CN106978373B - 一株用于细菌病害防治的假单胞菌及应用 - Google Patents

一株用于细菌病害防治的假单胞菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属生物技术领域，提供一株用于细菌病害防治的假单胞菌及应用。从花生基腐病发生土壤中分离一株对植物病原细菌具有抑菌活性的微生物；根据16S rRNA和全基因组序列特征，确定为假单胞属细菌；采用菌液灌根方法可以有效抑制番茄青枯病的发生。本发明涉及的假单胞菌可用于植物病原细菌的绿色生物防治。

Description

一株用于细菌病害防治的假单胞菌及应用
技术领域
本专利属于生物技术领域，涉及从土壤中分离到一株对多种植物病原细菌具有抑菌作用的假单胞菌株，并对番茄青枯菌进行了效果显著的防治应用。
背景技术
在田间自然生态中，农作物面临多种病原物的侵染威胁，创制广谱高效的新型农药是病害控制的一个有效策略。而我国农业生产上病害的综合控制技术有待提高，还有很大的提升空间，主要在于（1）常用的杀菌剂专一性强，往往是“摁下葫芦浮起瓢”，作物流行性的病害隔年交替爆发；（2）喷施以化学农药为主的杀菌剂，造成土壤环境污染严重，长期累积的农药残留已经进入农畜产品，污染了食品，对我们的身体健康造成很大的影响。
土壤环境中的假单胞菌是一种革兰氏阴性植物根围促生细菌，可优先利用根分泌物和根际土壤中的养料，得竞争优势，占居根际生态位，减少病原菌生长所必须的营养物质，从而抑制病原菌生长。假单胞菌还能产生吩嗪、硝吡咯菌素、藤黄绿脓菌素、氢氰酸等抗生素，在植物病害生物防治中发挥重要作用。本发明从花生根围土壤中分离到一株对多种植物病原细菌都有抑菌作用的假单胞菌株，这些病原菌侵染主要粮食作物水稻、重要果树柑橘以及蔬菜番茄，显示所分离的菌株具有广谱的杀菌和抑菌效果，市场应用前景巨大。通过全基因组测序分析，分离的假单胞菌株与已经报道的所有假单胞菌的遗传信息接近，但又存在很大的区别，是一个新的细菌种，具有专利保护价值。
茄科作物青枯病是由青枯劳尔氏细菌引起的一种具有毁灭性的土传病害，该病原菌从寄主植物的根部，入侵木质部导管，通过维管束系统迅速扩张到植物的地上部分，引发植物萎蔫，导致植物死亡。青枯菌的特殊病害循环及侵染途径，造成病害的传播和侵染性极强，在农业生产上缺乏有效的控制手段。化学药剂虽然能在一定程度上抑制病害的发生，但很难对青枯菌形成持续的作用，防治效果不理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一株用于细菌病害防治的假单胞菌及应用。
本发明从花生根围土壤中分离和鉴定了一株对植物病原细菌有抑制作用的假单胞菌株A1，通过全基因组测序确定为一个新的细菌菌株，在植物细菌病害的生态防治中具有极大的应用前景；通过温室盆栽试验，该假单胞菌可有效控制番茄青枯病的为害。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)A1，已于2017年4月14日于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.14027。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
假单胞菌A1在NB和LB固体培养基上划线培养后，没有明显的多糖产生，菌落颜色呈暗褐色。因为在NB固体平板上生长相对较好，颜色稍深。菌株不能使用半乳糖，甘露糖醇或阿多糖醇作为唯一的碳源，但具有利用果聚糖，果糖，肌醇和海藻糖的能力。
本发明的优点在于：本发明的生防菌株可以对青枯菌具有20天以上的持续作用，获得优异的防治效果。同时，运用本生防菌株，更接近田间自然生态，减少化学药剂在土壤中的残留，保证土壤质量，是一个经济有效的绿色防控措施。
附图说明
图1、基于假单胞菌16S rRNA序列的进化树分析。
图2、分离的假单胞菌在平板上的生长及其对碳源的利用。
图3、假单胞菌A1对植物病原细菌的抑制作用。
图4、假单胞菌A1对番茄青枯病的防治效果。
具体实施方式
实施例1
（1）假单胞菌A1的分离和鉴定
从安徽省全椒县的花生种植地采集土壤样品，按3%的接种量接种到富集培养基中, 经30℃ 12 h增殖培养；取上清2mL转接到10mL新鲜的NB培养基中30℃ 24h培养。将富集培养物通过梯度浓度平板涂布，分离获得培养基中的细菌培养物单菌落，其中的一个单菌落即为本发明的假单胞菌株，命名为A1。
设计16S rRNA通用引物（16SF: 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCA-3′; 16SR: 5′-GGTACCTTGTTACGACTT-3′) ，提取分离菌株AH的基因组为模板，扩增菌株的16S rRNA序列。PCR扩增条件为：95 ℃/5 min+(94 ℃/45 sec+52 ℃/30 sec+72 ℃/1min30 sec)×33循环+72℃/10min。PCR产物经测序后与GenBank数据库登录序列比较，确定为假单胞菌。在GenBank数据库中（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行同源性BLAST分析，同源序列均来自假单胞属细菌，可以明确是假单孢属细菌。其中，与恶臭假单胞菌和蒙氏假单胞菌的16S rRNA 有99％的一致性相似性。对亲缘关系较近的19个假单胞菌的16S rRNA基因序列为对象，构建系统发育树揭示这些菌株之间的亲缘关系（图1）。分离的菌与假单胞菌属细菌VLB120，Pseudomonas monteilii和Pseudomonas putida S16分为一组。 相比之下，与三种植物病原菌P. syringae pv. syringae，P. syringae pv. phaseolicola 和P. syringaepv. tomato DC3000的亲缘关系较远。因此，分离菌株是假单孢属细菌，命名为Pseudomonassp. A1。将改菌株送至上海派森诺生物科技股份有限公司进行全基因组测序，从遗传信息和基因结构组成分析，明确为假单孢属的一个细菌。
实施例2
Pseudomonas sp. A1在NB和LB固体培养基上划线培养后，没有明显的多糖产生，菌落颜色呈暗褐色。因为在NB固体平板上生长相对较好，颜色稍深。同时培养的荧光假单胞菌在NB和LB颜色呈灰白色。正是因为所分离菌株的特殊菌落生长颜色，才引起重视（图2A）。在基本培养基MMX中，分离的菌株不能使用半乳糖，甘露糖醇或阿多糖醇作为唯一的碳源，但它具有同化果聚糖，果糖，肌醇和海藻糖的能力（图2 B）。 在含有果糖和果聚糖的MMX培养基上，菌株生长速度最快，可能是利用效率最高的碳源。平行实验中的荧光假单胞菌除了可以利用果聚糖，果糖，肌醇和海藻糖，还可以利用半乳糖，甘露糖醇或阿多糖醇，表明分离的菌株与荧光假单胞菌不完全一样。
实施例3
（1）假单胞菌对几种植物病原细菌的抑菌作用
在丰富培养基中液体培养植物病原细菌：水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzaepv. oryzae）、水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）、柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri）和番茄青枯菌(Ralstonia solanacearum)，将培养的菌液OD600值调整到1.0。在制备平板之前，按1：100比例加到NA培养基中，摇匀后制作成带菌平板。在平板中央加入2微升假单胞菌液（OD600=1.0）；28℃静止培养48小时后，观察抑菌圈大小（图3）。结果显示，A1菌株对4个供试菌株都有明显的抑制作用。
（2）假单胞菌A1对番茄青枯病的防治作用
在5-6 片叶时期番茄植物的根部 1 cm 处用刀造成伤口，在伤根部位灌注4 mL假单胞菌液（OD600=1.0）；在伤根处灌水作为平行对照。2天后在伤根处灌注4 mL 番茄青枯菌菌液（OD600=1.0）。将接种后的番茄苗放入温室内，设定温度28 ℃，光照16 小时，黑暗8小时，用一个塑料袋包住植株，植株顶部将塑料袋开一小口，以保持其湿度；定期浇水，保持土壤湿润。7天后灌水对照组接种番茄青枯菌的植物连续发病，15天后，对照组全部萎焉发病；恶臭假单胞处理的植株生长良好（图4）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一株用于细菌病害防治的假单胞菌及应用
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat catggctca 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggtaccttgt tacgactt 18

Claims (2)

1.一株用于细菌病害防治的假单胞菌，其特征在于：假单胞菌(Pseudomonas sp.)A1，已于2017年4月14日于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.14027。
2.如权利要求1所述的假单胞菌在防治番茄青枯菌上的应用。
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