WO2016060539A1 - Cepas de lactobacillus brevis aisladas del aguamiel con actividad sal biliar hidrolasa y metodo de aislamiento y seleccion de las mismas - Google Patents

Cepas de lactobacillus brevis aisladas del aguamiel con actividad sal biliar hidrolasa y metodo de aislamiento y seleccion de las mismas Download PDF

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WO2016060539A1
WO2016060539A1 PCT/MX2015/000136 MX2015000136W WO2016060539A1 WO 2016060539 A1 WO2016060539 A1 WO 2016060539A1 MX 2015000136 W MX2015000136 W MX 2015000136W WO 2016060539 A1 WO2016060539 A1 WO 2016060539A1
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brevls
pta
strains
strain
lactobacillus
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PCT/MX2015/000136
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Yadira RIVERA ESPINOZA
Pablo MURIEL DE LA TORRE
Leticia GARDUÑO SICILIANO
Luis Alberto REYES NAVA
Ericka RAMOS TOVAR
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Instituto Politécnico Nacional
Centro De Investigación Y Estudios Avanzados Del Instituto Politécnico Nacional
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    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/24—Lactobacillus brevis

Definitions

  • the present invention is related to the principles and techniques employed in the development of new products, both food and pharmaceuticals and supplements, which include live microorganisms that produce beneficial effects on the health of individuals, and more specifically, is related to Lactobacillus strains brevis isolated from the Agave Salmiana mead, which, in addition to presenting probiotic properties, have bile salt hydrolase (BHS) activity; as well as, the present invention is related to the method of isolation and selection of said strains of Lactobacillus brevis.
  • BHS bile salt hydrolase
  • honey water mead is a sweet fluid (sap) that is obtained from different species of maguey (eg Agave americana, A. atrovlrens, A. feroz, A. maplsaga, A. salmiana) (Cervantes-Contreras, 2007; Escalante et al., 2004). Mead is appreciated as a sweet and refreshing drink that has been attributed medicinal uses as a diuretic to prevent various kidney conditions (Ram ⁇ rez-Rodr ⁇ guez, 2007). Also for the treatment of gastrointestinal disorders, loss of appetite and to increase milk secretion and improve its quality in women who breastfeed, among others (Ulloa, 1987).
  • Probiotics they are viable and non-pathogenic microorganisms capable of reaching the intestine in an amount sufficient to confer a benefit to the host (de Vrese and Schrezenmeir, 2008). Probiotics directly and indirectly influence the production of vitamins, short chain fatty acids, degradation of undigested food substances, stimulation of the immune response and protection against enteropathogenic microorganisms (Collado and Sanz, 2007).
  • Probiotics must be viable at the time of consumption and during the passage through the TGI to exercise its benefits. There are some discrepancies in the ideal values for the consumption of probiotics. According to the "Food and Agriculture Organization of the United Nations” (FAO), the minimum recommended level of viable probiotics to exert benefits is 10 6 CFU / mL at the time of consumption (Collado and Sanz, 2007).
  • the Termented milk and Lactic Acid Bacteria Beverage Association "proposes a minimum concentration of 10 7 CFU / ml of product, the" National Yogurth Association “(Sr ⁇ devi et al., 2009) requires a minimum of 10 8 CFU / g for a product can be qualified as a product with active cultures (Lourens-Hattingh, 2001). Others they propose the intake of a minimum daily dose between 10 9 and 10 10 CFU / ml so that health effects can be observed (Sanders and Hu ⁇ s int Veld, 1999).
  • probiotic microorganisms are bifidobacteria and lactic acid bacteria (Grill et ai., 1995; Collado and Sanz, 2007; Huang and Zheng, 2010).
  • probiotic microorganisms have been isolated from human and animal feces, as well as from fermented milks, but it has also been seen that some BALs present in fermented non-dairy substrates have probiotic characteristics (Rivera-Espinoza and Gallardo-Navarro, 2010).
  • probiotics improve human health with various modes of action (Ohland and Macnaughton, 2010):
  • probiotics can kill or inhibit the growth of pathogenic bacteria by expressing antimicrobial factors such as bacteriocins.
  • Probiotics can also compete with pathogens and other diners for binding sites in epithelial cells and thus prevent their colonization.
  • Lactobaclllus acidophilus strain La-5 secretes molecules that inhibit TGI colonization by Escherichla col!
  • EHEC 015 enterohemorrhagic 015: H7 (Medellin-Pena and Gr ⁇ f ⁇ ths, 2009) and through soluble and secreted components to the environment, Escherichla coli Nissle 1917 (EcN) inhibits the invasion of human intestinal cells INT407 by Versen / a ertterocoi ⁇ t ⁇ ca, Shlgella flexneri, Leglonalla pneumophlla and Listar ⁇ a monocytogenes (AKenhoefer et al., 2004).
  • probiotics can induce B cells, present in the lamina basement membrane, to increase their production of soluble IgA, and subsequently promote the transit of soluble IgA through epithelial cells for further secretion to the intestinal lumen. With these antibodies the colonization of the intestine is fought by pathogenic or commensal bacteria.
  • the administration of Lactobaclllus case / Shirota increases in the colon the level of soluble IgA against Shiga toxins 1 and 2 and against Eschertchla coli that produces Shiga toxin (STEC), in rabbits infected with STEC (Ogawa et al., 2001) .
  • Probiotics can also lessen the damage caused by viral infections in organs other than the intestine.
  • the administration of Lactobaclllus plantarum decreases the viral titer in the lungs and increases the level of interferon ⁇ (IFN- ⁇ ) in serum (Maeda et al., 2009 ).
  • IFN- ⁇ interferon ⁇
  • SBH bile salt hydrolase
  • SBH belongs to the family of coloylglycine hydrolases (EC 3.5.1.24) (Kim et al., 2004), has an optimal pH between 5 and 6 (Begley et al., 2006), is located inside bacteria (Corzo and Gilliland, 1999; Lundeen and Savage, 1990) but it is also secreted (Grill et al., 1995; Kishinaka et al., 1994).
  • Lactobaclllus acldophllus when evaluating in vitro the simultaneous decongestion of taurocholate with the assimilation of cholesterol in an MRS broth (acronym for Man, Rogosa and Sharpe, which are the creators of said broth) with 0.2% sodium thioglycolate. oxgall. 0.3%, taurocholate 0.2%, micelles of cholesterol and phosphatidyl choline 100mg / ml and L. acidophllus 43121 at 1%, a 50% removal of cholesterol was observed with a release of colic acid of 4.30 mmol / ml.
  • strain L acldophllus 43121 assimilates cholesterol and expresses activity of deconjugation and resistance to bile salts (Walker and Gilliland, 1993).
  • a dose of 2.5 x 10 "CFU was administered to Yorkshire pigs of 92 kg, a decrease in the total cholesterol concentration of 11.8% was observed (De Rodas et al., 1996).
  • Lactobacillus plantarum TGCM 15 decreased 81.46% cholesterol through bile salt hydrolase activity, when inoculated at a concentration of 1% P / V in MRS broth added with 0.3% P / V oxgall and soluble standard cholesterol in water at a concentration of 100 ⁇ g / ml (Sirilun, 2010).
  • L plantarum PH4 in an in vivo model of ICR mice has SBH activity on glycoconjugated bile salts and reduces total cholesterol by 7% and triglycerides by 10% (Nguyen et al., 2007).
  • Lactobaclllus plantarum 9-41 -A (with GenBank number HQ424577) administered to hypercolesterolemic SO male rats at a dose of 2x10 9 CFU / mL, decreased total cholesterol concentrations by 25.3% and low density lipoproteins by 32.9% , did not influence HDL levels. Rats administered with the microorganism excreted a greater amount of bile acids in feces (Xie et al., 2011).
  • Lactobaclllus plantarum LP09 and LP45 obtained from Kefir grains showed SBH activity in vitro tests and lowered total cholesterol, triglyceride and low density lipoprotein concentrations when administered in hypercolesterolemic Sprague-Dawley rats (Huang et al., 2013) .
  • Lactobaclllus plantarum NS5 [GenBank no. JQ013297] isolated from a Mongolian fermented dairy product in China, was administered in doses of 10 8 CFU / ml to male Sprague-Dawley (SD) rats fed a high cholesterol diet. CT and LDL concentrations were found to decrease by 18.11% and 33.33%, respectively (Hu et al., 2013).
  • Lactobaclllus reuteri CRL 1098 administered to hypercholesterolemic male mice at a concentration of 1x10 4 cells / day reduces total cholesterol by the action of SBH (Taranto et al., 1999).
  • Lactobaclllus reuteri with SBH activity on the following bile salts glycodeoxycholic acid, taurodeoxycholic acid, glycokenodeoxycholic acid and taurokenodeoxycholic acid, was administered in doses of 11.25 (SD 0.16) cell log to female and male pigs fed with hypercholesterolemic diet. A decrease in CT and LDL concentrations of 15 and 24% was found, respectively, no changes in HDL concentrations were found. An increase in the excretion of bile salts in the faeces was observed in the group treated with the microorganism, which confirmed the interaction of the SBH and the reduction of cholesterol concentrations (De Smet et al., 1998).
  • Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus delbrueckli subspecies Bulgaricus decreases by 40% the cholesterol in MRS broth added with oxgall 2-3 mg / ml and 100 ⁇ g / ml cholesterol, through a mechanism independent of SBH activity (Tok and Aslim, 2010) .
  • LactobacHlus delbrueckll subsp. bulgaricus NS12 [GenBank no. JX83976], isolated from natural fermented dairy products obtained from the Mongolian grasslands in China, was administered in doses of 10 8 CFU / ml to male Sprague-Dawley (SD) rats fed a high cholesterol diet. It was found that NS12 decreases total cholesterol concentrations by 12.83% and LDL concentrations by 22.44% (Hu et al., 2013).
  • LactobacHlus fermentum • LactobacHlus fermentum; LactobacHlus fermentum M1-16 (with GenBank number HQ423153 and obtained from feces of healthy adults) administered to hypercholesterolenic Sprague-Dawley (SD) male rats at a dose of 2 ⁇ 10 9 CFU / mL decreased CT and LDL concentrations 12.5% and 17.3% respectively, but did not influence HDL concentrations (Xie et al., 2011).
  • LactobacHlus fermentum SM-7 isolated from Kumis was tolerant of acids and bile, and also has microbial activity against pathogens such as Escherichia co // and Staphylococcus aureus.
  • pathogens such as Escherichia co // and Staphylococcus aureus.
  • the microorganism was shown to assimilate et cholesterol by 38.5% in a culture medium.
  • LactobacHlus gasseri the administration of L. gasseri SBT 0270 at a concentration of 1x10 9 CFU / ml to hypercholesterolenic Wistar rats reduces the concentration of LDL.
  • the microorganism deconjugates taurocolic acid and excretes bile acids in feces (Usman and Hosono, 2001).
  • LactobacHlus HJI-37 LactobacHlus HJI-37 tolerant to pH 2.5 - 3.0, 0.3% oxgall P / V and with SBH activity, decreased cholesterol concentration in an MRS medium with L-cysteine-HCI HaO 0.05% by 64% P / V (Hyeong-Jun et al., 2004).
  • - Mixtures strains of LaetobacUlus acldophlllus and Streptococcus faecalls, were administered to male F344 hypercholesterolemic rats at a dose of 10 7-8 CFU / mL CT concentrations were lower when the mixture of these two microorganisms was administered than when administered by separated. L.
  • acldophllus decreased the CT by 15.60%, Streptococcus faecalls 7.63% and the mixture by 22.9%. Both the mixture and the administration of each of the strains maintained the concentrations of HDL (Fukusima and Nakano, 1996).
  • Tolerant Streptococcus HJS-1 was isolated from the human intestine at pH 2.5 - 3.0, 0.3% oxgall p / v and with SBH activity, which decreased the cholesterol concentration in an MRS medium by 57% with L-cysteine HCI H 2 O 0.05% w / v (Hyeong-Jun et al., 2004).
  • Baclllus polyfermenticus SCD was administered to male Sprague-Dawley (SD) rats fed a diet high in fat and high in cholesterol, at a dose of 3.1 x10 6 CFU / d it was found that the microorganism significantly reduces LDL concentrations by 24 % while the CT decreased by 14% but it was not significantly (Paik et al., 2005).
  • the liver and probiotics the liver plays an important role within the human body since in addition to filtering the blood, it performs metabolic, digestive, homeostatic, immunological and metabolic reservoir functions, with a flow of around 1500ml of blood per minute. This organ can be affected by biological and chemical agents from other parts of the body. Kupffer cells (resident macrophages of the liver) play a key immune role in the process of capturing and detoxifying any foreign agent. Chemical and biological agents can be carried by blood through the portal system along with the nutrients absorbed and delivered directly to Kupffer cells for elimination (Maclas Rodr ⁇ guez, 2009).
  • liver cirrhosis The final state of chronic liver diseases is liver cirrhosis.
  • WHO World Health Organization
  • liver cirrhosis was the fourth leading cause of death in 2011 in our country, and ranked 19th worldwide (WHO, 2011).
  • L rhamnosus also proved to have a beneficial effect on the liver by reducing oxidative stress markers (Forsyth et al., 2009).
  • Transaminase enzymes had lower levels in an acute liver damage model after 2 days of treatment with L case / (Haro et al., 2009).
  • some probiotic bacteria should be contraindicated in immunocompromised individuals and / or chronic diseases, to avoid the development of possible complications.
  • lactobacilli such as L. rhamnosus GG, have been recognized for causing endocarditis in adults and sepsis in children (Boyle et al., 2006).
  • probiotic bacteria should always be subject to risk / benefit analysis before being administered (Floch, 2013), since a good probiotic in addition to exerting a beneficial effect on the host should not be pathogenic or toxic (Wallace et al. ., 2011).
  • Liver enzymes damage can be quantified by the state of the liver cells. Accordingly, measuring the expression of serum hepatocyte enzymes has proven to be a relevant method for assessing cell death. Liver damage can be reflected in the loss of integrity of hepatocyte components, such as the membrane or cytoplasm, where the alanine amino transferase (ALT), gamma glutamyl transpeptidase (v-GTP) enzymes are found and alkaline phosphatase (FA) (Ruiz Grinspan, 2004).
  • ALT alanine amino transferase
  • v-GTP gamma glutamyl transpeptidase
  • FA alkaline phosphatase
  • Oxidative stress is defined as a state of oxidation of vital molecules where its structure and biological function is modified, which over time lead to the deterioration of different organs and systems of living beings due to the imbalance between oxidant and antioxidant systems (Halliwell, 2009). Free radical damage to lipids (lipid peroxidation) is reflected in the structures rich in polyunsaturated fatty acids, such as cell membranes, where these molecules alter permeability, which induces edema and subsequently cellular tisis (Slater , 1984; Muriel, 1997, 2009).
  • Kpidos peroxidation is to quantify malondialdehyde (Buege and Aust, 1978).
  • the first step in the selection of a probiotic is that it should not be pathogenic, determine its taxonomic classification, study its tolerance to the conditions of TGI generated by the presence of gastric juices and bile, and check its beneficial effects on health (Mourad and Nour-Eddine, 2006).
  • Acidity tolerance is a desirable property when selecting microorganisms with probiotic characteristics. Gram positive microorganisms survive through a combination of inducible and constitutive strategies that include proton removal (H *), alkalization of the external environment, changes in cell membrane composition, protein production and expression of transcriptional regulators (Cotter and Hill, 2003).
  • Bile salts are biological detergents that disorganize the structure of the lipid bilayer, cross the bacterial membrane, acidify the bacterial cytoplasm, inhibit nutrient transport and therefore induce cell lysis (Begley et al., 2005).
  • the SBH activity of bacteria prevents microorganisms from becoming intoxicated by bile salts of TGI, and therefore favors their survival and persistence in the intestine (Begley et al., 2006).
  • the SBH also plays a very important role in nutrition, since the amino acids released by the decongestion of bile salts are used by microorganisms as a source of carbon, nitrogen and energy. Glycine is metabolized to ammonium and CO 2 , and taurine is metabolized to ammonium, CO 2 and sulfate (Begley et al., 2005). Microbial populations increase in size as a result of deconjugation reactions mediated by SBH.
  • Ljohnsonii PF01 Choe et ai., 2013
  • L plantarum BBE7 Downlink et al., 2012
  • L plantarum ST-lll Renid al., 2012
  • L plantarum WCFS1 Long et al., 2008
  • L acidophllus BFE 6128 Vizoso Pinto et al., 2006
  • L fermentum KC5b and Streptococcus bovis Pereira et al., 2003.
  • Mexican Patent Application No. MX / a / 2010/007488 relates to the branch of animal feed, with the obtainment of additives from plants, specifically obtaining a product with high levels of fructans and its application as a prebiotic to achieve a better growth of beneficial bacteria of TGI (probiotic bacteria), which has an impact on a better state of health in the host.
  • the objective of said invention is to propose a process that allows obtaining a prebiotic product from the Agave fourcroydes to be used as an additive, with high levels of fructans in a polydispersed mixture, in animal feed.
  • said patent is not related to the present invention since a prebiotic, unlike probiotics, is generally non-digestible carbohydrates that stimulate the growth of beneficial bacteria found in the TGI.
  • Mexican Patent Application No. MX / a / 2012/007970 (corresponding to the National Phase of the International Patent Application No. PCT / IT2011 / 000003) describes a process for the preparation of a biomass comprising one or more plantaricines A , N or K in association with lactic acid bacteria used for the preparation and uses thereof to stimulate the barrier function of human epidermal intestinal cells or keratinocytes.
  • the application does not mention the strains used, nor does it mention its effect in the presence of any pathogenic microorganism, its effect on liver enzymes, nor declares lipid lowering effects.
  • the effect attributed to the barrier function is the combination of lactic acid bacteria with plantaricin.
  • US Patent Series No. US5516684 describes lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus that do not exhibit bile acid deconjugation and inhibition of nutrient absorption, and display of decreased cholesterol in the blood and liver.
  • Lactobacillus strains There are two specific Lactobacillus strains that have been described that exhibit these characteristic properties. The two strains are Lactobacillus acldophllus FERM-P-14204 and Lactobacillus acidophilus FERM-P-14205.
  • Lactobacillus brevis Lb2H, LB3H and Lb13H strains were isolated and selected from the mead in a first phase; and, in a second phase, simulating the conditions of the gastrointestinal tract, the Lactobacillus brevis Lb5H and LB9H strains were isolated and selected from the mead.
  • Said five strains Lactobacillus brevis Lb2H, Lb3H, LbSH, Lb9H and Lb13H fulfill the objectives of the present invention.
  • Lactobacillus brevis Lb2H, LB3H, Lb13H and LB5H strains also referred to as Lactobacillus brevis mlx, is provided and described, which prevents liver damage by decreasing liver activity.
  • serum enzymes ALT, ⁇ -GTP and FA serum enzymes ALT, ⁇ -GTP and FA.
  • said mixture of Lactobacillus brevis strains does not produce it to the liver, nor does it exacerbate the damage caused by toxic agents.
  • each of the Lb2H, Lb3H, Lb5H and Lb13H strains must be present in said mixture in a concentration ranging from 1 ⁇ 10 8 to 1x10 10 CFU / ml, preferably 1x10 8 CFU / ml.
  • the Lactobacillus brevis Lb9H strain alone allows the atherogenic index to decrease.
  • the Lactobacillus brevis Lb9H strain must be used in a concentration ranging from 1x10 8 to 1x10 10 CFU / ml. or 1x10 8 CFU / ml.
  • the strains of Lactobaclllus brevis Lb2H, Lb3H, Lb5H, Lb9H and Lb13H were deposited with the ATCC (acronym for the American Type Culture Collection) as the International Deposit Authority of the Budapest Treaty for the International Recognition of Microorganism Deposit for Purposes of Patent Procedures with the following registration numbers:
  • SBH bile salt hydrolase
  • a further object of the present invention is to provide a mixture of Lactobacillus bnvls strains isolated from mead that allow preventing liver damage by decreasing the activity of serum alanine amino transferase (ALT), Gamma glutamyl transpeptidase ( ⁇ -GTP) enzymes. alkaline phosphatase (FA) with respect to the damage induced by LPS and D-Galactosamine.
  • ALT serum alanine amino transferase
  • ⁇ -GTP Gamma glutamyl transpeptidase
  • FA alkaline phosphatase
  • a further object of the present invention is to provide a strain of Lactobacillus bnvls isolated from mead that allows lowering the cholesterol concentration, as well as increasing the concentrations of low density lipoproteins (LOL), in addition to decreasing the atherogenic index by increasing the HDL / total cholesterol and HDL cholesterol / LDL cholesterol ratios by 45% and 68%, respectively.
  • LDL low density lipoproteins
  • Figure 1 shows a flow chart of the isolation method of strains 5 and 9.
  • the cellular package of the mead and the different stress conditions of the TGI is obtained, by centrifugation at 8000 rpm.
  • the stress conditions of the TGI used are: a) oral cavity.
  • DH 2.0.
  • FIG. 1 Plates with MRS agar added with 0.5% bile salts: (a) Upper left panel shows colonies in the presence of sodium glycocholate; (b) upper right panel colonies are observed in the presence of sodium glycodeoxychoate; (c) left lower panel colonies are observed in the presence of sodium taurocholate; and, (d) right lower panel colonies are observed in the presence of sodium taurodeoxycholate. Precipitation halos are observed around the colony, indicating SBH activity qualitatively in the four types of bile salts. Table 2 shows that the diameter obtained for each colony of the mead in the presence of the different bile salts is different.
  • glycocholate, glycodeoxycholate, taurocholate and taurodeoxycholate was shown by strains 2H, 3H, 5H and 13H, respectively.
  • the positive control L acidophilus showed a greater halo in GDC; meanwhile, the negative control, the pathogen E. col !, did not show halo.
  • FIG. 3 Identification of the precipitate of the colonies that come from the plates with MRS-bile salts agar: a) Upper left panel-sodium glycocholate (GC); b) upper right panel-sodium glycodeoxycholate (GDC); c) lower left panel-sodium taurocholate (CT); and, d) lower right-taurodeoxycholate panel (TDC).
  • C means sodium cholate and DC is sodium deoxycholate, both are products of primary and secondary salt deconjugation, respectively.
  • the treatment with the mixture formed by the Lactobacttlus bravia Lb2H, Lb3H, Lb5H and Lb13H strains (called L. brevis mix in Figures 9 and 10) isolated from the mead are harmless, since the group administered with the Lactobacttlus bravia mix Lb2H mixture , Lb3H, Lb5H and Lb13H showed no significant difference (p ⁇ 0.05) with the control group (water) when evaluating the activity of the ⁇ -GTP enzyme. By inducing damage with LPS plus D-GalN, the elevation of the ⁇ -GTP enzyme was found.
  • Figure 7 Effect of the Lactobacttlus bravls Lb9H strain on serum total cholesterol concentrations.
  • N Normal group
  • H hypercholesterolemic
  • Lb9H-H Hypercholesterolemic group + Lactobacttlus bravls Lb9H. Basal concentrations of total cholesterol were found in 27 mmol / L. The special diet raised the total cholesterol concentrations 50 mmol / L.
  • Figure 9 Effect of the Lactobaclllus brevls Lb9H strain on serum triglyceride concentrations.
  • N Normal group
  • H hypercholesterolemic
  • Lactobaclllus brevls Lb2H, LB3H and Lb13H strains were isolated from mead in a first phase; and, in a second phase, simulating the conditions of the gastrointestinal tract, the Lactobaclllus strains were isolated from the mead brevis LbSHyLBBH.
  • Said five strains Lactobaclllus brevis Lb2H, Lb3H, Lb5H, Lb9H and Lb13H fulfill the objectives of the present invention.
  • Lactobaclllus brevls Lb2H, LB3H, Lb13H and LBSH strains also referred to as Lactobaclllus brevls mlx
  • ALT serum alanine amino transferase
  • ⁇ -GTP Gamma glutamyl transpeptidase
  • FA alkaline phosphatase
  • each of the Lb2H, Lb3H, Lb5H and Lb13 strains is present in said mixture in a concentration ranging from 1x1o 8 to 1x10 10 CFU / ml, preferably 1x10 8 CFU / ml.
  • the Lactobaclllus brevls Lb9H strain alone allows the atherogenic index to decrease.
  • the Lactobaclllus brevls Lb9H strain to be functional it must be used in a concentration ranging from 1x10 * to 1x10 10 CFU / ml, preferably 1x10 * CFU / ml.
  • strains of Lactobaclllus brevls from honey water are described in the present invention, so that for their isolation, said mead was first collected.
  • the mead samples were obtained from the Salmian Agrave that is grown in the municipality of Huitzilac in the State of Morelos (19 ° 02'N, 99 ° 1 (WW). Solids soluble in ° Brix of the mead sample were 11.5 ⁇ 0.3 and the pH 4.2 ⁇ 0.2. The sample was placed in sterile tubes and transported to the laboratory under refrigeration conditions (4 ° C).
  • LbSH PTA-120748
  • Lb9H PTA-120751
  • Lb13H PTA-120752
  • Phase I of isolation and selection of Lactobaclllus brevis Lb2H, Lb3H and Lb13H comprises the steps of:
  • Phase II isolation and selection of the Lactobacillus brevis Lb5H and Lb9H strains comprises the steps of:
  • step (e) Incubate the cell pack obtained in step (d) above in 20ml of a 0.5% solution of NaCl and pH 2.0 with 3g / L of pepsin, wherein said incubation is carried out for 90 minutes at a temperature of 37 ° C simulating the conditions of artificial gastric juice, maintaining constant agitation at 180 rpm to reproduce peristaltic movements;
  • step (g) Incubate the cell packet obtained in step (f) in 20ml of a PBS solution at a pH of 6.8, added with 0.5% oxgall and 1g / l pancreatin, wherein said incubation is carried out during a time of 150 minutes at a temperature of 37 ° C simulating the conditions of duodenal secretion, maintaining constant agitation at 180 rpm to reproduce peristaltic movements;
  • step (h) Inoculate 10 ⁇ the cell packet obtained in step (g) in boxes prepared with MRS agar added with 0.5% sodium glycocholate and 0.37 g / l CaCl 2 , and incubate said boxes at 37 ° C for 72 hours;
  • Phase III of conservation of the Lactobaclllus brevls Lb2H (PTA-120749), Lb3H (PTA-120750), LbSH (PTA-120748), Lb9H (PTA-120751) and Lb13H (PTA-120752) strains comprise the stages of:
  • phase IV of qualitative evaluation of SBH activity of the cultures by size of the hydrolysis halo to obtain the mixture of Lactobaclllus brevls mlx strains formed by the Lb2H, Lb3H, Lb5H and Lb13H strains, wherein said phase IV comprises the stages of:
  • phase V of quantitative evaluation of bile salt hydrolase activity in the cultures by means of the release of glycine / taurine during the activity of said enzyme for the selection of strain Lb9H, wherein said phase V comprises the steps of:
  • the casal strain L was isolated from a commercial product, Lactobaclllus acldophllus, L Johnsonll and E. col! ATCC 160211 were kindly donated by Dr. Alejandro Azaola Espinosa (Autonomous Metropolitan University, Xochimilco, Mexico) and EPEC strain E2348 / 69 was generously donated by Dr. Fernando Navarro (Department of Cell Biology, Cinvestav, Mexico).
  • catalase activity was evaluated by adding a drop of hydrogen peroxide (30% v / v) to an aliquot of the pure culture to be analyzed. The test is based on the decomposition of hydrogen peroxide by catalase in water and oxygen. The presence of The latter is manifested by the appearance of bubbles. Lactic acid bacteria are generally catalase negative and do not generate bubbles.
  • Milk coagulation test in this test the ability of microorganisms to coagulate milk was evaluated. A sample of 1 x 10 8 CFU / ml was added to a sample of sterilized milk at 110 ° C for 10 minutes and incubated at 37 ° C for 24 hours. Lactobacillus johnsonll C4 and milk were used as a positive control without adding any culture as a negative control.
  • the strains were incubated overnight at 37 ° C in MRS broth. Immediately after, they were cultured in blood agar and incubated for 48 hours at 37 ° C. Hemolysis was considered positive when the agar around the colonies changed from red to green.
  • the discs were placed on MRS agar plates previously inoculated with each strain. Plates were incubated for 72 hours at 37 ° C under aerobic conditions. To express the results, the growth inhibition halo produced by each antibiotic was measured and expressed in mm. These mm were transformed according to the manufacturer's indications and the results were expressed as susceptible (S) and resistant (R) to the antibiotic.
  • PCR amplification of the isolated strains was carried out using the Lab-0159f (5 ' - GGAAACAG (A / G) TGCTAATACCG-3') and Uni-0515r (5WCGTATTACCGCGGCTGCTGGCA-3) primers derived from the amplification of 400 bp of the 16Sr DNA gene of LactobacHIus. Amplifications were performed using a T gradient thermal cycler (model Tgradient 96, Cat. 050-801, Bbmetra, Germany).
  • the relevant controls were carried out.
  • the serum activity of the liver enzymes alanine amino transferase (ALT), gamma glutamyl transpeptidase ( ⁇ -GTP) and alkaline phosphatase (FA) (Bergmeyer et al., 1983) were evaluated.
  • the concentration of glycogen and lipid peroxidation in liver was measured.
  • Total cholesterol was quantified through the CH201 enzyme reagent kit (Randox brand, Antrim, UK) and high density lipoproteins through the CH3811A kit (Randox brand, Antrim, UK) using an automated colorimetric kit known as Selectra from the serum obtained.
  • LDL Col - HDL - (TG x 0.45)
  • AI atherogenic index
  • AI (Total Cholesterol - HDL Cholesterol) / HDL Cholesterol
  • lactobacilli capable of growing in the presence of bile salts and surviving the stress conditions of the TGI environment.
  • PTA-120751 and LbH13 were selected because they possess the expected characteristics in a lactobacillus: bacillus form, Gram positive, catalase negative, coagulate milk. These characteristics were also found in strain L. case /, used as a control. Said strains Lactobacillus brevis Lb2H, Lb3H, Lb5H. Selected Lb9H and Lb13H did not show hemolytic activity, which is important, since the presence of this activity may contribute to the virulence of some pathogenic bacteria (Sridevi, 2009).
  • Bacilli isolated from mead were identified as belonging to the genus LactobacHIus by their fermentation pattern. With regard to the characterization by fermentation pattern, the isolates that come from the fresh sap (mead) of agave belong to the genus LactobacHIus, 3 isolated with identity of LactobacHIus collinoides and 2 isolated with identity of LactobacHIus brevis (see table 2). Two of the isolates identified as L.
  • collinoides (2H and 5H) had the same carbohydrate fermentation pattern (L-arabinose, D-ribose, D-xylose, D-glucose, D-fructose, metikxD-glucopyranoside, N-acetyl glucosamine, esculin, D-maKosa, potassium gluconate and potassium 5-Ketogluconate (95.1% identity).
  • the 5H isolate fermented D-mannose.
  • the 3H isolate identified as L collinoids (identity of 58.7) showed different fermentation pattern with respect to the mentioned strains, also fermenting O-galactose, D-mannitol, D-sorbitol and D-melibiosa.
  • isolates 9H and 3H identified as L brevis only differed from L collinoids in the fermentation of D-mannose and D-cellobiose.
  • Lactobacillus isolated from fresh agave sap were identified as LactobacHIus brevis by its genotypic pattern.
  • Water-honey Lactobacillus brevis strains hydrolyze bile salts: once the colonies were selected, their ability to hydrogenate 4 different bile salts selected from the group comprising: sodium taurocholate (TC), sodium taurodeoxycholate (TDC), glycocholate of sodium (GC) and sodium glycodeoxycholate (GDC), measured as hydrolysis halos.
  • TC sodium taurocholate
  • TDC sodium taurodeoxycholate
  • GC glycocholate of sodium
  • GDC sodium glycodeoxycholate
  • Table 2 shows that the diameter obtained for each colony of the mead in the presence of the different bile salts is different.
  • the largest size for glycocholate, glycodeoxycholate, taurocholate and taurodeoxycholate was shown by strains 2H, 3H, 5H and 13H, respectively.
  • the positive control L acldophilus showed a greater halo in GDC on the other hand, the negative control, the pathogen E. coli, showed no halo.
  • the 5 strains: Lb2H, Lb3H, LbSH, Lb13H and Lb9H show bile salt hydrolase activity on the 4 bile salts tested.
  • He isolated that presented the highest enzymatic activities on glycine conjugated bile salts was Lb9H on glycocholate (1307 U / mg protein), followed by Lb2H (1063 U / mg protein for glycocholate and 1038 U / mg protein for glycodeoxycholate).
  • Lb13H, LbSH and Lb3H strains showed similar SBH activity in the 4 bile salts tested.
  • the affinity shown by all isolated strains of L brevls to glycine-conjugated bile salts may be because glyco-conjugated bile salts are more toxic to bacteria compared to taurine-conjugates, and therefore lactobacilli express salt.
  • Bile hydrolase as a protective mechanism against toxicity of bile acids.
  • the fact that the isolated strains L brevls have greater affinity for glyco-conjugated bile salts is important, since most human bile salts are conjugated to glycine; and therefore, such isolated strains may be important in the deconjugation of bile salts in the human intestine.
  • LbH2 ATCC No. PTA-120749
  • LbH3 ATCC No. PTA-120750
  • LbH5 ATCC No. PTA-120748
  • LbH13 PTA-120752
  • brevls mix, considering the larger hydrolysis halo in the different bile salts: Lb2H in glycocholate salt, Lb3H in glycodeoxycholate salt, LbSH in taurocholate salt and Lb13H in taurodeoxycholate salt, to assess its safety and prevention effect of liver damage in a live model.
  • the strain with the highest specific SBH activity (LbSH) on glycocholate was selected to assess its lipid lowering effect.
  • the Lactobacillus brevls mix formed by the Lactobaclllus brevls Lb2H, Lb3H, LbSH and Lb13H strains isolated from mead maintains the serum activity of the Gamma enzyme glutamyl transpeptidase ( ⁇ -GTP) at the same levels as the control without the addition of said mixture of strains and decreases the serum activity of the enzyme Gamma glutamyl transpeptidase ( ⁇ -GTP) to 100% with respect to the damage induced by LPS and D -Galactosamine without the addition of said strain mixture.
  • ⁇ -GTP Gamma enzyme glutamyl transpeptidase
  • Lactobacillus brevis mix formed by the strains of Lactobacillus brevis Lb2H,
  • Lb3H, LbSH and Lb13H isolated from mead maintain the serum activity of the alkaline phosphatase at the same levels as the control without the addition of said strain mixture and decreases the serum activity of the enzyme alkaline phosphatase 100% with respect to LPS-induced damage and D-Galactosamine without the addition of said mixture.
  • the enzyme FA was raised, which is also indicative of damage to the hepatocyte canalicuiar membrane and cholestasis.
  • treatment for 14 days with the lactobacillus mixture prevented cholestasis induced by LPS + D-GalN.
  • the controls where only the lactobacillus mixture was administered did not show any alteration on normal liver function. Which indicates the safety of the mixture of strains in the model used.
  • Lactobaclllus brevls mixture of mead limited the serum activity of the FA enzyme by 58.6%, as shown in Figure 6.
  • a similar effect was found when administering L rhamnosus and L. plantarum (54.7%) in rats intoxicated with D-GalN (Adawi et al., 2001).
  • Lb9H low density lipoprotein
  • Treatment with Lb9H decreased the atherogenic index by increasing the ratios: total HDIJcolesterol cholesteroi and HD1JLDL cholesterol by 45% and 68%, respectively, and by decreasing the TG / HDL ratio by 9.4% (p ⁇ 0.05), which is desirable to reduce the incidence of diseases related to high cholesterol concentrations (see table 4).
  • the lipid-lowering effect found when administering the Lb9H strain may be due to the fact that this strain was found at the end of the TGI simulation, so it is suggested that it was able to remain viable and at the appropriate concentrations to exert a beneficial effect by decreasing levels of total cholesterol and LDL.
  • the Ub9H strain showed better specific activity bile salt hydrolase on glycocholate (primary bile salt present in higher concentration in the intestine), which is good considering that SBH activity has been related to the lipid lowering capacity of a bacterium (Kim et al., 2004).
  • Lactobacillus plantaaim 423 as probiotics by using a gastro-intestinal model with infant milk formulations as substrate.
  • Lactobaci ⁇ lus GG treatment ameliorates alcohol-induced intestinal oxidative stress, gut leakiness, and liver injury in a rat model of alcoholic steatohepatitis. Alcohol. 43: 163-172. Friedewald, WT, Rl Levy, and DS Fredrickson. 1972. Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge. Clin. Chem. 18: 499-502.
  • BioEdit a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98 / NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41: 95-98.
  • Lactobacillus casei influence on the innate immune response and haemostatic alterations in a liver-injury model. Dog. J. Microbe !. 55: 648-656.
  • Lactobacillus acidophilus American type culture collection 4356 in rats are mediated by the down-regulation of Niemann-Pick C1-like 1.
  • Oral administration of heat-killed Lactobacillus plantarum L-137 enhances protection against influenza virus infection by stimulation of type I interferon production in mice. Int.
  • Lactic acid starter and prob ⁇ otic bacteria a comparative "in vitro" study of probiotic character ⁇ stics and biological barrier resistance. Food Ros. Int. 36: 895-904.

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Abstract

La presente invención se relaciona con cepas de Lactobacillus brevis LbH2, LbH3, LbHS, LbH9 y LbH13, aisladas del aguamiel de Agave selmiana y su método de aislamiento, en donde dichas cepas presentan actividad sal biliar hidrolasa (SBH) así como propiedades probióticas que ayudan a prevenir e! incremento del coíesterol total. Asimismo, se relaciona con una mezcla de cepas de LactobscHius brevis, también denominada como Lactobacillus brevis mix, que previene el daño en el hígado ya que disminuye la actividad de las enzimas séricas marcadoras de daño hepático.

Description

CEPAS DE LACTOBACILLUS BREV1S AISLADAS DEL AGUAMIEL CON ACTIVIDAD SAL BILIAR HIDROLASA Y MÉTODO DE AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE LAS MISMAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención está relacionada con los principios y técnicas empleadas en el desarrollo de nuevos productos, tanto alimentos como farmacéuticos y suplementos, que incluyen microorganismos vivos que producen efectos benéficos en la salud de los individuos, y más específicamente, está relacionada con cepas de Lactobacillus brevis aisladas del aguamiel de Agave Salmiana, las cuales, además de presentar propiedades probióticas, tienen actividad sal biliar hidrolasa (BHS); así como también, la presente invención está relacionada con el método de aislamiento y selección de dichas cepas de Lactobacillus brevis.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Agua miel: el aguamiel es un fluido dulce (savia) que se obtiene a partir de diferentes especies de maguey (e.g. Agave americana, A. atrovlrens, A. feroz, A. maplsaga, A. salmiana) (Cervantes-Contreras, 2007; Escalante et al., 2004). El aguamiel es apreciado como una bebida dulce y refrescante a la cual se le han atribuido usos medicinales como diurético para evitar diversos padecimientos renales (Ramírez-Rodríguez, 2007). También para el tratamiento de trastornos gastrointestinales, pérdida del apetito y para incrementar la secreción de leche y mejorar su calidad en las mujeres que amamantan, entre otros (Ulloa, 1987).
Estudios experimentales han probado que el aguamiel posee actividad antimicrobiana, al inhibir el crecimiento de ciertas bacterias entéricas Gram negativas como Salmonella paratyphl, Pseudomona aeruglnosa, Escherlchla coll y Shlgella sonnel, así como a bacterias Gram positivas como Staphylococcus aureus (Davidson and Ortiz de Montellano, 1983).
Se ha reportado que en el aguamiel se encuentran microorganismos autóctonos, tales como bacterias acido lácticas (BAL) (Escalante et al., 2004). Estos y otros estudios del aguamiel se han centrado fundamentalmente en la microbiota.
Al momento de la presentación de la solicitud de patente que nos ocupa, no se encuentran en el estado de la técnica estudios publicados sobre las características probióticas de los microorganismos que se encuentran presentes en la savia del agave pulquero. Dentro del grupo de las BAL, se encuentra el género Lactobacillus, el cual es un grupo grande y diverso de bacterias Gram positivas. Dado que algunas cepas de este género bacteriano han sido utilizadas como probióticas, y son de amplia aceptación en la industria de los alimentos funcionales, es propósito de la presente invención determinar qué microorganismos dei aguamiel pueden otorgar beneficios a la salud porque poseen características probióticas.
Los probíóticos: son microorganismos viables y no patógenos capaces de llegar al intestino en una cantidad suficiente para conferir un beneficio al hospedero (de Vrese and Schrezenmeir, 2008). Los probióticos influyen directa e indirectamente a través de producción de vitaminas, ácidos grasos de cadena corta, degradación de sustancias alimenticias no digeridas, estimulación de la respuesta inmune y protección frente a microorganismos enteropatógenos (Collado and Sanz, 2007).
En el intestino, el deterioro de la función de barrera tiene como consecuencia la diarrea y la entrada de antígenos que pueden agravar o iniciar una inflamación, así como enfermedades autoinmunes. Se ha demostrado que algunos probióticos previenen o reducen ia enterocolitis necrotizante en infantes pre-término (Alfaleh et al., 2010; Deshpande et al., 2010), la diarrea en adultos asociada al tratamiento con antibióticos (Kale-Pradhan et al., 2010) o por infecciones en niños (Chen et al., 2010; Pedone et al., 1999) y la pouchitis que se presenta en el 30% de los pacientes con colitis ulcerativa crónica después de la anastomosis del íleo con el ano (Holubar et al., 2010). En cambio, existen datos contradictorios sobre el efecto benéfico de los probióticos en el tratamiento de dermatitis atópicas y alergias en niños (Boyle et al., 2009), la enfermedad inflamatoria intestinal y el síndrome del intestino irritable (Moayyedi et al., 2010; Rioux and Fedorak, 2006).
Los probióticos deben de ser viables en el momento del consumo y durante el pasaje por el TGI para ejercer sus beneficios. Existen algunas discrepancias en los valores ideales para el consumo de probióticos. De acuerdo a la "Food and Agricultura Organization of the United Nations" (FAO), el nivel mínimo recomendado de probióticos viables para ejercer beneficios es de 106 UFC/mL al momento del consumo (Collado and Sanz, 2007). La Termented milk and Lactic Acid Bacteria Beverage Association", propone una concentración mínima de 107 UFC/ml de producto, la "National Yogurth Association'' (Srídevi et al., 2009) exige un mínimo de 108 UFC/g para que un producto pueda ser calificado como producto con cultivos activos (Lourens-Hattingh, 2001). Otros proponen la ingesta de una dosis mínima diaria de entre 109 y 1010 UFC/ml para que puedan ser observados los efectos en la salud (Sanders and Huís int Veld, 1999).
La mayoría de los microorganismos probióticos son bifidobacterias y bacterias ácido lácticas (Grill et ai., 1995; Collado and Sanz, 2007; Huang and Zheng, 2010). Tradicionalmente, los microorganismos probióticos se han aislado de heces humanas y animales, asi como de leches fermentadas, pero también se ha visto que algunas BAL presentes en sustratos fermentados no lácteos presentan características probióticas (Rivera-Espinoza and Gallardo-Navarro, 2010).
La búsqueda de nuevas cepas con potencial probiótico es constante, ya que no se puede asumir que todas las BAL poseen propiedades probióticas. De igual manera, cuando se adscribe un efecto probiótico a una cepa, tampoco se puede extrapolar esa propiedad a las restantes cepas de la misma especie (Shah, 2007). En este sentido, se ha establecido que para considerar como probiótico a un microorganismo, éste no debe ser patógeno y debe ser capaz de resistir el paso a través del TGI para poder ejercer sus efectos benéficos (Vasiljevic and Shah, 2008). Además, debe de favorecer el equilibrio microbiano del intestino impidiendo la adhesión de microorganismos patógenos y/o produciendo sustancias antimicrobianas que inhiben la proliferación de los patógenos (O'Sullivan, 2000; Dolz, 2008).
Mecanismo de acción de los probióticos: los probióticos mejoran la salud humana con diversos modos de acción (Ohland and Macnaughton, 2010):
a) Promueven la exclusión de las bacterias patógenas del intestino: los probióticos pueden matar o inhibir el crecimiento de bacterias patógenas al expresar factores antimicrobianos como las bacteriocinas. Los probióticos también pueden competir con los patógenos y otros comensales por los sitios de unión en las células epiteliales y de esta manera prevenir su colonización. Así por ejemplo el Lactobaclllus acidophilus cepa La-5 secreta moléculas que inhiben la colonización del TGI por la Escherichla col! enterohemorrágica (EHEC) 015:H7 (Medellin-Pena and Grífñths, 2009) y a través de componentes solubles y secretados al medio, la Escherichla coli Nissle 1917 (EcN) inhibe la invasión de las células intestinales humanas INT407 por Versen/a ertterocoiítíca, Shlgella flexneri, Leglonalla pneumophlla y Listaría monocytogenes (AKenhoefer et al., 2004).
b) Modulan el sistema inmune del huésped, especialmente en el intestino: los probióticos pueden inducir a las células B, presentes en la lámina propia, a incrementar su producción de IgA soluble, y posteriormente promover la transitaste de IgA soluble a través de las células epiteliales para su ulterior secreción al lumen intestinal. Con estos anticuerpos se combate la colonización del intestino por bacterias patógenas o comensales. La administración de Lactobaclllus case/ Shirota incrementa en el colon el nivel de IgA soluble contra las toxinas Shiga 1 y 2 y contra la Eschertchla coli que produce la toxina Shiga (STEC), en conejos infectados con STEC (Ogawa et al., 2001). Los probióticos también pueden aminorar el daño causado por infecciones virales en órganos distintos al intestino. Así se ha visto que en ratones infectados con el virus de la influenza H1 N1 , la administración de Lactobaclllus plantarum disminuye el título viral en los pulmones e incrementa el nivel de interferón β (IFN-β) en suero (Maeda et al., 2009).
c) Aumentan la contractilidad del colon, lo que reduce la constipación intestinal: se ha visto que los sobrenadantes de cultivo de EcN estimulan la contracción de las células musculares lisas del intestino (Bar et al., 2009).
Los probióticos, el colesterol y su relación con la actividad de la sal biliar hidrolasa (SBH); pruebas in vtro e in vivo demuestran que algunas cepas probióticas disminuyen la concentración de colesterol. Aunque el mecanismo aún no se conoce con claridad, se sabe que en parte se debe a la producción de la SBH que cataliza la hidrólisis de las sales biliares conjugadas con glicina o taurina a sales biliares libres y residuos de aminoácidos durante la circulación enterohepática. Las sales biliares desconjugadas son menos solubles y se eliminan fácilmente por las heces. Esto promueve la síntesis de novo de sales biliares a partir de colesterol sérico y produce en consecuencia una reducción del mismo. La SBH también disminuye la solubilidad del colesterol exógeno y así logra reducir la absorción de éste por el intestino (Moayyedi et al., 2010).
La SBH pertenece a la familia de las coloilglicina hidrolasas (EC 3.5.1.24) (Kim et al., 2004), tiene un pH óptimo entre 5 y 6 (Begley et al., 2006), se localiza en el interior de las bacterias (Corzo and Gilliland, 1999; Lundeen and Savage, 1990) pero también es secretada (Grill et al., 1995; Kishinaka et al., 1994).
• Lactobacillus
- Lactobaclllus acldophllus: al evaluar in vitro la desconjugación simultánea del taurocolato con la asimilación del colesterol en un caldo MRS (acrónimo de Man, Rogosa y Sharpe, que son los creadores de dicho caldo) con tioglicolato de sodio 0.2%. oxgall. 0.3%, taurocolato 0.2%, micelas de colesterol y fosfatidil colina 100mg/ml y L. acidophllus 43121 al 1%, se observó una remoción del 50% de colesterol con una liberación de ácido cólico de 4.30 mmol/ml. Por ello, se concluyó que la cepa L acldophllus 43121 asimila colesterol y expresa actividad de desconjugación y resistencia a las sales biliares (Walker and Gilliland, 1993). Cuando se administró una dosis de 2.5 x 10" UFC a cerdos Yorkshire de 92 Kg se observó una disminución de la concentración de colesterol total de 11.8 % (De Rodas et al., 1996).
Cuando la cepa RP32 de Lactobacillus acldophllus se adicionó al 1% v/v en caldo MRS adicionado con 0.05% p/v de oxgall y colesterol 60 umol/l, se encontró un 49% de precipitación de colesterol total. La remoción de colesterol no se debió a la asimilación del colesterol, sino a la actividad SBH del microorganismo (Klaver and van der Meer, 1993). Asimismo, la cepa DSM 20079 de Lactobacillus acldophllus provocó una remoción de colesterol del 95.6% en un medio que contenía caldo MRS, colesterol 70 μg/ml, oxgall 0.2 % y el Lactobacillus al 1% (Al-Saleh, 2006).
Lactobacillus acldophllus ATCC 4356 administrado a ratas macho Sprague-Dawley (SD) hipercolesterolémicas a una dosis de 109 UFC/día disminuye las concentraciones de colesterol total en un 92.16 %, lípoproteínas de baja densidad en un 35.50% y los triglicérídos en un 34.17% (Huang et al., 2010).
Lactobacillus plantarum: el Lactobacillus plantarum TGCM 15 disminuyó el 81.46% de colesterol a través de la actividad sal biliar hidrolasa, cuando se inoculó a una concentración de 1% P/V en caldo MRS adicionado con oxgall 0.3% P/V y colesterol estándar soluble en agua en una concentración de 100 μg/ml (Sirilun, 2010).
El L plantarum PH4 en un modelo in vivo de ratones ICR tiene actividad de SBH sobre las sales biliares glicoconjugadas y reduce el colesterol total en un 7% y los triglicérídos en un 10% (Nguyen et al., 2007).
Al administrar L plantarum KCT3928 encapsulado, a ratones hipercolesterolémicos, se observó que el colesterol total disminuyó en un 33%, el HDL incrementó en un 35%, el LDL disminuyó un 42% y los triglicérídos bajaron en un 32%. Estos cambios se relacionan con la actividad SBH del microorganismo pues se observó un incremento de bilis en las heces (Jeun et al., 2010).
Al administrar una dosis de 1 x 1011 células de Lactobacillus plantarum MA2 al día por rata alimentadas con una dieta enriauecida con colesterol. se encontró una disminución en las concentraciones séricas de colesterol total, lipoprotefnas de baja densidad y triglicéridos (Wang et al., 2009).
Lactobaclllus plantarum 9-41 -A (con número de GenBank HQ424577) administrado a ratas macho SO hipercoiesterolémicas a una dosis de 2x109 UFC/mL, disminuyó las concentraciones de colesterol total en un 25.3 % y las lipoprotefnas de baja densidad en un 32.9%, no influyeron sobre los niveles de HDL. Las ratas administradas con el microorganismo excretaron una mayor cantidad de ácidos biliares en las heces (Xie et al., 2011).
Lactobaclllus plantarum LP09 y LP45 obtenidos a partir de granos de Kéfir presentaron actividad SBH en pruebas in vitro y disminuyeron las concentraciones de colesterol total, triglicéridos y lipoprotefnas de baja densidad cuando se administró en ratas Sprague-Dawley hipercoiesterolémicas (Huang et al., 2013).
Lactobaclllus plantarum NS5 [GenBank no. JQ013297] aislado de un producto lácteo fermentado de Mongolia en China, fue administrado en dosis de 108 UFC/ml a ratas macho Sprague-Dawley (SD) alimentadas con una dieta alta en colesterol. Se encontró que disminuyen las concentraciones de CT y LDL en un 18.11% y 33.33%, respectivamente (Hu et al., 2013).
- Lactobaclllus rautart: el Lactobaclllus reuteri CRL 1098 administrado a ratones machos hipercolesterolémicos a una concentración de 1x104 células/día reduce el colesterol total por acción de la SBH (Taranto et al., 1999).
El L reuteri NCIMB 30242 SBH activo y micro-encapsulado al ser administrado a una concentración de 5x109 a personas con hipercolesterolemia entre los 18 y 74 años, disminuyó el colesterol total en plasma y la LDL en un 4.81% y 8.92% respectivamente, y produjo un incremento de HDL de 6.01%, mientras que los triglicéridos no se alteraron (Jones et al., 2012).
Lactobaclllus reuteri con actividad SBH sobre las siguientes sales biliares: ácido glicodeoxicólico, ácido taurodeoxicólico, ácido glicoquenodeoxicólico y el ácido tauroquenodesoxicólico, fue administrado en dosis de 11.25 (SD 0.16) logio de células a cerdos hembras y machos alimentados con dieta hipercolesterolémica. Se encontró una disminución de las concentraciones de CT y LDL de un 15 y 24%, respectivamente, no se encontraron cambios en las concentraciones de HDL. Se observó un aumento de la excreción de sales biliares en las heces en el grupo tratado con el microorganismo con lo cual se corroboro la interacción de la SBH y la reducción de las concentraciones de colesterol (De Smet et al., 1998). • Lactobacillus delbrueckii: el Lactobacillus delbrueckli subespecie Bulgaricus disminuye en un 40% el colesterol en caldo MRS adicionado con oxgall 2-3 mg/ml y colesterol 100 μg/ml, mediante un mecanismo independiente a la actividad SBH (Tok and Aslim, 2010).
LactobacHlus delbrueckll subsp. bulgaricus NS12 [GenBank no. JX83976], aislado de los productos lácteos fermentados naturales obtenidos de las praderas de Mongolia en China, fue administrado en dosis de 108 UFC/ml a ratas macho Sprague-Dawley (SD) alimentados con una dieta alta en colesterol. Se encontró que NS12 disminuye las concentraciones de colesterol total en un 12.83 % y las concentraciones de LDL en un 22.44% (Hu et al., 2013).
• LactobacHlus fermentum; el LactobacHlus fermentum M1-16 (con número de GenBank HQ423153 y obtenido de heces de adultos sanos) administrado a ratas macho Sprague- Dawley (SD) hipercolesterolérnicas a una dosis de 2 χ 109UFC/mL disminuyó las concentraciones de CT y de LDL en un 12.5% y 17.3% respectivamente, pero no influyó sobre las concentraciones de HDL (Xie et al., 2011).
LactobacHlus fermentum SM-7 aislado del Kumis fue tolerante a los ácidos y a la bilis, además tiene actividad microbiana contra patógenos como Escherichia co// y Staphylococcus aureus. En pruebas in vitro el microorganismo demostró asimilar et colesterol en un 38.5% en un medio de cultivo. Al administrarlo a ratones ICR hiperlipidémicos demostró disminuir significativamente las concentraciones séricas de CT, TG, LDL (Pan et al., 2011).
- Lactobacillus casel: NCDC-19 (obtenido de la Colección Nacional de Microorganismos del Instituto de Investigación de Lácteos Nacional de Karnal, India), administrado a ratones albinos
Suizos hipercolesterolémicos en dosis de 106 células/mL, incrementó un 11% las concentraciones de HDL y disminuyó un 37% las concentraciones de LDL (Sindhu y Khetarpaul, 2003).
- LactobacHlus gasseri: la administración de L. gasseri SBT 0270 a una concentración de 1x109 UFC/ml a ratas Wistar hipercolesterolérnicas reduce la concentración de LDL. El microorganismo desconjuga al ácido taurocólico y excreta ácidos biliares en heces (Usman and Hosono, 2001).
- LactobacHlus HJI-37: el LactobacHlus HJI-37 tolerante a pH 2.5 - 3.0, 0.3% oxgall P/V y con actividad SBH, disminuyó un 64% la concentración de colesterol en un medio MRS con L- cisteína-HCI HaO 0.05% P/V (Hyeong-Jun et al., 2004). - Mezclas: cepas de LaetobacUlus acldophlllus y Streptococcus faecalls, fueron administrados a ratas macho F344 hipercoiesterolémicas a una dosis de 107-8UFC/mL Las concentraciones de CT fueron más bajas cuando se administró la mezcla de estos dos microorganismos que cuando se administran por separado. L. acldophllus disminuyó el CT un 15.60%, Streptococcus faecalls 7.63% y la mezcla un 22.9%. Tanto la mezcla como la administración de cada una de las cepas mantuvieron las concentraciones de HDL (Fukusima y Nakano, 1996).
La administración a cerdos de una mezcla compuesta por dos cepas de L johnsonll y una de LaetobacUlus reuteri aisladas de heces de cerdo y con actividad SBH sobre taurodeoxicolato y glicodeoxicolato, disminuye la concentración de colesterol total pero incrementa el nivel de triglicéridos en un 20% (du Toit et al., 1998).
Cuando el Bifldobacterium longum SPM 1207 aislado de las heces de coreanos sanos de entre 20 y 30 años, se administró a una concentración de 1x109 UFC/ml a ratas hiperlipidémicas, se produjo una reducción del colesterol total en plasma de 101.3 a 84.4 mg/dl. B. Longum inhibe a enzimas que sintetizan al colesterol, facilita la eliminación de colesterol a través de las heces e interfiere con el reciclaje de la sal biliar (Lee do et al., 2009).
• Otros: del intestino humano se aisló Streptococcus HJS-1 tolerantes a pH 2.5 - 3.0, 0.3% oxgall p/v y con actividad SBH, que disminuyó un 57% la concentración de colesterol en un medio MRS con L-cistefna HCI H2O 0.05% p/v (Hyeong-Jun et al., 2004).
Baclllus polyfermenticus SCD se administró a ratas macho Sprague-Dawley (SD) alimentadas con una dieta alta en grasa y alta en colesterol, a una dosis de 3.1 x106 UFC/d se encontró que el microorganismo reduce significativamente las concentraciones de LDL en un 24 % mientras que el CT disminuyó un 14 % pero no fue de forma significativa (Paik et al., 2005).
El hígado y los probióticos: el hígado juega un papel importante dentro del cuerpo humano puesto que además de filtrar la sangre, realiza funciones metabólicas, digestivas, homeostáticas, inmunológicas y de reservorio metabólico, con un flujo de alrededor de 1500ml de sangre por minuto. Este órgano puede ser afectado por agentes biológicos y químicos procedentes de otras partes del organismo. Las células de Kupffer (macrófagos residentes del hígado) desempeñan un papel inmunológico clave en el proceso de captación y de detoxificación de cualquier agente extraño. Los agentes químicos y biológicos pueden ser acarreados por la sangre a través del sistema portal junto con los nutrientes absorbidos y entregados directamente a las células de Kupffer para su eliminación (Maclas Rodríguez, 2009).
El estado final de las enfermedades crónicas del hígado es la cirrosis hepática. De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud (OMS), la cirrosis hepática ocupó la cuarta causa de muerte general durante el 2011 en nuestro país, y ocupó el lugar 19 a nivel mundial (WHO, 2011).
Se ha encontrado que algunas bacterias probióticas protegen al hígado ante un agente de daño. Los probióticos podrían modular el sistema inmune e inmovilizar ciertos componentes tóxicos (Gratz et al., 2010). Sin embargo, las investigaciones sobre el efecto hepatoprotector de algunas cepas de microorganismos probióticos son escasas. Algunos estudios reportan que la ingesta de B. blfídum y L plantarum por seis semanas en pacientes con daño al hígado tuvieron niveles significativamente más bajos de la enzima alanino amino transferasa (ALT), en comparación con los que no consumieron los probióticos, pero no redujeron la actividad de la enzima gamma glutamil transpeptidasa (γ-GTP) (Kirpich et al., 2008). En otra investigación, L rhamnosus también demostró tener un efecto benéfico en el hígado al reducir los marcadores de estrés oxidativo (Forsyth et al., 2009). Las enzimas transaminasas tuvieron menores niveles en un modelo de daño hepático agudo después de 2 días de tratamiento con L case/ (Haro et al., 2009). Por otro lado, diversas investigaciones han reportado que algunas bacterias probióticas deberían estar contraindicadas en individuos inmunodeprimidos y/o enfermedades crónicas, para evitar el desarrollo de posibles complicaciones. Por ejemplo, algunos lactobacilos, como L. rhamnosus GG, han sido reconocidos por causar endocarditis en adultos y sepsis en niños (Boyle et al., 2006). Es por ello que las bacterias probióticas deben ser siempre sujetas a análisis de riesgo/beneficio antes de ser administradas (Floch, 2013), ya que un buen probiótico además de ejercer un efecto benéfico al hospedero no debe ser patógeno ni tóxico (Wallace et al., 2011).
Para concluir, es importante mencionar que en la literatura existe un meta-análisis sobre el efecto de algunas bacterias probióticas sobre daño al hígado en el que se reúnen diversas investigaciones que señalan el efecto protector de los probióticos sobre diferentes determinaciones, como son actividad enzimática y estrés oxidativo (Riordan and Williams, 2006). Falta información respecto al uso de microorganismos probióticos que podrían exacerbar el daño. • Determinaciones de daño hepático
• Enzimas hepáticas: el daño puede ser cuantificado por el estado que guardan las células hepáticas. Por consiguiente, medir la expresión de las enzimas de los hepatocitos en suero ha demostrado ser un método pertinente para evaluar la muerte celular. El daño hepático se puede reflejar en la pérdida de la integridad de los componentes de los hepatocitos, como son la membrana o el citoplasma, lugar en donde se encuentran las enzimas alanino amino transferasa (ALT), gamma glutamil transpeptidasa (v-GTP) y fosfatase alcalina (FA) (Ruiz Grinspan, 2004).
- Estrés oxidativo: el estrés oxidativo es definido como un estado de oxidación de moléculas vitales en donde su estructura y función biológica es modificada, que con el paso del tiempo conducen al deterioro de distintos órganos y sistemas de los seres vivos por el desequilibrio entre los sistemas oxidante y antioxidante (Halliwell, 2009). El daño por radicales libres a los lípidos (peroxidación lipídica) se ve reflejada en las estructuras ricas en ácidos grasos poliinsaturados, como lo son las membranas celulares, en donde éstas moléculas alteran la permeabilidad, lo cual induce al edema y posteriormente tisis celular (Slater, 1984; Muriel, 1997, 2009). Una forma de cuantificar la peroxidación de Kpidos es cuantificando el malondialdehido (Buege and Aust, 1978).
• Criterios para la selección de nuevas cepas probióticas
El primer paso en la selección de un probiótico es que no debe ser patógeno, determinar su clasificación taxonómica, estudiar su tolerancia a las condiciones del TGI generadas por la presencia de jugos gástricos y bilis, y comprobar sus efectos benéficos en la salud (Mourad and Nour-Eddine, 2006).
El ambiente ácido que se encuentra en los alimentos utilizados como vehículos para la ingesta de probióticos y la acidez de los jugos gástricos, alrededor de 1.5 de pH, encontrados en el TGI, representan un reto importante para la supervivencia de las bacterias. La tolerancia a la acidez es una propiedad deseable a la hora de seleccionar microorganismos con características probióticas. Los microorganismos Gram positivos sobreviven mediante una combinación de estrategias inducibles y constitutivas que incluyen la remoción de protones (H*), alcalinización del ambiente externo, cambios en la composición de la membrana de la célula, producción de proteínas y expresión de reguladores transcripcionales (Cotter and Hill, 2003).
Otro de los criterios importantes en la selección de bacterias con potencial probiótico es la resistencia a las sales biliares, cuva concentración en el intestino oscila entre 0.15 v 0.30%. Las sales biliares son detergentes biológicos que desorganizan la estructura de la bicapa lipídica, cruzan la membrana bacteriana, acidifican el citoplasma bacteriano, inhiben el transporte de nutrientes y por consiguiente inducen la lisis celular (Begley et al., 2005).
La actividad de SBH de las bacterias evita que los microorganismos se intoxiquen por las sales biliares del TGI, y por lo tanto favorece su sobrevivencia y persistencia en el intestino (Begley et al., 2006). La SBH también juega un papel muy importante en la nutrición, ya que los aminoácidos liberados por la desconjugación de las sales biliares son utilizados por los microorganismos como fuente de carbono, nitrógeno y energía. La glicina se metaboliza a amonio y CO2, y la taurina se metaboliza a amonio, CO2 y sulfato (Begley et al., 2005). Las poblaciones microbianas incrementan su tamaño como resultado de las reacciones de desconjugación mediadas por SBH. Así, se observó que algunas cepas de Clostridlum spp y algunos Lactobacillus crecen a mayor velocidad en medios que contienen taurina, ya que utilizan al sulfato o la porción de sulfato de esta molécula como aceptor de electrones (Lundeen and Savage, 1990; Van EkJere et al., 1996). Entre los microorganismos con actividad de SBH se encuentran: Ljohnsonii PF01 (Chae et ai., 2013), L plantarum BBE7 (Dong et al., 2012), L plantarum ST-lll (Ren et al., 2011 ), L plantarum WCFS1 (Lambed et al., 2008), L acidophllus BFE 6128 (Vizoso Pinto et al., 2006), L fermentum KC5b y Streptococcus bovis (Pereira et al., 2003) .
En el estado de la técnica se encuentra una gran diversidad de documentos relacionados con ta materia de la presente invención, tal es el caso de la Solicitud de Patente Norteamericanas Serie No. US2010203025 (A1) que describe una bacteria ácido láctica aislada de la leche materna humana, más precisamente una cepa de Lactobacillus gassert BNR17 que está aislada de la leche de una madre de Corea, y tiene una excelente actividad probiótica incluyendo resistencia a los ácidos, resistencia a los ácidos biliares y la actividad antimicrobiana y el efecto inhibitorio de la ganancia de peso, así como también, el Lactobacillus gassert BNR17 tiene excelente actividad de absorción entérica y actividad antimicrobiana contra microorganismos patógenos, mediante la síntesis de los polisacáridos no digeribles de monosacáridos incluidos en la comida que se lleva a cabo liberando los polisacáridos sintetizados fuera del cuerpo. Por lo tanto, la cepa de la invención, debido a dichos efectos benéficos, se puede utilizar de manera efectiva no sólo para la producción de leche fermentada, otros productos alimenticios fermentados y alimentos para animales, sino también para la producción de productos de células en vivo y aditivos de alimentos para la prevención de ganancia de peso.
La Solicitud de Patente Mexicana No. MX/a/2010/007488 se relaciona con ta rama de la alimentación animal, con la obtención de aditivos a partir de plantas, específicamente la obtención de un producto con altos niveles de fructanos y su aplicación como prebiótico al lograr un mejor crecimiento de bacterias beneficiosas del TGI (bacterias probióticas), lo cual repercute en un mejor estado de salud en el hospedero. El objetivo de dicha invención es proponer un procedimiento que permita obtener un producto prebiótico a partir del Agave fourcroydes para ser empleado como aditivo, con altos niveles de fructanos en mezcla polidispersa, en la alimentación animal. Sin embargo, dicha patente no se relaciona con la presente invención ya que un prebiótico, al contrario que los probióticos, son por regla general carbohidratos no digestibles que estimulan el crecimiento de bacterias benéficas que se encuentran en el TGI.
La Solicitud de Patente Mexicana No. MX/a/2012/007970 (correspondiente con la Fase Nacional de la Solicitud Internacional de Patente No. PCT/IT2011/000003) describe un proceso para la preparación de una biomasa que comprende una o más plantaricinas A, N o K en asociación con las bacterias ácido lácticas utilizadas para la preparación y usos de la misma para estimular la función de barrera de las células intestinales o queratinocitos epidérmicos humanos. La solicitud no menciona las cepas utilizadas, así como tampoco menciona su efecto en presencia de algún microorganismo patógeno, su efecto en las enzimas hepáticas, ni declara efectos hipolipemiantes. Además, el efecto atribuido en la función de la barrera es por la combinación de las bacterias ácido lácticas con la plantaricina.
La Patente Norteamericana Serie No. US5516684 describe bacterias ácido lácticas del género Lactobacillus que no presentan desconjugación de ácidos biliares y la inhibición de la absorción de nutrientes, y exhibición de disminución del colesterol en sangre y el hígado. Existen dos cepas de Lactobacillus específicas que se han descrito que exhiben estas propiedades características. Las dos cepas son Lactobacillus acldophllus FERM-P-14204 y Lactobacillus acidophilus FERM-P-14205.
Asimismo, en el estado de la técnica se encuentra el documento "Con apoyo biotecnológico, renace bebida milenaria'', en el cual se menciona haber identificado cepas probióticas con propiedades antidiarreicas al inhibir el crecimiento de Salmonella. Sin embargo, no precisa las cepas a las cuales se refiere y a que características probióticas. Tampoco menciona si tienen efecto hipolipemiante. Dr. Sergio Trejo Estrada, 26 de septiembre del 2006.
Otro documento es el titulado "Estudian propiedades del pulque contra enfermedades". 8 de febrero del 2011. Dra. Yadira Rivera Espinoza. Dicho documento menciona que estudiaron pulque de Tizayuca, Hidalgo. De igual manera, menciona que existen bacterias que sobreviven a condiciones de estrés del TGI que inhiben el crecimiento de Eschelichia coli, Salmonela typhimuríum y Citrobacterfreundi. Sin embargo, no menciona qué bacterias son, así como tampoco mencionan resultados de la inocuidad y el nombre de las cepas aisladas del pulque, ni efectos hipolipemiantes.
Como puede verse de lo anteriormente descrito, existen documentos que describen características probióticas de diferentes especies de Lactobacillus, pero en ninguno de ellos se ha reportado el aislamiento de Lactobacillus brevis a partir del aguamiel proveniente del Agave.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
A través del método de aislamiento y selección de la presente invención, se lograron aislar y seleccionar del aguamiel, en una primera fase, las cepas Lactobacillus brevis Lb2H, LB3H y Lb13H; y, en una segunda fase, simulando las condiciones del tracto-gastrointestinal, se lograron aislar y seleccionar del aguamiel las cepas Lactobacillus brevis Lb5H y LB9H. Dichas cinco cepas Lactobacillus brevis Lb2H, Lb3H, LbSH, Lb9H y Lb13H cumplen con los objetivos de la presente invención.
Adicionalmente, en una modalidad alterna de la presente invención se provee y describe una mezcla formada por las cepas Lactobacillus brevis Lb2H, LB3H, Lb13H y LB5H, también denominada como Lactobacillus brevis mlx, la cual previene el daño en el hígado al disminuir la actividad de las enzimas séricas ALT, γ-GTP y FA. Además, dicha mezcla de cepas de Lactobacillus brevis no produce darlo al hígado, ni exacerba el daño causado por agentes tóxicos. Para que la mezcla de cepas Lactobacillus brevis mlx sea funcional, cada una de las cepas Lb2H, Lb3H, Lb5H y Lb13H debe estar presente en dicha mezcla en una concentración que va desde 1Χ108 hasta 1x1010 UFC/ml, preferiblemente 1x108 UFC/ml.
Por otro lado, la cepa Lactobacillus brevis Lb9H por sí sola permite disminuir el índice aterogénico. Para que la cepa Lactobacillus brevis Lb9H sea funcional se debe utilizar en una concentración aue va desde 1x108 hasta 1x1010 UFC/ml. oreferiblemente 1x108 UFC/ml. Por lo anteriormente expuesto, las cepas de Lactobaclllus brevis Lb2H, Lb3H, Lb5H, Lb9H y Lb13H, fueron depositadas ante la ATCC (acrónimo de American Type Culture Collection) como Autoridad Internacional de Depósito del Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional de Depósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimientos de Patentes con los siguientes números de registro:
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Una vez que el aguamiel ha sido recolectado, se da inicio a lo que es propiamente el método de aislamiento y selección de cepas Lactobaclllus brevis, así como la obtención de la mezcla de cepas Lactobaclllus brevis mix, en donde dicho método comprende las fases de:
I. Aislamiento y selección de cepas Lactobaclllus brevis Lb2H (PTA - 120749), Lb3H (PTA -
120750) y Lb13H (PTA - 120752);
II. Aislamiento y selección de cepas Lactobaclllus brevis Lb5H (PTA - 120748) y Lb9H (PTA -
120751) ;
III. Conservación de las cepas Lactobaclllus brevis Lb2H (PTA - 120749), Lb3H (PTA - 120750), LbSH (PTA - 120748), Lb9H (PTA - 120751) y LM3H (PTA - 120752);
IV. Evaluación cualitativa de actividad sal biliar hidrolasa de los cultivos por tamaño del hato de hidrólisis, para obtener la mezcla formada por las cepas Lactobaclllus brevis Lb2H (PTA - 120749), Lb3H (PTA - 120750), Lb5H (PTA - 120748) y Lb13H (PTA - 120752); y,
V. Evaluación cuantitativa de la actividad sal biliar hidrolasa en los cultivos por medio de la liberación de glicina/taurina durante la actividad de dicha enzima para la selección de la cepa Lactobaclllus brevis Lb9H (PTA - 120751). OBJETOS DE LA INVENCIÓN
Teniendo en cuenta los defectos de la técnica anterior, es un objeto de la presente invención aislar, identificar y caracterizar nuevos Lactobacillus bnvls aislados del aguamiel, los cuales tiene propiedades probióticas aportando beneficios a la salud de los individuos.
Es otro objeto más de la presente invención proveer cepas de Lactobacillus brevls aisladas del aguamiel que tengan actividad sal biliar hidrolasa (SBH).
Un objeto adicional de la presente invención es proveer una mezcla de cepas de Lactobacillus bnvls aisladas del aguamiel que permitan prevenir el daño en el hígado disminuyendo la actividad de las enzimas séricas alanino amino transferasa (ALT), Gamma glutamíl transpeptidasa (γ-GTP) y fosfatasa alcalina (FA) con respecto al daño inducido por LPS y D- Galactosamina.
Un objeto adicional de la presente invención es proveer una cepa de Lactobacillus bnvls aislada del aguamiel que permita disminuir la concentración de colesterol, así como el incremento en las concentraciones de las lipoprotefnas de baja densidad (LOL), además de disminuir el Indice aterogénico al incrementar las relaciones colesterol HDL/colesterol total y colesterol HDL/colesterol LDL en un 45% y 68%, respectivamente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Los aspectos novedosos que se consideran característicos de la presente invención, se establecerán con particularidad en las reivindicaciones anexas. Sin embargo, la invención misma, tanto por su organización, asi como por su método de operación, conjuntamente con otros objetos y ventajas de la misma, se comprenderán mejor en la siguiente descripción detallada de una modalidad particularmente preferida de la presente invención, cuando se lea en relación con los dibujos que se acompañan, en los cuales:
La figura 1 muestra un diagrama de flujo del método de aislamiento de las cepas 5 y 9. Se obtiene el paquete celular del aguamiel y de las diferentes condiciones de estrés del TGI, mediante centrifugación a 8000 rpm. Las condiciones de estrés del TGI utilizadas son: a) cavidad oral. Incubar en 20 mi de una solución electrolítica con 60mM de solución salina amortiguadora de fosfatos (PBS) a un pH de 6.2, esterilizar y posteriormente adicionar lisozima al 0.01% p/v durante 5 minutos a 37°C: b) iuaos aéstrícos. Incubar en 20 mi de una solución de NaCI al 0.5%. DH = 2.0. DeDsina 3a/l durante 90 minutos a 37*C; (c) jugos duodenales. Incubar en 20 ml de una solución de PBS a un pH de 6.8, oxgall 0.5% y pancreatina 1g/l durante 150 minutos a 37°C. Cada etapa del experimento se mantiene en agitación constante a 180 rpm para reproducir los movimientos peristálticos.
La figura 2. Placas con agar MRS adicionado con 0.5% de sales biliares: (a) Panel superior izquierdo se observan las colonias en presencia de glicocolato de sodio; (b) panel superior derecho se observan las colonias en presencia de glicodexicoiato de sodio; (c) panel inferior izquierdo se observan las colonias en presencia de taurocolato de sodio; y, (d) panel inferior derecho se observan las colonias en presencia de taurodeoxicolato de sodio. Se observan halos de precipitado alrededor de la colonia, indicando actividad SBH de manera cualitativa en los cuatro tipos de sales biliares. En el cuadro 2 se observa que el diámetro obtenido para cada colonia del aguamiel en presencia de las diferentes sales biliares es distinta. El mayor tamaño para glicocolato, glicodeoxicolato, taurocolato y taurodeoxicolato lo mostraron las cepas 2H, 3H, 5H y 13H, respectivamente. El control positivo L acidophilus mostró un halo mayor en GDC; por su parte, el control negativo, el patógeno E. col!, no mostró halo.
La figura 3. Identificación del precipitado de las colonias que provienen de las placas con agar MRS-sales biliares: a) Panel superior izquierdo-glicocolato de sodio (GC); b) panel superior derecho-glicodeoxicolato de sodio (GDC); c) panel inferior izquierdo-taurocolato de sodio (TC); y, d) panel inferior derecho-taurodeoxicolato (TDC). C significa colato sodio y DC es deoxicolato de sodio, ambos son productos de la desconjugación de sales primarias y secundarias, respectivamente.
La figura 4. Actividad especifica SBH de los aislados sobre diferentes sales biliares: glicocolato (GC), glicodeoxicolato (GDC), taurocolato (TC) y taurodeoxicolato de sodio (TDC) por el método cuantitativo de ninhidrina. LcS- control Lactobacillus case/. La cepa Lb9H aislada del aguamiel resistente a las condiciones simuladas del TGI, presentó actividad enzimática específica preferentemente sobre glicocolato de sodio y glicodeoxicolato de sodio. Dicha cepa Lb9H derivada del aguamiel, que además fue la que sobrevivió a las condiciones simuladas del TGI, presentó una actividad enzimática específica 1307 U/mg proteína cuando se utilizó glicocolato como sustrato y de 564.6 U/mg proteína para glicodeoxicolato. El L. casel usado como control no mostró actividad específica SBH cuando se utilizaron sales unidas a glicina y sí lo hizo cuando se utilizaron sales unidas a taurina. La figura 5. Actividad sérica de la enzima gamma glutamil transpeptidasa (γ-GTP) en el tratamiento preventivo con la mezcla de lactobacilos (Lb2H, Lb3H, Lb5H, Lb13H) ante el modelo de daño con LPS + D-GalN. a, diferencia significativa con respecto al grupo control, p < 0.05. b, diferencia significativa con respecto ai daño, p < 0.05. n=6. El tratamiento con la mezcla formada por las cepas Lactobacttlus bravia Lb2H, Lb3H, Lb5H y Lb13H (denominado L. brevis mix en la figura 9 y 10) aisladas del aguamiel son inocuas, ya que el grupo administrado con la mezcla de Lactobacttlus bravia mix Lb2H, Lb3H, Lb5H y Lb13H no mostró diferencia significativa (p<0.05) con el grupo control (agua) al evaluar la actividad de la enzima γ-GTP. Al inducir el daño con LPS más D-GalN, se encontró la elevación de la enzima γ-GTP. Al administrar la mezcla de cepas L brevis Lb2H, Lb3H, Lb5H y Lb13H previamente al daño, la actividad de dicha enzima se mantuvo en los niveles normales. ANOVA de una vfa con prueba de Tukey con una p<0.05.
La figura 6. Actividad sérica de la enzima fosfatase alcalina (FA) en el tratamiento preventivo con la mezcla de lactobacilos (Lb2H, Lb3H, Lb5H, Lb13H) ante el modelo de daño con LPS + D- GalN. a, diferencia significativa con respecto al grupo control, p < 0.05. b, diferencia significativa con respecto al daño, p < 0.05. n=6. El tratamiento con la mezcla formada por las cepas Lactobacttlus bravia Lb2H, Lb3H, Lb5H y Lb13H aisladas del aguamiel son inocuas, ya que el grupo con agua y el administrado con la mezcla de L bravls mix no mostraron diferencia significativa entre sí en la actividad de la enzima fosfatase alcalina. Al inducir el daño con LPS más D-GalN, se encontró la elevación de la actividad de la fosfatase alcalina. Al administrar L bravia mix, previamente al daño la actividad de dicha enzima se mantuvo en los niveles normales. ANOVA de una vfa con prueba de Tukey con una p<0.05.
La figura 7. Efecto de la cepa Lactobacttlus bravls Lb9H sobre las concentraciones de colesterol total sérico. N=Grupo normal, H=hipercolesterolémico, Lb9H-H= Grupo hipercolesterolémico + Lactobacttlus bravls Lb9H. Las concentraciones básales de colesterol total se encontraron en 27 mmol/L. La dieta especial elevó las concentraciones de colesterol total 50 mmol/L. Con la administración preventiva de Lactobacttlus bravls Lb9H al grupo de ratas alimentadas con la dieta hipercolesterolémíca solamente se elevó a 31.83 mmol/L. El limite de variación representa el error estándar, calculado para una n=6. Las barras que no comparten las mismas letras son significativamente diferentes a un nivel de significancia de 0.05 (p<0.05). La figura 8. Efecto de la cepa Lactobaclllus brevls Lb9H sobre la concentración de lipoproteínas de baja densidad (LDL). N=Grupo normal, H=hipercolesterolémico1 Lb9H-H= Grupo hipercolesterolémico + Lactobaclllus brevls Lb9H. El colesterol LDL con la dieta especial se elevó 39.68 mmol/L, y con el tratamiento solamente se elevó a 22.25 mmol/L. El límite de variación representa el error estándar, calculado para una n=6. Las barras que no comparten las mismas letras son significativamente diferentes a un nivel de significancia de 0.05 (p<0.05).
La figura 9. Efecto de la cepa Lactobaclllus brevls Lb9H sobre las concentraciones séricas de triglicéridos. En la figura se puede observar que el tratamiento con la cepa Lactobaclllus brevls Lb9H evitó el incremento de los triglicéridos. N=Grupo normal, H=hipercolesterolémico, Lb9H-H- Grupo hipercolesterolémico + Lactobaclllus brevls Lb9H. El límite de variación representa el error estándar, calculado para una n=6. Las barras que no comparten las mismas letras son significativamente diferentes a un nivel de significancia de 0.05 (p<0.05).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES DE LA INVENCIÓN
La búsqueda de nuevas cepas con potencial probiótico es constante, ya que no se puede asumir que todas las bacterias lácticas posean propiedades probióticas. De igual manera, cuando se adscribe un efecto probiótico a una cepa tampoco se puede extrapolar esa propiedad a las restantes cepas de la misma especie.
No existen a la fecha, estudios publicados de las características probióticas de los microorganismos que se encuentran presentes en el aguamiel o el producto que se obtiene a través de la fermentación (pulque). En razón de lo anterior, la presente invención pretende identificar aquellos microorganismos que pudiesen presentar propiedades probióticas.
Por lo tanto, en la presente invención, se describen diferentes cepas de Lactobaclllus brevls que han sido aisladas del aguamiel proveniente del Agave salmiana, las cuales presentan propiedades probióticas.
A través del método de aislamiento que se describe más adelante en una modalidad particularmente preferida de la presente invención, se lograron aislar del aguamiel, en una primera fase, las cepas Lactobaclllus brevls Lb2H, LB3H y Lb13H; y, en una segunda fase, simulando las condiciones del tracto-gastrointestinal, se lograron aislar del aguamiel las cepas Lactobaclllus brevis LbSHyLBBH. Dichas cinco cepas Lactobaclllus brevis Lb2H, Lb3H, Lb5H, Lb9HyLb13H cumplen con los objetivos de la presente invención.
Adicíonalmente, en una modalidad alterna de la presente invención se provee y describe una mezcla formada por las cepas Lactobaclllus brevls Lb2H, LB3H, Lb13H y LBSH, también denominada como Lactobaclllus brevls mlx, la cual previene el daño en el hígado al disminuir la actividad de las enzimas séricas alanino amino transferasa (ALT), Gamma glutamil transpeptidasa (γ-GTP) y fosfatasa alcalina (FA). Además, dicha mezcla de cepas de Lactobaclllus brevls no exacerba el daño causado por agentes tóxicos. Para que la mezcla de cepas Lactobaclllus brevls mlx sea funcional, cada una de las cepas Lb2H, Lb3H, Lb5HyLb13Hestá presente en dicha mezcla en una concentración que va desde 1x1o8 hasta 1x1010 UFC/ml, preferiblemente 1x108 UFC/ml.
Por otro lado, la cepa Lactobaclllus brevls Lb9H por sí sola permite disminuir el índice aterogénico. Para que la cepa Lactobaclllus brevls Lb9H sea funcional se debe utilizar en una concentración que va desde 1x10* hasta 1x1010 UFC/ml, preferiblemente 1x10* UFC/ml.
Por to anteriormente expuesto, las cepas de Lactobaclllus brevls Lb2H, Lb3H, LbSH, Lb9H y Lb13H, fueron depositadas ante la ATCC (acrónimo de American Type Culture Collection) como Autoridad Internacional de Depósito del Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional de Depósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimientos de Patentes con los siguientes números de registro:
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Como se ha mencionado, en la presente invención se describen cepas de Lactobaclllus brevls a partir del agua miel, por lo que para su aislamiento, primeramente se recolectó dicho aguamiel. Las muestras de aguamiel se obtuvieron del Agrave salmiana que se cultiva en el municipio de Huitzilac en el Estado de Morelos (19°02'N, 99°1 (WW). Los sólidos solubles en °Brix de la muestra de aguamiel fueron de 11.5 ± 0.3 y el pH de 4.2 ± 0.2. La muestra se colocó en tubos estériles y se transportó al laboratorio en condiciones de refrigeración (4°C).
Una vez hecho lo anterior, se da inicio a lo que es propiamente el método de aislamiento y selección de cepas Lactobaclllus brevis, así como la obtención de la mezcla de cepas Lactobaclllus brevis mix, en donde dicho método comprende las fases de:
I. Aislamiento y selección de cepas Lactobaclllus brevis LbH2 (ATCC No. PTA-120749), LbH3 (ATCC No. PTA-120750) y LbH13 (PTA-120752);
II, Aislamiento y selección de cepas Lactobaclllus brevis LbHS (ATCC No. PTA-120748) y LbH9 (ATCC No. PTA-120751);
III. Conservación de las cepas Lactobaclllus brevis LbZH (PTA - 120749), Lb3H (PTA -
120750), LbSH (PTA - 120748), Lb9H (PTA - 120751 ) y Lb13H (PTA - 120752);
IV. Evaluación cualitativa de actividad sal biliar hidrolasa de los cultivos por tamaño del halo de hidrólisis, para obtener la mezcla formada por las cepas Lactobaclllus brevis Lb2H, Lb3H, Lb5Hy Lb13H), y,
V. Evaluación cuantitativa de la actividad sal biliar hidrolasa en los cultivos por medio de la liberación de glicina/taurina durante la actividad de dicha enzima para la selección de la cepa Lactobaclllus brevis Lb9H.
A CONTINUACIÓN SE DESCRIBE EL PROCESO DE AISLAMIENTO Y SELECCIÓN BASANDONOS EN DATOS EJEMPLIFICATEOS Y/O DESMOTRATIVOS, MAS NO LIMITATIVOS DEL ALCANCE DE PROTECCIÓN DE LA INVENCIÓN.
La fase I de aislamiento y selección de las Lactobaclllus brevis Lb2H, Lb3H y Lb13H comprende las etapas de:
(a) Centrifugar 50ml de aguamiel a una velocidad de entre 8,000 y 10,000 rpm por espacio de 15 minutos y resuspender la pastilla en 10 mi de caldo MRS;
(b) Inocular 10μΙ en cajas preparadas con agar MRS adicionado con 0.5% de glicocoiato de sodio y 0.37 g/L de CaCI2, e incubar dichas cajas a 37°C durante 72 horas;
(c) Seleccionar las colonias que son capaces de crecer y formar halos de hidrólisis que presentan forma de bacilos, Gram-positivos, catalasa-negativos y con ausencia de actividad hemolitica para asegurar que no serán capaces de lisar glóbulos rojos, de tal manera que en esta etapa se seleccionan las cepas Lactobaclllus brevls Lb2H (PTA - 120749), Lb3H (PTA - 120750) y (PTA - 120752); y,
(d) Tomar cada una de las colonias seleccionadas y sembrar en una caja nueva con agar MRS para asegurar la pureza de los cultivos.
La fase II de aislamiento y selección de las cepas Lactobacillus brevis Lb5H y Lb9H comprende las etapas de:
(a) Ajustar la concentración de microorganismos totales a 1x107 UFC/ml con caldo MRS;
(b) Centrifugar 1ml de la suspensión y utilizar el paquete celular para llevar a cabo una simulación gastrointestinal de acuerdo con el método desarrollado por Vizozo Pinto, et al, 2006, con algunas modificaciones (Annan, 2008; Botes et al., 2008; Kimoto-Nira et al., 2010; Mainville et al., 2005);
(c) Incubar el paquete celular en 20ml de una solución electrolítica con 60mM de solución salina amortiguadora de fosfatos (PBS) a un pH de 6.2, esterilizar y posteriormente adicionar lisozima al 0.01% p/v; en donde dicha incubación se lleva a cabo por espacio de 5 minutos a una temperatura de 37°C simulando las condiciones de la cavidad oral, manteniendo una agitación constante a 180 rpm para reproducir los movimientos de la boca;
(d) Centrifugar el paquete celular a una velocidad de entre 8,000 y 10,000 rpm durante 10 minutos a una temperatura de 4°C para recuperar las células viables;
(e) Incubar el paquete celular obtenido en la etapa (d) anterior en 20ml de una solución al 0.5% de NaCI y pH de 2.0 con 3g/L de pepsina, en donde dicha incubación se lleva a cabo durante 90 minutos a una temperatura de 37°C simulando las condiciones del jugo gástrico artificial, manteniendo una agitación constante a 180 rpm para reproducir los movimientos peristálticos;
(f) Centrifugar el paquete celular a una velocidad de entre 8,000 y 10,000 rpm durante 10 minutos a una temperatura de 4°C para recuperar las células viables;
(g) Incubar el paquete celular obtenido en la etapa (f) en 20ml de una solución de PBS a un pH de 6.8, adicionado con 0.5% de oxgall y 1g/l de pancreatina, en donde dicha incubación se lleva a cabo durante un tiempo de 150 minutos a una temperatura de 37°C simulando las condiciones de la secreción duodenal, manteniendo una agitación constante a 180 rpm para reproducir los movimientos peristálticos; (h) Inocular 10μΙ el paquete celular obtenido en la etapa (g) en cajas preparadas con agar MRS adicionado con 0.5% de glicocolato de sodio y 0.37 g/l de CaCl2, e incubar dichas cajas a 37°C durante 72 horas;
(i) Seleccionar los microorganismos que son capaces de crecer y formar halos de hidrólisis que presentan forma de bacilos, Gram-positívos, catalasa-negativos y con ausencia de actividad hemolitica para asegurar que no serán capaces de lisar glóbulos rojos, de tal manera que en esta etapa se seleccionan las cepas Lactobaclllus brevls Lb5H (PTA - 120748) y Lb9H (PTA - 120751); y.
(j) Tomar cada una de las colonias seleccionadas y sembrar en una caja nueva con agar MRS para asegurar la pureza de los cultivos.
La fase III de conservación de las cepas Lactobaclllus brevls Lb2H (PTA - 120749), Lb3H (PTA- 120750), LbSH (PTA- 120748), Lb9H(PTA- 120751) y Lb13H (PTA - 120752) comprende las etapas de:
(a) Sembrar las colonias puras seleccionadas por estriado masivo e incubar a 37°C de 24 a 48 horas;
(b) Recolectar la biomasa mediante un lavado con 2ml de caldo MRS estéril e incubar en 8ml de caldo MRS a 37°C durante toda la noche;
(c) Realizar pases de cultivo en caldo MRS hasta llegar a una concentración de 1x109 UFC/ml;
(d) Centrifugar a 29,286.01 χ g durante 15 minutos a 4°C en condiciones de esterilidad; y, (e) Adicionar 10ml de caldo MRS y 20% de glicerol al paquete celular y distribuir la muestra en microtubos Eppendorf de 0.5ml para conservar a -80°C.
La fase IV de evaluación cualitativa de actividad SBH de los cultivos por tamaño del halo de hidrólisis para obtener la mezcla de cepas Lactobaclllus brevls mlx formada por las cepas Lb2H, Lb3H, Lb5H y Lb13H,.en donde dicha fase IV comprende las etapas de:
(a) Activar las colonias en caldo MRS a 37°C durante toda la noche;
(b) Centrifugar durante 10 minutos a 10,000 rpm a 4°C para eliminar el glicerol y estandarizar la concentración celular de cada uno de los cultivos mediante espectrofotometría a 660nm a una absorbencia de 1.0;
(c) Sembrar en cajas con agar MRS-0.5% de diferentes sales biliares que se seleccionan del grupo que comprende: glicocolato de sodio, glicodeoxicolato de sodio, taurocolato de sodio y taurodeoxicolato de sodio más 0.37g/l de CaCI2; dividir las cajas con agar MRS-sales biliares en 4 partes y colocar discos de papel filtro de 1cm de diámetro (4 por cada caja), y colocar 20μΙ de cada uno de los cultivos de interés sobre el papel filtro;
(d) Incubar por 72 horas a 37°C en condiciones de anaerobiosis (Forma Scientific anaerobio chamber) de acuerdo con el método de Dashkevicz and Feighner (1989) con algunas modificaciones;
(e) Cortar las fracciones de agar alrededor de las colonias que contienen el halo más grande de precipitado con una navaja estéril, colocarlas en 5ml de agua y calentar a 90°C. Enfriar a temperatura ambiente por 10 minutos;
(f) Ajustar el pH a 1 con HCI concentrado, mezclar con acetato de etilo en una relación 3:1 y dejar reposar por 20 minutos para permitir la separación de las fases. Tomar 3μΙ de la fase orgánica y colocar en placas de sílica gel (8 cm x 13 cm, Merck, Darmstadt, Germany) para poder observar los productos de desconjugación de sales biliares (ácido cólico y deoxicólico preparados al 0.5% en acetato de etilo, pH de 1). Utilizar como fase móvil acetato isoamllico:ácido propiónico:n-propanol:agua en proporciones de 40:30:20:10 (%), respectivamente;
(g) Seleccionar 4 cepas con el mayor halo de hidrólisis alrededor de los discos de papel filtro, en donde las cepas seleccionadas son Lb2H, Lb3H, Lb5HyLb13H. Una por cada una de las sales biliares utilizadas (glicocolato con Lb3H; glicodeoxicolato con Lb2H; taurocolato con Lb5H; taurodeoxicolato con Lb13H).
La fase V de evaluación cuantitativa de la actividad sal biliar hidrolasa en los cultivos por medio de la liberación de glicina/taurina durante la actividad de dicha enzima para la selección de la cepa Lb9H, en donde dicha fase V comprende las etapas de:
(a) Activar las cepas de Lactobaclllus brevls o la cepa control (Lactobaclllus case/ Shirota ) en caldo MRS a 37°C durante toda la noche;
(b) Centrifugar durante 10 minutos a 10,000 rpm a 4°C para eliminar el glicerol;
(c) Resuspender la pastilla de cada cultivo en 5ml de solución reguladora de sodio 0.1 M a pH de
7.0. y centrifugar durante 10 minutos a 10000 rpm y a una temperatura de 4°C. Repetir esta etapa por lo menos una vez más; (d) Resuspender la pastilla de cada cultivo en la misma solución reguladora y ajusfar la concentración celular de cada uno de los cultivos a una absorbancia de 3.0 mediante espectrofotometría a 660nm;
(e) Tomar una alícuota de 1ml de cada cultivo y centrifugar 5 minutos a 13,000 rpm y a una temperatura de 4°C:
(f) Inocular la pastilla obtenida de cada cultivo en 5ml de una solución 0.5% de sales biliares
(glicocolato, taurocolato, glicodeoxicolato o taurodeoxicolato de sodio), pH de 6.0 e incubar a una temperatura de 37°C por un tiempo de18 horas, manteniendo una agitación constante;
(g) Centrifugar durante 5 minutos a 13,000 rpm y a una temperatura de 4°C para eliminar las células de cada cepa y obtener un sobrenadante (extracto crudo enzimático);
(h) Tomar una alícuota de 50μΙ del sobrenadante (extracto crudo enzimático) obtenido en la etapa
(g) anterior y mezclarla con 50μΙ de solución reguladora de fosfato de sodio 0.1 M, pH de 6.0 y 100μΙ de una solución de cada sal biliar al 0.5% p/v (sustrato). Adicionar 10μΙ de ditiotreitol (DTT) 10mM para disminuir la oxidación de la enzima. Incubar a una temperatura de 37°C, durante 30 minutos. Añadir 100μΙ de ácido tricloroacético al 15% para detener la reacción;
(i) Preparar de manera simultánea el testigo, el cual consiste en mezclar 100μΙ de ácido tricloroacético más 100μΙ de una solución de cada una de las sales biliares (glicocolato, taurocolato, glicodeoxicolato o taurodeoxicolato de sodio) al 0.5% p/v (sustrato) e incubar a 37°C durante 30 min. Después de la incubación agregar 50 μΙ del sobrenadante (extracto crudo enzimático) más 50μΙ de solución reguladora de fosfato de sodio 0.1 M, pH de 6.0;
(j) Centrifugar las mezclas de reacción durante 5 minutos a 13,000 rpm para separar el precipitado
(sustrato no transformado) del sobrenadante (sustrato transformado);
(k) Tomar una alícuota de 50μΙ de sobrenadante de cada muestra y mezclar con 50μΙ de agua destilada para obtener un volumen de 100μΙ. Adicionar 1.9ml de reactivo de ninhidrina (0.5ml de 1 % p/v de ninhidrina en solución reguladora de citratos 0.5M y pH de 5.5, 1.2ml de glicerol y 0.2ml de solución reguladora de citratos 0.5M y pH de 5.5) a cada una de las muestras de 100μΙ. Homogeneizar en vórtex, hervir durante 14 minutos y dejar enfriar durante 3 minutos en un baño de hielo;
(I) Determinar la absorbancia a 570nm. Preparar una curva estándar para cada ensayo mediante el uso de glicina o taurina y 10μΙ de DTT. Una unidad de actividad SBH se definió como la cantidad de enzima que libera 1 mmol de aminoácidos por 1ml de sustrato por minuto. La concentración de proteína se determinó con el estuche de proteínas Bio-Rad (CAT 500-0006, Bio-Rad, USA, CA) y se realizó de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se utilizó como estándar albúmina sérica bovina; y,
(m) Seleccionar la cepa Lactobaclllus bravie Lb9H que es la cepa con mayor actividad enzimática específica sobre las sales biliares unidas a glicina, ya que particularmente el glicocolato de sodio es una de las sales biliares que predominan en el intestino humano y según Brashear et al. (1998) mencionan que si la desconjugación de las sales biliares es importante para disminuir las concentraciones de colesterol sérico, entonces las cepas que desconjugan preferiblemente glicocolato de sodio podrían tener mayor capacidad para disminuir las concentraciones de colesterol sérico.
> Técnicas usadas para caracterizar las cepas Lactobaclllus Bravia Lb2H, Lb3H, LbSH, Lb9H y Lb13H.
Para llevar a cabo la presente invención se utilizaron las siguientes cepas de referencia: La cepa L casal se aisló de un producto comercial, los Lactobaclllus acldophllus, L Johnsonll y E. col! ATCC 160211 fueron amablemente donados por del Doctor Alejandro Azaola Espinosa (Universidad Autónoma Metropolitana, Xochimilco, México) y EPEC cepa E2348/69 fue generosamente donado por el Dr. Fernando Navarro (Departamento de Biología Celular, Cinvestav, México).
- Tinción de Gram: se tomó la colonia a evaluar y se dispersó en un porta objetos. Se acercó suavemente a la flama de un mechero para fijarla y posteriormente se añadió el colorante primario cristal violeta por un minuto, se enjuagó con agua destilada y se añadió lugol por 30 segundos. Se enjuagó nuevamente con agua, se lavó con alcohol-acetona (relación 95:5) por 15 segundos, se enjuagó nuevamente con agua destilada y se añadió safranina por 1 minuto. Se dejó secar y se observó al microscopio donde se comprobó que las cepas presentaran una morfología de bacilos y fueran Gram positivos por su color violeta.
- Prueba bioquímica de la catalasa: se evaluó la actividad de catalasa añadiendo una gota de peróxido de hidrógeno (30% v/v) a una alícuota del cultivo puro a analizar. La prueba se basa en la descomposición del peróxido de hidrógeno por la catalasa en agua y oxígeno. La presencia de este último se manifieste por la aparición de burbujas. Las bacterias ácido lácticas generalmente son catalasa negativa y no generan burbujas.
• Prueba de coagulación de la leche: en esta prueba se evaluó la capacidad de los microorganismos para coagular ia leche. A una muestra de leche esterilizada a 110°C por 10 minutos se le adicionó una muestra de 1 x 108 UFC/ml y se incubó a 37°C por 24 horas. Se utilizó como control positivo Lactobacillus johnsonll C4 y leche sin adición de cultivo alguno como control negativo.
- Actividad hemolitica de los Lactobacillus: las cepas se incubaron durante la noche a 37°C en caldo MRS. Inmediatamente después, se cultivaron en agar sangre y se incubaron durante 48 horas a 37°C. La hemólisis se consideró positiva cuando el agar alrededor de las colonias cambio de color rojo a verde.
- Tolerancia de ios Lactobacillus a los antibióticos: se utilizaron discos individuales (Cat. 71080480, BIO-RAD, S.A., México) de los siguientes antibióticos: tetraciclina (30ug), ciprofloxacino (5ug), cloranfenicol (30μg), estreptomicina (300μg), gentamicina (120μg), rifampicina (5μg), ampicilina (1 Oμg), eritrocina (15μg), kanamicina (30μg), vacomicina (30μς), trimetoprima (5μg).
Los discos se colocaron en placas de agar MRS previamente inoculadas con cada cepa. Las placas se incubaron durante 72 horas a 37°C en condiciones aerobias. Para expresar los resultados se midió el halo de inhibición de crecimiento producido por cada antibiótico y se expresó en mm. Estos mm fueron transformados de acuerdo a las indicaciones del fabricante y tos resultados se expresaron como susceptible (S) y resistente (R) al antibiótico.
- Identificación de ios lactobacilos por patrón de fermentación: se tomó 1 mi de 1x108 UFC de los aislados y se adicionó a 10ml de caldo MRS a 37°C. Posteriormente, se centrifugó a 8,000 rpm, se recuperó la pastilla y se resuspendió en solución fisiológica salina estéril al 0.9%. Se centrifugó nuevamente para eliminar la solución fisiológica y la pastilla obtenida se resuspendió en medio API 50 CHL (API systems, bioMérieux). Cada una de las muestras se agitó en vórtex y se transfirió a cada uno de los 50 microtubos con diferentes carbohidratos de la galería API 50 CH. Todos los microtubos fueron recubiertos con aceite de parafina (Merck) para mantener condiciones de anaerobiosis y se incubaron a 37°C. La lectura de cada galería se realizó a las 24 y 48 horas de incubación. El perfil bioquímico obtenido en cada aislado se evaluó con el software de identificación Apiweb* . - Identificación genotipica de ios LactobacHIus: la extracción de ADN se realizó con el estuche de aislamiento de ADN genómico Easy-DNATM (Num. Cat. K1800-01, Invitrogen, Cergy-Pontoise, Francia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La amplificación por PCR de las cepas aisladas se llevó a cabo mediante el uso de los cebadores Lab-0159f (5'- GGAAACAG(A/G)TGCTAATACCG-3') y Uni-0515r (5WCGTATTACCGCGGCTGCTGGCA-3 ) derivados de la amplificación de 400pb del gen de ADN 16Sr de LactobacHIus. Las amplificaciones se realizaron utilizando un ciclador térmico de gradiente T (modelo Tgradient 96, Cat. 050-801, Bbmetra, Germany). Los productos de PCR amplificados se purificaron con el estuche de purificación QIAquick PCR purification kit 50 (QIAGEN, CAT 28704, USA) y se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% con una tinción de bromuro de etidio y con luz UV. Las comparaciones y alineaciones de secuencias se hicieron con el analizador de secuencias de ADN BioEdit y la herramienta de alineamiento básica de la NCBI (http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi =)(Hall, 1999).
El análisis estadístico de datos se realizó mediante ANOVA con el software R (lenguaje y entorno para el cálculo estadístico) http://www.R-project.org, 2010. La prueba de Tukey se hizo para obtener diferencias estadísticas para la actividad sal biliar hidrolasa de cada cepa.
Para poder administrar la mezcla de cepas de LactobacHIus brevls 2LbH, 3LbH, 5LbH, 13LbH, los viales se descongelaron a temperatura ambiente por aproximadamente 3 minutos y se centrifugaron a 13,000 rpm con el objetivo de separar el glicerol. Inmediatamente después, se extrajo el glicerol con una jeringa estéril y se agregó agua destilada estéril, aforando el microtubo a 1ml y centrifugándolo nuevamente. Este procedimiento se realizó tres veces más para eliminar el glicerol de las cepas conservadas. El vehículo utilizado para administrar a los microorganismos fue agua.
Evaluación de la mezcla de cepas de LactobacHIus brevls (LactobacHIus brevls m\x) Lb2H, Lb3H, Lb5H y Lb13H en un daño hepático experimental:
- Modelo de daño hepático: las ratas Wistar macho de 250 + 20g de peso se alimentaron con dieta comercial estándar y agua (ad libitum) con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas, en una humedad constante y temperatura de entre 20 y 24°C. Los animales (n=7) recibieron una dosis de la mezcla de cepas de LactobacHIus brevls Lb2H, Lb3H, Lb5H y Lb13H de 1 x108 UFC/ml diariamente por 14 días y por vía oral de cada una de las cepas. Se indujo daño hepático agudo el día 14 con la administración intraperítoneai de lipopolisacárídos de E. colí (LPS obtenido de E. coli Sigma serotipo 026: B6) + D-galactosamina (Sigma G-0500; D-GaIN) 50μg y 500mg, respectivamente, por kilogramo de peso de rata en agua trídestilada. Se llevaron a cabo los controles pertinentes. Se evaluó la actividad sérica de las enzimas hepáticas alanino amino transferasa (ALT), gamma glutamil transpeptidasa (γ-GTP) y fosfatase alcalina (FA) (Bergmeyer et al., 1983). Además, se midió la concentración de glucógeno y peroxidación lipídica en hígado. Todos los animales fueron tratados de acuerdo al comité de ética del CINVESTAV (Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN) y a la Norma Oficial Mexicana (NOM-062-ZOO-1999), considerando las especificaciones técnicas de producción, cuidado y uso de animales de laboratorio. Para el análisis de datos se utilizó el programa estadísticos GraphPad Prism®, se utilizó una ANOVA y prueba de Tukey. Los datos se consideraron significativos en un intervalo de confianza del 95% o p < 0.05.
- Evaluación del efecto hipolipemiante de los Lactobacilos: se utilizaron ratas Wistar macho de 250 + 20g de peso, se alimentaron con dieta comercial estándar y agua (adlibitum) con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas, en una humedad constante y temperatura de entre 20 y 24°C. Los animales (n=7) recibieron una dosis de lactobacilos de 1 x109 UFC/ mi diariamente por 21 días y por vía oral. El día 14 se les cambió la dieta normal por una dieta hipercolesterolémica compuesta por 1% de colesterol (C8503 modelo 57-88-5 marca Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA), 5.0% de mantequilla, 0.5% de colato de sodio (C1254 modelo 206986-87-0 marca Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA), 30% de azúcar glas, 10% de caseína láctica (Alquimia Mexicana, S. de R.L., D.F, México) y 53.5% de alimento estándar para roedor (Rat Chow 5012 marca Purina, D.F, México) (Matsuda et al., 1986). Se hicieron los controles pertinentes. Una vez finalizado el período experimental las ratas se sometieron a un período de ayuno de 12 horas para extraer 1ml de sangre mediante punción del seno retroorbital. Las muestras de sangre fueron colocadas en tubos estériles de 1 mi y centrifugadas a 21 ,920 x g durante 15 minutos. El colesterol total se cuantificó a través del kit de reactivos enzimáticos CH201 (marca Randox, Antrim, Reino Unido) y las Lipoproteínas de alta densidad a través del kit CH3811A (marca Randox, Antrim, Reino Unido) utilizando un equipo colorimétrico automatizado conocido como Selectra a partir del suero obtenido.
La concentración de LDL se calculó con la fórmula desarrollada por Friedewald (Friedewald, 1972): LDL = Col - HDL - (TG x 0.45)
De igual forma, se calculó el índice aterogénico (IA) que predice el riesgo de sufrir acumulación de depósitos de grasas en las arterias (arterioesclerosis) y desarrollar enfermedades cardiovasculares (Irurita et al., 2007).
índice Aterogénico, IA = (Colesterol Total - Colesterol HDL)/ Colesterol HDL
- Análisis estadístico: para el presente estudio se utilizó el Software de análisis Estadístico MINITAB 16.0. Los datos fueron expresados como las medias +/- SEM, realizando un ANOVA de una vía con un nivel de significancia de 0.05 para saber si había diferencias significativas, se usó también la prueba de comparación múltiple de Tukey al mismo nivel de significancia.
RESULTADOS
En el aguamiel existen algunos lactobacilos capaces de crecer en presencia de sales biliares y que sobreviven a las condiciones del estrés del ambiente del TGI.
En el aguamiel de Huitzilac se encontraron 2 colonias (5H y 9H) resistentes al paso por las condiciones simuladas al TGI (descritas párrafos arriba). Asimismo, se seleccionaron otras 3 colonias (2H, 3H, 13H) antes del tratamiento de estrés del TGI, ya que fueron capaces de crecer en agar MRS adicionado con 0.5% de glicocolato de sodio y 0.37g/l de CaCI2 (ver cuadro 1). Estas cepas Lactobacillus brevis LbH2 (ATCC No. PTA-120749), LbH3 (ATCC No. PTA-120750), LbHS (ATCC No. PTA-120748), LbH9 (ATCC No. PTA-120751) y LbH13 (PTA-120752), además de tener propiedades probióticas, fueron seleccionadas porque poseen las características esperadas en un lactobacilo: forma de bacilo, Gram positivo, catalasa negativa, coagulan la leche. Estas características también se encontraron en la cepa L. case/, utilizada como control. Dichas cepas Lactobacillus brevis Lb2H, Lb3H, Lb5H. Lb9H y Lb13H seleccionadas no mostraron actividad hemolítica, lo cual es importante, ya que la presencia de esta actividad puede contribuir a la virulencia de algunas bacterias patógenas (Sridevi, 2009).
Figure imgf000030_0001
Los bacilos aislados del aguamiel se identificaron como pertenecientes al género LactobacHIus mediante su patrón de fermentación. Con respecto a la caracterización por patrón de fermentación, los aislados que provienen de la savia fresca (aguamiel) de agave pertenecen al género LactobacHIus, 3 aislados con identidad de LactobacHIus collinoides y 2 aislados con identidad de LactobacHIus brevis (ver cuadro 2). Dos de los aislados identificados como L. collinoides (2H y 5H) tuvieron el mismo patrón de fermentación de carbohidratos (L-arabinosa, D- ribosa, D-xilosa, D-glucosa, D-fructosa, metikxD-glucopiranosida, N-acetil glucosamina, esculina, D-maKosa, gluconato potásico y 5-Cetogluconato potásico) (identidad del 95.1%). Además, el aislado 5H fermentó D-manosa. El aislado 3H identificado como L collinoides (identidad de 58.7), mostró diferente patrón de fermentación respecto a las cepas mencionadas, fermentando además, O-galactosa, D-manitol, D-sorbitol y D-melibiosa.
Por otro lado, los aislados 9H y 3H identificados como L brevis sólo se diferenciaron de L collinoides en la fermentación de D-manosa y D-celobiosa.
Los lactobacillus aislados de la savia fresca (aguamiel) de agave se identificaron como LactobacHIus brevis por su patrón genotípico.
El análisis de ADN mostró que los primeros Lab-0159f y Uni-0515r fueron eficaces para amplificar el fragmento de 400 pb del gen ADNr 16S de todas las cepas seleccionadas. Cabe señalar que el control positivo (LactobacHIus case!) amplificó para estos primeros, mientras que el control negativo (E. co// ATCC 160211) no lo hizo. Los aislados 2H, 3H, 5H, 9H y 13H mostraron 99% de identidad con la secuencia de Lactobacillus brevis. La identificación genotípica es considerada más precisa que la evaluación del patrón de fermentación de carbohidratos. Por ello, de ahora en adelante se utilizará la nomenclatura que arrojó la prueba genotípica. A los aislados 2H, 3H, 5H, 9H y 13H se les agregó las siglas Lb. Ejemplo: Lb2H, significa que es un LactobacHIus brevis, colonia número 2, aislada de la región de Huitzilac.
Las cepas de Lactobacillus brevis del agua-miel hidrolizan las sales biliares: una vez seleccionadas las colonias se evaluó su habilidad para hidroiizar 4 diferentes sales biliares seleccionadas del grupo que comprende: taurocolato de sodio (TC), taurodeoxicolato de sodio (TDC), glicocolato de sodio (GC) y glicodeoxicolato de sodio (GDC), medida como halos de hidrólisis. Las colonias seleccionadas del aguamiel al sembrarlas en cajas de Petrí que contienen diferentes sales biliares: taurocolato de sodio (TC). taurodeoxicolato de sodio (TDCV alicocolato de sodio (GC) y glicodeoxicolato de sodio (GDC), formaron halos de hidrólisis (ver figura 2). En el cuadro 2 se observa que el diámetro obtenido para cada colonia del aguamiel en presencia de las diferentes sales biliares es distinta. El mayor tamaño para glicocolato, glicodeoxicolato, taurocolato y taurodeoxicolato lo mostraron las cepas 2H, 3H, 5H y 13H, respectivamente. El control positivo L acldophilus mostró un halo mayor en GDC por su parte, el control negativo, el patógeno E. coli, no mostró halo.
Figure imgf000032_0001
Los precipitados formados en las placas con agar MRS-sales biliares fueron analizados por cromatografía en capa fina (Figura 3 a, b, c, d). Se encontró que en el precipitado había glicocolato y colato de sodio, el cual es un producto de su desconjugación, así como glicodeoxicolato de sodio y el producto de su desconjugación, deoxicolato de sodio. Por lo tanto, el halo de precipitado y el material granular blanco alrededor de las colonias de las cepas observado en la figura 2 de los dibujos que se acompañan, son las sales biliares desconjugadas atribuida a la actividad SBH.
Una cepa aislada a partir del aguamiel, además de sobrevivir a las condiciones simuladas del TGI, presentó actividad enzimática específica preferentemente sobre sales biliares, primaria y secundaria, unidas a glicina.
Como se muestra en la figura 4 de los dibujos que se acompañan, las 5 cepas: Lb2H, Lb3H, LbSH, Lb13H y Lb9H muestran actividad sal biliar hidrolasa sobre las 4 sales biliares probadas. El aislado que presentó las actividades enzimáticas más altas sobre las sales biliares conjugadas con glicina fue Lb9H sobre glicocolato (1307 U/mg proteína), seguida por Lb2H (1063 U/mg proteína para glicocolato y 1038 U/mg proteína para glicodeoxicolato). Mientras que las cepas Lb13H, LbSH y Lb3H presentaron actividad SBH similar en las 4 sales biliares probadas. L case/ solo mostró actividad sobre los tauroconjugados (909 U/mg proteína para taurocolato y 186 U/mg proteína para taurodeoxicolato).
La afinidad mostrada por todas las cepas aisladas de L brevls a las sales biliares conjugadas a glicina puede deberse a que las sales biliares glico-conjugadas son más tóxicas para las bacterias comparadas con las taurino-conjugadas, y por lo tanto los lactobacilos expresan la sal biliar hidrolasa como un mecanismo protector contra ta toxicidad de los ácidos biliares.
Por otro lado, el hecho de que las cepas aisladas L brevls presenten mayor afinidad por las sales biliares glico-conjugadas es importante, ya que la mayoría de las sales biliares humanas están conjugadas a glicina; y por lo tanto, dichas cepas aisladas pueden ser importantes en la desconjugación de sales biliares en el intestino humano.
Las 5 cepas de L brevls aisladas del aguamiel LbH2 (ATCC No. PTA-120749), LbH3
(ATCC No. PTA-120750), LbH5 (ATCC No. PTA-120748), LbH9 (ATCC No. PTA-120751 ) y LbH13 (PTA-120752) mostraron una relación de desconjugación de glicocolato:taurocolato 100:11. Existen diferencias con otras cepas de L. brevls, por ejemplo la cepa ATCC 14869 tiene actividad sal biliar hidrolasa sobre glicodeoxicolato pero no sobre taurodeoxicolato. Otras cepas de L brevls mostraron una relación glicocolato:taurocolato 100:3, la cual es menor a la encontrada en las cepas del aguamiel, motivo de la presente invención.
Se procedió a formar una mezcla de 4 cepas LbH2 (ATCC No. PTA-120749), LbH3 (ATCC No. PTA-120750), LbH5 (ATCC No. PTA-120748) y LbH13 (PTA-120752), denominada también como Lactobacllus brevls mix, considerando el halo de hidrólisis de mayor tamaño en las diferentes sales biliares: Lb2H en sal de glicocolato, Lb3H en sal de glicodeoxicolato, LbSH en sal de taurocolato y Lb13H en sal de taurodeoxicolato, para evaluar su inocuidad y efecto en la prevención del daño al hígado en un modelo ¡n vivo. Posteriormente, se seleccionó la cepa con mayor actividad específica SBH (LbSH) sobre glicocolato para evaluar su efecto hipolipemiante.
La mezcla Lactobacillus brevls mix formada por las cepas Lactobaclllus brevls Lb2H, Lb3H, LbSH y Lb13H aisladas del aguamiel mantiene la actividad sérica de la enzima Gamma glutamil transpeptidasa (γ-GTP) en los mismos niveles que el control sin la adición de dicha mezcla de cepas y disminuye la actividad sérica de la enzima Gamma glutamil transpeptidasa (γ-GTP) al 100% con respecto al daño inducido por LPS y D-Galactosamina sin la adición de dicha mezcla de cepas.
Una vez encontrado un efecto benéfico in vitro en la mezcla Lactobacillusbrevis mix formada con las cepas de Lactobacillus brevis Lb2H, Lb3H, LbSH y Lb13H aisladas del aguamiel, se decidió evaluar su inocuidad utilizando para ello un estudio in vivo con ratas Wistar. Como puede observarse en la figura 5 de los dibujos que se acompañan, en el modelo de daño hepático con LPS + D-GaIN se elevó la enzima v-GTP, la cual es indicadora de daño en la membrana canalicular del hepatocito y de colestasis. Interesantemente el tratamiento por 14 días con la mezcla de lactobacilos previno la colestasis inducida por LPS + D-GalN. Los controles en donde sólo se administraron la mezcla de lactobacilos no mostraron ninguna alteración sobre la función hepática normal, lo cual indica la inocuidad de las bacterias utilizadas. Se ha mencionado anteriormente que la actividad de la enzima v-GTP es un predictor de riesgo de diabetes y enfermedades cardiovasculares, por lo que una disminución en ia actividad de esta enzima limita su posible desarrollo.
En el tratamiento preventivo con la mezcla Lactobacillus brevis mix formada con las cepas de Lactobacillus brevis Lb2H, Lb3H, LbSH y Lb13H aisladas del aguamiel en las ratas intoxicadas con LPS + D-GalN, se encontró una disminución en la actividad de la enzima v-GTP en un 55.7%, tal como se puede observar en la figura 9 de los dibujos que se acompañan. Otros estudios muestran una disminución menor a la encontrada en la presente investigación. Por ejemplo, la administración de L plantarum y B. blfídum por siete días en pacientes alcohólicos, se encontró una disminución de la actividad sérica de la enzima y-GTP en un 16.7% (Kirpich et al., 2008). En otro estudio, la administración de L. brevis disminuyó la actividad de la enzima y-GTP en un 5% (Wakita et al. 2012).
La mezcla Lactobacillus brevis mix formada por las cepas de Lactobacillus brevis Lb2H,
Lb3H, LbSHy Lb13H aisladas del aguamiel mantiene la actividad sérica de la fosfatase alcalina en los mismos niveles que el control sin la adición de dicha mezcla de cepas y disminuye la actividad sérica de la enzima fosfatasa alcalina al 100% con respecto al daño inducido por LPS y D- Galactosamina sin la adición de dicha mezcla. Como puede observarse en la figura 6 de los dibujos que se acompañan, en el modelo de daño hepático con LPS + D-GaIN se elevó la enzima FA, la cual también es indicadora de daño en la membrana canalicuiar del hepatocito y de colestasis. Interesantemente, el tratamiento por 14 días con la mezcla de lactobacilos previno la colestasis inducida por LPS + D-GalN. Los controles en donde sólo se administraron la mezcla de lactobacilos no mostraron ninguna alteración sobre la función hepática normal. Lo cual indica ia inocuidad de la mezcla de cepas en el modelo utilizado.
En este estudio, la mezcla de Lactobaclllus brevls del aguamiel limitó la actividad sérica de la enzima FA en un 58.6%, tal como se observa en la figura 6. Un efecto similar fue encontrado al administrar L rhamnosus y L. plantarum (54.7%) en ratas intoxicadas con D-GalN (Adawi et al., 2001).
El tratamiento con la cepa de Lactobaclllus brevls Lb9H (cepa con mayor actividad específica SBH sobre glicocolato) previno la elevación de las concentraciones de colesterol total en un 100%. Las concentraciones básales de colesterol total se encontraron en 27 mmol/l. La dieta especial elevó las concentraciones de colesterol total 50 mmol/l. Con la administración preventiva de Lb9H ai grupo de ratas alimentadas con la dieta hipercolesterolémica solamente se elevó a 31.83 mmol/l (figura 7 de los dibujos que se acompañan). Al no haber diferencias estadísticamente significativas entre el grupo normal y el grupo hipercolesterolémico que fue administrado con la cepa Lb9H, se considera que la prevención del incremento del colesterol total fue del 100%.
El tratamiento con la cepa Lb9H (cepa con mayor actividad específica SBH sobre glicocolato) previno la elevación de las concentraciones de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) en un 100%. Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) en el grupo normal (N) se encontraron en 16 mmol/l y en el grupo que recibió la dieta hiperlipidémica (H) se elevaron a más del doble (39.68 mmol/l). Como se puede observar en la figura 8 de los dibujos que se acompañan, no existen diferencias estadísticamente significativas (p≤0.05) entre el grupo normal y el grupo hipercolesterolémico tratado previamente con el lactobacilo Lb9H (Lb9H-H). Luego entonces, la administración de Lb9H previno el incremento de las lipoproteínas de baja densidad al 100%.
El tratamiento con la cepa Lb9H (cepa con mayor actividad específica SBH sobre glicocolato) previno el incremento de los triglicéridos en un 60%. La dieta hiperlipidémica elevó los triglicéridos de 0.4 a 0.6 mmol/l (figura 9 de los dibujos que se acompañan). Con la administración de la cepa Lb9H se previno el incremento de los triglicéridos en un 60%. Dichos resultados fueron estadísticamente significativos (p≤0.05).
El tratamiento con Lb9H disminuyó el índice aterogénico al incrementar las relaciones: colesteroi HDIJcolesterol total y colesterol HD1JLDL en un 45% y 68%, respectivamente, y al disminuir la relación TG/HDL en un 9.4% (p<0.05), lo cual es deseable para disminuir la incidencia de enfermedades relacionadas con altas concentraciones de colesterol (ver cuadro 4).
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El efecto hipolipemiante encontrado al administrar la cepa Lb9H puede deberse a que esta cepa fue encontrada al final de la simulación del TGI, por lo que se sugiere que fue capaz de mantenerse viable y en las concentraciones adecuadas para ejercer un efecto benéfico al disminuir los niveles de colesterol total y LDL. Además, la cepa Ub9H mostró mejor actividad específica sal biliar hidrolasa sobre glicocolato (sal biliar primaria presente en mayor concentración en el intestino), lo cual es bueno tomando en cuenta que la actividad SBH ha sido relacionada con la capacidad hipolipemiante de una bacteria (Kim et al., 2004).
En un estudio realizado a ratas, se encontró una disminución del 14% en colesterol total, la cual no fue significativa (p<0.05) y una disminución del 24% en colesterol LDL, estadísticamente significativa (p<0.05) cuando se administró una dieta hiperlipidémica suplementada con Baciílus polyfermenticus (3.1x106 UFC) por 6 semanas. El efecto encontrado en este trabajo con la cepa Lb9H fue superior al reportado con Baclllus polyfermenticus.
De conformidad con lo anteriormente descrito, se podrá observar que el método que se describe en la modalidad particularmente preferida de la presente invención ha sido ideado para aislar eficientemente cepas de Lactobacillus brevls, tales como Lb2H (depósito ATCC No. PTA- 120749), Lb3H (depósito ATCC No. PTA-120750), Lb5H (depósito ATCC No. PTA-120748), £Jt»9H (depósito ATCC No. PTA-120751) y Lb13H (depósito ATCC No. PTA-120752), las cuales tiene actividad sal biliar hidrolasa, disminuyen la concentración de colesterol, y previenen la elevación de enzimas séricas indicadoras de daño hepático, y será evidente para cualquier experto con conocimientos en la materia que son posibles numerosas modificaciones a dicha invención, pero sin apartarse del verdadero alcance de la invención, tales como modificar la velocidad y tiempo de centrifugación, las condiciones de almacenamiento, las condiciones simuladas del tracto gastrointestinal, modificar los criterios de selección de los microorganismos; entre muchas otras modificaciones. Por lo tanto, la presente invención no debe ser restringida excepto por lo establecido en el estado de la técnica y por el verdadero alcance de las reivindicaciones anexas, interpretadas en función de la descripción detallada de las modalidades de la presente invención.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. - Una cepa de Laetobacillus brevls, caracterizada porque dicha cepa es aislada del aguamiel de Agave salmiana, mostrando un 99% de identidad con la secuencia de Laetobacillus brevls, dicha cepa siendo Gram positiva y catalasa negativa, no presenta actividad hemolítica que pudiera lisar a los glóbulos rojos.
2. - La cepa de Laetobacillus brevls de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque la cepa presenta propiedades probióticas y actividad sal biliar hidrolasa (SBH).
3. - La cepa de Laetobacillus brevls de conformidad con la reivindicación 2, caracterizadas además porque la actividad sal biliar hidrolasa es sobre las sales biliares seleccionadas del grupo que comprende: taurocolato de sodio (TC), taurodeoxicolato de sodio (TDC), glicocolato de sodio (GC) y glicodeoxicolato de sodio (GDC).
4- La cepa de Laetobacillus brevls de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque se trata de la cepa Laetobacillus brevls LbH2 depositada ante la ATCC con la designación de depósito de patente No. PTA-120749.
5. - La cepa de Laetobacillus brevis de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque se trata de la cepa Laetobacillus brevls LbH3 depositada ante la ATCC con la designación de depósito de patente No. PTA-120750.
6. - La cepa de Laetobacillus brevls de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque se trata de la cepa Laetobacillus brevis LbH5 depositada ante la ATCC con la designación de depósito de patente No. PTA-120748.
7. - La cepa de Laetobacillus brevis de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque se trata de la cepa Laetobacillus brevls LbH9 depositada ante la ATCC con la designación de depósito de patente No. PTA-120751.
8.- La cepa de Laetobacillus brevis de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque se trata de la cepa Laetobacillus brevls LbH13 depositada ante la ATCC con la designación de depósito de patente No. PTA-120752.
9.- Una mezcla de cepas de Laetobacillus brevis, caracterizada porque previene los daños hepáticos disminuyendo al 100% la actividad de las enzimas séricas alanino amino transferasa (ALT), gamma glutamil transpeptidasa (γ-GTP) y fosfatase alcalina (FA) con respecto al daño inducido por LPS y D-galactosamina.
10. - La mezcla de cepas de LactobacHIus brevls de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque previene la colestasis inducida por LPS + D-galactosamina.
11. - La mezcla de cepas de LactobacHIus brevls de conformidad con las reivindicaciones 9 a 10, caracterizada además porque ia mezcla comprende a las cepas LactobacHIus brevls LbH2 (PTA-120749), LbH3 (PTA-120750), LbHS (PTA-120748) y LbM 3 (PTA-120752).
12. - La mezcla de cepas de LactobacHIus brevls de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada además porque la cepa LactobacHIus brevls Lb2H (PTA-120749) se encuentra presente en la mezcla en una concentración que va desde 1x108 hasta 1x1010 UFC/ml.
13. - La mezcla de cepas de LactobacHIus brevls de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque la cepa LactobacHIus brevls Lb2H (PTA-120749) se encuentra presente en la mezcla en una concentración de 1x108 UFC/ml.
14. - La mezcla de cepas de LactobacHIus brevls de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada además porque la cepa LactobacHIus brevls Lb3H (PTA-120750) se encuentra presente en la mezcla en una concentración que va desde 1x108 hasta 1x1010 UFC/ml.
15.- La mezcla de cepas de LactobacHIus brevls de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque la cepa LactobacHIus brevls Lb3H (PTA-120750) se encuentra presente en la mezcla en una concentración de 1x108 UFC/ml.
16. - La mezcla de cepas de LactobacHIus brevls de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada además porque la cepa LactobacHIus brevls Lb5H (PTA-120748) se encuentra presente en la mezcla en una concentración que va desde 1x108 hasta 1x1010 UFC/ml.
17. - La mezcla de cepas de LactobacHIus brevls de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la cepa LactobacHIus brevis Lb5H (PTA-120748) se encuentra presente en la mezcla en una concentración de 1x108 UFC/ml.
18. - La mezcla de cepas de LactobacHIus brevls de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada además porque la cepa LactobacHIus brevls Lb13H (PTA-120752) se encuentra presente en la mezcla en una concentración que va desde 1x108 hasta 1x1010 UFC/ml.
19. - La mezcla de cepas de LactobacHIus brevls de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque la cepa LactobacHIus brevis Lb13H (PTA-120752) se encuentra presente en la mezcla en una concentración de 1x108 UFC/ml.
20. - La cepa de Lactobacillus brevls de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la cepa de Lactobacillus brevls Lb9H (PTA-120751) previene en un 100% el incremento en las concentraciones de colesterol total.
21. - La cepa de Lactobacillus brevls de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la cepa de Lactobacillus brevls Lb9H (PTA-120751) previene en un 100% el incremento en las concentraciones de las lipoprotefnas de baja densidad (LOL).
22. - La cepa de Lactobacillus brevls de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque la cepa de Lactobacillus brevls Lb9H (PTA-120751) disminuye el índice aterogénico at incrementar las relaciones colesterol HDL/colesterol total y colesterol HDIJcolesterol LOL en un 45% y 68%, respectivamente.
23. - La cepa de Lactobacillus brevls de conformidad con las reivindicaciones 20 a 23, caracterizada además porque la cepa de Lactobacullls brevls Lb9H (PTA-120751) debe estar en una concentración que va desde 1x108 hasta 1x1010 UFC/ml para que sea funcional.
24. - La cepa de Lactobacillus brevls de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque la cepa de Lactobacullls brevls Lb9H (PTA-120751) debe estar en una concentración de 1x108 UFC/ml para que sea funcional.
25. - Un método de asilamiento y selección de cepas Lactobacillus brevls, caracterizado porque comprende las fases de:
I. Aislamiento y selección de cepas Lactobacillus brevls LbH2 (ATCC No. PTA-120749), LbH3 (ATCC No. PTA-120750) y LbH13 (PTA-120752);
II. Aislamiento y selección de cepas Lactobacillus brevls LbHS (ATCC No. PTA-120748) y LbH9 (ATCC No. PTA-120751);
III. Conservación de las cepas Lactobacillus brevls Lb2H (PTA - 120749), Lb3H (PTA - 120750), LbSH (PTA - 120748), Lb9H (PTA - 120751 ) y Lb13H (PTA - 120752);
IV. Evaluación cualitativa de actividad sal biliar hidrolasa de los cultivos por tamaño del halo de hidrólisis, para obtener la mezcla formada por las cepas Lactobacillus brevls Lb2H, Lb3H, Lb5H y Lb13H); y,
V. Evaluación cuantitativa de la actividad sal biliar hidrolasa en los cultivos por medio de la liberación de glicina/taurina durante la actividad de dicha enzima para la selección de la cepa Lactobacillus brevis Lb9H.
26.- El método de aislamiento y selección de cepas Lactobaclllus brevls de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la fase I de aislamiento y selección de las Lactobaclllus brevls Lb2H, Lb3H y Lb13H comprende las etapas de:
(e) Centrífugar 50ml de aguamiel a una velocidad de entre 8,000 y 10,000 rpm por espacio de 15 minutos y resuspender la pastilla en 10 mi de caldo MRS;
(f) Inocular 10μΙ en cajas preparadas con agar MRS adicionado con 0.5% de glicocolato de sodio y 0.37 g/l de CaCb.e incubar dichas cajas a 37°C durante 72 horas;
(g) Seleccionar las colonias que son capaces de crecer y formar halos de hidrólisis que presentan forma de bacilos, Gram-positivos, catalasa-negativos y con ausencia de actividad hemolítica para asegurar que no serán capaces de lisar glóbulos rojos, de tal manera que en esta etapa se seleccionan las cepas Lactobaclllus brevls Lb2H (PTA - 120749), Lb3H (PTA - 120750) y Lb13H (PTA - 120752); y,
(h) Tomar cada una de las colonias seleccionadas y sembrar en una caja nueva con agar MRS para asegurar la pureza de los cultivos.
27.- El método de aislamiento y selección de cepas Lactobaclllus brevls de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque la fase II de aislamiento y selección de las cepas Lactobaclllus brevls Lb5H y Lb9H comprende las etapas de:
(a) Ajusfar la concentración de microorganismos totales a 1x107 UFC/ml con caldo MRS;
(b) Centrifugar 1ml de la suspensión y utilizar el paquete celular para llevar a cabo una simulación gastrointestinal de acuerdo con el método desarrollado por Vizozo Pinto, et al., 2006, con algunas modificaciones;
(c) Incubar el paquete celular en 20ml de una solución electrolítica con 60mM de solución salina amortiguadora de fosfatos (PBS) a un pH de 6.2, esterilizar y posteriormente adicionar lisozima al 0.01% p/v; en donde dicha incubación se lleva a cabo por espacio de 5 minutos a una temperatura de 37°C simulando las condiciones de la cavidad oral, manteniendo una agitación constante a 180 rpm para reproducir los movimientos de la boca;
(d) Centrifugar el paquete celular a una velocidad de entre 8,000 y 10,000 rpm durante 10 minutos a una temperatura de 4°C para recuperar las células viables;
(e) Incubar el paquete celular obtenido en la etapa (d) anterior en 20ml de una solución al 0.5% de NaCI y pH de 2.0 con 3g/l de pepsina, en donde dicha incubación se lleva a cabo durante 90 minutos a una temperatura de 37°C simulando las condiciones del jugo gástrico artificial, manteniendo una agitación constante a 180 rpm para reproducir los movimientos peristálticos; (f) Centrifugar el paquete celular a una velocidad de entre 8,000 y 10,000 rpm durante 10 minutos a una temperatura de 4°C para recuperar las células viables;
(g) Incubar el paquete celular obtenido en la etapa (f) en 20ml de una solución de PBS a un pH de 6.8, adicionado con 0.5% de oxgall y 1g/l de pancreatina, en donde dicha incubación se lleva a cabo durante un tiempo de 150 minutos a una temperatura de 37°C simulando las condiciones de la secreción duodenal, manteniendo una agitación constante a 180 rpm para reproducir los movimientos peristálticos;
(h) Inocular 10μΙ el paquete celular obtenido en la etapa (g) en cajas preparadas con agar MRS adicionado con 0.5% de glicocolato de sodio y 0.37 g/l de CaCb, e incubar dichas cajas a 37°C durante 72 horas;
(i) Seleccionar los microorganismos que son capaces de crecer y formar halos de hidrólisis que presentan forma de bacilos, Gram-positivos, catalasa-negativos y con ausencia de actividad hemolítica para asegurar que no serán capaces de lisar glóbulos rojos, de tal manera que en esta etapa se seleccionan las cepas Lactobacillus bravls Lb5H (PTA - 120748) y Lb9H (PTA - 120751);
(j) Tomar cada una de las colonias seleccionadas y sembrar en una caja nueva con agar MRS para asegurar la pureza de los cultivos.
28.- El método de aislamiento y selección de cepas Lactobacillus brevls de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la fase III de conservación de las cepas Lactobacillus brevis Lb2H (PTA - 120749), Lb3H (PTA - 120750), LbSH (PTA - 120748), Lb9H (PTA - 120751) y Lb13H (PTA - 120752) comprende las etapas de:
(a) Sembrar las colonias puras seleccionadas por estriado masivo e incubar a 37°C de 24 a 48 horas;
(b) Recolectar la biomasa mediante un lavado con 2ml de caldo MRS estéril e incubar en 8ml de caldo MRS a 37°C durante toda la noche;
(c) Realizar pases de cultivo en caldo MRS hasta llegar a una concentración de 1x109 UFC/ml;
(d) Centrifugar a 29,286.01 * g durante 15 minutos a 4°C en condiciones de esterilidad; y, (e) Adicionar 10ml de caldo MRS y 20% de glicerol al paquete celular y distribuir la muestra en microtubos Eppendorf de 0.5ml para conservar a -80°C.
29.- El método de aislamiento y selección de cepas Lactobaelllus brevis de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la fase IV de evaluación cualitativa de actividad sal biliar hidrolasa de los cultivos por tamaño del halo de hidrólisis para obtener la mezcla de cepas Lactobaelllus bravia mix formada por las cepas Lb2H, Lb3H, Lb5H yLb13H, comprende las etapas de:
(a) Activar las colonias en caldo MRS a 37°C durante toda la noche;
(b) Centrifugar durante 10 minutos a 10,000 rpm a 4°C para eliminar el glicerol y estandarizar la concentración celular de cada uno de los cultivos mediante espectrofotometría a 660nm a una absorbencia de 1.0;
(c) Sembrar en cajas con agar MRS-0.5% de diferentes sales biliares que se seleccionan del grupo que comprende: glicocolato de sodio, glicodeoxicolato de sodio, taurocolato de sodio y taurodeoxicolato de sodio más 0.37g/l de CaCb; dividir las cajas con agar MRS-sales biliares en 4 partes y colocar discos de papel filtro de 1cm de diámetro (4 por cada caja), y colocar 20μΙ de cada uno de los cultivos de interés sobre el papel filtro;
(d) Incubar por 72 horas a 37°C en condiciones de anaerobiosis (Forma Scientific anaerobio chamber) de acuerdo con el método de Dashkevicz and Feighner (1989) con algunas modificaciones;
(e) Cortar las fracciones de agar alrededor de las colonias que contienen el halo más grande de precipitado con una navaja estéril, colocarlas en 5ml de agua y calentar a 90°C. Enfriar a temperatura ambiente por 10 minutos;
(f) Ajusfar el pH a 1 con HCI concentrado, mezclar con acetato de etilo en una relación 3:1 y dejar reposar por 20 minutos para permitir la separación de las fases. Tomar 3μΙ de la fase orgánica y colocar en placas de sílica gel (8 cm x 13 cm, Merck, Darmstadt, Germany) para poder observar los productos de desconjugación de sales biliares (ácido cólico y deoxicólico preparados al 0.5% en acetato de etilo, pH de 1); utilizar como fase móvil acetato isoamílteo: ácido propiónico:n-propanol:agua en proporciones de 40:30:20:10 (%), respectivamente;
(g) Seleccionar 4 cepas con el mayor halo de hidrólisis alrededor de los discos de papel filtro, en donde las cepas seleccionadas son Lb2H, Lb3H, Lb5H y Lb13H; una cepa por cada una de las sales biliares utilizadas (glicocolato con Lb3H; gücodeoxicolato con Lb2H; taurocolato con Lb5H; taurodeoxicolato con Lb13H).
30.- El método de aislamiento y selección de cepas Lactobaclllus brevis de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la fase V de evaluación cuantitativa de la actividad sal biliar hidrolasa en los cultivos por medio de la liberación de glicina/taurina durante la actividad de dicha enzima para la selección de la cepa Lb9H, comprende las etapas de:
(a) Activar las cepas de Lactobaclllus bravia o la cepa control (Lactobaclllus casal Shirota) en caldo MRS a 37°C durante toda la noche;
(b) Centrifugar durante 10 minutos a 10,000 rpm a 4°C para eliminar el glicerol;
(c) Resuspender la pastilla de cada cultivo en 5ml de solución reguladora de sodio 0.1M a pH de
7.0. y centrifugar durante 10 minutos a 10,000 rpm y a una temperatura de 4°C;
(d) Resuspender la pastilla de cada cultivo en la misma solución reguladora y ajustar la concentración celular de cada uno de los cultivos a una absorbencia de 3.0 mediante espectrofotometría a 660nm;
(e) Tomar una alícuota de 1ml de cada cultivo y centrifugar 5 minutos a 13,000 rpm a una temperatura de 4°C;
(f) Inocular la pastilla obtenida de cada cultivo en 5ml de una solución 0.5% de sales biliares (glicocolato de sodio, taurocolato de sodio, gücodeoxicolato de sodio o taurodeoxicolato de sodio), pH de 6.0 e incubar a una temperatura de 37°C por un tiempo de 18 horas, manteniendo una agitación constante;
(g) Centrifugar durante 5 minutos a 13,000 rpm y a una temperatura de 4°C para eliminar las células de cada cepa y obtener un sobrenadante (extracto crudo enzimático);
(h) Tomar una alícuota de 50μΙ del sobrenadante (extracto crudo enzimático) obtenido en la etapa (g) anterior y mezclarla con 50μΙ de solución reguladora de fosfato de sodio 0.1 M, pH de 6.0 y 100μΙ de una solución de cada sal biliar al 0.5% p/v (sustrato), adicionar 10ul de ditiotreitol (DTT) 10mM para disminuir la oxidación de la enzima, para posteriormente incubar a una temperatura de 37°C, durante 30 minutos; adicionalmente se añaden 100μΙ de ácido tricloroacético al 15% para detener la reacción;
(i) Preparar de manera simultánea el testigo, el cual consiste en mezclar 100μΙ de ácido tricloroacético más 100μΙ de una solución de cada una de las sales biliares (glicocolato de sodio, taurocolato de sodio, glicodeoxicolato de sodio o taurodeoxicolato de sodio) al 0.5% p/v (sustrato) e incubar a 37°C durante 30 minutos; después de la incubación se agregan 50 μΙ del sobrenadante (extracto crudo enzimático) más 50μΙ de solución reguladora de fosfato de sodio 0.1 M, pH de 6.0;
0) Centrifugar las mezclas de reacción durante 5 minutos a 13,000 rpm para separar el precipitado (sustrato no transformado) del sobrenadante (sustrato transformado);
(k) Tomar una alícuota de 50μΙ de sobrenadante (sustrato transformado) de cada mezcla y mezclar con 50μΙ de agua destilada para obtener un volumen de 100μΙ y se adicionan 1.9ml de reactivo de ninhidrína [0.5ml de 1% p/v de ninhidrína en solución reguladora de citratos 0.5M y pH de 5.5, 1.2ml de glicerol y 0.2ml de solución reguladora de citratos 0.5M y pH de 5.5] a cada una de las muestras de 100 μΙ; posteriormente se homogeneiza en vórtex, hervir durante 14 minutos y se deja enfriar durante 3 minutos en un baño de hielo;
(I) Determinar ia absorbencia a 570nm, para lo cual se prepara una curva estándar para cada ensayo mediante el uso de glicina o taurina y 10μΙ de DTT; una unidad de actividad SBH se definió como la cantidad de enzima que libera 1 mmol de aminoácidos por 1ml de sustrato por minuto, la concentración de proteína se determinó con el estuche de proteínas Bio-Rad (CAT 500-0006, Bio-Rad, USA, CA) y se realizó de acuerdo con las instrucciones del proveedor, utilizándose como estándar albúmina sérica bovina; y,
(m) Seleccionar la cepa Lactobacillus brevis Lb9H que es la cepa con mayor actividad enzimática específica sobre las sales biliares unidas a glicina, ya que particularmente el glicocolato de sodio es una de las sales biliares que predominan en el intestino humano y según Brashear et al. (1998) mencionan que si la desconjugación de las sales biliares es importante para disminuir las concentraciones de colesterol sérico, entonces las cepas que desconjugan preferiblemente glicocolato de sodio podrían tener mayor capacidad para disminuir las concentraciones de colesterol sérico.
31.- El método de aislamiento y selección de cepas de Lactobacillus brevis de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque la etapa (c) se repite, por lo menos una vez más.
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