CN105543140B - 一株大叶黄杨内生细菌甲基营养型芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株大叶黄杨内生菌甲基营养型芽孢杆菌HYEB5‑6，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC No：M2015728，保藏日期：2015年12月8日。本发明的甲基营养型芽孢杆菌HYEB5‑6，为大叶黄杨内生菌，能够延迟大叶黄杨炭疽菌分生孢子的萌发，抑制芽管的伸长，抑制分生孢子的萌发，诱导菌丝产生膨大体，致菌丝畸形；接种试验结果表明，喷洒HYEB5‑6菌体后显著抑制了大叶黄杨炭疽病的感病指数和缩小大叶黄杨炭疽病的病斑；HYEB5‑6菌株在平板上对大叶黄杨炭疽菌、交链孢菌、金黄壳囊孢菌、希金斯刺盘孢菌、稻瘟病菌、丝核菌、七叶树壳梭孢菌和腐皮镰刀菌均具有一定的拮抗效果。

Description

一株大叶黄杨内生细菌甲基营养型芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物农药领域，尤其涉及一株大叶黄杨内生细菌甲基营养型芽孢杆菌及其应用。

背景技术

植物炭疽病是一类地域分布广泛的世界性病害。从单子叶植物到双子叶植物、从裸子植物到被子植物均有炭疽病危害的报道。该病侵染植物叶片、茎干、果实等，造成巨大的经济损失。炭疽菌的无性阶段隶属于真菌界(Eumycota)，半知菌亚门(Deuteromycotina)，腔孢纲(Coelomycetes)，黑盘孢目(Melanconiales)，炭疽菌属(Colletotrichum Corda)；有性态属于真菌界(Eumycota)，子囊菌门(Ascomycota)，核菌纲(Pyrenomyetes)，球壳菌目(Sphaeriales)，小丛壳属(Glomerella)。植物炭疽病菌以菌丝体和分生孢子盘随病残体或者在土壤中越冬，成为病害的初侵染源，当温湿度条件适宜时，分生孢子萌发产生菌丝并侵染植物。炭疽病菌在寄主植物上形成分生胞子盘，产生的分生孢子通过风雨溅散传播进行再侵染。炭疽病严重影响农林作物和园林观赏植物的产量与品质，危害严重时甚至引起植物死亡。

大叶黄杨(Euonymus japonicus Thunb.)是一种在我国广泛分布的常绿树种，常常作为园林园艺观赏植物栽植于道路两旁、公园、校园、私人庭院等场所。大叶黄杨常受到各种病虫害的侵害，其中炭疽病是一类在大叶黄杨上发生普遍、危害严重的一种真菌病害。该病主要发生于大叶黄杨的叶片和枝梢上，感病植株叶部的病斑常呈褐色，近圆形或不规则形，微具同心轮纹；枝梢部的病斑呈椭圆形或不规则形的溃疡斑，病斑扩展后，枝梢头部弯曲下垂枯死，后期病斑上产生小粒黑点即病菌分生胞子盘。在高温多湿条件下，分生孢子盘会产生胶粘状粉红色分生孢子堆。

大叶黄杨炭疽病原菌的分生孢子在病枝、病叶或土壤中越冬，翌年借风雨传播并侵染新叶，病菌孢子主要通过风雨、昆虫等传播，还通过栽培管理活动或带病苗木远距离传播。该病可从伤口侵入或者自然孔口，也可直接侵入。

目前大叶黄杨炭疽病的防治主要还依赖于化学防治，该防治方法容易导致病菌的抗药性和环境污染等问题。植物内生菌是一类与寄主植物长期协同进化而形成的一类共生微生物，在促进植物生长、提高植物抗逆性等方面发挥重要作用，内生菌作为微生物农药也具有潜在的应用前景。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株大叶黄杨内生细菌甲基营养型芽孢杆菌，满足使用需求。本发明的另一目的是提供上述大叶黄杨内生细菌甲基营养型芽孢杆菌的应用。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一株大叶黄杨内生菌甲基营养型芽孢杆菌，其分类命名为(Bacillusmethylotrophicus)HYEB5-6，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO：M2015728，保藏日期：2015年12月8日，保藏地址为湖北武汉武汉大学。

所述的大叶黄杨内生菌甲基营养型芽孢杆菌HYEB5-6在抑制大叶黄杨炭疽菌生长中的应用。

所述的大叶黄杨内生菌甲基营养型芽孢杆菌HYEB5-6培养物在防治大叶黄杨炭疽病中的应用。

所述的大叶黄杨内生菌芽孢杆菌HYEB5-6在拮抗大叶黄杨炭疽菌、交链孢菌、金黄壳囊孢菌、希金斯刺盘孢菌、稻瘟病菌、丝核菌、七叶树壳梭孢菌和腐皮镰刀菌中的应用。

大叶黄杨内生细菌芽孢杆菌HYEB5-6，是一株从大叶黄杨(Euonymus japonicusThunb.)一年生幼嫩的枝条中筛选获得的对大叶黄杨炭疽菌(C.gloeosporioides)生长繁殖有抑制作用的内生细菌菌株。该大叶黄杨内生细菌芽孢杆菌HYEB5-6的生物学特性如下：

菌株在NA培养基上的菌落形态表现为圆形、扁平、乳白色、表面褶皱；菌体杆状、长1.5-2μm；具椭圆形芽孢，且芽孢中生；革兰氏染色呈阳性；有周生鞭毛；吲哚乙酸试验和产H₂S试验呈阴性，甲基红、明胶水解、淀粉水解及V.P试验均呈阳性。HYEB5-6菌株形态学及生理生化特征与芽孢杆菌属具有明显的相似性。

HYEB5-6菌株的16SrDNA序列(SEQ ID NO.1)与eztaxon数据库中模式菌种的16SrDNA序列进行比对，并采用MEGA6.0软件构建HYEB5-6与高相似性菌株的系统发育树。从系统发育树可以看出，HYEB5-6菌株与其他7株枯草芽孢杆菌同属于枯草芽孢杆菌复合种这一分支，其中与甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)的亲缘关系最接近(图1)。结合该菌的生物学习性与生理生化特性，将HYEB5-6鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：

1)甲基营养型芽孢杆菌HYEB5-6为植物内生细菌，与其他从土壤、植株表面分离的拮抗菌相比，能更好地稳定存在于大叶黄杨体内，抑菌作用具有更好的持续性，该菌对大叶黄杨炭疽菌(C.gloeosporioides)的生长和致病性均具有显著的抑制作用。

2)甲基营养型芽孢杆菌HYEB5-6对其他植物病原真菌，如交链孢菌(Alternariasp.)、金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperm)、希金斯刺盘孢菌(Colletotrichumhigginsianum)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、丝核菌(Rhizoctonia sp.)、七叶树壳梭孢(Fusicoccum aesculi)和腐皮镰刀菌属(Fusarium solani)等均具有明显的抑菌作用。

3)该菌株对大叶黄杨炭疽病菌等多种植物病原菌具有明显的拮抗作用，为进一步开发以该菌株为核心的植物病害生防菌剂提供了基础。

附图说明

图1是HYEB5-616S rDNA系统进化树图；

图2是HYEB5-6对大叶黄杨炭疽病菌菌丝生长的影响结果图；

图3是HYEB5-6对几种植物病原真菌生长的抑制作用结果图；图中，1-7分别为链格孢菌，金黄色壳囊孢菌，希金斯刺盘孢菌，稻瘟病菌，丝核菌，七叶树壳梭孢菌，腐皮镰刀菌；

图4是HYEB5-6的代谢产物对大叶黄杨炭疽病菌分生孢子萌发及芽管菌丝生长的影响结果图；图中，A.HYEB5-6代谢产物对分生孢子萌发的影响，B.HYEB5-6代谢产物对分生孢子萌发产生的菌丝芽管的影响，C.HYEB5-6代谢产物处理后芽管菌丝膨大球的直径；

图5是HYEB5-6的代谢产物对大叶黄杨炭疽病菌附着孢形成及附着膨压的影响结果图；图中，A.HYEB5-6代谢产物对大叶黄杨炭疽病菌附着孢形成的影响，B.HYEB5-6代谢产物处理对附着孢膨压的影响。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：HYEB5-6对大叶黄杨炭疽病菌菌丝生长的影响

在PDA平板中央接种大叶黄杨炭疽病菌菌块，同时在与菌饼左右各20mm的位置划线接纯化后的HYEB5-6，对照平板只接病原真菌菌饼，试验重复3次。将接种后的平板置于28℃培养箱中培养3d，测定HYEB5-6对大叶黄杨炭疽病菌的抑菌作用。结果如图2，HYEB5-6表现出对大叶黄杨炭疽病菌菌丝生长明显的抑制作用。

实施例2：HYEB5-6对几种植物病原菌菌丝生长的抑制作用

在PDA平板中央接种病原菌菌块，同时在与菌饼相距30mm的4个角处分别点接纯化后的HYEB5-6，对照平板只接病原真菌菌饼，试验重复3次。将接种后的平板置于28℃培养箱中培养3～5d，测定HYEB5-6对其他7种病原菌的抑菌作用。结果如图3，从图中可以看出，HYEB5-6对7种病原菌均具有明显的抑制作用。

实施例3：HYEB5-6的代谢产物对大叶黄杨炭疽病菌分生孢子的萌发与芽管菌丝生长的影响

将活化的HYEB5-6单菌落接种至100mL液体NA培养基中，28℃250rmp震荡培养12h。离心后收集上清液，上清液经0.22μm过滤器过滤除菌获得含有HYEB5-6代谢产物的无菌滤液，将该无菌滤液用灭菌水稀释5倍备用。将大叶黄杨炭疽病菌HYCG2-3接种至新鲜的PDA平板上，至28℃培养5天，从菌落得边沿切下直径为5mm的菌丝块接种至100mL CMC液体培养基，28℃，250rmp震荡培养3天。收集大叶黄杨炭疽病菌的分生孢子并调整浓度至10⁶个/mL。将以上无菌滤液与等体积的浓度为10⁶的大叶黄杨炭疽病菌的孢子液混合后，取20μL混合液至干净的载玻片上，并将载玻片至于培养皿中，在该培养皿中放置潮湿的滤纸进行保湿处理，将以上培养皿封口后置于28℃恒温培养箱，并以空白的NA培养基为阴性对照。以上处理于2h、4h和8h后在显微镜下分别统计分生孢子的萌发率。同时于2h、4h、8h、12h和24h测定孢子萌发产生的芽管菌丝长度。

与阴性对照相比，HYEB5-6的代谢产物处理分生孢子2h后，显著抑制了大叶黄杨炭疽病菌分生孢子的萌发；而处理4h和8h后，HYEB5-6的代谢产物处理与阴性对照没有显著差异(图4A)。以上结果表明，HYEB5-6的代谢产物显著延迟了大叶黄杨炭疽病菌分生孢子的早期萌发。

对分生孢子萌发产生的芽管菌丝长度的测量结果表明，HYEB5-6的代谢产物显著抑制了大叶黄杨炭疽病菌芽管菌丝的伸长(图4B)。且经HYEB5-6培养滤液处理后，在大叶黄杨的芽管菌丝上形成了大量的菌丝膨大体，致菌丝畸形，且菌丝膨大球的直径随着代谢物处理的时间延长而增大(图4C)。

实施例4：HYEB5-6的代谢产物对大叶黄杨炭疽病菌附着孢形成的影响

按照实施例3中的方法制备大叶黄杨炭疽病菌的分生孢子液和HYEB5-6代谢产物的无菌滤液。将浓度为10⁵个孢子/mL的孢子液与HYEB5-6代谢产物的无菌滤液等体积混合后，取20μL混合液至疏水玻片上诱导附着孢的形成，将以上玻片置于干净的培养皿并封口后放置于28℃恒温培养箱中，24h后取出玻片统计附着孢的形成率。

附着孢维持一定的膨压有利于炭疽病菌的侵染钉等结构穿透寄主的表皮，并成功侵染寄主。在一定浓度的PEG处理下附着孢的塌陷率是反映附着孢膨压的有效方法。本实施例将以上孢子悬浮液与HYEB5-6的无菌滤液的混合液置于疏水玻片上，28℃恒温培养处理24h后，采用滤纸吸干疏水玻片上的液滴，同时添加20μl 3M的PEG，10min后测定附着孢的塌陷率。以上实验均以不接种HYEB5-6的空白NA培养基为对照。

附着孢形成率测定结果表明，HYEB5-6的代谢产物能显著抑制了大叶黄杨炭疽病菌附着孢的形成(图5A)。此外，HYEB5-6的代谢产物处理后大叶黄杨炭疽病菌附着孢的塌陷率显著增加(图5B)。以上结果表明，HYEB5-6的代谢产物对大叶黄杨炭疽病菌的侵染结构具有显著的破坏作用。

实施例5：HYEB5-6对离体条件下大叶黄杨炭疽病菌致病力的影响

按照实施例3中的方法制备大叶黄杨炭疽病菌的分生孢子液，调整孢子浓度至10⁷个孢子/mL，并向孢子液中添加0.75％的明胶备用。按照实施例3中的方法接种单菌落至50mL的液体NA培养基中，震荡培养12h后离心收集菌体，并用灭菌蒸馏水洗涤菌体3次，最后用5mL灭菌蒸馏水悬浮菌体备用。

从野外摘取无病的1年生嫩叶，用水清洗叶片表面灰尘后用75％酒精棉擦拭叶片，进行表面除菌，晾干。再将以上制备好的HYEB5-6的菌体悬浮液喷雾至叶片表面，并将叶片放入培养皿中，培养皿封口后置于25℃培养箱中进行12h光照/12h黑暗交替处理。3d后，将处理的叶片进行表面创伤接种5μL的以上制备的大叶黄杨炭疽病菌分生孢子悬浮液，并放入培养箱培养中进行12h光照/12h黑暗交替处理，7天后测量病斑直径并计算病情指数。以上实验以不接种HYEB5-6的空白NA液体培养基为对照。

实验结果表明，经HYEB5-6处理后，离体的大叶黄杨叶片上的病斑直径显著缩小，病情指数也显著下降(表1)。

表1 HYEB5-6对离体条件下大叶黄杨炭疽病的防治效果

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一株大叶黄杨内生细菌甲基营养型芽孢杆菌及其应用

<130> 100

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1515

<212> DNA

<213> Bacillus methylotrophicus HYEB5-6

<400> 1

agagtttgat cgtggctcag agacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgag 60

cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta 120

acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga tggttgtttg 180

aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg gacccgcggc 240

gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga 300

gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag 360

ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt 420

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tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 540

ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc 600

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accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga 780

gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg 840

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taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaca atcctggaga 1020

taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc 1080

gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc 1140

agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa 1200

atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggacaga acaaagggca 1260

gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc 1320

aactcgactg cgtggagctg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata 1380

cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc 1440

ggtgaggtaa ccttttagga gccagccgcc gaaggtggga cagatgattg gggtgaagtc 1500

gtaacaaggt aacca 1515

Claims (4)

1.一株大叶黄杨内生菌甲基营养型芽孢杆菌，其分类命名为（Bacillus methylotrophicus）HYEB5-6，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO：M2015728，保藏日期：2015年12月8日，保藏地址为湖北武汉武汉大学。

2.权利要求1所述的大叶黄杨内生菌甲基营养型芽孢杆菌HYEB5-6在抑制大叶黄杨炭疽菌生长中的应用。

3.权利要求1所述的大叶黄杨内生菌甲基营养型芽孢杆菌HYEB5-6培养物在防治大叶黄杨炭疽病中的应用。

4.权利要求1所述的大叶黄杨内生菌芽孢杆菌HYEB5-6在拮抗大叶黄杨炭疽菌、交链孢菌、金黄壳囊孢菌、希金斯刺盘孢菌、稻瘟病菌、丝核菌、七叶树壳梭孢菌和腐皮镰刀菌中的应用。