CN105039220B - 甲基营养型芽孢杆菌ar3、枯草芽孢杆菌ar4、解淀粉芽孢杆菌ar10及应用 - Google Patents
甲基营养型芽孢杆菌ar3、枯草芽孢杆菌ar4、解淀粉芽孢杆菌ar10及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了芽孢杆菌AR4及其制备抗作物青枯病菌剂方面的应用，本发明通过在宣恩县健康烟田中取土样、筛选、分析、培养后得到枯草芽孢杆菌AR4，并通过大量田间实验验证：AR4生防芽孢杆菌单独使用，或与另外两株从宣恩县健康烟田中分离筛选得到的甲基营养型芽孢杆菌AR3以及解淀粉芽孢杆菌AR10混合使用时，防治作物青枯病效果好，针对性强，污染小，制成菌剂后可长期保存，方便于田间应用，进一步丰富了芽孢杆菌生防菌研究领域的成果，对以后相关研究工作具有指导意义。
Description
技术领域
本发明具体涉及三株生防芽孢杆菌，甲基营养型芽孢杆菌AR3、枯草芽孢杆菌AR4、解淀粉芽孢杆菌AR10，以及在制备抗烟草、番茄、辣椒、姜的青枯病菌剂中的应用，属于农业微生物学技术及生物防治技术领域。
背景技术
作物青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的严重危害农业生产的重要病害，是一种制约着农业生产的主要病害，在我国多个省区普遍发生。青枯病是一种维管束疾病，发病时，作物的根、茎、叶均会发病，但主要集中在根、茎部位，其典型症状是发病后叶片枯萎但仍然呈绿色，因此得名青枯病。
近年来，为了防治植物病害，化学药剂的滥用对环境的污染已十分严重。为了解决这一问题，人们开始寻找一种对环境无害且防效良好的新的植物病害防治策略。利用有益微生物来防治植物病害逐渐受到重视，植物病害生防微生物已涉及细菌、真菌、放线菌、病毒等多个种群。
芽孢杆菌(Bacillus spp.)是一种应用较多的生防细菌。关于芽孢杆菌的防病作用机制已经进行了大量的研究，目前普遍认为的生防机制主要有营养和空间位点竞争、分泌抗菌物质、诱导植物产生抗性、溶菌作用等方面，其防病效果是多种机制的综合结果。此外，芽孢杆菌还能激发植物的诱导抗性，从而提高植物的抗病能力。芽孢杆菌也可以在真菌菌丝上吸附并伴随其生长，然后产生溶菌物质最终溶解菌丝并杀死病原真菌。
目前，虽然化学杀菌剂在植物病害防治方面仍占主导地位，但是芽孢杆菌类生防菌剂因其高效、针对性强、无毒无污染等优势逐渐受到重视。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有化学杀菌剂效率低、针对性弱、污染大等缺陷，提供三株生防芽孢杆菌：甲基营养型芽孢杆菌AR3、枯草芽孢杆菌AR4、解淀粉芽孢杆菌AR10，以及其在制备抗作物青枯病菌剂方面的应用。
为实现上述目的，首先本发明提供一种甲基营养型芽孢杆菌，分类命名为甲基营养型芽孢杆菌AR3，Bacillus methylotrophicus AR3，已于2015年4月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2015248。
本发明还提供上述甲基营养型芽孢杆菌在制备抗烟草、番茄、辣椒、姜的青枯病菌剂中的应用。
本发明同时也提供了上述甲基营养型芽孢杆菌的青枯病防治使用方法，具体步骤如下：将甲基营养型芽孢杆菌AR3培养后，获得的发酵液，对植株苗进行茎基部喷淋，单株植株苗所喷淋的发酵液含有的甲基营养型芽孢杆菌AR3数量大于等于109CFU。
第二，本发明提供一种枯草芽孢杆菌，分类命名为枯草芽孢杆菌AR4，Bacillussubtilis AR4，已于2015年4月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2015249。
本发明还提供上述枯草芽孢杆菌在制备抗烟草、番茄、辣椒、姜的青枯病菌剂中的应用。
本发明同时也提供了上述枯草芽孢杆菌的青枯病防治使用方法，具体步骤如下：将枯草芽孢杆菌AR4培养后，获得的发酵液，对植株苗进行茎基部喷淋，单株植株苗所喷淋的发酵液含有的枯草芽孢杆菌AR4数量大于等于109CFU。
第三，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌AR10，Bacillus amyloliquefaciens AR10，已于2015年4月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2015250。
本发明还提供上述解淀粉芽孢杆菌在制备抗烟草、番茄、辣椒、姜的青枯病菌剂中的应用。
本发明同时也提供了上述解淀粉芽孢杆菌的青枯病防治使用方法，具体步骤如下：将解淀粉芽孢杆菌AR10培养后，获得的发酵液，对植株苗进行茎基部喷淋，单株植株苗所喷淋的发酵液含有的解淀粉芽孢杆菌AR10数量大于等于109CFU。
第四，本发明提供一种拮抗菌，该拮抗菌为甲基营养型芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌的混合菌，其中，上述甲基营养型芽孢杆菌的分类命名为甲基营养型芽孢杆菌AR3，Bacillus methylotrophicus AR3，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2015248；上述枯草芽孢杆菌的分类命名为枯草芽孢杆菌AR4，Bacillus subtilis AR4，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2015249；上述解淀粉芽孢杆菌的分类命名为解淀粉芽孢杆菌AR10，Bacillusamyloliquefaciens AR10，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M 2015250，上述三种菌的保藏地址均为中国.武汉.武汉大学。
本发明还提供上述拮抗菌在制备抗烟草、番茄、辣椒、姜的青枯病菌剂中的应用。
本发明同时也提供上述拮抗菌防治青枯病的使用方法，具体步骤如下：将拮抗菌中的甲基营养型芽孢杆菌AR3、枯草芽孢杆菌AR4、解淀粉芽孢杆菌AR10分别培养后，混合发酵产物获得混合发酵液，再对植株苗进行茎基部喷淋，单株植株苗所喷淋的混合发酵液中甲基营养型芽孢杆菌AR3、枯草芽孢杆菌AR4、解淀粉芽孢杆菌AR10三种菌数量之和大于等于109CFU。
本发明的有益效果：提供了三株生防芽孢杆菌：甲基营养型芽孢杆菌AR3、枯草芽孢杆菌AR4、解淀粉芽孢杆菌AR10，以及其在防治作物青枯病方面的应用，本发明通过在宣恩县健康烟田中取土样、筛选、分析、培养后得到三株芽孢杆菌甲基营养型芽孢杆菌AR3、枯草芽孢杆菌AR4、解淀粉芽孢杆菌AR10，并通过大量田间实验验证：上述三种生防芽孢杆菌单独使用、拮抗使用时，防治作物青枯病效果好，针对性强，污染小，制成菌剂后可长期保存，方便于田间应用，进一步丰富了芽孢杆菌生防菌研究领域的成果，对以后相关研究工作具有指导意义。
附图说明
图1为健康烟田土样中筛选的优势菌株照片。
图2为三株生防菌抑菌活性验证结果照片。
图3为三株生防菌16S rRNA PCR产物凝胶电泳结果图。
图4示范区对烟草青枯病防控效果示意图。
具体实施方式
本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术，所用试剂如未特别说明，均来源于商业化渠道。
实施例1制备三种芽孢杆菌AR3、AR4、AR10
1.细菌的筛选
从宣恩县健康烟田中取土样，带回实验室进行分析。称取5克土样放于含15-20个小玻璃珠已灭菌的150mL三角瓶中，加入45mL无菌水后将三角瓶摇振20min，静置30min所得上清液即为10-1稀释梯度的土壤浸液。再用1mL灭菌移液枪吸取10-1稀释液1mL移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液，取100μl浓度为10-2～10-4的土壤浸液，用涂布棒分别均匀地涂于平板上，放置20min后将培养皿翻转，37℃下培养24h。挑选最适于挑取单菌落的平板，其所对应的稀释梯度即为最适稀释梯度。挑取平板上的单菌落保存，分离的细菌见图1(做了多组平行实验，图中3号、4号、9号、10号、12号、16号、18号是最终从健康烟田土样中筛选的优势菌株)。
2.青枯菌拮抗细菌的筛选
将之前土壤浸液涂布平板获得的单菌落接种在LB液体培养基中摇瓶培养72h，将获得的发酵液于12000r/min离心5min收集上清，然后过滤除菌。将青枯雷尔氏菌涂布在PDA平板上，用灭菌的打孔器在培养基上打孔(直径5mm)，然后将过滤除菌后的发酵液分别注入圆孔中，每个孔注入50μl，以无菌水为对照，然后用灭菌的滤纸片盖住圆孔。将平板放入37℃培养箱中培养48h，观察是否有抑菌圈的产生。
3.细菌鉴定
将保存的抑菌圈最明显的三株细菌培养好，取1mL培养好的细菌菌液，12000r/min离心5min，去上清以后收集菌体，加入400μl去离子水煮沸10min，12000r/min离心5min，取上清做模板，PCR体系总体积50μl：模板DNA:2μl，正反引物各2μl，2×Easy Taq PCR superMix 25μl，ddH2O 19μl，进行PCR扩增。反应在Thermo-Hybaid PCR仪上进行，程序为94℃变性3min，94℃变性45s，59℃复性45s，72℃延伸45s进行30个循环，72℃延伸10min。取3μlPCR产物在0.8％琼脂糖凝胶80V电泳，260nm紫外灯下观察并照相。将所得的PCR产物片段送上海生工公司进行测序，所得序列片段登陆NCBI网站进行检索。
实施例2三株生防菌活性验证
将保存的三株菌株挑取单菌落到5mL LB培养基中，于37℃，180rpm/min摇床培养72h，分别取1mL发酵液于1.5mL离心管中，12000r/min离心5min，收集上清液，用注射器吸取上清液用过滤器过滤除菌。准备PDA平板，将培养24h的青枯雷尔氏菌取100μl用涂布器均匀地涂布在PDA平板上，然后用灭菌的打孔器在平板上打孔(直径5mm)。将过滤除菌后的发酵液取50μl注入圆孔，等量无菌水作对照，最后用灭菌的滤纸片将圆孔盖上。将平板放到37℃培养箱中培养48h，观察记录抑菌结果，如图2(1：AR3抑菌活性验证结果；2：AR4抑菌活性验证结果；3：AR10抑菌活性验证结果)。
实施例3生防菌的鉴定
将保存的三株菌株挑取单菌落到5mL LB培养基中，37℃，180rpm/min摇床培养5-6h，取出1mL培养好的菌液于1.5mL离心管中，12000r/min离心5min，弃上清收集菌体，向离心管中加入去离子水400μl，沸水煮10min，12000r/min离心5min，取上清做模板。
PCR体系总体积50μl：模板DNA 2μl，正反引物各2μl，2×Easy Taq PCR super Mix25μl，ddH2O 19μl。
以准备好的上清做模板，进行PCR扩增。反应在Thermo-Hybaid PCR仪上进行，程序为94℃变性3min，94℃变性45s，59℃复性45s，72℃延伸45s进行30个循环，72℃延伸10min。反应结束后取3μlPCR产物在0.8％琼脂糖凝胶80V电泳，260nm紫外灯下观察并照相，结果如图3(M：DL2000Marker；1、2：ddH2O；3、4：AR316SrRNA PCR产物；5、6：AR416SrRNA PCR产物；7、8：AR1016SrRNA PCR产物)。将所得的PCR产物片段送上海生工公司进行测序，结果见序列表，再将所得片段序列登陆NCBI网站进行检索。
试验例
试验例1
2013年在宣恩县晓关镇古路村幺棚开展田间试验。该试验地历年种植烟草，青枯病发生严重，土壤属黄棕壤，肥力中等，地势平坦，光照条件较好，海拔900m左右。供试品种为云烟87。将三株生防芽孢杆菌分别挑取到NA培养基中37℃，180rpm/min摇床培养72h，获得发酵液。对烟草苗进行茎基部喷淋，每棵烟草苗使用50mL发酵液。
试验共设置7个处理，即：处理1：0.1亿cfu/g多粘类芽孢杆菌细粒剂1250g/667m2(浙江省桐庐汇丰生物化工有限公司)；处理2：AR3发酵液稀释50倍；处理3：AR4发酵液稀释50倍；处理4：AR10发酵液稀释50倍；处理5：农用链霉素与大蒜素1:1比例200倍；处理6：农用链霉素200倍(河北三农农用化工有限公司)；处理7：CK(灌清水)；以上处理在烟苗移栽时、移栽后30天和60天进行根部灌淋。
在移栽后50、70和90天，调查各处理青枯病的发病情况，并计算发病率、病情指数、相对防效。结果见表1。
表1. 2013年田间试验烟草青枯病发病率及生防菌的防效结果
烟草青枯病及其他病害的调查标准均参照中华人民共和国国家标准GB/T 3222—2008。
烟草青枯病病情分级标准(以株为单位)：
0级：全株无病；
1级：茎部偶有褪绿斑，或病侧二分之一以下叶片凋萎；
3级：茎部有黑色条斑，但不超过二分之一，或病侧二分之一至三分之二叶片凋萎；
5级：茎部黑色条斑超过二分之一，但未到达茎顶部，或病侧三分之二以上叶片凋萎；
7级：茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部凋萎：
9级：病株基本枯死。
试验例2
2014年在宣恩县晓关镇古路村幺棚开展田间试验。该试验地历年种植烟草，青枯病发生严重，土壤属黄棕壤，肥力中等，地势平坦，有灌溉条件，光照条件较好，海拔900m左右。供试品种为云烟87。将三株生防芽孢杆菌分别挑取到NA培养基中37℃，180rpm/min摇床培养72h，获得发酵液。三株芽孢杆菌发酵液等体积混匀，对烟草苗进行茎基部喷淋，每棵烟草苗使用50mL发酵液。市售20％噻菌铜悬浮剂茎基部喷淋为对照组。
试验共设置4个处理：处理1：0.1亿cfu/g多粘类芽孢杆菌细粒剂1250g/667m2；处理2：AR3+AR4+AR10发酵液混匀后稀释50倍；处理3：20％噻菌铜悬浮剂(浙江龙湾化工有限公司)100g/亩；处理4：C K(灌清水)。
在移栽后60、90和120天调查各处理青枯病的发病情况，并计算发病率、病情指数、相对防效。结果见表2。
表2. 2014年田间试验三株芽孢杆菌混合施用对烟草青枯病的防效
试验例3
2014年在恩施州示范3000亩，其中宣恩椒园2000亩，恩施市城郊基地单元1000亩，将有益菌AR3、AR4、AR10混合后稀释成50倍菌液，在移栽后30天和60天进行根部灌淋。试验共设置4个处理：处理1：0.1亿cfu/g多粘类芽孢杆菌细粒剂1250g/667m2；处理2：AR3+AR4+AR10发酵液混匀后稀释50倍；处理3：20％噻菌铜悬浮剂(浙江龙湾化工有限公司)100g/亩；处理4：C K(灌清水)。发病高峰期调查各处理青枯病的发病情况，并计算发病率、病情指数、相对防效，统计烟叶经济性状。结果见图4，表3、4。
表3.不同药剂处理对烟叶经济性状的影响
表4.主要烟叶经济性状及收购情况比较
Claims (4)
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AR4，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M 2015249。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备抗烟草、番茄、辣椒、姜的青枯病菌剂中的应用。
3.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的青枯病防治的使用方法，其特征在于，将枯草芽孢杆菌AR4培养后，获得的发酵液，对植株苗进行茎基部喷淋，单株植株苗所喷淋的发酵液含有的枯草芽孢杆菌AR4数量大于等于109CFU/ml。
4.一种拮抗菌剂，其特征在于：所述拮抗菌剂为枯草芽孢杆菌与甲基营养型芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌的混合菌，其中，所述枯草芽孢杆菌的分类命名为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)AR4，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2015249；所述甲基营养型芽孢杆菌的分类命名为甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)AR3，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M 2015248；所述解淀粉芽孢杆菌的分类命名为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)AR10，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M 2015250。
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