CN103642715A - 生防枯草芽孢杆菌株sh7的发酵培养方法及使用该方法培养所得生防枯草芽孢杆菌sh7 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及生防枯草芽孢杆菌株SH7的发酵培养方法及使用该方法培养所得生防枯草芽孢杆菌SH7，本发明方法按顺序包括如下步骤：（1）种子准备：将枯草芽孢杆菌SH7菌株接种于牛肉汁液体种子培养基中，灭菌，37℃过夜摇菌得种子菌液，所述牛肉汁液体种子培养基包含酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏；（2）发酵培养：于发酵培养基中接种步骤（1）的种子菌液，摇菌36h后取发酵完毕的菌液，离心5分钟，倒掉上清液，冷冻干燥后，称重。本发明所筛选出的芽孢杆菌SH7对烟草青枯病菌表现出了良好的拮抗性，温室药效试验达到了较高的水平，前景广阔，本发明方法为枯草芽孢杆菌的生产应用打下了良好的基础。

Description

生防枯草芽孢杆菌株SH7的发酵培养方法及使用该方法培养所得生防枯草芽孢杆菌SH7

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及生防枯草芽孢杆菌株SH7的发酵培养方法及使用该方法培养所得生防枯草芽孢杆菌SH7。 

背景技术

烟草细菌性青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种典型的维管束病害，最显著的症状是枯萎，且枯萎的速度很快，一旦发病即可造成全株死亡，是烟草上一大毁灭性病害。目前在我国长江流域及其以南烟区普遍发生；在多发病区旱地烟田的发病率为30%-50%，特别是旱地重茬连作烟田的发病率为50%以上；尤以华南烟区为害严重，个别年份暴发流行。近几年来，该病的发病和为害范围有向北方烟区扩展的趋势，在山东、河南、陕西及辽宁等省都有发生，局部地区为害较重。目前该病造成的损失已居各类病害的第四位，必须重视该病的防治工作。尤其近年以来由根结线虫造成的伤口引起的青枯病、黑胫病复合侵染的危害呈上升趋势，造成烟田严重减产。鉴于化学防治对环境的污染和生态平衡的破坏，因此烟草青枯病的生物防治越来越被重视。 

烟草是我国重要的经济作物，中国烤烟的主要产区分布在云南、贵州、四川、湖北、湖南、陕西、河南、安徽、山东、辽宁、吉林、黑龙江等20多个省区的近900个县市。其中，云南省是我国烟草种植面积最大的省。中国烟叶的质量在不断提高，全国良种化面积达到90%以上，是世界上最大的烟草生产国。 

在烟草生产上病害是严重影响产量和质量的重要因素。烟草细菌性青枯病又称“烟瘟”，是由Ralstonia solanacearum引起的一种维管束病害，主要侵染烟草根部和茎，也可侵染叶片；在苗床和大田均能发生，常造成烟株大片枯萎死亡，是一种毁灭性的土传病害。1864年印度尼西亚首先报道在烟草上引起毁灭性的损失；在美国,1880年首次发现此病，1910年大面积流行，随后美国一些农场被迫停止种烟。此病广泛分布于世界热带、亚热带及温带等湿热地区；我国烟草青枯病菌的地理分布长江以南发生居多，依发病高低可划分为4个区，多发病区包括广东、江西、福建、湖南、四川、浙江、安徽等省区；次发病区包括贵卅、湖北；偶发病区包括云南、河南、山东、陕西、辽宁；其余为无病区，各区的划分是相对的，区间存在过渡带；呈现由西向东、由北向南逐渐增加的趋势。 

烟草细菌性青枯病菌的寄主范围很广，可侵染50多个科200余种植物，是番茄、马铃薯、 烟草、花生、甘薯、茄子、生姜、香蕉以及一些贵重药品和花卉等植物生产的重要限制因素。大多数禾本科植物及棉花、甘薯和麻类作物不受侵染。病菌主要在土壤和堆肥中越冬，也可以潜伏在种子、根际或生长着的寄主体内越冬；一般条件下，是从根部伤口侵入，不能从气孔侵入。青枯病的主要初次侵染来源是土壤、病残组织和肥料中的病菌，这些病原菌靠雨水、排灌水、病土、带菌苗、疫苗、人畜、生产工具及昆虫进行扩散远距离传播。 

烟草青枯病在苗床和大田均能发生。主要侵染烟株根、茎，也可侵染叶片，染病叶片初期仍为绿色悬挂在茎上，故称“青枯病”；天气炎热时，病株的叶片呈不规则的灼伤，叶片变干，边缘脱落。病株的茎呈直立状，茎上垂着死亡的叶片。土壤湿度大时，根软腐发粘，致使全株枯死。 

利用有益微生物防治植物病害，已成为一个十分活跃并开始显示良好应用前景的领域。许多论著报道（Cook,K.J.and Baker K.F.The nature and practice of biological control of plant pathogens.1984,APS press USA）认为生物防治在未来农业中具有重要地位。大量的研究表明，生防细菌在其生长发育中产生多种拮抗性或竞争性的代谢产物，通过直接或间接作用，达到阻碍或杀死病原菌的效果。无论是自然发生的生物防治现象还是人们用于生物防治的生物类型中，细菌的作用是非常明显的。其主要优势在于：1)细菌的种类和数量众多，在植物根际和地上部大量存在；2)细菌对病原菌的作用方式较广，可以通过竞争、拮抗和诱导植物产生抗性等方式对病原菌产生影响；3)具有惊人的繁殖速度；4)许多细菌存在于植物根际和地上部，对植物的生态比较适宜；5)细菌大多可以人工培养，便于控制，在实践中易于操作；6)有些细菌不仅能防治病害而且可以增加作物产量(程亮等,拮抗细菌的研究进展[J].江西农业大学学报,2003,25(5):732～736)。表现出或被认为有生防潜力的有益细菌种类众多（Dviad M.Biological Control of Soilbrone Plant Pathogens in the Rizhosphere with Bacteria.Ann.Rev.Phytopathol.1988,26:379～407）；包括了许多属的细菌，目前成功应用的植物病害生防细菌有Agrobacterium、Bacillus、Pseudomonas、Erwinia、Xanthomonas等属的一些菌株。 

烟草青枯病是烟草生产中最严重的病害之一，每年都造成烟叶产量的严重损失和品质下降，是烟草生产中一个很重要的制约因素。而作物青枯病生防枯草芽孢杆菌株SH7能有效地防治和减轻烟草青枯病的危害，但是现有技术中发酵培养该菌株产量低，不适合大量发酵用。 

发明内容

根据上述领域的需求和不足，本发明提供一种作物青枯病生防枯草芽孢杆菌株SH7的发酵培养方法。该方法为作物青枯病生防枯草芽孢杆菌株SH7的生产应用打下了良好的基础。 

本发明的技术方案如下： 

生防枯草芽孢杆菌株SH7的发酵培养方法，其特征在于，按顺序包括如下步骤： 

（1）种子准备：将生防枯草芽孢杆菌SH7菌株接种于牛肉汁液体种子培养基中，灭菌，37℃过夜摇菌得种子菌液，所述牛肉汁液体种子培养基包含酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏； 

（2）发酵培养：于发酵培养基中接种步骤（1）的种子菌液，摇菌36h后取发酵完毕的菌液，离心5分钟，倒掉上清液，冷冻干燥后，称重。 

所述发酵培养基包含牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、淀粉、30.8mg/L的硫酸锰溶液。 

所述发酵培养基中含有牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、葡萄糖1份、氯化钠0.5份。 

所述发酵培养基各成分重量份配比为牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、葡萄糖1份、氯化钠0.5份、淀粉0.3份、30.8mg/L的硫酸锰溶液0.1份。 

步骤（2）中，发酵培养基的pH值为7.9-8.2；300ml的三角瓶的装瓶量为40-80ml；接种量4%-8%；培养温度为28-31℃；培养转速为150r/min-240r/min；发酵时间为24h-60h。 

发酵培养基的pH值为8.2；300ml的三角瓶的装瓶量为60ml；接种量8%；培养温度为31℃；培养转速为150r/min；发酵时间为48h。 

所述牛肉汁液体种子培养基按如下方法配制：将酵母粉0.5g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、加入容器定容至1L。 

上述的发酵培养方法在培养作物青枯病生防枯草芽孢杆菌株SH7中的应用。 

上述的发酵培养方法直接培养的生防枯草芽孢杆菌SH7。 

本发明发明人通过对该菌培养基配方和培养条件的优化选择以及正交试验，确定最适宜SH7菌株生长的培养基配方及培养条件如下：0.9%牛肉膏+2%蛋白胨+2%葡萄糖+1.1%NaCl；发酵起始pH值为8.2、300ml的三角瓶装瓶量为60ml、接种量为8%、温度为31℃、转速为150r/min，发酵时间为48h。 

众所周知，烟草业在国民经济中的占有重要地位，目前青枯病的化学防治和生防都不甚理想，一定程度上制约了我国的烟草生产和出口。本发明发明人所筛选出的芽孢杆菌SH7对烟草青枯病菌表现出了良好的拮抗性，温室药效试验达到了较高的水平，前景广阔。本试验筛选出了适合该菌的发酵配方并优化了发酵条件，为该菌的生产应用打下了良好的基础。 

菌种保藏信息： 

菌种名称：芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 

保藏日期：2006年6月7日 

保藏编号：CGMCC  1732 

附图说明

图1为pH筛选结果； 

图2为装瓶量筛选结果； 

图3为接种量筛选结果； 

图4为温度筛选结果； 

图5为转速结果筛选； 

图6为发酵时间筛选结果； 

图7为5升发酵实验SH生长曲线图； 

图8为50升发酵实验SH生长曲线图； 

图9为发酵液抑制青枯菌的结果。 

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。 

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。 

本发明使用的枯草芽孢杆菌SH7菌株为由本室筛选并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的枯草芽孢杆菌SH7菌株，其保藏编号为：CGMCC  1732。 

实施例1.生防菌株SH7的摇瓶发酵条件的筛选 

1材料与方法 

1.1供试菌株和培养基 

保藏号为CGMCC1732的枯草芽孢杆菌SH7菌株由本室筛选、保存。 

种子培养基:牛肉汁液体培养基（酵母粉0.5g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、pH7.0，定容至1L）。 

待测培养基的配制: 

①号培养基:淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%、豆粕1%； 

②号培养基:淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%、豆粕1%、30.8mg/L的硫酸锰溶液 0.1%； 

③号培养基:牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、葡萄糖1%、氯化钠0.5%； 

④号培养基:牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、葡萄糖1%、氯化钠0.5%、淀粉0.3%、30.8mg/L的硫酸锰溶液0.1%。 

将4种不同培养基pH值均调为7.2—7.3，装液量为60ml/300ml。121℃灭菌20min，备用。 

1.2方法 

1.2.1种子准备牛肉汁液体培养基，pH为7.0，装瓶量为100ml/300ml三角瓶，121℃灭菌20min。将牛肉汁液体培养基接菌后37℃过夜摇菌。 

1.2.2培养基配方筛选上述4种培养基中接种种子菌液1.5ml，在31℃条件下，摇菌36h后取5ml发酵完毕的菌液，在12000r/min下离心5分钟，倒掉上清，冷冻干燥沉淀18h后，称重量。 

1.2.3发酵培养条件优化每次只改变测定的一个发酵条件，其它方法同1.2.2。 

2结果 

2.1培养基配方筛选结果 

从表1可以看出，3次重复中5ml培养液中菌体干重的平均值大小依次为④号（0.0094g）>③号（0.0089g）>①号（0.0059g）>②号（0.0054g），因此④号培养基较适合该菌的发酵。 

表1：培养基配方筛选结果 

2.2发酵培养条件优化 

2.2.1pH值 

将发酵培养基的pH分别调为7.0、7.3、7.6、7.9、8.2，3次重复。在装瓶量为60ml/300ml，接种量为1.5ml，31℃，180/min条件下摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。结果为，pH7.0为0.0081g、pH7.3为0.0061g、pH7.6为0.0079g、pH7.9为0.0082g、pH8.2为0.0092g。pH8.2比较适合该菌的发酵(见图1)。 

2.2.2装瓶量 

将发酵培养基的pH分别调为8.2，接种量为1.5ml，在300ml的三角瓶中分别装入40ml、60ml、80ml、100ml、120ml，3次重复。在31℃、180r/min条件下摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。结果为，40ml的为0.0065g、60ml的为0.0071g、80ml的为0.0065g、100ml 的为0.0053g、120ml的为0.0062g。300ml的三角瓶中装60ml培养基较适合该菌生长（见图2）。 

2.2.3接种量 

将培养基的pH值调为8.2、装瓶量为60ml/300ml三角瓶，接种量分别设为2%、4%、6%、8%、10%，3次重复。在31℃、180r/min条件下摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。结果是，接种量2%的为0.0098g、4%的为0.0108g、6%的为0.0103g、8%的为0.0112g、10%的为0.0096g。较合适的接种量为8%（见图3）。 

2.2.4培养温度 

将培养基的pH值调为8.2、装瓶量为60ml/300ml三角瓶，接种量为8%，将温度分别设为25℃、28℃、31℃、34℃、37℃。在180r/min条件下摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。其结果是，25℃为0.0087g、28℃为0.0107g、31℃为0.0112g、34℃为0.0099g、37℃为0.0106g。较合适的温度为31℃（见图4）。 

2.2.5培养转速 

将培养基的pH值调为8.2、装瓶量为60ml/300ml三角瓶，接种量为8%，温度为31℃。将转速分别设为120r/min、150r/min、180r/min、210r/min、240r/min,摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。其结果是，120r/min为0.0091g、150r/min为0.0109g、180r/min为0.0092g、210r/min为0.0107g、240r/min为0.0101g。150r/min比适合该菌发酵，所以选定150r/min做为较适转速（见图5）。 

2.2.6发酵时间 

将培养基的pH值调为8.2、装瓶量为60ml/300ml三角瓶、接种量为8%、温度为31℃、转速为150r/min，将摇菌时间分别设为12h、24h、36h、48h、60h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。其结果是，12h为0.0038g、24h为0.0062g、36h为0.0063g、48h为0.0067g、60h为0.0063g。发酵时间36h和60h菌体重量相同，但48h菌体重量最大，发酵时间越长对于生产越不经济，所以选取48h为较适发酵时间（见图6）。 

2.3正交试验结果 

为了确定最优的培养基配方，我们将摇瓶试验结果相对较好的④号培养基作为基础培养基（培养基中其它营养成分不变）,从中选出四种主要成分，采用优化好的发酵条件，按正交设计表L₉(3⁴)设计了4个因素、三个水平的正交试验,以进一步优化培养基配比^[7～8]。正交试验设计和结果见表2。由表中R值可看出,影响SH7菌量依次为：牛肉膏>蛋白胨>NaCl>葡萄糖。正交试验结果表明最佳培养基组合为：0.9%牛肉膏+2%蛋白胨+2%葡萄糖+1.1%NaCl。 

表2：正交试验设计及结果 

3结果分析 

本发明通过对该菌培养基配方和培养条件的优化选择以及正交试验，初步确定最适宜SH7菌株生长的培养基配方及培养条件如下：0.9%牛肉膏+2%蛋白胨+2%葡萄糖+1.1%NaCl；发酵起始pH值为8.2、300ml的三角瓶装瓶量为60ml、接种量为8%、温度为31℃、转速为150r/min，发酵时间为48h。这为SH7菌株的发酵罐放大试验提供了理论依据。 

本发明采用渐进法优化发酵条件，每确定一项，就在下一目标筛选中应用，这样使得得到的试验结果更准确。同时也要考虑到实际生产中成本问题，例如某些营养物质含量不能太高或发酵周期不能过长，否则成本就会升高。 

实施例2.5升和50升发酵条件（④号培养基） 

分别用5L以及50L的发酵罐对SH7进行培养，每隔2小时或4小时对其取样一次，通过计其菌体质量及数量对其生长曲线进行描绘，得出SH7菌株的生长曲线。 

1、材料和方法 

在液体培养基中装液量为135ml/500ml，接菌后培养18h。分别配制3.5L和35L液体培养基待用。 

发酵罐准备： 

将发酵罐先进行“空消”（不带液体培养基灭菌）再进行“实消”（带液体培养基灭菌），并加入灭过菌的约5%的消泡剂，以防止泡沫过多导致溢出。 

菌落计数： 

每隔2h取样，涂平板，计算菌落数量。 

发酵液的抑菌效果： 

取样过滤后用于抑青枯菌效果试验，固体牛肉汁培养基溶化后50℃加入青枯菌，倒平板，放上牛金杯，凝固后取出，在孔处加过滤后的菌液100ul，放置到30培养，3天后检查抑菌效果。 

2.发酵产品的抑菌效果 

试验结果见表1和表2及图7和图8。 

5升发酵，发酵36小时菌落数最大，为5.33×10⁶Cell/ml。50升发酵，发酵36小时菌落数最大，为1.23333333×10⁸Cell/ml。发酵液2h后开始有抑菌效果，见图9。 

本发明发明人从土壤中筛选出一株对烟草青枯病有较强防治作用的枯草芽孢杆菌SH7菌株。先前通过实验已经对发酵培养基及发酵条件进行了优化（发酵起始pH值8.2、500ml三角瓶装瓶量为100ml、接种量为8%、温度为31℃、转速为150r/min，发酵时间为48h），本次实验发明人分别用5L以及50L的发酵罐对其进行培养，每隔2小时或4小时对其取样一次，通过计其菌体质量及数量对其生长曲线进行描绘。从而得出SH7菌株的生长曲线。 

表1 5升发酵罐的发酵结果 

表2、50升发酵罐的发酵结果 

3.结果分析 

5升发酵，发酵36小时菌落数最大，为5.33×10⁶Cell/ml。50升发酵，发酵36小时菌落数最大，为1.23333333×10⁸Cell/ml。发酵液2h后开始有抑菌效果，见图9。因此发酵产品均 可以用于防治烟草青枯病。 

实施例3.对比试验1-使用③号培养基和④号培养基并使用本发明发酵培养方法培养枯草芽孢杆菌SH7菌株比较 

1.使用④号培养基培养枯草芽孢杆菌SH7菌株 

1.1.种子准备牛肉汁液体培养基，pH为7.0，装瓶量为100ml/300ml三角瓶，121℃灭菌20min。将牛肉汁液体培养基接菌后37℃过夜摇菌。 

1.2.发酵培养将④号培养基的pH值调为8.0，于该培养基中接种种子菌液1.5ml，接种量为4%、装瓶量为70ml/300ml三角瓶，在30℃条件下，转速设为150r/min摇菌，36h后取5ml发酵完毕的菌液，在12000r/min下离心5分钟，倒掉上清，冷冻干燥沉淀18h后，称重量。 

2.使用③号培养基培养枯草芽孢杆菌SH7菌株 

2.1.种子准备牛肉汁液体培养基，pH为7.0，装瓶量为100ml/300ml三角瓶，121℃灭菌20min。将牛肉汁液体培养基接菌后37℃过夜摇菌。 

2.2发酵培养将③号培养基的pH值调为8.0，于该培养基中接种种子菌液1.5ml，接种量为4%、装瓶量为70ml/300ml三角瓶，在30℃条件下，转速设为150r/min摇菌，36h后取5ml发酵完毕的菌液，在12000r/min下离心5分钟，倒掉上清，冷冻干燥沉淀18h后，称重量。 

3.如上两种方法培养枯草芽孢杆菌SH7菌株的数据比较 

表3使用③号培养基和④号培养基的发酵培养比较 

4.如上两种方法培养枯草芽孢杆菌SH7菌株的数据结果分析 

使用④号培养基发酵培养，SH7菌株发酵液中的菌体含量达到0.011633(g/5ml)，比③号培养基培养枯草芽孢杆菌SH7菌株提高了0.0056(g/5ml)，产量较③号培养基提高了52.15%。对其工艺进行优化，所添加的淀粉及硫酸锰溶液均为常用试剂，可用于规模化生产。为枯草芽孢杆菌SH7微生物农药的创制与产业化提供了重要的技术保障。 

实施例4.1吨发酵罐发酵工艺 

1、优化的发酵罐配方(装液量600L）： 

2、使用④号培养基的发酵条件优化： 

2012年12月10日19:00接种，12月12日7:00停罐，发酵时间36h。含菌量14.6×10⁸cfu/ml。 

有关③号培养基的发酵培养工艺，在研发中发现，③号培养基的发酵培养在1吨发酵罐的发酵工艺中其菌体含量远远低于④号培养基的发酵培养；发酵时间为36h时,含菌量为1.347×10⁸cfu/ml。该菌生长需要大量营养，③配方中无淀粉，而④配方中的成分中含有淀粉，该效果可能是淀粉与其他组分依其之间的特定配比进行组合，从而协同增效使营养大增的结果。 

Claims (9)

1.生防枯草芽孢杆菌株SH7的发酵培养方法，其特征在于，按顺序包括如下步骤：

（1）种子准备：将生防枯草芽孢杆菌SH7菌株接种于牛肉汁液体种子培养基中，灭菌，37℃过夜摇菌得种子菌液，所述牛肉汁液体种子培养基包含酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏；

（2）发酵培养：于发酵培养基中接种步骤（1）的种子菌液，摇菌36h后取发酵完毕的菌液，离心5分钟，倒掉上清液，冷冻干燥后，称重。

2.根据权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于，所述发酵培养基包含牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、淀粉、30.8mg/L的硫酸锰溶液。

3.根据权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于，所述发酵培养基中含有牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、葡萄糖1份、氯化钠0.5份。

4.根据权利要求3所述的发酵培养方法，其特征在于，所述发酵培养基各成分重量份配比为牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、葡萄糖1份、氯化钠0.5份、淀粉0.3份、30.8mg/L的硫酸锰溶液0.1份。

5.根据权利要求1-4任一所述的发酵培养方法，其特征在于，步骤（2）中，发酵培养基的pH值为7.9-8.2；300ml的三角瓶的装瓶量为40-80ml；接种量4%-8%；培养温度为28-31℃；培养转速为150r/min-240r/min；发酵时间为24h-60h。

6.根据权利要求5所述的发酵培养方法，其特征在于，发酵培养基的pH值为8.2；300ml的三角瓶的装瓶量为60ml；接种量8%；培养温度为31℃；培养转速为150r/min；发酵时间为48h。

7.根据权利要求6所述的发酵培养方法，其特征在于，所述牛肉汁液体种子培养基按如下方法配制：将酵母粉0.5g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、加入容器定容至1L。

8.权利要求1-7任一所述的发酵培养方法在培养作物青枯病生防枯草芽孢杆菌株SH7中的应用。

9.由权利要求1-7任一所述的发酵培养方法直接培养的生防枯草芽孢杆菌SH7。

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