CN114480198A - 一株阴道卷曲乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株阴道卷曲乳杆菌及其应用，阴道卷曲乳杆菌分类命名为Lactobacillus crispatus ZH17，保藏号为CCTCC M20211647，对白色念珠菌具有较好的拮抗作用，即使在白色念珠菌占生长优势的情况下也能抑制其生长；能在阴道较低pH环境中生长，能较快降低阴道内pH，对阴道炎中常见的抗生素耐药，可以作为防治阴道炎和抑制白色念珠菌的菌剂，还可以与临床用药联合用于治疗阴道炎。

Description

一株阴道卷曲乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及医药微生物领域，具体涉及一株阴道卷曲乳杆菌，还涉及该菌株的应用。
背景技术
健康女性阴道内寄生着以乳酸杆菌占优势的微生物群，中国女性最常见的优势乳杆菌有卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、约氏乳杆菌等。通常认为，乳酸杆菌能主动或被动的利用糖原产生乳酸维持阴道内的低pH环境，防止其他不耐酸的致病菌的繁殖，并且能产生过氧化氢、细菌素等物质抑制病原菌生长。同时，乳酸杆菌还通过竞争排斥机制阻止其他微生物对上皮细胞的吸附成膜。
通常当宿主的某些不良生活习惯，如抗生素及激素药物的滥用、不当的冲洗、不注重贴身衣物卫生、不洁的性生活等，可能导致阴道环境内pH的改变和局部免疫功能下降，病原菌乘机优势生长，侵占粘膜上皮的优势地形，通过多种方式引起上皮细胞损伤和炎症，导致各种阴道炎症的发生，常见的如细菌性阴道炎(Bacterial vaginitis，BV)、外阴阴道假丝酵母菌病(Vulvovaginal candidiasis，VVC)、需氧性阴道炎(Aerobic vaginitis，AV)等。
通过在阴道内投放乳酸杆菌，用于恢复阴道微生态平衡已有尝试。目前国内上市的阴道内投放乳酸杆菌的制剂仅有1种，为内蒙古双奇药业股份有限公司生产的商品名为“定君生”的市售药品，包含1种乳杆菌——德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)，但该菌种不属于我国妇女阴道优势菌种。专利(CN201410674502.2)报道了一株卷曲乳酸杆菌IMC-79具有较强产生H2O2的能力，对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用，但对白色念珠菌真菌感染的阴道炎防治没有报道。并且现有报道的乳酸杆菌主要通过产生乳酸发挥抗菌作用，其乳酸产量较低。因此，急需一种乳酸合成能力更强的菌。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株阴道卷曲乳杆菌；人体阴道分离得到，阴道卷曲乳杆菌分类命名为Lactobacillus crispatus ZH17，保藏号为CCTCC M20211647。
阴道卷曲乳杆菌对白色念珠菌具有较好的拮抗作用，即使在白色念珠菌占生长优势的情况下也能抑制其生长，因此可以制备白色念珠菌的拮抗菌剂。
阴道卷曲乳杆菌能在阴道较低pH环境中生长，并产生较高浓度乳酸，丁二酸、丙酸、苯乳酸等小分子酸，较快降低阴道内pH，能产生过氧化氢协同抗菌，因此可以制备防治阴道炎的抗真菌剂中的应用，特别是针对白色念珠菌感染真菌。
对阴道炎中常见的抗生素耐药，可与临床常见抗生素联合用于治疗阴道炎。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一株从人体阴道分离得到的一株卷曲乳酸杆菌Lactobacillus crispatus ZH17，具有较高的合成乳酸能力，同时还产生其他小分子酸包括丁二酸、苯乳酸、丙酸等，可是实现协同抗菌的功能，并产生较强的H2O2能力，能够用于制备白色念珠菌的拮抗菌剂，防治阴道炎菌剂，和与抗生素联合用于治疗阴道炎；对阴道炎的治疗提供了新的菌剂。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为Lactobacillus crispatus ZH17 16srRNA序列；
图2为基于Lactobacillus crispatus ZH17 16srRNA基因序列的系统进化树；
图3为不同比例Lactobacillus crispatus ZH17对白色念珠菌抑制作用；
图4为白色念珠菌优势生长下Lactobacillus crispatus ZH17对白色念珠菌抑制作用；
图5为Lactobacillus crispatus ZH17培养液抑制率；
图6为标准品GC-MS总离子流色谱图；
图7为Lactobacillus crispatus ZH17培养液衍生化产物GC-MS总离子流色谱图；
图8为Lactobacillus crispatus ZH17耐酸生长情况；
图9为Lactobacillus crispatus ZH17生长过程降低pH情况；
图10为Lactobacillus crispatus ZH17的产过氧化氢能力；
图11为Lactobacillus crispatus ZH17 MIC测试结果；
图12为Lactobacillus crispatus ZH17黏附CaSki细胞。
菌种保藏
本发明中卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)ZH17是从人体阴道分离得到；送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M20211647，地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2021年12月20日，分类命名为卷曲乳酸杆菌(Lactobacilluscrispatus)ZH17。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、16srDNA序列的测定
本发明从人体阴道分离纯化得到菌株，采用细菌鉴定通用引物27F/1492R，具体引物如下：
27F：5'-agagtttgatcctggctcag-3'(SEQ ID NO.1)；
1492R：5'-ggttaccttgttacgactt-3'(SEQ ID NO.2)；
扩增16srDNA，扩增体系为(50μL)：25μL 2×phanta Max Buffer，1μL of 10mMdNTPs，2μL of正反引物(5μM)，1μL of PhantaMax super-fidelity DNA聚合酶，10ng DNA模板；扩增程序如为：95℃预变性2min；95℃变性30s，55℃退火30s；72℃延伸30s；72℃后延伸5min；循环35次。
将16s rDNA片段纯化后使用TA克隆试剂盒(TAKARA)将目的片段插入T载体，送阳性菌落菌液测序，测序结果(图1)经NCBI比对后，使用mega6构建系统发育树，经比对其与卷曲乳杆菌同源性最高(图2)。命名为卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)ZH17，送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M20211647，保藏日期为2021年12月20日。
实施例2、Lactobacillus crispatus ZH17对白色念珠菌(CA)的拮抗作用
共培养：收集活化后白色念珠菌，调整菌液浓度为1x107cfu/ml，以1％接种于新鲜MRS培养基中，收集活化后乳酸杆菌，调整菌液浓度为1x108cfu/ml，10倍梯度稀释至浓度1x107cfu/ml，1x106cfu/ml，以1％接种于新鲜MRS培养基中。37℃静置培养24h，用PBS稀释培养液至适宜的梯度，取100μL培养液涂布于YPD固体培养基，37℃培养，计数白色念珠菌的数量，以不含乳杆菌MRS为对照处理，计算抑制率，每组设3个平行。
结果表明，在共培养体系中，乳杆菌对白色念珠菌的抑制作用随初始接种比例的增高而增强，在接种比例为1:10，1:1，10:1(Lb:Ca)时，其24h抑制率分别为51.99％，83.19％，93.36％(图3)。
白色念珠菌生长优势下乳酸杆菌抑制作用：收集活化后白色念珠菌菌液，调整菌液浓度为1x107cfu/ml，以1％接种于新鲜MRS培养基中，静置培养8h(约1x107cfu/ml)，加入等量新鲜MRS培养基重悬的ZH17菌液，同时以加入不含乳杆菌的新鲜MRS培养基为对照。继续37℃静置培养24h，于加入乳杆菌后4h，8h，12h，16h取培养液用PBS稀释至适宜的梯度，取100μL培养液涂布于YPD固体培养基，37℃培养，计数白色念珠菌的数量，每组设3个平行。
结果表明，即使在白色念珠菌优势生长的情况下，ZH17的等比例外源加入也能抑制其生长，并在生长后期产生杀灭作用，24h时其抑制率可达到46.7％(图4)。
实施例3、Lactobacillus crispatus ZH17培养液白色念珠菌的生长抑制作用
乳酸菌在厌氧条件下于37℃的MRS肉汤(pH 6.5)中生长48小时。通过在4℃下以8000rpm离心培养物15分钟来制备无细胞上清液(CFS)，然后通过0.22μm过滤器进行过滤。
使用微孔板测定来评估CFS对白色念珠菌的抗菌活性。将YPD肉汤中的100μL白色念珠菌悬液(～106CFU/mL)和100μL测试的CFS的混合物添加到无菌96孔微量培养板的每个孔中。使用MRS培养基代替CFS作为阳性生长对照。将平板在37℃有氧条件下培养24小时，并使用酶标仪在600nm波长下将白色念珠菌的生长记录为OD。生长抑制率(％)表示为：(OD测试-OD CFS)/OD空白×100。
经测定其原始培养液对白色念珠菌生长抑制率可达56％，调节培养液pH为7.0后再次测试其抑制率大幅降低(图5)，说明其抑菌相关代谢产物类型为酸或与酸相关物质。
GC-MS分析培养液中酸性物质组成：
进行代谢组学分析乳杆菌培养上清液(CFS)中的酸性代谢物，并以MRS肉汤为对照。简而言之，将30μLCFS或MRS肉汤加入离心管(1.5mL)中的20μL核糖醇(内标溶液)中，冷冻干燥。将100μL甲氧胺盐酸盐(10mg/mL)的吡啶溶液加入含有CFS和核糖醇干燥样品的离心管中，所得混合物在加热块中于37℃下孵育90分钟，然后在添加40μL MSTFA，所得混合物在37℃下进一步孵育30分钟。将1μL衍生化样品通过自动进样器进样。GC-MS进样分流比为1:10，进样口温度为240℃，使用氦气作为载体进行分析。温度梯度为：80℃下保持10分钟，然后以5℃/min升至230℃，然后以90℃/min升至320℃，并保持5分钟。传输线和离子源的温度分别为280℃和300℃。在m/z中采集质量数据范围为33–600，电子电离设置为70eV。使用内置标准质谱数据库鉴定代谢物。根据保留时间和质谱相似度(超过80％)匹配确定了潜在代谢物。
标准品GC-MS总离子流色谱图如图6所示，Lactobacillus crispatus ZH17培养液衍生化产物GC-MS总离子流色谱图如图7所示。以核糖醇为内标的GC-MS分析表明，其主要小分子酸成分含量如表1。
表1、各成分含量
Figure BDA0003501836520000041
实施例4、Lactobacillus crispatus ZH17的耐酸性能
活化后菌株调节菌浓度为1x108cfu/mL，以1％转接于pH为6.2、4.5的MRS培养基中，于0、6、12、24、36、48小时取样用酶标仪测定OD600。测试结果表明Lactobacilluscrispatus ZH17能耐受阴道内pH4.5的低pH环境图8。
实施例5、Lactobacillus crispatus ZH17的降低pH性能
活化后菌株调节浓度为1x108 cfu/mL，1％转接于MRS培养基中，于0、6、12、24、36、48小时取样测定其pH值。经测定，ZH17菌株能在24h内将培养液pH降低到人阴道正常生理范围图9。
实施例6、Lactobacillus crispatus ZH17的产过氧化氢能力
将活化后菌株划线于补充了1mM TMB(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)，2U/mL过氧化物酶的MRS琼脂平板。在37℃厌氧培养48小时后，将板暴露于空气。能够产生过氧化氢的菌落呈现蓝色或棕色，测试结果表明Lactobacillus crispatus ZH17具有较强的H2O2产生能力图10。
实施例7、Lactobacillus crispatus ZH17的抗生素敏感性测试
采用肉汤稀释法测定乳酸杆菌对常用抗生素阿莫西林、庆大霉素、头孢噻肟钠、氯霉素、克林霉素、甲硝唑、氧氟沙星、红霉素的最低抑菌浓度(MIC)。测试药品及浓度范围如表2，结果表明，Lactobacillus crispatus ZH17对阴道炎常用药甲硝唑、克林霉素耐受图11，说明其可以用于阴道炎协同治疗。
表2测试药品浓度范围
Figure BDA0003501836520000051
实施例8、Lactobacillus crispatus ZH17对CaSki细胞黏附性
CaSki细胞在10％胎牛血清的DMEM培养基中在12孔细胞培养板(37℃，5％CO2)中生长至80％汇合。一式三份加入乳杆菌分离物(1x107CFU)并在37℃共培养3小时，然后用PBS洗涤细胞三次，轻轻去除未结合的细菌。使用0.1％TritonX-100分离细胞和未结合的细菌，连续稀释，接种到MRS琼脂平板上，并在37℃下厌氧培养48小时。粘附细菌的百分比计算为结合细胞的数量与最初添加的细菌细胞总数之比。
结果显示：Lactobacillus crispatus ZH17的3h黏附率为87.5％，经染色可观察到较高密度的黏附图12。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (7)

1.一株阴道卷曲乳杆菌，其特征在于：所述阴道卷曲乳杆菌分类命名为Lactobacilluscrispatus ZH17，保藏号为CCTCC M20211647。
2.权利要求1所述阴道卷曲乳杆菌在制备白色念珠菌的拮抗菌剂中的应用。
3.权利要求1所述阴道卷曲乳杆菌在制备防治阴道炎的抗真菌剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述真菌为白色念珠菌。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述抗真菌剂通过产生较高浓度乳酸和小分子酸，产生过氧化氢实现协同抗菌功能。
6.权利要求1所述阴道卷曲乳杆菌与抗生素联合用于制备治疗阴道炎的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述抗生素为甲硝唑或克林霉素。
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