KR101627829B1 - 식선충 진균의 분아포자를 함유하는 소나무 재선충 방제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소나무 재선충에 대한 식선충 진균을 이용한 소나무 재선충 방제용 조성물과 상기 조성물을 이용한 소나무 재선충 방제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 소나무 재선충에 대한 식선충 효능을 갖는 에스테야 베르미콜라(E. vermicola)의 분아포자를 함유하는 것을 특징으로 하는 소나무 재선충 방제용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 소나무 재선충 방제 방법에 관한 것이다.

Description

식선충 진균의 분아포자를 함유하는 소나무 재선충 방제용 조성물{Composition for Anti-Pine Wood Nematodes Comprising Blastospore of Nematophagous Fungi}

본 발명은 소나무 재선충에 대한 식선충 진균을 이용한 소나무 재선충 방제용 조성물과, 상기 조성물을 이용한 소나무 재선충 방제 방법에 관한 것이다.

소나무 재선충은 매개충인 솔수염하늘소에 의해 전파되는 식물기생선충으로서 현재 적합한 방제약이 없고 매개충에 대한 천적도 없어 한번 감염되면 감염 1년 만에 99.9%의 소나무를 고사시킨다. 소나무 재선충병은 1905년 일본에서 최초로 발견되었으나 1972년에야 원인해충이 소나무 재선충으로 판명되어 현재는 일본전역의 소나무림 대부분이 고사된 상태로 알려졌다. 이후, 국제교역의 증대로 아시아 전역을 비롯하여 세계로 확산되고 있다. 중국에서는 1982년 남경지역에서의 발병 확인된 이후 점차 확산되고 있으며, 대만에서는 1985년에 발병되어 고유의 유구송이 거의 전멸되는 피해를 입은 것으로 알려졌다. 우리나라에서는 1988년 부산 금정산에서 처음 보고되어 10여년 만에 경북지역까지 확산되었다. 소나무재선충병의 박멸 및 확산방지를 위하여 산림청에서는 매년 막대한 예산과 인력을 투입하고 있으나 해마다 피해지역과 고사목의 수는 증가하고 있는 상황이다.

소나무 재선충은 분류학적으로 참선충목의 잎선충과 소나무 재선충속에 속하고, 전세계적으로 49종(Proc. Helminthol. Soc. Wahs. 55(1), pp 1-11, 1988년)이 보고되어 있으며, 우리나라에는 현재 Bursaphelenchus xylophilus와 Bursaphelenchus mucronatus 2종만이 알려져 있다. 이 중 B. mucronatus은 소나무 내에 기생하기는 하지만 고사시키지는 않으므로 실질적으로는 B. xylophilus만이 소나무 재선충병의 원인이 된다.

재선충은 1 ㎜ 이하의 크기를 가지며, 25℃에서 1세대 경과 소요 일수는 4~5일에 불과하다. 1쌍이 20일 후면 20만 마리로 증식하여, 기주식물의 가도관을 막아 수분상승을 차단하고, 독소인 셀룰라아제(Cellulase)를 분비하여 조직을 파괴시켜 기주식물을 고사케 한다. 소나무 속의 재선충은 솔수염하늘소의 유충을 통해 번데기를 거쳐 솔수염하늘소 몸속으로 이동하여 다른 소나무로 전염된다. 이렇게 솔수염하늘소는 자력이동 능력이 없는 재선충을 기주식물에 옮겨주고, 재선충은 소나무를 고사하게 하여 솔수염하늘소의 산란처를 제공해 주는 특수한 공생관계에 있다.

거의 30년간 소나무재선충병의 방제를 위하여 매개충인 솔수염하늘소를 주 타겟으로 많은 연구를 수행하였으나 생물학적 접근을 이용한 소나무재선충에 직접적인 저해제 개발은 매우 미흡한 수준이다.

대한민국 등록특허 제10-0464059호는 고사한 흑송으로부터 소나무 재선충을 복원하던 중 식선충성 진균인 에스테야 베르미콜라를 분리하였음을 보고하였다. 이후 상기 등록특허에 기재된 ACTC 74485를 비롯하여 CBS 100821, CBS 115803 및 CNU 120806 4가지 변종의 에스테야 베르미콜라가 알려졌다. 에스테야 베르미콜라는 고체배지 또는 생체 내에서 두 가지 형태의 분생포자를 형성한다. 이 중 초승달 모양(lunate)의 분생포자는 오목한 쪽에 있는 점착성 점액을 이용하여 소나무 선충의 몸체 전체에 걸쳐 무작위로 부착한다. 이후 18-24시간이 경과하면, 분생포자가 발아하여 선충의 표피를 뚫고 침투하여 피하감염구(感染球 infection bulb)를 만들어내고, 이곳에서 두 개 내지 세 개의 영양균사가 만들어진다. 감염균사가 대량으로 분지를 형성하여 장기와 조직을 파괴하면 선충은 사멸하게 된다. 보통 감염이 있은 지 8-10일 이내에, 거의 100%의 선충 집단이 사라진다. 반면 막대모양의 분생포자는 점착성을 나타내지 않으며, 선충에 대한 감염 효능도 없는 것으로 알려져 있다. 에스테야 베르미콜라를 액체배지에서 배양하면 분아포자가 형성되는데, 선충의 생체 내에서는 발견되지 않고 액체 배양의 경우에만 관찰되어 그 자체로는 선충을 감염시키지 않는다.

이에 선충 감염 효능이 높은 초승달 모양의 분생포자가 많이 형성되는 조건에서 에스테야 베르미콜라를 배양하여 소나무 재선충에 대한 생물방제제로 사용하려는 시도가 있어왔다. 그러나 시험관에서는 100%의 살선충 효능을 나타냈음에도 불구하고 선충에 감염된 소나무에 처리하는 경우에는 시험관에 비해 방제 효과가 낮았다. 초승달 모양의 분생포자는 8.2-11.1×3.5-3.7㎛ 크기로 물에 혼합되지 않고 그 자체의 이동성이 없기 때문에 수관을 따른 이동이 제한되기 때문으로 사료된다. 이에 본 발명자들은 이러한 문제를 해소하기 위하여 에스테야 베르미콜라에 감염된 선충을 사용하여 초승달 모양의 에스테야 베르미콜라 분생포자에 이동성을 부여하는 것에 의해 소나무 재선충의 방제 효능이 증가하는 것을 확인하였다. 상기 내용은 등록특허 제10-1033270호로 등록된 바 있다.

대한민국 등록특허 제10-0464059호 대한민국 등록특허 제10-1033270호

본 발명은 종래기술에서는 살선충 효능이 없는 것으로 알려진 에스테야 베르미콜라의 분아포자를 이용한 소나무 재선충 방제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 사용하여 소나무 재선충을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 소나무 재선충에 대한 식선충 효능을 갖는 에스테야 베르미콜라(E. vermicola)의 분아포자를 함유하는 것을 특징으로 하는 소나무 재선충 방제용 조성물애 관한 것이다. 에스테야 베르미콜라는 대한민국 공개특허 제2000-56182호에 기재된 ACTC 74485를 비롯하여 CBS 100821, CBS 115803 및 CNU 120806 4가지 변종만이 알려져 있으나 이에 한정되는 것이 아니라 에스테야 베르미콜라의 특징적 특성을 갖는 모든 진균 및 공지의 방법에 의해 이미 알려진 균주로부터 유도된 변종을 모두 포함하는 것은 당연하다. 이제까지 에스테야 베르미콜라는 초승달 형태의 분생포자만이 식선충 효능을 갖기 때문에, 분아포자를 방제에 사용하기 위해서는 영양분이 부족한 고체배지에서 계대배양하여 발아에 의해 초승달 모양의 분생포자를 형성시켜야하는 것으로 알려져 왔다. 본 발명의 분아포자는 그 자체로 소나무 재선충 방제가 가능할 뿐 아니라 초승달 모양의 분생포자에 비해서도 효과가 탁월함을 확인하였다.

에스테야 베르미콜라는 고체배지나 생체 내에서는 초승달 모양 또는 막대모양의 분생포자가 형성되며, 액체배지에서는 분아포자가 형성된다. 특히 분아포자는 에스테야 베르미콜라를 PDB(Potato Dextrose Broth) 배지에서 배양하는 경우 형성이 효과적이었다. 상기 PDB 배지가 소나무 분말이나 밀기울을 추가로 함유하는 경우에도 분아포자의 형성이 더욱 효과적이었다.

상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제 등과 혼합된 형태로 사용될 수 있다. 초승달 모양의 분생포자의 경우에는 초승달 모양의 분생포자의 경우에는 물에 대한 용해도가 좋지 않다. 따라서 조성물의 제조 시 유화제, 안정화제와 같은 첨가제를 필수적으로 포함하여야 하지만, 분아포자는 물에 대한 용해도가 높기 때문에 별도의 첨가제가 없이 배양액 그 자체 또는 배양액의 상등액 자체를 조성물로 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 소나무 재선충 방제용 조성물을 이용한 소나무 재선충 방제 방법에 관한 것이다. 소나무 재선충은 수관에 기생하므로 나무의 가지나 잎에 뿌려주는 것 보다는 분아포자가 수관으로 이동하여 재선충에 직접적으로 작용할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 조성물을 나무 주면의 토양에 뿌려주어 뿌리를 통해 수관으로 이동하도록 할 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 조성물을 수관 주사에 의해 직접 수관으로 주입하는 것이다. 초승달 모양의 분생포자의 경우에는 물에 대한 용해도가 좋지 않아 물과 혼합하였을 때 물의 위에 뜨는 경향이 있다. 따라서 상기 조성물을 토양에 뿌려주거나 수관주사로 주입하는 경우 분생포자의 이동이 제한된다. 분아포자의 경우에는 분생포자에 비해 크기가 작고 물에 대한 용해도 또한 우수하기 때문에 수관을 통한 이동이 더 용이할 것으로 사료된다. 이에 수관이 막혀 완전히 고사된 상태가 아니라면 수관을 따른 이동이 가능하고 이에 따른 재선충의 퇴치가 가능하다.

본 발명의 조성물의 유효성분의 투여량은 소나무의 수령, 크기, 주변 환경, 감염의 정도 등을 고려하여 적절히 선택될 수 있을 것이나, 직경 15cm인 소나무를 기준으로 분아포자 10⁸~10¹⁰개를 주입하는 것이 바람직하다. 직경이 큰 소나무나 감염 정도가 심한 소나무에 대해서는 더 많은 약이 투여되어야 함은 당연하다. 또한, 현재 소나무 재선충병에 감염된 소나무의 치료 뿐 아니라 소나무 재선충병의 예방적 차원에서도 사용될 수 있음 역시 당연하다. 예방의 목적으로 사용하는 경우에는, 보다 짧은 시간에 넓은 면적 또는 많은 수량의 소나무에 대해 방제가 가능하도록 토양에 살포하는 것이 좋다.

이상과 같이 본 발명의 소나무 재선충 방제용 조성물은 에스테야 베르미콜라를 단순히 액체 배양하는 것에 의해 분아포자를 대량으로 생산하는 것이 가능하고, 생성된 분아포자의 물에 대한 용해도가 높기 때문에 조성물을 보다 경제적으로 대량생산에 의해 손쉽게 제조할 수 있다.

또한 본 발명의 조성물을 사용하여 소나무 재선충을 방제하는 경우 종래에 식선충 효능이 알려진 초승달 모양의 분생포자나 분생포자에 의해 감염된 선충에 비해서도 탁월한 치료 효과를 나타내어 소나무 재선충의 효율적인 방제에 이용될 수 있다.

도 1은 에스테야 베르미콜라의 분아포자 및 분생포자의 형태를 보여주는 현미경 사진.
도 2는 본 발명의 일실시예에 의한 온실 내 방제 시험 사진.
도 3은 본 발명의 일실시예에 의한 온실 내 방제 시험의 결과를 보여주는 그래프.
도 4는 소나무 재선충 감염 수목에 대한 방제 시험의 사진.
도 5는 에스테야 베르미콜라의 초승달 모양의 분생포자에 의한 재선충의 사멸과정을 보여주는 사진.
도 6은 에스테야 베르미콜라의 분아포자에 의한 재선충의 감염상태를 보여주는 사진.

이하 첨부된 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.

실시예

실시예 1 : 에스테야 베르미콜라 분아세포의 배양

E. vermicola의 CNU 120806은 충남대학교 농업생명과학대학 미생물공학실로부터 분주 받아 26℃ PDB(Potato Dextrose Broth) 배지 또는 PDB 배지에 0.5w%의 소나무 분말과 밀기울을 각각 첨가한 배지에서 7일간 배양하였다. 7일 후 Haemocytometer에 의해 배양액의 상등액 속 포자 농도의 측정 결과, 상등액의 포자의 농도는 10⁸~10⁹개/㎖ 였다. 하기 실험에서는 상기 배양액의 상등액을 분아포자 용액으로 사용하였다.

도 1의 a는 배양액의 현미경 사진(×100)으로, b는 초승달 모양(lunate)의 분생포자(×400), c는 막대 모양(bacilloid)의 분생포자(×400)와는 다른 형태의 분아포자(blastopore)를 보여준다.

실시예 2 : 분아세포에 의한 소나무 재선충병의 방제 시험

1) 소나무 재선충의 분리

소나무재선충(B. xylophilus)은 소나무재선충 감염지역에서 샘플링한 고사목으로부터 바에르만(Baermann) 깔대기법을 이용하여 분리하였다. 보다 구체적으로, 전정가위를 이용하여 목편 시료를 사방 1cm 크기로 잘게 자르고 고무튜브를 연결한 깔대기 위에 시료를 놓은 후 물을 가득 채웠다. 24시간 후 고무튜브 밑에 모인 소나무재선충을 확인하고 집게를 걸어 튜브를 분리하였다.

분리된 현탁액을 현미경(올림푸스 BX41)으로 관찰하여 소나무재선충의 수를 세어 농도를 환산한 결과 약 20,000마리/㎖임을 확인하였다.

2) 온실 내 방제 시험

온실 내에서 소나무 재선충의 방제실험을 하기 위하여 도 2와 같이 5년생 적송을 20목씩 네 개의 군으로 나누었다. 각 군의 적송 지상 약 5cm 높이 위치의 표피를 벗겨내고 내피에 탈지면을 넣었다. ICL군과 ITL군에는 B. xylophilus 약 100마리가 포함되도 희석된 현탁액 100㎕를, ICM과 ITM군에는 B. xylophilus 약 1000마리가 포함되도록 희석된 현탁액 100㎕를 파이펫을 이용하여 탈지면에 흡수시켰다. 이 후 증발을 방지하기 위하여 sealing film으로 표피부분을 감아주었다.

B. xylophilus의 감염 2주 후 ITL과 ITM군에만 실시예 1에서 배양한 에스테야 베르미콜라 분아포자의 배양 상등액을 사용하여 B. xylophilus의 감염과 동일한 방법에 의해 약 10⁷개의 분아포자를 주입하였다. 이후 각 실험군에서 감염 소나무 속 재선충의 수를 시간 경과에 따라 측정하였다. 즉, B. xylophilus의 감염 10일, 25일 및 60일 후 각 실험군의 적송으로부터 10g의 시료를 채취하여 전정가위로 사방 1cm의 크기가 되도록 잘게 잘랐다. 각 시료를 고무튜브를 연결한 깔대기 위에 놓고 물을 가득 채워 24시간 경과 후 고무튜브 밑에 현탁액을 수집하였다. 현미경(올림푸스 BX41)으로 수집된 현탁액 중 소나무재선충의 수를 세어 농도를 환산하고, 그 결과를 도 3에 도시하였다.

도 3으로부터 감염 선충의 수가 적은 경우(즉, ICL 및 ITL)에는 별도의 방제를 하지 않은 대조군인 ICL에서도 60일 후에는 소나무 재선충이 검출되지 않아 감염된 소나무 재선충에 대해 소나무의 자가면역이 작동함을 확인할 수 있었다. 감염 선충의 수가 증가하면(ICM 및 ITM), 자가면역만으로는 소나무 재선충병이 치료되지 않아 기간이 경과할수록 시료 속 B. xylophilus의 수가 증가하였다. 이에 반해 에스테야 베르미콜라의 분아포자를 처리한 군에서는 60일 이후에는 B. xylophilus이 전혀 검출되지 않아 소나무 재선충 병에 대한 방제효과가 매우 탁월함을 확인할 수 있었다.

이는 실험방법의 차이가 있긴 하지만 본 발명자이 등록특허 10-1033270호에서 보고한 초승달 모양의 분생포자와 포자 감염 선충을 사용하여 실험한 방제효과에 비해서도 매우 현저한 효과이다. 이와 같은 효과의 차이는 물에 잘 섞이지 않는 에스테야 베르미콜라의 초승달 모양의 분생포자나, 분생포자에 감염된 선충은 수관을 따른 이동이 제한적이지만, 크기가 매우 작고 물에 대한 용해도가 높은 분아포자는 수관을 통한 이동이 용이하기 때문인 것으로 사료된다.

3) 소나무 재선충 감염 수목에 대한 방제 시험

소나무 재선충병 감염되어 벌목 위기에 처한 제주시 애월읍 월산리에 소재의 소나무 15그루를 대상으로 방제 시험을 실시하였다.

먼저, 지상에서 약 50cm 높이에서 감염 소나무에 대해 드릴을 이용하여 천공하고 실시예 1의 1)에서 준비한 분아포자 용액 100㎖(포자농도 10⁷~10⁹개/㎖)를 수관주사에 의해 주입하였다.

도 5의 왼쪽은 2014년 11월 에스테야 베르미콜라의 분아포자를 처리하기 직전의 사진이며, 오른쪽은 분아포자 처리 약 4개월 후의 사진이다. 사진에서 2014년 11월 이미 고사한 상태의 나뭇가지를 다시 소생시킬 수 없었으나, 누렇게 시들었던 가지는 다시 푸르게 변한 것을 확인할 수 있다(붉은 원 표시 부분). 이는 분아포자가 수관을 따라 이동하기 때문에 가도관이 이미 막힌 고사한 나뭇가지에서는 효과를 발휘할 수 없었으나, 수관을 통하여 이동이 가능한 경우에는 선충에 도달하여 사멸시킨 것으로 사료된다. 따라서, 에스테야 베르미콜라 분아포자를 함휴하는 조성물을 사용하면 재선충에 의해 고사된 나뭇가지가 일부 존재하더라도 수백년된 소나무 전체를 벌목하지 않고 완전 고사된 부분만을 제거하는 것에 의해 재선충병을 치료할 수 있다.

4) 분생포자와 분아포자에 의한 소나무 재선충의 사멸 비교

에스테야 베르미콜라의 초승달 모양(lunate)의 분생포자가 점착성 점액을 이용하여 소나무 재선충의 몸체 전체에 걸쳐 부착한 후, 선충의 표피를 뚫고 발아하여 만든 감염균사가 선충의 장기와 조직을 파괴하여 사멸시키는 것은 전술한 바와 같다. 도 5는 초승달 모양의 분생포자에 의한 선충의 감염 및 사멸과정을 보여주는 현미경 사진이다.

도 5는 상기 3)의 소나무 방제 실험에서 분아포자를 주입하고 10일이 경과한 후, 시들은 나뭇가지 시료에서 관찰된 재선충의 현미경 사진이다. 초승달 모양의 분생포자가 소나무 재선충의 몸체 전쳐에 부착한 것에 반해 분아포자는 선충의 입 부분(과 꼬리 부분)에만 선택적으로 집중되어 있는 것을 보여준다. 분아포자에 의한 선충의 감염이 진행되면, 선충은 머리 및 꼬리 부분이 분해되어 결국 사멸하게 된다(도 5의 오른쪽 위 사진 참조). 이는 분생포자가 감염균사에 의해 선충의 장기와 조직을 파괴하여 사멸시키는 것과 비교되며, 분아포자는 초승달 모양의 분아포자와는 전혀 다른 방법으로 선충을 사멸시킴을 나타낸다.

Claims (7)

1. 에스테야 베르미콜라(E. vermicola)의 분아포자를 포함하며, 상기 분아포자의 소나무 재선충에 대한 살선충 효능에 의하여 소나무 재선충의 방제 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 소나무 재선충 방제용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 분아포자는 에스테야 베르미콜라를 PDB(Potato Dextrose Broth) 배지에서 배양하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 소나무 재선충 방제용 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 배지는 소나무 분말과 밀기울을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 소나무 재선충 방제용 조성물.
   
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 의한 소나무 재선충 방제용 조성물을 사용하는 것을 특징으로 하는 소나무 재선충 방제 방법.
   
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 조성물을 나무 주변의 토양에 뿌려주는 것을 특징으로 하는 소나무 재선충 방제 방법.
   
6. 제 4 항에 있어서,
   상기 조성물을 수관 주사에 의해 주입하는 것을 특징으로 하는 소나무 재선충 방제 방법.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   직경 15cm인 소나무를 기준으로 소나무 1본 당 주입되는 분아포자의 농도가 10⁸~10¹⁰개가 되도록 처리하는 것을 특징으로 하는 소나무 재선충 방제 방법.
   

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