CN103320368B - 一种菌根辅助细菌芽孢杆菌及其在促进杨树生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种菌根辅助细菌芽孢杆菌及其在促进杨树生长中的应用，该菌根辅助细菌的分类命名为芽孢杆菌（ Bacillus sp.）MY-DZ18，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC NO：M2013125，保藏日期：2013年4月6日，保藏地址：中国武汉武汉大学。本发明的芽孢杆菌MY-DZ18为植物根际促生细菌，能够促进两种外生菌根真菌彩色豆马勃与劣味乳菇菌丝的生长；盆栽试验结果表明，MY-DZ18菌株分别与两种外生菌根真菌双接种显著提高了杨树根系的菌根形成率，促进了杨树的生长；MY-DZ18菌株对杨树溃疡病菌拟茎点霉、金黄壳囊孢以及苗木猝倒病原菌尖孢镰刀菌均具有拮抗效果。

Description

一种菌根辅助细菌芽孢杆菌及其在促进杨树生长中的应用

技术领域

本发明属于微生物肥料领域，尤其涉及一种外生菌根辅助细菌芽孢杆菌及其在促进杨树生长中的应用。

背景技术

杨树(Populus)主要分布于北半球，特别是亚洲和北美居多，是这些地区造林绿化的主要树种。杨树种类繁多、生长迅速，能在短期内解决木材短缺问题，在林业生产上占有十分重要的地位。但由于杨树对养分消耗量大，易造成土壤肥力下降，施肥成为杨树生产必不可少的技术措施。然而，随着化肥使用量的增加，环境污染、林地生产力下降，土壤生物多样性降低等负面影响日益明显。因此，探寻肥源，特别是生物肥源，以代替化肥的研究备受关注。

植物根际促生细菌(Plant growth promoting rhizospherebacteria；PGPR)是一类存在于植物根际的有益微生物。它主要通过溶解矿物质，分泌植物激素以及抑制病原微生物来发挥作用。一些研究表明，PGPR与菌根真菌共同接种能够对植物的生长产生显著的促进作用。Azospirillumbrasilense与丛枝菌根真菌(AMF)Gigaspora margarita或Glomus fasciculatum共接种通过促进磷元素摄取过程显著促进了珍珠粟(Pennisetum americanum)的根生物量和茎生物量。Gamalero(2004)研究发现，当两株PGPR菌株Pseudomonas fluorescens 92、P.fluorescens P190r与菌根真菌G.mossaeae BEG12共接种时，番茄的生长得到显著的促进。很多PGPR能够产生嗜铁素，由于嗜铁素的作用，一方面使植物能够吸收更多的铁元素，另一方面使存在于根围的病原菌由于得不到足够的铁不能进行正常的生长和定殖，从而起到一定的生物防治作用。鉴于PGPR促进植物矿物质吸收、促进植物生长代谢甚至抑制有害微生物的多重作用，PGPR作为微生物肥料用于多种气候及土壤条件下的农林作物将具有巨大的潜力。

菌根辅助细菌作为一类特殊的PGPR在植物根围发挥着重要的作用。Bowen和Theodorou(1979)第一次报道某些细菌可以参与植物的菌根形成过程。随后的一系列研究证实了某些细菌能够促进植物外生菌根(ECM)和丛枝菌根的形成。这一类细菌被命名为菌根辅助细菌(mycorrhiza helper bacteria；MHB)。MHB同样具有促进植物营养吸收、生长以及拮抗病原微生物的作用。Barea等研究发现根际细菌促进丛枝菌根真菌的形成以及难溶性磷酸岩的溶解。Vivas(2003)等发现一株MHB短小芽孢杆菌Brevibacillus能够促进红车轴草菌根及根瘤的形成，提高了茎生物量及N、P元素的积累并减少了植物体中Pb的含量。

近几年的研究报道中，研究菌根辅助细菌促进植物生长的能力被认为是一项科学的、生态的和经济的内容。因此，将MHB作为一种新型微生物肥料(如施用PGPR菌剂或MHB-EMF混合菌剂)进行开发，使土壤中无效营养有效化、预防和控制植物病害、减少农药和化肥的使用，是一种环境友好、经济有效的改善林地地力衰退、提高农林作物产量的良好途径。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种外生菌根辅助细菌芽孢杆菌，促进杨树形成菌根并促进杨树生长。本发明的另一目的是提供上述外生菌根辅助细菌芽孢杆菌的应用。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一株外生菌根辅助细菌芽孢杆菌，其分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)MY-DZ18，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC NO：M 2013125，保藏日期：2013年4月6日，保藏地址：中国武汉武汉大学。

上述外生菌根辅助细菌芽孢杆菌MY-DZ18，是一株从杨树根际土壤中筛选获得的对杨树与彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)(简称Pt2)、劣味乳菇(L.insulsus)(简称Li)形成菌根及杨树生长具有促进作用的MHB菌株。该菌株的生物学特性为：菌株在TSA培养基上的菌落形态表现为圆形、扁平、乳白色、表面褶皱；100倍光学显微镜下菌体长杆状、长1.5-2um，常成短链；具椭圆形芽孢，且芽孢中生；革兰氏染色呈阳性；无鞭毛；吲哚乙酸、甲基红、明胶水解、淀粉水解、过氧化氢、产H₂S试验以及V.P试验均呈阳性。MY-DZ18菌株形态学及生理生化特征与芽孢杆菌表现出很大的相似性。

MY-DZ18菌株的16SrDNA序列与eztaxon数据库中模式菌种的16SrDNA序列进行比对，获得相似度较高的12株菌株序列，将目的序列和获得序列通过Bioeditd软件进行多重序列比对，再经mega4.0软件构建出MY-DZ18菌株的系统发育树。从系统发育树可以看出，MY-DZ18菌株与蕈状芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides聚类在同一分支上，亲缘关系最接近。经查阅文献，蕈状芽孢杆菌模式菌种吲哚乙酸试验和产H₂S试验均呈阴性，而MY-DZ18菌株的吲哚乙酸试验和产H₂S试验均呈阳性，二者生理生化特征不符，所以排除MY-DZ18菌株是蕈状芽孢杆菌的可能性。基于上述试验结果，确定MY-DZ18菌株是芽孢杆菌属Bacillus sp.的一种。目前16SrDNA基因序列已提交GenBank，序列号为KC476443。详细序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的外生菌根辅助细菌芽孢杆菌在促进彩色豆马勃及劣味乳菇生长中的应用。对彩色豆马勃及劣味乳菇具有促生作用，且其与两种外生菌根真菌互作对杨树的促生长作用显著高于各接种处理。

所述的外生菌根辅助细菌芽孢杆菌在促进杨树生长中的应用。

所述的外生菌根辅助细菌芽孢杆菌在拮抗杨树溃疡病菌拟茎点霉(Phomopsis macrospore)、金黄壳囊孢(Cytospora chrysosperma)及苗木猝倒病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporium)中的应用。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：

(1)外生菌根辅助细菌芽孢杆菌MY-DZ18为植物根际促生细菌，对杨树的生长具有促进作用，能够促进外生菌根真菌彩色豆马勃及劣味乳菇的生长，其与两种外生菌根真菌双接种对杨树的促生效果优于两者单接种处理。

(2)外生菌根辅助细菌芽孢杆菌MY-DZ18对对三种杨树溃疡病病原菌拟茎点霉、金黄壳囊孢以及一种苗木猝倒病病原菌尖孢镰刀菌具有抑菌作用。

附图说明

图1是芽孢杆菌MY-DZ18菌体对彩色豆马勃及劣味乳菇菌丝生长的影响对比图；图中，(A，a)是P.tinctorius接种MY-DZ18；(B，b)是单接种P.tinctorius；(C，c)是L.insulsus接种MY-DZ18；(D，d)是单接种L.insulsus；

图2是芽孢杆菌MY-DZ18与彩色豆马勃(Pt2)及劣味乳菇(Li)双接种对杨树的促生长作用结果图；

图3是芽孢杆菌MY-DZ18与四种病原菌对峙培养结果图；图中，A为拟茎点霉；B为金黄壳囊孢；C为镰刀菌；

图4是芽孢杆菌MY-DZ18胞外代谢物与四种病原菌对峙培养结果图；图中，A为拟茎点霉；B为金黄壳囊孢；C为镰刀菌。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1芽孢杆菌MY-DZ18对彩色豆马勃(Pt2)及劣味乳菇(Li)的促生作用

将土样中分离得到的供试细菌MY-DZ18活化后，用接种环取少量接种于装有50mL TSA液体培养基的三角瓶中，于28℃、160r/min条件下振荡培养72h。4℃、5000r/min离心5min，将离心后的上清液倒掉，获得细菌菌体。用生理盐水润洗菌体两次，最后用生理盐水制成细菌悬浮液，即为细菌接种体。

(1)芽孢杆菌MY-DZ18菌悬液对彩色豆马勃及劣味乳菇的促生测定。

采用干皿对抗法进行试验。将彩色豆马勃与劣味乳菇培养于MMN培养基上，待菌根真菌在MMN平板上生长至旺盛期时，从菌落边缘取下菌块(直径4mm；厚度4mm)倒置于空的灭菌培养皿中，在菌块上滴加25μL供试细菌接种体。将培养皿置于25℃培养箱中黑暗条件下培养。两周后，借助体式显微镜(放大倍数×40)观测真菌菌丝生长状况。测算两个垂直方向上菌丝生长的平均值。每个真菌/细菌组合设三皿，每皿放置三个菌块，对照组为在菌根真菌菌块上滴加等量生理盐水。试验结果表明(表1，图1)，MY-DZ18菌株对彩色豆马勃及劣味乳菇菌丝的生长均有促进作用，与对照相比，菌丝增长率分别为282％与164％。

表1 MY-DZ18菌株菌体对两种外生菌根真菌生长的影响

注：CK(Pt2)：单接种彩色豆马勃(Pt2)；Pt2+MY-DZ18：彩色豆马勃(Pt2)与MY-DZ18互作；CK(Li)：单接种劣味乳菇(Li)；劣味乳菇(Li)与MY-DZ18互作。

(2)芽孢杆菌MY-DZ18胞外代谢产物对彩色豆马勃与劣味乳菇生物量的影响。

通过将MY-DZ18菌株胞外代谢产物分别与彩色豆马勃与劣味乳菇共培养，称量菌丝干重的方法来研究胞外代谢产物对菌根菌丝生长量的影响。具体方法如下：每50mL MMN液体培养基中加入3个供试外生菌根真菌菌饼(直径4mm，厚度4mm)，同时加入2mL细菌胞外代谢物，25℃、160r/min培养两周，定性滤纸过滤，60℃烘箱中烘至恒重后称重。以加入2mL稀释后的TSB培养液代替MY-DZ18细菌胞外代谢物作为对照，每处理3个重复。MY-DZ18菌株胞外代谢物与两株外生菌根真菌液体共培养结果(表2)显示：MY-DZ18菌株的胞外代谢物对彩色豆马勃和劣味乳菇菌丝的生物量有显著提高作用，与对照相比分别增长了77.9％和31.5％。

表2 DZ18菌株胞外代谢物对两种外生菌根真菌生长的影响

注：CK(Pt2)：单接种彩色豆马勃；Pt2+MY-DZ18：彩色豆马勃与MY-DZ18互作；CK(Li)：单接种劣味乳菇；Li+DZ18：劣味乳菇(Li)与MY-DZ18互作。

实施例2芽孢杆菌MY-DZ18与彩色豆马勃、劣味乳菇互作对杨树的促生作用。

供试植株采用杨树实生苗。杨树种子于2011年6月采自江苏泗阳，母树品种为美洲黑杨Populus deltoides。将土壤基质高温湿热法灭菌后装盆，杨树种子采用1‰浓度高锰酸钾表面消毒后播入盆中，每盆3～4粒种子。待杨树苗长至一定高度，选取长势最好的一株保留，其余剔除。自然条件下培养，保持浇水量、光照、通风、温度等条件相同。

芽孢杆菌MY-DZ18菌体悬浊液的制备：将各菌株活化后，用接种环取少量接种于装有50mLNB培养基的100mL三角瓶中，28℃，160r·min^-1振荡培养48h发酵液即作为接种菌剂，备用。

彩色豆马勃、劣味乳菇液体菌剂的制备：在装有灭菌的MMN液体培养基的500mL三角瓶中接入10-15个真菌菌块，25℃条件下150r·min^-1震荡培养，待瓶中长满菌丝球，用搅拌器将菌丝球绞碎，作为真菌液体菌剂。

彩色豆马勃、劣味乳菇与芽孢杆菌DZ18双接种的盆栽试验：挑选生长状况良好且一致的一年生杨树实生苗接种外生菌根真菌和MHB潜力菌株。将细菌接种液浓度调整至约10⁸cfu/g，接种量为10mL/株，真菌液体菌剂接种量为15mL/株。采用打孔接菌的方法。以只接种MHB潜力菌株、只接种外生菌根真菌和只接种培养基3种处理作为对照，每处理5个重复。置于25℃温室培养，光照为12h/d，适时浇水，统一管理。待盆栽接种四个月后测量苗高、地径，根生物量、茎生物量以及光合作用等生长指标。

试验结果表明(表3；图2)，单接种MY-DZ18菌株、单接种彩色豆马勃、劣味乳菇菌株，双接种MY-DZ18+Pt2、MY-DZ18+Li都对杨树的生长起到了较明显的促进作用。单独接种彩色豆马勃或劣味乳菇时，杨树苗高、地茎及生物量与CK相比显著提高，苗高增长率分别为9.5％和7.1％；而当两种外生菌根菌分别与DZ18菌株双接种时，与CK相比苗高增长率分别达到22.7％和23.7％，对杨树的促生作用更加显著。同时，单独接种MY-DZ18菌株与单独接种两种外生菌根真菌相比，单独接种MY-DZ18菌株时杨树的生长效果更好。

表3 MY-DZ18菌株与彩色豆马勃、劣味乳菇双接种对杨树生长的影响

注：CK：不接菌处理；Li：单接种劣味乳菇；Pt2：单接种彩色豆马勃；DZ18：单接种MY-DZ18菌株；Li+DZ18：劣味乳菇与MY-DZ18互作；Pt2+DZ18：彩色豆马勃与MY-DZ18互作。

实施例3芽孢杆菌MY-DZ18对三种植物病原真菌的平板抑菌作用

在ZPD平板中央接种病原菌菌饼，同时在与菌饼相距25mm的4个角处分别点接纯化后的MHB菌株MY-DZ18，对照平板只接病原真菌菌饼，试验重复3次。将做好的平板置于25℃培养箱中培养3～5d，观察该菌株对三种病原菌有无拮抗作用。结果如图3，从图中可以看出，MY-DZ18菌株对三种病原菌均具有一定的抑制作用。

实施例4芽孢杆菌MY-DZ18胞外代谢物对三种病原真菌的平板抑制效果

MHB菌株经震荡培养24h所得的无菌滤液1、3、5mL与25mL ZPD混合倒平板，制得无菌滤液浓度1:25、3:25、1:5的ZPD培养基，接种病原菌菌丝块，25℃恒温培养4天，平板抑制效果如表4、图4所示。总体而言，MY-DZ18菌株的无菌滤液对尖孢镰刀菌Fusarium oxysporium、拟茎点霉Phomopsis macrospore、金黄壳囊孢Cytospora chrysosperma具有一定的抑制效果，且随着无菌滤液浓度的增大抑制效果更加明显，胞外代谢产物浓度为1:5时对病原菌的抑制效果均最为明显。其中，MY-DZ18菌株胞外代谢产物对拟茎点霉Phomopsis macrospore的抑制效果最好达66.1％；其次对金黄壳囊孢Cytospora chrysosperma，抑制效果为58.20％。

表4 MY-DZ18菌株的胞外代谢物对病原菌的拮抗效果

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京林业大学

 

<120>  一种菌根辅助细菌芽孢杆菌及其在促进杨树生长中的应用

 

<130>  100

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1450

<212>  DNA

<213>  Bacillus sp.

 

<400>  1

ccgtgggtca aacctctagc ggctggctcc aaaaggttac ccaccgactt cgggtgttac     60

 

aaactctcgt ggtgtgacgg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg    120

 

ctgatccgcg attactagcg attccagctt catgtaggcg agttgcagcc tacaatccga    180

 

actgagaacg gttttatgag attagctcca cctcgcggtc ttgcagctct ttgtaccgtc    240

 

cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac    300

 

cttcctccgg tttgtcaccg gcagtcacct tagagtgccc aacttaatga tggcaactaa    360

 

gatcaagggt tgcgctcgtt gcgggactaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca    420

 

accatgcacc acctgtcact ctgcccccga aggggaagcc ctatctctag ggttgtcaga    480

 

ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg    540

 

cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag tttcagcctt gcggccgtac tccccaggcg    600

 

gagtgcttaa tgcgttaact tcagcactaa agggcggaaa ccctctaaca cttagcactc    660

 

atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcgc    720

 

ctcagtgtca gttacagacc agaaagtcgc cttcgccact ggtgttcctc catatctcta    780

 

cgcatttcac cgctacacat ggaattccac tttcctcttc tgcactcaag tctcccagtt    840

 

tccaatgacc ctccacggtt gagccgtggg ctttcacatc agacttagaa accacctgcg    900

 

cgcgctttac gcccaataat tccggataac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct    960

 

ggcacgtagt tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca aggtgccagc ttattcaact   1020

 

agcacttgtt cttccctaac aacagagttt tacgacccga aagccttcat cactcacgcg   1080

 

gcgttgctcc gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg   1140

 

agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc   1200

 

gtcgccttgg tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gacgcgggtc catccataag   1260

 

tgacagccga agccgccttt caatttcgca ccatgaggtg caaaatatta tccggtatta   1320

 

gccccggttt cccggagtta tcccagtctt atgggcaggt tacccacgtg ttactcaccc   1380

 

gtccgccgct aacttcataa gagcaagctc ttaatccgtt cgctcgactt gcattacagc   1440

 

agccttccag                                                          1450 

 

Claims (4)

1.一株外生菌根辅助细菌芽孢杆菌，其分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)MY-DZ18，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC NO：M 2013125，保藏日期：2013年4月6日，保藏地址：中国武汉武汉大学。 

2.权利要求1所述的外生菌根辅助细菌芽孢杆菌在促进彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)及劣味乳菇(Lactarius insulsus)生长中的应用。 

3.权利要求1所述的外生菌根辅助细菌芽孢杆菌在促进杨树生长中的应用。 

4.权利要求1所述的外生菌根辅助细菌芽孢杆菌在拮抗杨树溃疡病菌拟茎点霉(Phomopsis sp.)、金黄壳囊孢(Cytospora chrysosperma)及苗木猝倒病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)中的作用。