CN114214256A - 一株用于防治泌尿生殖感染的格氏乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株格氏乳杆菌，其保藏号为CGMCC No.20696，于2020年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明提供的格氏乳杆菌研制乳杆菌活菌制剂，具有安全、可靠、不良反应少、效果好等优点，对于泌尿生殖感染具有很好的治疗效果，特别是具有改善妇女泌尿生殖道感染的治疗效果，也可从根本上恢复阴道的微生态环境，有益于妇女健康。

Description

一株用于防治泌尿生殖感染的格氏乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株用于防治泌尿生殖感染的格氏乳杆菌及其应用。
背景技术
泌尿生殖道感染是临床常见的疾病之一，临床常见的类型有细菌性阴道炎(BV)、外阴阴道念珠菌病(VVC)和毛滴虫病等，泌尿生殖道感染多是大肠杆菌或金黄色葡萄球菌、阴道加德纳菌及白色念珠菌感染，患病率高达40％；其治疗主要依靠抗生素，但治愈率偏低，复发率可达40％以上。
目前临床上应用抗生素治疗防治泌尿生殖感染时，虽然在短时间内可以有效杀死大量的病原菌，但未能恢复健康的微生态环境，具有较高的复发率，很难彻底治愈，超过一半的患者在治疗后半年内复发。同时对于一些女性生殖感染患者也增加了患子宫内膜炎、流产、早产的风险。
有相关文献表明乳酸杆菌可以阻止病原菌对泌尿或生殖系统的感染，并且对阴道感染有格外显著的治疗效果。目前国内外已报道过部分适用于治疗阴道炎的正常分离株，但是整体数量还是较少，无法满足不同差异人群的需要，为了增加候选株的多样性，需要筛选更多可作为候选的乳酸杆菌。
大量的微生物定植于人体，统称为人类微生物群。生殖道特别是女性生殖道也是微生物群定植的主要部位之一，形成一个庞大且复杂的微生态环境。其中乳酸杆菌在健康女性阴道中占有主导地位，含量约为70％-95％，如格氏乳杆菌、卷曲乳杆菌，詹氏乳杆菌等；同时某些致病微生物也是存在的，如阴道加德纳菌，大肠埃希菌等，通常情况下，二者处于平衡状态，形成了以乳酸杆菌为优势菌群的阴道微生态环境。阴道微生态与女性生殖道健康存在着十分密切的关系。
女性阴道是一个复杂的微生态体系，由阴道的解剖结构、微生态菌群、局部免疫及机体的内分泌调节功能共同组成，疾病受病因、环境和宿主3个因素的支配，但其核心是正常微生物群与其宿主的相互关系。从临床角度看，女性生殖道微生态与生殖道感染关系密切。各种阴道炎的发病大多与阴道微生态失衡有关，会引起妇女外阴阴道不适。尤其是顽固的反复发作和不正规治疗，以致久治不愈，因此恢复阴道微生态平衡是一个不可忽视的问题。虽然目前临床上抗菌药物治疗阴道炎的疗效较好，但药物的耐药性和毒副作用仍妨碍一些病例的治疗，同时抗菌药物治疗不易在短期内恢复阴道微生态环境，致治疗阴道炎质量不高，故易复发。如何提高阴道炎的治疗质量和降低复发率，恢复和保持阴道微生态环境的平衡，是目前阴道炎研究的重要课题。
乳杆菌是阴道正常菌群中最常见的细菌，它是正常成熟女性阴道的常驻菌、优势菌，在阴道排出物中的分离率为80％-100％，对于维持阴道微生态平衡具有重要作用。乳酸杆菌将阴道上皮细胞内的糖原分解为乳酸，维持阴道正常的酸性环境(pH<4.5)，可以防御外界致病菌的入侵，降低阴道感染的发生。此外，阴道的酸性环境也有利于乳酸杆菌发挥其生物学效应，有利于其生长以及增强其与VEC受体结合的能力；有利于维持乳酸杆菌产生的H2O2活性以及细菌素类物质的活性。因此，利用乳杆菌酸化阴道环境，有利于乳酸杆菌的生长和发挥微生态调节的机能。阴道炎的发生与乳杆菌数量减少，其他厌氧菌及兼性厌氧菌大量繁殖，阴道pH升高有关。因此，在杀灭致病菌的同时，恢复阴道乳杆菌的主导地位，恢复阴道的酸性环境，维持正常阴道微生态环境及pH值是治疗阴道炎的关键。目前治疗阴道感染方面存在一些不足和不规范现象，如利用抗菌药物直接杀灭致病菌，虽可使实验室检测病原体转阴，但抗菌药物无法很快恢复阴道微生态平衡，主要是不能快速恢复阴道内乳酸杆菌的数量和质量，也不能很快恢复阴道pH值，致使治疗后部分患者阴道不适的自觉症状持续存在，阴道炎治疗质量欠佳，且因阴道微生态失衡而易复发或继发其他病原体感染。
在阴道中处于主导地位的乳酸杆菌主要通过产酸(主要是乳酸)，产过氧化氢，粘附、定制抗力及增强机体免疫功能等作用对维持阴道微生态的稳定，乳酸菌主要通过三种形式维持阴道的微生态平衡：一是竞争性粘附作用，占据生殖道粘膜表面，阻止有害菌的粘附；二是抑制病原菌的生长，乳酸菌可以产生乳酸等酸性物质，降低pH，抑制假丝酵母、加德纳氏菌等致病菌的繁殖，产生具有抑菌能力的H2O2，产生细胞素等抑菌活性物质，与致病菌竞争营养物质等；三是免疫防御作用，乳酸菌既可以引起宿主有益的免疫反应，还可以下调不良免疫反应、炎症反应和过敏反应，既可以调节非特异性免疫功能，增强粘膜的屏障作用、产生细胞因子等，还可以调节特异性免疫功能，刺激免疫细胞的增殖、分化及产生细胞因子的能力。目前乳酸杆菌制剂被认为是一种安全可靠，高效性并且低复发率的治疗细菌性阴道炎和外阴阴道念珠菌病的微生态制剂。主要采用从阴道分离出具有抑菌活性的乳酸杆菌，通过大量的体外实验评估其产酸、产过氧化氢及粘附能力，最终筛选出适合于产品化的益生菌。
格氏乳杆菌是乳酸杆菌的一种，而且是人体泌尿系统或生殖系统的优势菌株，特别是在女性引导，因此格氏乳杆菌在泌尿系统或生殖系统微生态平衡方面应用前景广阔。
中国专利202111205336.8中公开了一株格氏杆菌LS03，保藏编号为CGMICCNo.22009，能够产乳酸降低pH同时在体外能显著抑制病原菌的生长，显著抑制大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母对人阴道上皮细胞VK2/E6E7的粘附，用于制备治疗和/或预防女性生殖道疾病药物。
中国专利201810026176.2中公开了一种格氏乳杆菌及其用于制备阴道抑菌药物的应用，该格氏乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.14109。研究其代谢性能发现，相对普通格氏乳杆菌，该菌株具备较强的乳酸和过氧化氢生产能力，对致病菌的抑菌能力很强，同时具有突出的阴道上皮细胞粘附能力。基干以上发现的新性质，确定了利用其制备阴道抑菌药物的新用途，可实现多种细菌性阴道疾病的治疗。其提供的菌剂对细菌性阴道疾病效果显著，且安全无毒、稳定性好、可长期保存。还涉及其在预防和/或治疗妇科疾病的药物中的用途。
目前大部分格氏乳杆菌是通过阴道直接施用以治疗阴道炎症，在使用过程中难免不便。
发明内容
为了解决上述问题，本发分离了能高效拮抗金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌、白色念珠菌，又具有较高粘附能力的格氏乳杆菌；此格氏乳杆菌研制乳杆菌活菌制剂，具有安全、可靠、不良反应少、效果好等优点，对于泌尿生殖感染具有很好的治疗效果，特别是具有改善妇女泌尿生殖道感染的治疗效果，也可从根本上恢复阴道的微生态环境，有益于妇女健康。
一方面，本发明提供了一株格氏乳杆菌。
所述的格氏乳杆菌保藏号为CGMCC No.20696，拉丁文学名为Lactobacillusgasseri，于2020年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
所述的格氏乳杆菌的16S rDNA的序列为SEQ ID NO:1。
另一方面，本发明提供了一种菌剂。
所述的菌剂为微生物菌剂，所述的菌剂中包括前述的格氏乳杆菌和/或其制备物。
优选地，所述的菌剂中格氏乳杆菌的含量为1.0×105-9.9×1010CFU/g或1.0×105-9.9×1010CFU/mL。
所述的格氏乳杆菌的制备物包括其培养物、培养物提取物、发酵液、发酵液上清、发酵液沉淀、发酵液提取物、冻干粉中的一种或多种。
所述的培养物为前述的格氏乳杆菌接种于培养基得到。
所述的培养基包括但不限于MRS液体培养基、MC液体培养基、BCP培养基。
所述的发酵液为前述的格氏乳杆菌发酵得到。
所述的冻干粉由前述的发酵液离心获得沉淀后包埋冻干得到。
优选地，所述的冻干粉包括包埋剂和菌体；所述的包埋剂中包括质量分数为9％的酵母浸粉、质量分数为8.4％的脱脂乳粉、质量分数为7.4％的大豆分离蛋白、质量分数为6.8％的海藻糖、质量分数为1％的D-异抗坏血酸钠；进一步优选地，所述的冻干粉中菌含量为2×108-2×1012CFU/g。
再一方面，一种格氏乳杆菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、接种格氏乳杆菌CGMCC No.20696于培养基；
S2、条件培养。
所述的S2中条件培养包括但不限于厌氧培养、好氧培养和兼性厌氧培养。
所述的培养基包括但不限于MRS液体培养基、MC液体培养基、BCP培养基。
所述的培养基还可以是任何可以用于格氏乳杆菌培养的培养基，一般地，所述的培养基中包括用于格氏乳杆菌培养的常见成分如：牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、硫酸镁、吐温80、蒸馏水等。
又一方面，本发明提供了前述的格氏乳杆菌和/或菌剂在制备用于治疗或预防泌尿感染和/或生殖感染的药物中的应用。
所述的泌尿感染或生殖感染可以由革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌引起。
所述的革兰氏阴性菌包括但不限于：大肠埃希菌、克雷伯杆菌、变形杆菌、柠檬酸杆菌。
所述的革兰氏阳性菌包括但不限于：肠球菌、葡萄球菌。
所述的泌尿感染或生殖感染还可以由其他病原体引起，所述的其他病原体包括但不限于：腺病毒、结核分枝杆菌、衣原体。
所述的泌尿感染即尿路感染，包括但不限于上尿路感染和下尿路感染。
所述的上尿路感染包括但不限于肾盂肾炎、输尿管炎；所述的下尿路感染包括但不限于膀胱炎、尿道炎。
所述的生殖感染由细菌、病毒、支原体、霉菌、滴虫等多种病原体引起。
所述的生殖感染包括但不限于：阴部念珠菌病、滴虫病、细菌性阴道炎、阴部传染性软疣、生殖感染肉芽肿(腹股沟淋巴肉芽肿)、阴虱病、巨细胞病毒感染。
优选地，所述的生殖感染为细菌性阴道炎。
又一方面，本发明提供了一种预防或治疗泌尿感染和/或生殖感染的药物。
所述的药物中包括前述的格氏乳杆菌和/或菌剂。
所述的药物可口服或直接用于患处。
所述的药物的剂型包括但不限于：片剂、颗粒剂、口服液、栓剂、搽剂。
又一方面，本发明提供了一种保健品。
所述的保健品用于泌尿系统或生殖系统的保健功能。
所述的保健功能包括但不限于维持菌落平衡。
所述的保健品中包括前述的格氏乳杆菌和/或菌剂。
又一方面，本发明提供了一种食品。
所述的食品中包括前述的格氏乳杆菌和/或菌剂。
所述的食品可以是酸奶、乳饮料、固体饮料、谷类早餐、果浆食品、冰淇淋、植物蛋白饮料。
又一方面，本发明提供了一种格氏乳杆菌冻干粉的制备方法。
所述的制备方法中包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的格氏乳杆菌的发酵液12000-18000rpm离心，操作时间在13小时内完成，收集菌泥，整个过程严格无菌操作；
(2)菌体包埋：加入包埋剂对菌体进行包埋，包埋剂与菌泥的比例为1：1，搅拌均匀，全过程严格无菌操作；
(3)冷冻干燥：进行预冻，将温度降至-40℃，然后升温至-20℃，保持30分钟，继续升温至-10℃，保持30分钟，之后以每增加5℃继续进行升温至26℃，每个升温过程大概需要3小时左右，并在每个温度下保持30分钟，冻干时间为30-48小时；
(4)粉碎：粉碎后，冻干粉为乳白色至棕色粉末或颗粒状，具有乳酸菌特殊气味；称量冻干粉重量，保存。
优选地，所述的步骤(2)中的包埋剂中包括质量分数为9％的酵母浸粉、质量分数为8.4％的脱脂乳粉、质量分数为7.4％的大豆分离蛋白、质量分数为6.8％的海藻糖、质量分数为1％的D-异抗坏血酸钠。
本发明的有益效果：
本发明提供的格氏乳杆菌MH-501具有较好的产酸能力和产H2O2能力，与德氏乳杆菌及格氏乳杆菌其他分离株相比较，格氏乳杆菌MH-501生长繁殖能力更强。格氏乳杆菌冻干粉在浓度为120mg/mL条件下，对回收菌数为9×104CFU/mL的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、阴道加德纳菌的抑制作用强，抑菌率为100％。格氏乳杆菌MH-501对VK2/E6E7细胞的粘附作用较强，其粘附指数为28.3±2.3，粘附率为87％，远远高于现有同类菌种的粘附力。
保藏说明
中文学名：格氏乳杆菌MH-501；
拉丁文学名：Lactobacillus gasseri；
保藏号：CGMCC No.20696；
保藏时间：2020年9月22日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位简称：CGMCC；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为格氏乳杆菌MH-501形态学鉴定结果图，其中A为格氏乳杆菌MH-501菌落，B为格氏乳杆菌MH-501革兰氏染色结果。
图2为格氏乳杆菌MH-501的生长曲线图。
图3为的格氏乳杆菌MH-501产酸能力检测结果图。
图4为格氏乳杆菌MH-501溶血试验结果图。
图5为格氏乳杆菌MH-501冻干粉对金黄色葡萄球菌的抑制效果图。
图6为格氏乳杆菌MH-501冻干粉对大肠埃希菌的抑制效果图。
图7为格氏乳杆菌MH-501冻干粉对白色念珠菌的抑制效果图。
图8为格氏乳杆菌MH-501冻干粉对阴道加德纳菌的抑制效果图。
图9为格氏乳杆菌MH-501菌液体外抑菌性能检测结果。
图10为格氏乳杆菌MH-501对阴道上皮细胞VK2/E6E7的粘附作用实验；其中A为德氏乳杆菌对阴道上皮细胞VK2/E6E7的粘附效果，B为对照格氏乳杆菌(分离株)对阴道上皮细胞VK2/E6E7的粘附效果，C为格氏乳杆菌MH-501对阴道上皮细胞VK2/E6E7的粘附效果。
图11为格氏乳杆菌MH-501抑制致病菌粘附阴道上皮细胞VK2/E6E7的能力检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
基础实验例1 格氏乳杆菌菌株的分离
MRS培养基成分如下：蛋白胨10.0g；牛肉膏10.0g；酵母膏5.0g；柠檬酸氢二铵2.0g；葡萄糖20.0g；吐温80，1.0mL；乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g；磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g；硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58g；硫酸锰(MnSO4·H2O)0.25g；蒸馏水1000mL；调至pH6.2-6.6。
分离步骤如下：
(1)收集80例临床检测无阴道炎症状体征的健康妇女阴道分泌物样品，将样本依次编号，接种于MRS液体培养基，37℃厌氧培养24h。
(2)每个样本随机挑选5个单菌落于2mL MRS液体培养基中培养增菌24h，并对菌落依次编号。
(3)扩增细菌用于细菌保种与DNA制备。将分离到的数百株细菌分别进行菌种鉴定；进行抑制金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、阴道加德纳菌生长的检测及与VK2/E6E7细胞(阴道上皮细胞)粘附作用的检测，筛选其中一株具有最强粘附作用且有效抑制金黄色葡萄球、大肠埃希菌、白色念珠菌及阴道加德纳生长的菌，命名为MH-501。
基础实验例2 格氏乳杆菌菌株的鉴定
对基础实验例1中筛选得到的菌株MH-501进行以下鉴定：
(1)形态学鉴定：在MRS乳酸杆菌培养基平板上，分离得到的菌株MH-501表现为大小约1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落，且菌落边缘整齐、较湿润，大小形态稳定，见图1中的A；革兰氏染色阳性，短杆状，见图1中的B。
(2)16S rDNA序列同源性分析
常规方法培养上述分离得到的菌株MH-501，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，采用通用引物27F(SEQ ID NO:2)和1492R(SEQ ID NO:3)扩增细菌16S rDNA基因保守区。
扩增体系(25μL)为：1×PCR反应缓冲液，200μmol/L dNTPs，上游及下游引物各0.2μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，1μL模板DNA。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸30s，共25个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1％凝胶电泳检测，阳性结果用通用引物27F和1492R进行双向测序。序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线完成，确定为格氏乳杆菌。
菌株MH-501的16S rDNA的序列见SEQ ID NO:1。
经过上述鉴定，MH-501于2020年9月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20696，分类命名为格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)。
实施例1 格氏乳杆菌MH-501生化反应实验
对格氏乳杆菌MH-501进行生理生化试验检测，包括触酶试验、明胶液化试验、H2S试验、硝酸盐还原试验和运动性试验进行鉴定：
1.触酶试验
挑出一个纯化后的单个菌落，置于一张新的载玻片上，滴加数滴过0.3％的氧化氢溶液，此溶液最好现用现配，短时间内出现气泡为阳性(+)结果，反之不产生气泡为阴性(-)结果。
2.明胶液化实验
用接种针挑取纯化后的单个菌落经穿刺接种于明胶固体培养基，穿刺深度约为培养基的2/3，20℃培养箱培养7d，每间隔24h取出，4℃冰箱放置30min再取出，一定时间内不呈凝固状态则为阳性(+)结果，如发生凝固则为阴性(-)结果。
3.H2S产生试验
用接种针挑取纯化后的单个菌落经穿刺接种于醋酸铅培养基，37℃培养箱培养2d，观察是否有黑色硫化铅沉淀生成，即为阳性(+)结果，无黑色沉淀则为阴性(-)结果。
4.硝酸盐还原实验
用接种针挑取纯化后的单个菌落于硝酸盐培养基中，37℃培养箱培养3d。将甲、乙试剂等比混匀，向培养基中加入0.1mL，观察试管内液体颜色，变红则为阳性(+)结果，颜色不变为阴性(-)结果。
5.运动性实验
用接种针挑取纯化后的单个菌落于半固体培养基中，穿刺深度约为2/3，置于37℃厌氧培养24h。若穿刺线变模糊，出现扩散生长痕迹则为阳性(+)结果，若穿刺线依然清晰可见则为阴性(-)结果。
实验结果见下表，硝酸盐还原实验、H2S产生实验、动力实验均为阴性(-)。
格氏乳杆菌MH-501的生化试验结果
Figure BDA0003466729040000091
实施例2 格氏乳杆菌MH-501碳水化合物产酸试验
将格氏乳杆菌MH-501通过梅里埃API50 CH鉴定系统对菌种进行生化鉴定，发酵反应呈阳性的为：D-葡萄糖，D-果糖，D-甘露糖，D-半乳糖，N-乙酰-葡糖胺，苦杏仁甙，熊果甙，七叶灵，水杨苷，纤维二糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，棉子糖，淀粉，龙胆二糖。不发酵、反应呈阴性的有：甘油，赤藓醇，D-阿拉伯糖，L-阿拉伯糖，D-核糖，D-木糖，L-木糖，阿冬醇，β-甲基-D-木糖甙，L-山梨糖，L-鼠李糖，卫矛醇，肌醇，甘露醇，山梨醇，α-甲基-D-甘露醇甙，α-甲基-D-葡萄糖甙，蜜二糖，菊糖，松三糖，糖原，木糖醇，D-松二糖，D-来苏糖，D-塔格糖，D-岩藻糖，L-岩藻糖，D-阿拉伯糖醇，L-阿拉伯糖醇，葡萄糖酸盐，2-酮基-葡萄糖酸盐。
实施例3 格氏乳杆菌MH-501生长曲线
格氏乳杆菌MH-501与格氏乳杆菌其他分离株、德氏乳杆菌(市场占有率最高的妇科乳酸菌药物所用菌株：德式乳杆菌DM8909)分别接种浓度为2.0×104CFU/mL的菌液10μL于MRS液体培养基中，37℃培养36h。每隔4h测量OD600处的吸光度并且对培养物通过梯度稀释涂布进行菌落计数。结果如图2所示，发现格氏乳杆菌MH-501在0h-4h吸光值增长较慢，8h-24h增长较快，进入对数生长期，24h-36h趋于平稳，对数生长后期的吸光值在1.0-1.2之间。与德氏乳杆菌及格氏乳杆菌其他分离株相比较，格氏乳杆菌MH-501生长繁殖能力更强。
实施例4 格氏乳杆菌MH-501产酸能力
格氏乳杆菌MH-501与格氏乳杆菌其他分离株、德氏乳杆菌(市场占有率最高的妇科乳酸菌药物所用菌株：德式乳杆菌DM8909)分别接种浓度为2.0×104CFU/mL的菌液10μL于MRS液体培养基中，涡旋震荡混匀。37℃培养36h，培养期间每隔4h，用pH计测发酵液上清pH值。结果见图3，格氏乳杆菌MH-501、格氏乳杆菌其他分离株与德氏乳杆菌在0-16h的pH值下降速度快，说明此段时间产酸速度较快，与生长曲线情况相符，在20h后，pH值变化幅度小，基本保持不变。其中，格氏乳杆菌MH-501在培养20h后pH值达小于或等于4，而格氏乳杆菌其他分离株和德氏乳杆菌的pH值在4.5左右。说明，分离得到的格氏乳杆菌MH-501产酸能力较德氏乳杆菌强，对维持阴道酸性环境有重要作用。
实施例5 格氏乳杆菌MH-501产H2O2能力
格氏乳杆菌MH-501与格氏乳杆菌其他分离株、德氏乳杆菌(市场占有率最高的妇科乳酸菌药物所用菌株：德式乳杆菌DM8909)分别接种浓度为2.0×104CFU/mL的菌液10μL于MRS液体培养基中，涡旋震荡混匀。37℃培养24h。因H2O2与硫酸钛生产黄色的过氧化钛复合物，在415nm有特征吸收峰。采用北京索莱宝过氧化氢检测试剂盒检测格氏乳杆菌MH-501、格氏乳杆菌其他分离株及德氏乳杆菌菌体细胞中H2O2含量，细菌H2O2含量(μmol/104细菌)＝0.002×ΔA测定÷ΔA标准，测得结果如下表所示，可知格氏乳杆菌MH-501的产H2O2量明显高于格氏乳杆菌其他分离株及德氏乳杆菌，可达0.00081μmol/104细菌。
格氏乳杆菌MH-501产H2O2能力
Figure BDA0003466729040000111
实施例6 格氏乳杆菌MH-501抗生素敏感性试验
采用琼脂纸片扩散法测定格氏乳杆菌MH-501对克林霉素、万古霉素、氯霉素、红霉素、庆大霉素、卡那霉素、氨节青霉素、四环素、链霉素的敏感性。
结果显示格氏乳杆菌MH-501对各类抗生素均为敏感。
实施例7 格氏乳杆菌MH-501溶血试验
细菌的溶血试验可以反映出细菌是否有致病性，将格氏乳杆菌MH-501接种于血琼脂平板，观察溶血性。判断标准：α溶血：菌落周围形成1-2mm的草绿色溶血环，有致病性；β溶血：菌落周围形成2-4mm的透明的溶血环，极强致病性；γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，无致病性。如图4所示，本格氏乳杆菌MH-501无溶血现象产生。
实施例8 格氏乳杆菌MH-501冻干粉的制备方法
将格氏乳杆菌MH-501发酵结束后，立即进行高速离心分离，离心转数14000rpm，操作时间在13小时内完成，离心收集活菌体。整个过程严格无菌操作。
1.菌体包埋：加入包埋剂对菌体进行包埋，包埋剂配方：酵母浸粉9％、脱脂乳粉8.4％、大豆分离蛋白7.4％、海藻糖6.8％、D-异抗坏血酸钠1％。包埋剂与菌泥的比例为1：1，搅拌均匀，全过程严格无菌操作。
2.冷冻干燥：进行预冻，将温度降至-40℃，然后升温至-20℃，保持30分钟，继续升温至-10℃，保持30分钟，之后以每增加5℃继续进行升温至26℃，每个升温过程大概需要3小时左右，并在每个温度下保持30分钟，冻干时间为30-48小时。
3.粉碎：粉碎后，冻干粉为乳白色至棕色粉末或颗粒状，具有乳酸菌特殊气味。称量冻干粉重量，保存。
实施例9 格氏乳杆菌MH-501菌液的制备方法
在MRS琼脂平皿上，取单菌落接入含10mL MRS液体培养基的试管内，摇匀，37℃培养24小时，进行菌落计数，4℃冰箱保存备用。
实施例10 格氏乳杆菌MH-501的抗菌性能检测
1、格氏乳杆菌MH-501冻干粉体外抑菌性能检测
样液：将0.6g的格氏乳杆菌冻干粉(根据实施例8所述的方法制备)溶解在5mL的PBS溶液内，即为样液(实验组)，设置5mL的PBS溶液为对照组。
将测试目的菌金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)24h斜面培养物用PBS洗下，制成目的菌悬液(回收菌数为4.5×106CFU/mL)。
两组分别加入目的菌悬液各100μL(体系中目的菌含量为9×104CFU/mL)，混合均匀后作用2min。
取作用后液体0.5mL，分别做10倍，100倍，1000倍，10000倍稀释，每个稀释浓度分别吸取500μL菌液分别加入无菌平皿中，尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的营养琼脂培养基约15mL/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。待培养基凝固后用封口膜封闭平皿，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养48h。
计算抑菌率：
X＝(A-B)/A×100％
A：对照组平均菌落数；
B：实验组平均菌落数。
参照上述方法对格氏乳杆菌MH-501抗大肠埃希菌(ATCC 25922)性能进行检测，培养基为营养琼脂，培养48h。
参照上述方法对格氏乳杆菌MH-501抗白色念珠菌(ATCC 10231)性能进行检测，白色念珠菌培养基为SDA培养基，培养时间72h。
参照上述方法对格氏乳杆菌MH-501抗阴道加德纳菌(ATCC 14018)性能进行检测，阴道加德纳菌培养基为BHI培养基，培养时间48h。
结果分析：图5-8为作用后液体稀释10000倍后的平皿培养结果。抑菌实验结果表明格氏乳杆菌冻干粉在浓度为120mg/mL条件下，对回收菌数为9×104CFU/mL的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、阴道加德纳菌的抑制作用强，抑菌率为100％。
2.格氏乳杆菌MH-501菌液体外抑菌性能检测
为了更好地体现格氏乳杆菌MH-501的抑菌性能，本申请还进行了对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、阴道加德纳菌的抑菌圈实验，以德氏乳杆菌作为对照。格氏乳杆菌MH-501及德氏乳杆菌培养至对数生长期，分别取相同的活菌数(2.0×104CFU/mL)，分别接种10μL于10mL MRS液体培养基中，37℃培养24小时。然后通过纸片扩散法检测格氏乳杆菌MH-501及德氏乳杆菌的抑菌能力。
试验菌：金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠杆菌(ATCC 25922)、白色念珠菌(ATCC10231)、阴道加德纳菌(ATCC 14018)，分别制备5×106CFU/mL的菌悬液1mL。
抑菌片载体：5mm直径圆形新华一号定性滤纸片，制备成厚度不超过4mm圆片，经压力蒸汽灭菌处理后，置120℃烤干2h，保存备用。
具体步骤如下：
(1)抑菌片的制备：格氏乳杆菌抑菌片及德氏乳杆菌抑菌片每片均滴加20μL菌液，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，室温下自然干燥后备用。
(2)试验菌的接种：用玻璃棒将5×106CFU/mL试验菌悬液，分别在相应培养基上涂抹均匀。盖好平皿，置室温干燥5min。金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的培养基为营养琼脂，白色念珠菌培养基为SDA培养基，阴道加德纳菌培养基为BHI培养基。
(3)抑菌剂样片贴放：用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置37℃温箱，培养16h-18h观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径。
结果显示，格氏乳杆菌MH-501对金黄色葡萄球菌的抑菌环直径到达30mm，德氏乳杆菌抑菌环直径为19mm，结论为格氏乳杆菌MH-501抑制金黄色葡萄球菌的效果明显优于德氏乳杆菌，见图9中的A。格氏乳杆菌MH-501对大肠埃希菌的抑菌环直径到达28mm，德氏乳杆菌抑菌环直径为15mm，结论为格氏乳杆菌MH-501抑制大肠埃希菌的效果明显优于德氏乳杆菌，见图9中的B。格氏乳杆菌MH-501对白色念珠菌的抑菌环直径为29mm，德氏乳杆菌抑菌环直径为16mm，结论为格氏乳杆菌MH-501抑制白色念珠菌的效果明显优于德氏乳杆菌，见图9中的C。格氏乳杆菌MH-501对阴道加德纳菌的抑菌环直径为36mm，德氏乳杆菌抑菌环直径为18mm，结论为格氏乳杆菌MH-501抑制阴道加德纳菌的效果明显优于德氏乳杆菌，见图9中的D。
抑菌环直径(mm)
致病菌 格氏乳杆菌MH-501 德氏乳杆菌
金黄色葡萄球菌 30 19
大肠埃希菌 28 15
白色念珠菌 29 16
阴道加德纳菌 36 18
实施例11 格氏乳杆菌MH-501对VK2/E6E7细胞的粘附作用
1、细胞转接
待VK2/E6E7细胞在细胞培养瓶中覆盖率约80％时，用0.5mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA(美国Gibco)溶液消化，轻轻吹打使细胞脱离培养瓶，加入15mL 10％FBS-DMEM(美国Gibco)含0.5％S/P双抗(美国Gibco)培养液洗涤细胞，用吸管吹打均匀。取2个24孔板，24孔板的前四排中每个孔加一个15mm圆形无菌玻片，然后每孔加入0.5mL上述细胞悬浮液。将细胞培养板用胶带粘住两边置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
2、换液
将24孔板从37℃培养箱中取出，用微量移液器弃去旧的细胞培养液，每孔滴加1mLPBS清洗三次，换用0.5mL 5％FBS-DMEM细胞培养液，将细胞培养板用胶带粘住两边置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h，细胞密度为5×105/mL。
3、粘附用格氏乳杆菌制备
格氏乳杆菌MH-501培养液离心去除上清后，重悬沉淀的菌体于PBS中，并用5mL的PBS洗涤三遍(8000rpm，10min)。用2mL 5％FBS-DMEM细胞培养液悬浮菌体，调整浓度为5×107/mL。
4、粘附
粘附前，将细胞培养板中培养液吸出，每孔加1mL的PBS洗涤细胞3次。每孔加入0.25mL的5％FBS-DMEM培养液，0.25mL菌悬浮液。轻柔晃动细胞培养板，使乳酸菌充分散均匀，将细胞培养板用胶带粘住两边置于37℃，5％CO2培养箱中2.5h。
5、粘附效果观察
弃掉混有细菌的培养液，用PBS洗涤3遍，最后一遍洗涤在弃掉PBS前用1mL注射器针头从细胞培养板中取出玻片，置于室温下自然干燥。干燥后用2mL的4％多聚甲醛固定10分钟，革兰氏染色，油镜下观察细菌在VK2/E6E7细胞上的粘附情况。
作为对照，将另外一株同样采用基础实验例1的方法分离鉴定得到的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)及德氏乳杆菌的数据进行对比。
结果显示格氏乳杆菌MH-501对VK2/E6E7细胞的粘附作用较强。图10中的A为格氏乳杆菌MH-501对VK2/E6E7细胞的粘附效果图，其粘附指数为28.3±2.3，粘附率为87％，；图10中的B为格氏乳杆菌分离株对VK2/E6E7细胞的粘附效果图，其粘附指数为12.8±1.6，粘附率为32％；图10中的C为德式乳杆菌对VK2/E6E7细胞的粘附效果图，其粘附指数为2.8±1.6，粘附率为7.3％。格氏乳杆菌MH-501粘附能力更强。
实施例12 格氏乳杆菌MH-501抑制致病菌粘附VK2/E6E7细胞的能力检测
参照实施例2的方法，将格氏乳杆菌MH-501粘附于VK2/E6E7细胞，37℃培养2h，PBS缓冲液洗去未粘附的格氏乳杆菌MH-501，再分别加细胞培养液重悬的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、阴道加德纳菌悬液，培养2h后，通过梯度稀释涂布计数分析粘附的病原菌的数量。
作为对照，将另外一株同样采用基础实验例1的方法分离鉴定得到的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)分离株及德氏乳杆菌的数据进行对比。
结果如图11所示，格氏乳杆菌MH-501能够明显抑制金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、阴道加德纳菌对VK2/E6E7细胞的粘附，效果明显优于德氏乳杆菌。
实施例13 格氏乳杆菌MH-501的耐酸能力检测
配制四组不同pH值的MRS液体培养基，分别为1.5、2.5、3.5、4.5。将对数生长期的格氏乳杆菌MH-501，以10％的体积比接种量分别接种于不同pH值的培养基中，37℃恒温培养，在0h、1h、2h、3h、4h取出适量菌液，平板菌落计数法做3个重复测定活菌数。
在低pH情况下，格氏乳杆菌MH-501具有较强耐酸生存能力。37℃经过4h培养，在pH为3.5和4.5时，其活菌数不但没有下降，反而明显上升。pH为4.5时，活菌数由5.8×1010CFU/mL增加到6.9×1011CFU/mL；pH为3.5时，活菌数由2.9×1010CFU/mL增加到3.5×1010CFU/mL。在pH 2.5条件下，经过4个小时的培养，活菌数有所下降，但是仍在108CFU/mL以上。当在pH1.5条件下，培养4个小时后，活菌数明显减少，为103CFU/mL，但是在培养2小时的时候仍能达到106CFU/mL以上。由此可见，本株格氏乳杆菌MH-501具有较强的抗酸性，乳酸菌产品发挥功能特性时活菌数的临界值为106CFU/mL或106CFU/g。通常胃酸的pH在3左右，流体食物在胃内停留时间为1-2h，本研究结果表明，格氏乳杆菌MH-501的活菌数超过了临界值。因此，具有较强的耐酸能力，能够顺利通过胃酸环境而到达肠，适合于通过口服方式使用的微生态制剂及生物制品的制备。
实施例14 格氏乳杆菌MH-501的耐胆盐能力检测
用猪胆汁盐将MRS液体培养基胆汁盐含量分别调为1、2、3、4g/kg，于121℃灭菌15min。在超净工作台上，将活化的体积分数10％的格氏乳杆菌MH-501接种于MRS-胆汁盐培养基中，37℃培养，每隔1h，采用无菌生理盐水以10倍递减依次稀释，进行平板菌落计数，测定0-4h活菌数的变化情况，做3个平行管。
格氏乳杆菌MH-501具有很强的耐胆汁盐能力。在0.1％胆汁盐浓度下，37℃培养1小时，活菌数并没有降低，反而上升达到4.8×1010CFU/mL。在0.2％胆汁盐浓度下，活菌数有下降趋势，但是在培养4小时后，活菌数仍在109CFU/mL以上。在0.3％胆汁盐浓度下，活菌数受到一定的影响，但是在4小时后，仍能到达106CFU/mL。即使在0.4％高浓度胆汁盐条件下，格氏乳杆菌MH-501仍有部分存活。在小肠正常胆汁盐条件下(0.3-3％)，格氏乳杆菌MH-501可以存活，并保持足够的活菌数，可以用于口服食品、保健食品、药品的制备。
实施例15 格氏乳杆菌MH-501胶囊针对细菌性阴道炎志愿者试用试验
1.试验材料
有效成分：格氏乳杆菌MH-501冻干粉(制备方法见基础实验例10)；
辅料：淀粉(西安天正药用辅料有限公司)；
胶囊：0#明胶空心胶囊，江苏力凡胶囊有限公司生产；
以上原料分别制备格氏乳杆菌胶囊及淀粉胶囊：
格氏乳杆菌胶囊：0.5克/粒，每粒内含格氏乳杆菌活菌应不低于1×106CFU；
淀粉胶囊：0.5克/粒，全部成分为淀粉；
经过活菌计数，杂菌、霉菌检验合格后，进行人体试验。
2.试验对象：共计19人(本次试验均已获得志愿者本人许可)；
(1)健康组：7人，无细菌性阴道炎，格氏乳杆菌胶囊，每日1次，连用7天；
(2)试验组：7人，细菌性阴道炎，有分泌物异常、瘙痒等症状，格氏乳杆菌胶囊，每日1次，连用7天；
(3)对照组：5人，细菌性阴道炎，有分泌物异常、瘙痒等症状，淀粉胶囊，每日1次，连用7天。
3.试验结果
(1)使用感受
19人中，16人无明显不适感，试验组有3人开始有刺痒随后消失，其中1人自身存在阴道刺痒。说明本格氏乳杆菌MH-501无刺激性。
Figure BDA0003466729040000181
(2)胶囊阴道内溶解情况
胶囊溶解度良好，菌粉(淀粉)能够溶解流出，个体体验不同可能与分泌物颜色及量相关。
Figure BDA0003466729040000182
(3)对健康人阴道分泌物影响
格氏乳杆菌MH-501不会引起健康者(健康组)阴道分泌物的改变，间接反映不会造成感染。
Figure BDA0003466729040000183
(4)试验组阴道分泌物的变化
7例患者阴道分泌物均趋于正常，其中3例之前有分泌物异常。
Figure BDA0003466729040000184
Figure BDA0003466729040000191
(5)试验组炎症恢复情况
试验组7例患者中，炎症全部有所缓解，其中3例恢复正常，3例明显缓解，1例轻微缓解。说明本格氏乳杆菌具有缓解细菌性阴道炎的作用，未来可用于妇科产品的制备。
Figure BDA0003466729040000192
(6)对照组阴道分泌物的变化
对照组5例患者的阴道分泌物情况没有改善，与原来相同。
Figure BDA0003466729040000193
(7)对照组炎症恢复情况
对照组5例患者的阴道炎症没有缓解，与使用胶囊前无明显区别。
Figure BDA0003466729040000194
序列表
<110> 哈尔滨美华生物技术股份有限公司
<120> 一株用于防治泌尿生殖感染的格氏乳杆菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1405
<212> DNA
<213> Lactobacillus gasseri
<400> 1
aaaggttatc ccaccggctt tgggtgttac agactctcat ggtgtgacgg gcggtgtgta 60
caaggcccgg gaacgtattc accgcggcgt gctgatccgc gattactagc gattccagct 120
tcgtgtaggc gagttgcagc ctacagtccg aactgagaac ggctttcaga gatccgcttg 180
ccttcgcagg ttcgcttctc gttgtaccgt ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat 240
aaggggcatg atgacttgac gtcatcccac cttcctccgg tttgtcaccg gcagtccatt 300
agagtgccca acttaatgat ggcaactaat gacaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa 360
cccaacatct cacgacacga gctgacgaca gccatgcacc acctgtctca gcgtccccga 420
agggaactcc taatctctta ggtttgcact ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg 480
ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag 540
tttcaacctt gcggtcgtac tccccaggcg gagtgcttaa tgcgttagct gcagcactga 600
gaggcggaaa cccccaacac ttagcactca tcgtttacgg catggactac cagggtatct 660
aatcctgttc gctacccatg ctttcgagcc tcagcgtcag ttgcagacca gagagccgcc 720
ttcgccactg gtgttcttcc atatatctac gcattccacc gctacacatg gagttccact 780
ctcccttctg cactcaagtt caacagtttc tgatgcaatt ctccggttga gccgaaggct 840
ttcacatcag acttattgaa ccgcctgcac tcgctttacg cccataaatc cggacaacgc 900
ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtgactt tctaagtaat 960
taccgtcaaa taaaggccag ttactacctc tatctttctt cactaccaac agagctttac 1020
gagccgaaac ccttcttcac tcacgcggcg ttgctccatc agacttgcgt ccattgtgga 1080
agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ttgggccgtg tctcagtccc aatgtggccg 1140
atcagtcctc aaccggctat gcatcattgc ctggtaagcc gttaccttac caactagcta 1200
atgcaccgca ggtccatcca agagtgatag cagaaccatc ttttaaactc tagacatgcg 1260
tctagtgttg ttatccggta ttagcatctg tttccaggtg ttatcccagt ctctgggcag 1320
gttacccacg tgttactcac ccgtccgccg ctcgcttgta tctagtttat ttggtgcaag 1380
caccaaattc atctaggcaa gctcg 1405
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (15)

1.一株格氏乳杆菌，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.20696，于2020年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的格氏乳杆菌和/或其制备物。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述的格氏乳杆菌的制备物为其培养物、培养物提取物、发酵液、发酵液上清、发酵液沉淀、发酵液提取物、冻干粉中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述的培养物为权利要求1所述的格氏乳杆菌接种于培养基得到，所述的培养基为MRS液体培养基、MC液体培养基、BCP培养基中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述的发酵液为权利要求1所述的格氏乳杆菌发酵得到。
6.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述的冻干粉由权利要求5中所述的发酵液离心获得沉淀后包埋冻干得到。
7.一种格氏乳杆菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、接种格氏乳杆菌CGMCC No.20696于培养基；
S2、条件培养。
8.权利要求1所述的格氏乳杆菌和/或权利要求2-6任一项所述的菌剂在制备用于治疗或预防泌尿感染和/或生殖感染的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的泌尿感染为：肾盂肾炎、输尿管炎、膀胱炎、尿道炎中的一种或多种。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的生殖感染为阴部念珠菌病、滴虫病、细菌性阴道炎、阴部传染性软疣、生殖感染肉芽肿、阴虱病、巨细胞病毒感染中的一种或多种。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的生殖感染为细菌性阴道炎。
12.一种预防或治疗泌尿感染和/或生殖感染的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的的格氏乳杆菌和/或权利要求2-6任一项所述的菌剂。
13.一种保健品，其特征在于，包括权利要求1所述的格氏乳杆菌和/或权利要求2-6任一项所述的菌剂。
14.一种食品，其特征在于，包括权利要求1所述的格氏乳杆菌和/或权利要求2-6任一项所述的菌剂。
15.一种格氏乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的格氏乳杆菌的发酵液12000-18000rpm离心，操作时间在13小时内完成，收集菌泥，整个过程严格无菌操作；
(2)菌体包埋：加入包埋剂对菌体进行包埋，包埋剂与菌泥的比例为1：1，搅拌均匀，全过程严格无菌操作；
(3)冷冻干燥：进行预冻，将温度降至-40℃，然后升温至-20℃，保持30分钟，继续升温至-10℃，保持30分钟，之后以每增加5℃继续进行升温至26℃，每个升温过程大概需要3小时左右，并在每个温度下保持30分钟，冻干时间为30-48小时；
(4)粉碎：粉碎后，冻干粉为乳白色至棕色粉末或颗粒状，具有乳酸菌特殊气味；称量冻干粉重量，保存。
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Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010023222A1 (en) * 2008-08-27 2010-03-04 Ellen Ab Administration unit comprising lactic acid bacteria
CN104080903A (zh) * 2011-07-14 2014-10-01 Gt生物制剂有限公司 从猪分离的菌株
CN104178437A (zh) * 2013-11-08 2014-12-03 苏州欧赛微科生物医药科技有限公司 一种卷曲乳杆菌及其在妇科疾病中的应用
CN104630083A (zh) * 2013-11-08 2015-05-20 苏州欧赛微科生物医药科技有限公司 一种卷曲乳杆菌及其在妇女保健产品中的应用
TW201531560A (zh) * 2013-11-08 2015-08-16 Suzhou Osel Bio Pharm Co Ltd 一種捲曲乳桿菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）及其應用
CN108004187A (zh) * 2018-01-11 2018-05-08 广东龙创基药业有限公司 一种格氏乳杆菌及其用于制备阴道抑菌药物的应用
WO2018100533A1 (en) * 2016-11-30 2018-06-07 Probioswiss Ag Urogenital medical device formulation based on suitable biochemical compositions for the stabilization of the acidity and the redox state of the vaginal fluid
EP3412766A1 (en) * 2017-06-06 2018-12-12 Casen Recordati, S.L. Lactobacillus salivarius strain, composition comprising the same, and uses thereof
CN109402002A (zh) * 2018-11-01 2019-03-01 南京工业大学 一种加氏乳杆菌及其在制备预防早产药物中的应用
WO2021000046A1 (en) * 2019-07-02 2021-01-07 Microsintesis Inc. Quorum-sensing inhibitors and/or postbiotic metabolites and related methods
WO2021007341A2 (en) * 2019-07-08 2021-01-14 BioPlx, Inc. Live biotherapeutic compositions and methods
CN112342154A (zh) * 2020-09-03 2021-02-09 上海上药信谊药厂有限公司 用于预防和治疗女性生殖道炎症的益生菌
CN112458006A (zh) * 2020-11-10 2021-03-09 深圳华大生命科学研究院 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病的格氏乳杆菌

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010023222A1 (en) * 2008-08-27 2010-03-04 Ellen Ab Administration unit comprising lactic acid bacteria
CN104080903A (zh) * 2011-07-14 2014-10-01 Gt生物制剂有限公司 从猪分离的菌株
CN104178437A (zh) * 2013-11-08 2014-12-03 苏州欧赛微科生物医药科技有限公司 一种卷曲乳杆菌及其在妇科疾病中的应用
CN104630083A (zh) * 2013-11-08 2015-05-20 苏州欧赛微科生物医药科技有限公司 一种卷曲乳杆菌及其在妇女保健产品中的应用
TW201531560A (zh) * 2013-11-08 2015-08-16 Suzhou Osel Bio Pharm Co Ltd 一種捲曲乳桿菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）及其應用
WO2018100533A1 (en) * 2016-11-30 2018-06-07 Probioswiss Ag Urogenital medical device formulation based on suitable biochemical compositions for the stabilization of the acidity and the redox state of the vaginal fluid
EP3412766A1 (en) * 2017-06-06 2018-12-12 Casen Recordati, S.L. Lactobacillus salivarius strain, composition comprising the same, and uses thereof
CN108004187A (zh) * 2018-01-11 2018-05-08 广东龙创基药业有限公司 一种格氏乳杆菌及其用于制备阴道抑菌药物的应用
CN109402002A (zh) * 2018-11-01 2019-03-01 南京工业大学 一种加氏乳杆菌及其在制备预防早产药物中的应用
WO2021000046A1 (en) * 2019-07-02 2021-01-07 Microsintesis Inc. Quorum-sensing inhibitors and/or postbiotic metabolites and related methods
WO2021007341A2 (en) * 2019-07-08 2021-01-14 BioPlx, Inc. Live biotherapeutic compositions and methods
CN112342154A (zh) * 2020-09-03 2021-02-09 上海上药信谊药厂有限公司 用于预防和治疗女性生殖道炎症的益生菌
CN112458006A (zh) * 2020-11-10 2021-03-09 深圳华大生命科学研究院 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病的格氏乳杆菌

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. J. AHIRE等: "In Vitro Assessment of Lactobacillus crispatus UBLCp01, Lactobacillus gasseri UBLG36, and Lactobacillus johnsonii UBLJ01 as a Potential Vaginal Probiotic Candidate", 《PROBIOTICS AND ANTIMICROBIAL PROTEINS》 *
WALLACE JENG YANG CHEE等: "Vaginal microbiota and the potential of Lactobacillus derivatives in maintaining vaginal health", 《MICROBIAL CELL FACTORIES》 *
侯莹: "功能益生菌的筛选及产品开发", 《食品安全导刊》 *
赵慧等: "女性阴道中产细菌素的乳杆菌筛选与鉴定", 《中国微生态学杂志》 *
马晓平等: "大熊猫阴道源乳酸杆菌生物学特性研究", 《浙江农业学报》 *
龚莉等: "一株新型抑制细菌性阴道病的菌种鉴定", 《韩山师范学院学报》 *

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