菌 对阴道上皮细胞的粘附作用。
发明内容
本发明提供一种卷曲乳杆菌SQ1505，其分离自健康女性阴道后穹庐处。
本发明的卷曲乳杆菌SQ1505的形态为杆状，革兰氏染色阳性，不形成芽抱， 产生乳酸，兼性厌氧。
本发明的卷曲乳杆菌SQ1505具有较强的生物膜形成能力。
本发明的卷曲乳杆菌SQ1505对阴道上皮细胞具有粘附作用。
本发明的目的是提供一株卷曲乳杆菌SQ1505，具有产酸及产过氧化氢能力， 对阴道致病菌具有抑菌作用，具备预防和治疗阴道炎的功能。
所述阴道致病菌是指大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆 菌、粪肠球菌和绿脓杆菌。
本发明的SQ1505菌株经鉴定为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，2017年8月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌种保藏号为 CGMCC NO：14488，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步描述：
图1卷曲乳杆菌SQ1505在显微镜(X 100倍)下的菌体形态；
图2卷曲乳杆菌SQ1505产酸能力检测：图2A是产酸空白板，图2B是SQ1505 菌株产酸板；
图3卷曲乳杆菌SQ1505产过氧化氢能力的检测：图3A是产过氧化氢空白 板，图3B是SQ1505菌株产过氧化氢板；
图4卷曲乳杆菌SQ1505的耐酸性能，在不同pH条件进行活菌数计数分析；
图5卷曲乳杆菌生物膜形成的定量检测：上面图5A是空白对照，下面图5B是SQ1505菌株；
图6卷曲乳杆菌SQ1505粘附能力检测：图6A为SQ1505菌株与阴道上皮 细胞的粘附作用(冲洗前)；图6B为SQ1505菌株与阴道上皮细胞的粘附作用(冲 洗后)。
具体实施方式
为了更详细地进一步阐明而不是限制本发明，给出下列实施例。
实施例1.卷曲乳杆菌SQ1505的分离、纯化
无菌条件下用接种环挑取卷曲乳杆菌SQ1505在MRS平板上划线，平板置于 厌氧培养箱中37℃培养48hrs，挑选单菌落进行镜检，达到菌株分离纯化。
实施例2.卷曲乳杆菌SQ1505发酵
用接种环将卷曲乳杆菌SQ1505从甘油菌种中挑取一环至装有10mL MRS液 体培养基中，37℃培养14hrs，再以4％接种量接入80mL MRS液体培养基中，37℃ 培养8hrs，即得卷曲乳杆菌SQ1505二级发酵液。
实施例3.卷曲乳杆菌SQ1505镜检
本发明的卷曲乳杆菌SQ1505发酵过程：于MRS液体培养基中37℃培养14hrs。 无菌条件下用接种环挑卷曲乳杆菌SQ1505，涂于载玻片上，固定后并革兰氏染 色，在显微镜下观察菌体形态。
实施例4.卷曲乳杆菌SQ1505发酵的种的鉴定特征
本发明的卷曲乳杆菌SQ1505经过平板培养后，挑取单菌落穿刺于加入如下 糖的MRS固体培养基中，37℃好氧培养，3天后观察培养基的颜色变化。
本发明的卷曲乳杆菌SQ1505利用苦杏仁苷、纤维二糖、七叶苷、果糖、半 乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、甘露糖、水杨苷和蔗糖(表1)。
表1嗜酸乳杆菌糖发酵鉴定结果
对卷曲乳杆菌SQ1505的16S rDNA序列进行测序，具体核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例5.卷曲乳杆菌SQ1505耐酸性能
本发明的卷曲乳杆菌SQ1505菌株于MRS液体培养基中37℃培养14小时后， 离心收集菌体，取1.0mL沉淀重悬至pH3.0,pH4.0和pH5.0的9.0mL无菌PBS 中，37℃处理0、1、2、3hrs后进行活菌计数分析(图4)。
结果表明，pH3.0条件下处理3小时活菌数下降一个数量级，pH4.0条件下 处理3小时活菌数下降小于0.5个数量级，pH5.0下处理3小时活菌数变化较小， 说明该菌株具有较好的耐酸能力；健康妇女阴道pH值在4.0左右，所以该菌株 可以在阴道中正常定植。
实施例6.卷曲乳杆菌SQ1505抑菌性能
本发明的卷曲乳杆菌SQ1505于MRS液体培养基37℃静置培养14hrs，将该 菌液点到MRS固体平板上，每板平行三个点，37℃静置培养12hrs。将200mL 培养过夜的指示菌液(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、 粪肠球菌和绿脓杆菌)调节至OD600＝0.1，分别均匀涂布于MRS固体平板，用灭 菌后的镊子将牛津杯放置平板中央，吸取50μL供试菌悬液至牛津杯。将平板于 35℃厌氧培养24hrs后拍照并测量抑菌圈大小(表2)。
表2卷曲乳杆菌SQ1505抑菌性能(注:“-”表示卷曲乳杆菌SQ1505对指示菌没有抑制作 用)
结果表明，卷曲乳杆菌SQ1505对大部分阴道有害菌均有抑制作用，其中对 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌和绿脓杆菌 的抑制作用最强，而对阴道有益菌如格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、植物乳杆菌和阴 道乳杆菌均无抑制作用。
实施例7.卷曲乳杆菌SQ1505不同发酵条件下菌密度的测定
本发明的卷曲乳杆菌SQ1505于好氧、静置(微好氧)和严格厌氧三种不同 发酵条件下37℃培养8h后，分别测定卷曲乳杆菌SQ1505活菌数(表3)。
培养条件 好氧 静置(微好氧) 厌氧
菌浓度(cfu/mL) 6.3×108 9.31×108 1.52×109
表3不同发酵条件下卷曲乳杆菌SQ1505的活菌数
实施例8.卷曲乳杆菌SQ1505生物膜形成能力的测定
本发明的卷曲乳杆菌SQ1505二级发酵液加入96孔板，每孔200μL菌悬液， 每组10个平行孔，以培养基为阴性对照。于37℃下厌氧培养24hrs；弃去各孔 液体，每孔加入200μL无菌生理盐水进行清洗，洗去培养基及未粘附的细菌，每 孔清洗三次；每孔加入200μL99％甲醇，固定15分钟之后弃去甲醇并晾干；然 后每孔加入200μL2％的Hucker革兰氏结晶紫染色液，染色5分钟。平板上多余 的染色液在水龙头下冲洗干净，并晾干；每孔加入160μL33％的冰醋酸溶解。用 酶标仪测定630nm下的吸光值，从而对卷曲乳杆菌生物膜进行定量检测(见图5)。
实施例9.卷曲乳杆菌SQ1505粘附能力的测定
将PBS以及DPBS 37℃温育1h，备用；将培养至二代的阴道上皮细胞，胰酶 消化后放置于放有飞片的12孔板中，二氧化碳培养箱内培养，待12孔板中的飞 片上细胞长至面积达40％时，使用无抗生素的培养液洗涤三次，备用；将培养好 的菌液离心(12000r/min、5min)，弃上清；用10mLPBS分别离心洗涤2次，洗 涤干净后，弃掉上清液；用10mLDPBS分别离心洗涤2次，洗涤干净后，弃掉 上清液；再使用无抗细胞培养液洗涤2次，然后使用无抗细胞培养液调整菌体浓 度1.0×107个/mL(平板计数)，备用；分别取调整好浓度的菌体悬液，用无抗 生素培养液洗涤三次，滴加至放有飞片的12孔板中，温育(37℃、2hrs或3hrs)， 同时以菌体悬液作为阴性对照，无菌细胞飞片作为阳性对照(见图6)。
实施例10.卷曲乳杆菌SQ1505抑制大鼠阴道细菌感染动物实验
筛选40只正常雌性大鼠，随机分为4组：正常组、模型组、自然恢复组和 卷曲乳杆菌组，每组10只。具体安排见表4。
表4卷曲乳杆菌SQ1505抑制大鼠阴道细菌感染动物实验
大鼠阴道菌群的测定与分析
用微量加样器取0.2mL生理盐水，反复冲洗大鼠阴道8～10次，取50μL的 阴道冲洗液分别进行大肠杆菌和乳杆菌活菌计数(表5)。
表5大鼠阴道冲洗液菌群检测结果
从表5可以看出，卷曲乳杆菌治疗组和自然恢复组都比模型组中大鼠阴道内 的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌定植的数量少。而模型组大鼠阴道内的乳杆菌数量 明显低于卷曲乳杆菌组大鼠阴道内的乳杆菌数量，卷曲乳杆菌菌液治疗组大鼠阴 道内乳杆菌数量甚至已超过正常水平以上。
以上结果表明，本发明中的卷曲乳杆菌SQ1505具有调节阴道菌群、抑制阴 道致病菌生长和定植的作用，可用于预防与治疗细菌性阴道炎。
序列表
<110> 申请人
<120> 一种卷曲乳杆菌及其应用
<130> 一种卷曲乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1449
<212> DNA
<213> Lactobacillus crispatus
<400> 1
gctgctatac atgcagtcga gcgagcggaa ctaacagatt tacttcggta atgacgttag 60
gaaagcgagc ggcggatggg tgagtaacac gtggggaacc tgccccatag tctgggatac 120
cacttggaaa caggtgctaa taccggataa gaaagcagat cgcatgatca gcttttaaaa 180
ggcggcgtaa gctgtcgcta tgggatggcc ccgcggtgca ttagctagtt ggtaaggtaa 240
aggcttacca aggcgatgat gcatagccga gttgagagac tgatcggcca cattgggact 300
gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgcaa 360
gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt 420
ggtgaagaag gatagaggta gtaactggcc tttatttgac ggtaatcaac cagaaagtca 480
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta 540
ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggaagaa taagtctgat gtgaaagccc tcggcttaac 600
cgaggaactg catcggaaac tgtttttctt gagtgcagaa gaggagagtg gaactccatg 660
tgtagcggtg gaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctctctggt 720
ctgcaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag 780
tccatgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tgggaggttt ccgcctctca gtgctgcagc 840
taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg 900
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 960
accaggtctt gacatctagt gccatttgta gagatacaaa gttcccttcg gggacgctaa 1020
gacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080
cgagcgcaac ccttgttatt agttgccagc attaagttgg gcactctaat gagactgccg 1140
gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atgcccctta tgacctgggc 1200
tacacacgtg ctacaatggg cagtacaacg agaagcgagc ctgcgaaggc aagcgaatct 1260
ctgaaagctg ttctcagttc ggactgcagt ctgcaactcg actgcacgaa gctggaatcg 1320
ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca tgggagtctg caatgcccaa agccggtggc ctaaccttcg gaaggagccg 1440
tctaagcgc 1449

Claims (4)

1.一株卷曲乳杆菌SQ1505，其特征在于，其保藏编号为：CGMCC NO.14488。
2.权利要求1所述的卷曲乳杆菌SQ1505在抑制阴道致病菌中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述阴道致病菌是指大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽抱杆菌、粪肠球菌、绿脓杆菌和蜡样芽抱杆菌。
4.权利要求1所述的卷曲乳杆菌在调节阴道菌群、预防和治疗阴道炎中的应用。
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