CN105287644A

CN105287644A - 治疗奶牛隐性子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂

Info

Publication number: CN105287644A
Application number: CN201510583176.9A
Authority: CN
Inventors: 吕文发; 王军; 赵静; 杨雨江; 田丰松
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2015-09-14
Filing date: 2015-09-14
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2035-09-14
Also published as: CN105287644B

Abstract

本发明公开了保藏编号为CGMCC？No.11133的唾液乳杆菌菌株LWT1和保藏编号为CGMCC？No.11134的魏斯氏菌菌株LWT20，2株益生菌均从健康奶牛阴道内分离获得，它们在治疗奶牛子宫内膜炎方面均具有良好的疗效，本发明还提供了由唾液乳杆菌菌株LWT1与魏斯氏菌菌株LWT20用MRS培养基培养的菌液，浓度比为2:1，终浓度为：10¹⁵CFU/mL，用于治疗奶牛隐性子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂。唾液乳杆菌菌株LWT1和魏斯氏菌菌株LWT2经过300次传代，并没有发现变异现象，对抗生素均具有较好的敏感性，具有良好的稳定性和安全性。并且在4℃保存半年后其抑菌能力没有明显变化，所以该益生菌组合活菌制剂可以长期保存，该益生菌组合活菌制剂治疗奶牛隐性子宫内膜炎治愈率达到85%。

Description

治疗奶牛隐性子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及益生菌菌株唾液乳杆菌(LactobacillusSalivarius)菌株LWT1和魏斯氏菌(Weissellakoreensis)菌株LWT20及治疗奶牛隐性子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂。

背景技术

奶牛子宫内膜炎是由产后细菌感染引起的一种常见的产科疾病。采用抗生素及化学药物治疗常导致刺激子宫粘膜出血，细菌耐药性及牛奶污染等问题。中药制剂药方复杂、操作不便、剂量大、见效慢；中西药复方仍会有抗生素的残留；而激光、针灸、溶菌酶操作繁琐、见效慢。所以子宫内膜炎的治疗急需新型药物，而微生态制剂在肠道中已经得到广泛性应用，并且效果显著，但对奶牛子宫内膜炎治疗方面尚处于空白阶段。

发明内容

本发明的目的是为解决抗生素药物残留、致病菌的耐药性；中药制剂药方复杂、操作不便、剂量大、见效慢；激光、针灸、溶菌酶操作繁琐、见效慢等问题，因此提供益生菌菌株唾液乳杆菌(LactobacillusSalivarius)LWT1和魏斯氏菌(Weissellakoreensis)LWT20及治疗牛子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂。

唾液乳杆菌菌株LWT1，保藏编号：CGMCCNo.11133。

魏斯氏菌菌株LWT20，保藏编号：CGMCCNo.11134。

治疗奶牛隐性子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂，它是由保藏编号为CGMCCNo.11133的唾液乳杆菌菌株LWT1和保藏编号为CGMCCNo.11134的魏斯氏菌菌株LWT20组合成的活菌制剂；

所述的牛为奶牛；

所述的唾液乳杆菌菌株LWT1与魏斯氏菌菌株LWT20的浓度比为1-3:1；

所述的唾液乳杆菌菌株LWT1与魏斯氏菌菌株LWT20的浓度比为2:1；

所述的活菌制剂为MRS培养基活菌制剂；

所述的活菌制剂终浓度为：10¹⁵CFU/mL。

本发明提供了唾液乳杆菌菌株LWT1，它的保藏编号为CGMCCNo.11133和魏斯氏菌菌株LWT20，它的保藏编号为CGMCCNo.11134，2株益生菌均从健康奶牛阴道内分离获得，它们在治疗奶牛隐性子宫内膜炎方面均具有良好的疗效，本发明还提供了由唾液乳杆菌菌株LWT1与魏斯氏菌菌株LWT20用MRS培养基培养的菌液，浓度比为2:1，终浓度为10¹⁵CFU/mL，用于治疗奶牛隐性子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂。唾液乳杆菌菌株LWT1和魏斯氏菌菌株LWT2经过300次传代，并没有发现变异现象，对抗生素均具有较好的敏感性，具有良好的稳定性和安全性。并且在4℃保存半年后其抑菌能力没有明显变化，所以该益生菌组合活菌制剂可以长期保存，该益生菌组合活菌制剂治疗奶牛隐性子宫内膜炎治愈率达到85%。

附图说明

图1分离的乳酸菌产酸测定结果图。

具体实施方式

实施例1菌株来源

1）唾液乳杆菌、魏斯氏菌、嗜酸乳杆菌均从健康奶牛阴道内分离获得，具体方法如下：

a从吉林农业大学奶牛场和九台养牛场分别选取30头产后健康奶牛作为样本。用棉拭子采集健康奶牛阴道内分泌物。采完后立即在无菌条件下放入事先配置好的MRS液体培养基的试管中，1h内送回实验室并在37℃下厌氧培养18—24小时，完成细菌的富集并取一部分菌液保存备用。

b使用MRS选择性培养基对乳酸菌进行分离与纯化，最后对乳酸菌分离株进行保存。

2）筛选与鉴定

通过乳酸菌对致病菌的抑菌试验对乳酸菌分离株进行筛选，此次使用的致病菌指示菌为金黄色葡萄球菌。具体操作如下：

本试验采用杯碟法对乳酸菌抑制致病菌生长能力进行测试。分别取乳酸菌上清液240ul加入事先准备好的金黄色葡萄球菌平板上的牛津杯中。将平板放入培养箱中37℃培养48h，每个菌株设置3个重复组，对照组添加等量的灭菌水，培养完后使用游标卡尺分别测量各个菌株的抑菌环直径大小并做好记录。具体结果如表1所示：

通过乳酸菌对金黄色葡萄球菌的抑菌试验筛选出了13株具有抑菌能力的乳酸菌分离株，并通过16SrDNA测序对乳酸菌分离株进行鉴定，经鉴定乳酸菌分离株分别为唾液乳杆菌7株、魏斯氏菌5株、嗜酸乳杆菌1株。（具体结果为：LWT1,3,5,6,12,16,17为唾液乳杆菌，LWT18,19,20,111,112为魏斯氏菌，LWT113为嗜酸乳杆菌）。随后对筛选出的13株乳酸菌进行了对大肠杆菌、沙门氏菌和链球菌的抑菌活性试验，抑菌结果如表1所示。

最后通过乳酸菌分离株对4种指示菌的抑菌活力试验，筛选出唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳杆菌LWT113进一步研究其益生特性（唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳杆菌LWT113在其所属的菌种里抑菌能力最强）。

实施例2乳酸菌产酸试验

将唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳杆菌LWT113接种于已灭菌的MRS液体培养基中，放入厌氧培养箱中，37℃厌氧静止培养24h。每隔2h，使用酸度计分别测量各试管中菌液的酸度值。用未接菌的液体培养基做空白对照。最后以时间为横坐标，酸度值为纵坐标，绘制益生菌的酸度变化曲线。结果见图1。

实施例3乳酸菌抗生素敏感性试验

挑取唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳杆菌LWT113的单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，离心去上清，用生理盐水重新悬浮并调整菌液浓度为3×10⁶CFU/mL，使用涂布器在平板上均匀涂布，盖上平皿盖，室温下放置5分钟，用无菌眼科镊子将抗生素纸片贴于平板上，37℃厌氧培养18h。使用游标卡尺测量其抑菌圈的大小，对抑菌圈不明显的，细菌分布不均的和抑菌圈过大的平板要做补充试验，以做进一步的验证。药敏试验具体评价标准如表2所示。

+敏感++中度敏感+++高度敏感R抗性

唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20对万古霉素具有抗性，此外唾液乳杆菌LWT1还对庆大霉素具有抗性，嗜酸乳杆菌LWT113对所有测试抗生素都具有较好的敏感性。由此可以得出3株乳酸菌都具有较好的安全性。

唾液乳杆菌(LactobacillusSalivarius)LWT1、魏斯氏菌(Weissellakoreensis)LWT20，已于2015年7月17日送于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。唾液乳杆菌(LactobacillusSalivarius)LWT1保藏编号：CGMCCNo.11133；魏斯氏菌(Weissellakoreensis)LWT20保藏编号：CGMCCNo.11134。

实施例4唾液乳杆菌、魏斯氏菌、嗜酸乳杆菌对子宫内膜上皮细胞粘附研究

将细胞浓度为2×10⁵CFU/mL的细胞悬浮液接种于6孔细胞培养板中培养至长成单层细胞。然后使用PBS冲洗3次后，每孔中加入1mL细菌悬液和1mL新鲜的DMEM/F12不完全培养液，以无菌PBS缓冲液作为对照，置37℃、5%CO₂培养箱中培养90min。培养完成后用PBS冲洗单层细胞5次，除去未粘附的细菌。

黏附结果：

平均每个子宫内膜上皮细胞黏附的唾液乳杆菌、魏斯氏菌、嗜酸乳杆菌的细菌数分别为70.5、34.1、40.2,从黏附试验结果中可看到唾液乳杆菌LWT1的黏附能力显著高于嗜酸乳杆菌。

实施例5乳酸菌组合对金黄色葡萄球菌抑菌性能研究

评价1株菌株是否可以作为开发微生态制剂的益生菌使用，其最主要的性能是其对致病菌的抑菌能力高低，从上表1可以看出，嗜酸乳杆菌LWT113和魏斯氏菌LWT20对4种致病菌的抑菌能力相近，无显著差异，但唾液乳杆菌LWT1对其余4种致病菌的抑菌能力要远远高于嗜酸乳杆菌LWT113。本研究的目的是开发一种用于治疗奶牛隐性子宫内膜炎益生菌组合，所以接下来就益生菌组合对致病菌金黄色葡萄球菌的抑菌能力进行测试，同时本项研究对每组益生菌组合的比例进行筛选。

（1）唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20益生菌组合，组合比例为1：1；2：1；1：2；3：1；1:3五组不同比例。其抑菌能力结果如下表：

（2）唾液乳杆菌LWT1、嗜酸乳杆菌LWT113益生菌组合，组合比例为1：1；2：1；1：2：3：1；1:3五组不同比例。其抑菌能力结果如下表.

（3）魏斯氏菌LWT20、嗜酸乳杆菌LWT113益生菌组合，组合比例为1：1；2：1；1：2；3：1；1:3五组不同比例。其抑菌能力结果如下表：

从上述表格可知：当唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20组合最佳比例为2:1；唾液乳杆菌LWT1和嗜酸乳杆菌LTW113组合最佳比例为1:1；魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳杆菌LTW113组合最佳比例为1:3。然后以唾液乳杆菌LWT1和魏斯氏菌LWT20益生菌2:1组合、唾液乳杆菌LWT1和嗜酸乳杆菌LTW113益生菌1:1组合、魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳杆菌LTW113益生菌1:3组合对大肠杆菌、链球菌和沙门氏菌进行了抑菌试验（见下表）。

上述实验结果表明：唾液乳杆菌LWT1与魏斯氏菌LWT1以2:1组合后对4种致病菌的抑菌能力显著增强，并且抑菌能力要高于其他两组组合。

接下来将上述3种益生菌组合制成活菌菌制剂和单独的唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20、嗜酸乳杆菌LWT113活菌制剂进行了临床性试验。

实施例6临床试验

1、动物模型

取普通级新西兰雌性家兔70只，每只家兔用犬导尿管向子宫内灌注培养24h的致病性链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的混合培养液6ml，如未出现临床症状再重复上面操作，待出现临床症状时（向家兔阴道接种病原微生物24小时后，家兔阴道排出黏液性分泌物，食欲减少，体温升高;涂片镜检有链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表明建模成功），并将70只家兔随机分为7组，每组10只，6组为治疗组，1组为对照组。将所制备的益生菌制剂用无菌液体MRS培养基稀释（终浓度为：10¹⁵CFU/mL），治疗组用犬导尿管子宫灌注益生菌制剂10mL，对照组用犬导尿管子宫灌注生理盐水6mL，隔天1次，连续3次为一个疗程：

唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20益生菌组合治疗组治愈率达到80%；

唾液乳杆菌LWT1、嗜酸乳杆菌LWT113益生菌组合治疗组治愈率达到70%；

魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳杆菌LWT113益生菌组合治疗组治愈率达到70%；

唾液乳杆菌LWT1制剂治疗组治愈率达到60%；

嗜酸乳杆菌乳杆菌LWT113制剂治疗组治愈率达到40%；

魏斯氏菌LWT20制剂治疗组治愈率达到40%；

生理盐水对照组治愈率为0%。

隐性子宫内膜炎临床试验

1）将浓度为10¹⁵CFU/mL的唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌培养液LWT20以2：1比例组合制成活菌制剂对患有隐性子宫内膜炎的20头奶牛进行临床试验，每头奶牛子宫内灌注本制剂150mL，隔天1次，连续3次，3次为一个疗程。一个疗程后治愈率达到85%。

2）将浓度为10¹⁵CFU/mL的唾液乳杆菌LWT1、嗜酸乳杆菌LWT113培养液以1：1比例组合制成活菌制剂对患有隐性子宫内膜炎的20头奶牛进行临床试验，每头奶牛子宫内灌注本制剂150mL，隔天1次，连续3次，3次为一个疗程。一个疗程后治愈率达到75%。

3）将浓度为10¹⁵CFU/mL的唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌培养液LWT20和嗜酸乳杆菌LWT113以2：1：1比例组合制成活菌制剂对患有隐性子宫内膜炎的20头奶牛进行临床试验，每头奶牛子宫内灌注本制剂150mL，隔天1次，连续3次，3次为一个疗程。一个疗程后治愈率达到70%。

4）将浓度为10¹⁵CFU/mL的魏斯氏菌LWT20、嗜酸乳杆菌LWT113培养液以1：3比例组合制成活菌制剂对患有隐性子宫内膜炎的20头奶牛进行临床试验，每头奶牛子宫内灌注本制剂150mL，隔天1次，连续3次，3次为一个疗程。一个疗程后治愈率达到65%。

5）将浓度为10¹⁵CFU/mL的唾液乳杆菌LWT1活菌制剂对患有隐性子宫内膜炎的20头奶牛进行临床试验，每头奶牛子宫内灌注本制剂150mL，隔天1次，连续3次，3次为一个疗程。一个疗程后治愈率达到55%。

6）将浓度为10¹⁵CFU/mL的魏斯氏菌LWT20活菌制剂对患有隐性子宫内膜炎的20头奶牛进行临床试验，每头奶牛子宫内灌注本制剂150mL，隔天1次，连续3次，3次为一个疗程。一个疗程后治愈率达到45%。

治愈标准：患牛全身症状消失，奶牛阴道分泌物只有少量的透明粘液流出，子宫颈口肿胀消失，通过对奶牛的直肠检查发现奶牛子宫的形状、大小、子宫壁质地恢复良好。

从上述一系列试验证明了唾液乳杆菌LWT1和魏斯氏菌LWT20以2:1比例组合对奶牛隐性子宫内膜炎治疗具有最佳效果，随后我们对唾液乳杆菌LWT1和魏斯氏菌LWT20的稳定性及安全性进行了研究。

实施例7唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20稳定性研究

（1）首先分别对唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20进行传代培养，分别传至300代，然后对唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20及其2：1组合抑制致病菌的能力进行测试。

（2）将过夜培养的唾液乳杆菌LWT1和魏斯氏菌LWT20培养液置于4℃冰箱中进行保存，时间为半年，然后分别测试唾液乳杆菌LWT1和魏斯氏菌LWT20及其组合对致病菌抑菌能力是否发生改变。结果如下表。

(3)采用平板计数法对存放半年的唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20及其益生菌组合活菌制剂的活菌数进行计数。具体做法为：取100uL微生态制剂，用灭菌生理盐水做10倍梯度稀释，分别取稀释度为10^-7、10^-8、10^-9、10^-10的稀释液0.1mL均匀涂布于MRS固体培养上，37℃厌氧培养24—48h后计数；每个稀释度做3个重复，求算数平均值。经计算得到，唾液乳杆菌LWT1和魏斯氏菌LWT20及其复合菌制剂存放半年之后活菌数量仍然达到10¹³CFU/mL，可以继续使用。

由上述结果可以看出,当唾液乳杆菌LWT1和魏斯氏菌LWT20传代至300代时，其对致病菌的抑菌能力并没有明显变化，而当唾液乳杆菌LWT1和魏斯氏菌LWT20放入4℃冰箱中保存半年之后，其抑菌能力略微下降，但并不明显，证明在4℃保存半年之后该益生菌组合活菌制剂依然具有良好的抑菌效果。

实施例8唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20安全性试验

将唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20接种于MRS液体培养基中，37℃振荡培养24小时，待用。将菌液腹腔接种小白鼠（18—20g），0.4mL/只，每种菌接种5只，同时设无菌生理盐水做对照组。连续观察7天，如果小鼠出现死亡，结合小白鼠临床变化和剖检结果判定分离株的安全性。

连续观察小鼠7天，试验组和对照组小鼠采食量、饮水量等全部正常，无任何异常现象出现。证明，唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20无致病性，可以应用于临床治疗奶牛隐性子宫内膜炎。

通过上述一系列试验证明了唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳杆菌LWT113为健康奶牛阴道内益生菌群，并且经过乳酸菌组合试验筛选出各种组合的最佳比例，最后确定使用唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT202:1组合制成益生菌活菌制剂用来治疗奶牛隐性子宫内膜炎.对唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20的稳定性、安全性进行了研究，发现唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20均具有良好的稳定性和安全性，并且在4℃保存半年后其抑菌能力没有明显变化，证明该复合菌制剂可以长期保存，并且能够应用于临床治疗奶牛隐性子宫内膜炎。

Claims

1.唾液乳杆菌菌株LWT1，保藏编号：CGMCCNo.11133。

2.魏斯氏菌菌株LWT20，保藏编号：CGMCCNo.11134。

3.治疗奶牛隐性子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂，它是由保藏编号为CGMCCNo.11133的唾液乳杆菌菌株LWT1和保藏编号为CGMCCNo.11134魏斯氏菌菌株LWT20组合制成的活菌制剂。

4.根据权利要求3所述的治疗牛隐性子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂，其特征在于：所述的牛为奶牛。

5.根据权利要求3或4所述的治疗牛隐性子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂，其特征在于：所述的唾液乳杆菌菌株LWT1与魏斯氏菌菌株LWT20的浓度比为1-3:1。

6.根据权利要求5所述的治疗牛隐性子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂，其特征在于：所述的唾液乳杆菌菌株LWT1与魏斯氏菌菌株LWT20的浓度比为2:1。

7.根据权利要求6所述的治疗牛隐性子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂，其特征在于：所述的活菌制剂为MRS培养基活菌制剂。

8.根据权利要求7所述的治疗牛隐性子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂，其特征在于：所述的活菌制剂终浓度为：10¹⁵CFU/mL。