CN111107746B

CN111107746B - 包含阿拉酸式苯-s-甲基作为有效成分的松材线虫病防治用组合物及利用其的松材线虫防治方法

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Publication number: CN111107746B
Application number: CN201880060344.8A
Authority: CN
Inventors: 金镇铁; 朴涯兰; 全熙元; 郑世仁; 徐荣秀; 金男圭; 金俊宪; 高尚贤; 李承奎
Original assignee: University Industry Cooperation Foundation of Pusan National University; Industry Foundation of Chonnam National University
Current assignee: University Industry Cooperation Foundation of Pusan National University; Industry Foundation of Chonnam National University
Priority date: 2017-09-19
Filing date: 2018-09-17
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2038-09-17
Also published as: KR20190031929A; EP3685668A2; WO2019059599A2; EP3685668A4; WO2019059599A3; CN111107746A; KR102004213B1

Abstract

本发明涉及包含阿拉酸式苯‑S‑甲基作为有效成分的松材线虫病防治用组合物及利用其的松材线虫防治方法，在体外确认了本发明的阿拉酸式苯‑S‑甲基的防治效果起因于诱导抗性。通常，由于诱导抗性以少量有效并作为在植物体内表达基因的机制显示药效，因此对人体无害且不诱发环境污染。因此，能够开发松材线虫病的环保药剂，能够提高开发利用其的新概念松材线虫病防治剂的可能性。并且，在将现有的为了防治松材线虫病而使用的杀线虫制剂的树干注入方法转换为诱导抗性制剂的土壤浇灌或叶面喷洒方法的情况下，具有能够以低廉费用进行有效防治并扩大松材线虫病防治剂的喷洒适用范围的优点。

Description

包含阿拉酸式苯-S-甲基作为有效成分的松材线虫病防治用组合物及利用其的松材线虫防治方法

技术领域

本发明涉及包含阿拉酸式苯-S-甲基(Acibenzolar-S-methyl)或其农药学上可接受的盐作为有效成分的松材线虫病防治用组合物及利用其的松材线虫防治方法。

背景技术

因松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起的松材线虫病对全球松树诱发严重的灾害，近年来，随着气候变化引起的森林生态系统环境变化，呈现复杂状态并迅速扩散。已知松材线虫病的主要原因是松材线虫，其作为通过寄主、病原体、媒介虫及环境因素之间的复杂的相互作用枯死松树的难以防治的森林病害虫，一旦被感染，就无法治疗，几乎所有松树都会枯死。并且，众所周知，松材线虫病不仅侵害松属(Pinus)，也侵害冷杉属(Abiea)、云杉属(Picea)及落叶松属(Larix)的一部分树种等。据报道，在韩国的情况下，庆尚道、全罗道及江陵地区主要在松树发病，相反，在江源道西部地区及京畿道主要在红松发病。

为了防治这种松材线虫病而提出了多种方法，但是通过树干注入的防治方法几乎是作为预防方法的唯一方法。但是，在树干注入的情况下，目前广泛使用的阿维菌素及埃玛菌素药效持续时间短，仅为两年，注入时期也有限，日本的绿色卫士因价格高而在广泛应用中受限。在树干注入的情况下，不仅存在药剂价格问题，还存在难以预防大范围地区的问题，在高山地带的松树林的情况下，因难以接近而不能成为有效的方法。而且，黑田(Kuroda)及剱持(Kenmochi)(2016年，松树病大会(Pine Wilt Disease Conference)- 国际林业研究组织联盟(IUFRO))警告为了防治松材线虫病而反复树干注入杀线虫剂反而是杀死未感染的松树的原因。

因此，开发通过土壤浇灌等来有效防治大范围地区的药剂为非常紧急的情况。在松树的情况下，小坂(Kosaka)等人(2001年，第二十一届国际林业研究组织联盟世界大会(XXI IUFRO World Congress))及竹内(Takeuchi) 等人(2006年，线虫学期刊(Nematology)，8：435-442)发现：若将非病原性线虫接种到松树后再接种材线虫，则出现发病延迟的诱导抗性现象。这种结果表明在向松树诱导抗性的情况下，可在一定程度上预防松材线虫病。近年来，根据平尾(Hirao)等人(2012年：生物群系中心植物生物学(BMC PlantBiology)，12：13)证实，通过比较对松材线虫的易感品种及抗性品种的表达基因来确认了PR-9、PR-10及细胞壁相关基因(例如，富含羟脯氨酸的糖蛋白前体和伸展蛋白(e.g.forhydroxyproline-rich glycoprotein precursor and extensin))等在抗性品种中大幅上调，在松树的情况下，也具有与一般作物相同的抗性机制。

WO2015/141867号及WO2009/081851号描述了将阿拉酸式苯-S-甲基作为杀菌剂及杀虫剂的植物病害防治组合物的用途。WO2012/072660号描述了将阿拉酸式苯-S-甲基作为可诱导宿主防御的化合物的其用途，但是并不像本发明提及的作为松材线虫病的主要原因的松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)，而是局限于其对象植物体、蔬菜及西红柿等的作物，且未公开对于松树等的木本类的利用诱导抗性的松材线虫病防治技术。

发明内容

技术问题

本发明作为由如上所述的要求导出，在本发明中，为了筛选出如下的药剂进行了持续的研究：通过发掘作为起到诱导抗性而熟知的多种物质来向寄主诱导诱导抗性以有效防治松材线虫病。其结果，揭露了阿拉酸式苯-S-甲基为对松材线虫病诱导抗性的活性物质，通过多种方法确认了上述物质对松树表现出诱导抗性活性。

尤其，在通过树干注入、叶面喷洒及土壤浇灌的三种处理方法调查本发明的阿拉酸式苯-S-甲基的松材线虫病防治效果的结果，确认了相对于所使用的阿拉酸式苯-S-甲基的含量，土壤浇灌方法的松材线虫病防治率显著高于树干注入方法的松材线虫病防治率。

如上所述的事实确认，利用诱导抗性材料不仅能够以比现有药剂低廉的费用预防松材线虫病，还能够将松材线虫病的预防制剂处理方法从树干注入拓宽到其他方式以拓宽选择幅度，由此可扩大松材线虫病的预防药剂的喷洒适用范围，从而可成为更有效的防治方法，并由此完成了本发明。

解决问题的方案

为了解决上述问题，本发明提供包含阿拉酸式苯-S-甲基或其农药学上可接受的盐作为有效成分的植物的松材线虫病防治用组合物。

本发明提供包括在树木栽植地处理上述松材线虫病防治用组合物的步骤的松材线虫病的防治方法。

本发明提供在赤松(Pinus densiflora)或黑松(Pinus thunbergii)栽培地处理上述松材线虫病防治用组合物的预防或治疗松材线虫病的方法。

本发明提供包含阿拉酸式苯-S-甲基或其农药学上可接受的盐作为有效成分的用于防治松材线虫病的土壤浇灌或叶面喷撒处理用组合物。

本发明提供包含阿拉酸式苯-S-甲基或其农药学上可接受的盐作为有效成分的用于诱导对松材线虫病的诱导系统抗性(induced systemic resistance) 的组合物。

发明的效果

根据本发明，当对松材线虫病进行树干注入、叶面喷洒及土壤浇灌处理时，阿拉酸式苯-S-甲基显示出防治活性。并且，在体外(in vitro)确认了阿拉酸式苯-S-甲基的防治效果起因于诱导抗性。通常，由于诱导抗性以少量有效并作为在植物体内表达基因的机制显示药效，因此对人体无害且不诱发环境污染。因此，可开发松材线虫病的环保药剂，可提高开发利用其的新概念松材线虫病防治剂的可能性。并且，在将现有的为了防治松材线虫病而使用的杀线虫制剂的树干注入方法以转换为诱导抗性制剂的土壤浇灌或叶面喷洒方法的情况下，具有能够以低廉费用进行有效防治并扩大松材线虫病防治剂的喷洒适用范围的优点。

附图说明

图1示出对赤松(Pinus densiflora)(a)树干注入10000μg/ml的阿拉酸式苯-S-甲基、(b)树干注入200μg/ml的阿拉酸式苯-S-甲基、(c)土壤浇灌阿拉酸式苯-S-甲基、(d)叶面喷洒阿拉酸式苯-S-甲基、(e)未处理区及(f)未接种区的松材线虫病防治试验结果。

具体实施方式

为了实现本发明的目的，本发明提供包含阿拉酸式苯-S-甲基或其农药学上可接受的盐作为有效成分的植物的松材线虫病防治用组合物。

在本发明发现了如下事实：在进行探明松材线虫病的病害防治机制的研究的过程中，在特定诱导抗性物质对还未进行研究的松材线虫病的寄主的松树类诱导抗性起到非常重要作用，并且利用其可防治松材线虫病。

在本发明中，在诱导抗性材料中的阿拉酸式苯-S-甲基对松材线虫病的寄主植物诱导抗性来显示松材线虫病的防治效果，在进行作为现有的埃玛菌素等的阿维菌素系列的物质未见任何活性的处理方法的土壤浇灌处理时也显示出防治活性。这种事实作为全世界最初发现的事实，提供如下的处理方法：利用诱导抗性材料不仅能够以比现有药剂低廉的费用预防松材线虫病，还将松材线虫病的预防制剂处理方法从树干注入拓宽到其他方式以拓宽选择幅度，由此可扩大松材线虫病的预防药剂的喷洒适用范围，因此可有效防治松材线虫病。

本发明的上述松材线虫病防治用组合物可以是在松材线虫病的寄主植物堆积水杨酸(salicylic acid)来诱导抗性的诱导抗性材料。

在本发明的一实例的松材线虫病防治用组合物中，阿拉酸式苯-S-甲基的农药学上可接受的盐可包含诸如金属盐、有机碱盐、无机酸盐、有机酸盐、碱性氨基酸盐或酸性氨基酸盐等。合适的金属盐可包含诸如钠盐及钾盐等的碱性金属盐；钙盐、镁盐及钡盐等的碱性土金属盐；铝盐等。有机碱盐可包含诸如三甲胺盐、三乙胺盐、吡啶、甲基吡啶、2，6-二甲基吡啶盐、乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、环己胺盐、二环己胺盐及N，N-二苄基乙二胺盐等。无机酸盐可包含诸如盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐及磷酸盐等。有机酸盐可包含诸如甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、苯二甲酸盐、富马酸盐、二乙酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐及对甲苯磺酸盐等。碱性氨基酸盐可包含诸如精氨酸盐、赖氨酸盐及鸟氨酸盐等。酸性氨基酸盐可包含诸如天门冬氨酸盐及谷氨酸盐等。

本发明的一实例的松材线虫病防治用组合物可追加包含农药学可接受的载体和/或赋形剂。本发明的组合物中包含的赋形剂为农业领域通常使用的赋形剂可追加包含诸如硅藻土及熟石灰等的氧化物、磷灰石等的磷酸盐、石膏等的硫酸盐、黏土、瓷土、膨润土、酸性白土、石英及二氧化硅等的矿物质粉末等的固体载体和填充剂、抗凝剂、表面活性剂、乳化剂及防腐剂等。并且，可通过该领域中已公开的方法进行配制，以对植物处理本发明的组合物使得活性成分迅速释放、缓慢释放及迟缓释放。可通过配合为了配置而将通用的表面活性剂、稀释剂、分散剂及辅助剂等添加剂与活性成分并以来制剂多种形态的水和剂、悬浮剂、乳剂、乳浊剂、微乳液、液剂、分散性液剂、粒状水和剂、颗粒剂、粉剂、液状水和剂、水面浮上性粒剂(U-Granule)及片剂等来使用。

本发明的松材线虫病防治用组合物可制备成诸如可直接喷射的溶液、粉末及悬浮液形态或高浓缩水性、油性或其他悬浮液、分散液、乳液、油性分散液、糊剂、粉尘、撒播物质或颗粒剂，但不限于此。并且，上述松材线虫病防治用组合物可通过喷射、喷雾、喷洒、撒播或浇注来使用。使用形式取决于所意图的目的，但是在所有情况下，本发明的组合物的分布应尽可能地微细且均匀。

本发明的松材线虫病防治用组合物能够以多种形态制剂化。上述制剂可通过添加诸如溶剂和/或载体来制备。通常，混合诸如乳化剂或分散剂与制剂的非活性添加剂及表面-活性物质。合适的表面-活性物质可以为芳族磺酸 (例如，木质素磺酸、苯酚磺酸、萘磺酸及二丁基萘磺酸)、脂肪酸、烷基及烷基芳基磺酸盐、烷基月桂基醚、脂肪醇硫酸盐的碱金属、碱土金属、铵盐、硫化六醇、硫化七醇及硫化十八醇、脂肪醇乙二醇醚的盐、磺酸萘及其衍生物、甲醛的缩合物、萘或萘磺酸、酚和甲醛的缩合物、聚氧乙烯辛基酚醚、乙氧基化异辛基酚、乙氧基化辛基酚或乙氧基化壬基酚、烷基苯基聚乙二醇醚或三丁基苯基聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、异十三烷基醇、脂肪醇 /环氧乙烷缩合物、乙氧基化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚或聚氧丙烯、月桂醇聚乙二醇醚乙酸酯、山梨糖醇酯、木质素-亚硫酸盐废液或甲基纤维素，但不限于此。

原则上，合适的固体载体物质均为多孔性且农业上可接受的载体，例如，可以为矿物土类(例如，二氧化硅、硅胶、硅酸盐、滑石、高岭土、石灰石、石灰、白垩、黄土、粘土类、白云石、硅藻土类、硫酸钙、硫酸镁、氧化镁及粉碎合成材料)、化肥(例如，硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵及尿素)、植物性产品(例如，谷物粉、树皮粉、木粉(wood meal)及坚果壳粉)或纤维素粉，但不限于此。并且，上述固体载体可混合使用一种或两种以上。

本发明的松材线虫病防治用组合物可与扩散剂及渗透剂或表面活性剂混用，以增进植物体吸收及效果。

在本发明的一实例的组合物中，上述植物可以为松属、冷杉属、云杉属或落叶松属，优选地，可以为松属，但不限于此。

并且，本发明提供包括在树木栽植地处理上述松材线虫病防治用组合物的步骤的松材线虫病的防治方法。

在本发明的一实例的方法中，上述阿拉酸式苯-S-甲基的处理可以为诱导松树的诱导系统抗性(induced systemic resistance)，但不限于此。

在本发明的一实例的方法中，上述松树可以为黑松或赤松，但不限于此。

在本发明的一实例的方法中，上述阿拉酸式苯-S-甲基的处理可以为树干注入处理、土壤浇灌处理或叶面喷洒处理，优选地，可以为土壤浇灌处理或叶面喷洒处理，更优选地，可以为土壤浇灌处理，但不限于此。

并且，本发明提供在赤松(Pinus densiflora)或黑松(Pinus thunbergii) 栽培地处理松材线虫病防治用组合物为特征的预防或治疗松材线虫病的方法。本发明的方法不受限制，只要是需要防治松材线虫病的树木即可，例如，可在松属、冷杉属、云杉属或落叶松属栽培地处理本发明的组合物，优选地，可以为赤松或黑松栽培地。优选地，处理方法可以为土壤浇灌处理或叶面喷洒处理，但不限于此。

并且，本发明提供包含阿拉酸式苯-S-甲基或其农药学上可接受的盐作为有效成分的用于防治松材线虫病的土壤浇灌或叶面喷撒处理用组合物。

并且，本发明提供包含阿拉酸式苯-S-甲基或其农药学上可接受的盐作为有效成分的用于诱导对松材线虫病的诱导系统抗性的组合物。

以下，通过实施例详细说明本发明。但是，下述实施例仅用于例示本发明，本发明的内容不限于下述实施例。

实施例1.筛选用于防治松材线虫病的诱导抗性物质

将16种已知对各种病害在植物体诱导抗性的诱导抗性物质作为候选组，并调查了松材线虫病的防治效果。使用两年生松树幼苗(直径5.5mm左右、高约35cm)进行了利用松树赤松的体外测试中的松材线虫病的防治效果实验。

作为诱导抗性物质候选组使用了阿拉酸式苯-S-甲基、噻酰菌胺(Tiadinil，TDL)、异噻菌胺(Isotianil，ITL)、噻菌灵(Probenzole，PBZ)、嘧菌酯 (Azoxystrobin，AZO)、井冈霉素(Validamycin A，VMA)、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)、DL-3-氨基丁酸(DL-3-aminobutyric acid，BABA)、2， 3-丁二醇(2，3-Butanediol，2，3-BDO)、r-氨基丁酸(r-Aminobutyric acid，GABA)、葡聚糖(Glucan)、麦角固醇(Ergosterol，ER)及壬二酸(Azelaic acid，AZA)。药剂注入以树干注入方法注入，其方法如下：以厚度为1.5mm 的钻子在从松树的地表面部距离5cm至10cm的树干部位上以45°角度穿孔，向孔中插入200μl的尖端(tip)，以200μg/ml、20μg/ml及2μg/ml水平将候选物质分别溶解在溶剂中并装入上述尖端的内部后，向每棵松树注入 100μl。注入药剂后，尖端的后部用封口膜封闭。

通过贝尔曼漏斗法(Baermann funnel method)收获松材线虫 (Bursaphelenchusxylophilus，韩国国立森林科学院)，上述松材线虫为将在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato dextrose agar，PDA)中生长的灰霉菌 (Botrytis cinerea)作为食饵，并在25℃条件下培养一周而成，之后在光学显微镜下调查数量并制成20000条/ml的水平。在药剂处理一周后，利用树皮剥皮接种法向每棵树各接种100μl的松材线虫接种，共2000条，接种 30天后，观察了结果。其结果如表1所示，在200μg/ml、20μg/ml及2μg /ml的所有浓度下，阿拉酸式苯-S-甲基及50％阿拉酸式苯-S-甲基(水分散颗粒剂(Water Dispersible Granule，WG))的活性最优秀。

表1.诱导抗性物质候选组的松材线虫病发病率

a/b(c)*：(a)表示枯萎症状的松树个体数量，(b)表示实验中所使用的松树个体数量，(c)表示在显示枯萎症状的松树个体数量(a)中仅树干的生长点部分显示枯萎症状的松树个体数量。

实施例2.通过阿拉酸式苯-S-甲基体外(in vitro)鉴定杀线虫

调查了在实施例1中显示出效果最为优秀的阿拉酸式苯-S-甲基的杀线虫是否有活性。为了阿拉酸式苯-S-甲基的杀线虫活性实验，在96-孔微板上以每孔50条/99μl的水平稀释松材线虫悬浮液。在丙酮溶剂中以处理浓度的100倍的储备溶液(stock solution)以制成阿拉酸式苯-S-甲基，并在分别加入1μl以成为300μg/ml、100μg/ml及33.3μg/ml。每个处理区反复进行3次，对照区使用了2.15％的化学农药埃玛菌素(Emamection benzoate)。在处理后，96-孔微板在如下的暗室中保管3天后观察：在塑料箱底部铺上浸渍水的劲拭(wypall)以维持100％的湿度，在箱子上盖上黑布以遮挡光线。其结果显示，阿拉酸式苯-S-甲基对松材线虫2龄幼虫没有杀线虫活性。

表2.阿拉酸式苯-S-甲基对松材线虫的杀线虫活性

实施例3.在温室中的根据阿拉酸式苯-S-甲基的处理方法的体内(in vivo) 松材线虫病防治效果

调查了在实施例1中活性最优秀的阿拉酸式苯-S-甲基的树干注入、叶面喷洒及土壤浇灌的三种不同处理方法的防治效果。松树使用与实施例1相同的两年生赤松幼苗(直径5.5mm左右、高约35cm)。

树干注入的注入方法如下：以厚度为1.5mm的钻子在从松树的地表面部距离5cm至10cm的树干部位上以45°角度穿孔，向孔中插入200μl的尖端，将阿拉酸式苯-S-甲基以0.2mg/ml及10mg/ml的水平溶解在包含10％的丙酮及10％的甲醇的水溶液并装入上述尖端后，向每棵松树注入100μl。处理后，尖端的后部用封口膜封闭，并开个小孔使空气流通。叶面喷洒方法如下：在分别用5ml的250μg/ml吐温20对每棵松树充分地进行预处理，以使药剂很好的吸附在叶子上，之后干燥2小时。之后，在包含10％的丙酮及250μg/ml吐温20的水溶液中以1.6mg/ml的水平溶解后，放入微型喷射器，向每棵松树分别叶面喷撒5ml。土壤浇灌方法如下：在包含10％的丙酮及250μg/ml吐温20的水溶液中以0.2mg/ml的水平溶解阿拉酸式苯-S- 甲基后，在每棵种植松树的接壤处土壤浇灌40ml。在药剂处理1周后，松材线虫接种以与实施例1相同的方法进行接种，并观察松树枯萎程度80天。

表3.根据处理方法的阿拉酸式苯-S-甲基的松材线虫病的防治效果

其结果，在树干注入的情况下，在10000μg/ml及200μg/ml中分别显示出27％及77％的防治率。可推定在低浓度下比在高浓度下显示出更高的活性是基于诱导抗性的防治效果而不是阿拉酸式苯-S-甲基的杀线虫活性。并且，阿拉酸式苯-S-甲基在叶面喷洒及土壤浇灌的情况下分别显示出61％及 97％的高防治效果。与此相比，在现有最广泛用作树干注入用杀线虫剂的埃玛菌素的情况下，树干注入在20000μg/ml中显示出100％的高防治效果，相反，在200μg/ml中根本不显示其效果。并且，当叶面喷洒及土壤浇灌处理时根本不显示活性，因此该药剂通过土壤浇灌及叶面喷洒几乎不会渗透到松树内，以非常低的浓度渗透。如上所述，由于阿拉酸式苯-S-甲基不仅通过树干注入显示出效果，还通过叶面喷洒及土壤浇灌显示出效果，因此在制备最佳制剂的情况下，可期待亦可开发航空喷洒的产品。

实施例4.用于筛选松树诱导抗性物质的体外诱导抗性鉴定

在包含诱导抗性的多种抗性机制中，使用植物防御相关的基因的PRs 基因，筛选了如下确保的16个松树诱导抗性相关的基因候选组及一个参照基因(参照基因，延伸因子1α(reference gene，Elongation factor_1alpha))。

表4.诱导抗性相关的基因

以200μg/ml处理诱导抗性候选物质，并通过使用表4的诱导抗性相关基因的体外诱导抗性鉴定法来确定了松树愈伤组织的诱导抗性相关基因的表达。松树诱导抗性候选物质使用了阿拉酸式苯-S-甲基、噻酰菌胺、异噻菌胺、噻菌灵、嘧菌酯、井冈霉素、茉莉酸甲酯、DL-3-氨基丁酸、2，3-丁二醇、r-氨基丁酸、葡聚糖、麦角固醇及壬二酸。体外诱导抗性鉴定方法如下：将100mg的松树愈伤组织与12-孔微板低甲氧基果胶(LM)液体培养基500μl一起在表面处理，以使诱导抗性候选物质成为200μg/ml，在25℃的黑暗条件的振荡培养箱中，以搅拌机的50rpm速度使愈伤组织表面与松树诱导抗性候选物质充分反应24小时。从与诱导抗性物质完成反应的愈伤组织中提取RNAs后，合成了cDNA，并通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 或实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)确认了特异性增加的诱导抗性基因的表达。

表5.在松树愈伤组织中的诱导抗性物质候选组的诱导抗性基因表达

表6.在松树愈伤组织中的诱导抗性物质候选组的诱导抗性基因表达

其结果，如表5及表6所示，在200μg/ml的浓度中，松树诱导抗性相关的多个基因候选组的诱导整体性2倍以上的高表达的物质为阿拉酸式苯 -S-甲基、r-氨基丁酸及井冈霉素。其中，阿拉酸式苯-S-甲基显示出大部分的 PRs基因增加2倍以上。

实施例5.在用阿拉酸式苯-S-甲基处理后，基于培养时间的基因表达

在幼苗鉴定及基因表达中，由于阿拉酸式苯-S-甲基显示出最优秀的效果，因此仅使用阿拉酸式苯-S-甲基来进行之后的实验。在进行药剂处理后，调查了随着时间流逝的诱导抗性基因表达程度。体外诱导抗性鉴定方法如下：使用松树愈伤组织，在具有愈伤组织的低甲氧基果胶培养基中以200μg/ml 的浓度处理阿拉酸式苯-S-甲基后，在25℃的黑暗条件的振荡培养箱中反应了24小时。从经反应的愈伤组织中提取RNAs后，合成了cDNA，并通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)或实时荧光定量逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR)来确认了特异性增加的诱导抗性基因的表达。在进行处理后，随着时间流逝，并随着1天、7天及14天后的确保的诱导抗性基因的表达及处理浓度，调查了200μg/ml、20μg/ml及2μg/ml中的诱导抗性基因的表达。在用阿拉酸式苯-S-甲基处理后，随着时间的愈伤组织的体外诱导抗性试验结果如表7所示，在用阿拉酸式苯-S-甲基处理24小时后，诱导抗性相关的基因的表达最高，并显示出随着时间流逝基因表达逐渐减少的倾向。这被认为是通过由阿拉酸式苯-S-甲基获取的抗性形质在病原菌的侵入之前仅记忆或维持最小水平而不维持最大限度地表达的状态从而有效运用植物体的能源消耗的一环。

表7.随着阿拉酸式苯-S-甲基的时间流逝的松树愈伤组织的体外诱导抗性鉴定

并且，根据阿拉酸式苯-S-甲基的浓度的愈伤组织的体外诱导抗性试验结果如表8所示，大致在以200μg/ml及20μg/ml的浓度处理时，显示出高基因表达。但是，即使将浓度分别稀释10倍，诱导抗性基因的表达未按比例减少，并确认了减少幅度非长小。而且，在多个诱导抗性基因中存在反而在低浓度中基因的表达高的情况。这意味着具有如下潜力：作为诱导抗性物质的特性之一，可通过在低浓度中诱导抗性基因的表达来极大化病害防治效果。

表8.根据阿拉酸式苯-S-甲基的浓度的松树愈伤组织的体外诱导抗性鉴定

实施例6.根据阿拉酸式苯-S-甲基的处理方法的抗性基因表达

为了体外鉴定根据阿拉酸式苯-S-甲基的处理方法，进行了松树愈伤组织表面处理方式(喷雾处理)及在松树愈伤组织低甲氧基果胶培养基中直接投入诱导抗性物质的方式的两种不同的处理方法。松树愈伤组织表面处理方式(喷雾处理)如下：在中用500μl的低甲氧基果胶浸湿100mg的松树愈伤组织后，将500μl的400μg/ml阿拉酸式苯-S-甲基分别以100μl分5次喷洒在表面上，使其成为200μg/ml阿拉酸式苯-S-甲基，在25℃的黑暗条件的振荡培养箱中，以搅拌机的50rpm速度反应24小时。当完成24小时的反应时，从愈伤组织中提取RNAs后，合成了cDNA，并通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)或实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)确认了特异性增加的诱导抗性基因的表达。

在作为松树愈伤组织成长培养基的低甲氧基果胶胶体培养基中处理阿拉酸式苯-S-甲基，以制备了200μg/ml阿拉酸式苯-S-甲基的低甲氧基果胶胶体培养基。在200μg/ml阿拉酸式苯-S-甲基低甲氧基果胶胶体培养基中，在25℃的黑暗条件的振荡培养基中使100mg的松树愈伤组织反应24小时后，从愈伤组织中提取RNAs后，合成了cDNA，并通过逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)或实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)确认了特异性增加的诱导抗性基因的表达。

其结果如表9所示，可推定在以相同浓度处理的情况下，与松树愈伤组织表面处理方式(喷雾处理)相比，当直接注入到低甲氧基果胶培养基时，低甲氧基果胶培养基成分及阿拉酸式苯-S-甲基直接被吸收至松树内，从而有效提高松树的诱导抗性相关的基因表达。

表9.根据阿拉酸式苯-S-甲基的处理方法的松树愈伤组织的体外诱导抗性鉴定

实施例7.在温室中的阿拉酸式苯-S-甲基制剂的松材线虫病体内防治效果

为了调查阿拉酸式苯-S-甲基制剂对松材线虫病的效果配制了阿拉酸式苯-S-甲基。阿拉酸式苯-S-甲基由5％的原制剂、作为表面活性剂的10％的丙二醇、2％的CR-KSP40M(聚乙氧基三苯乙烯基苯基醚(Polyethoxylated tristyrylphenyl ether)、磷酸盐(phosphate)及钾盐(Potassium salt))、0.1％的黄原胶(Xanthan gum)、0.1％的消泡剂(Defoamer)及82.8％的水配制而成。

为了在温室中确认阿拉酸式苯-S-甲基制剂对不同敏感性松树种的效果，松材线虫病的体内测试使用松树黑松及赤松2年生幼苗(直径5.5mm左右、高约35cm)，制剂的处理通过叶面喷洒及土壤浇灌方法进行。叶面喷洒方法如下：在分别用5ml的250μg/ml吐温20对每棵松树充分地进行预处理，以使药剂很好的吸附在叶子上，之后干燥2小时。之后，将阿拉酸式苯-S- 甲基制剂以1.6mg/ml的水平进行溶解后放入微型喷射器，向每棵松树分别叶面喷撒5ml。土壤浇灌方法如下：在以0.2mg/ml的水平溶解阿拉酸式苯 -S-甲基后，在每棵种植松树的接壤处土壤浇灌40ml。在药剂处理1周后，松材线虫接种以与实施例1相同的树皮剥皮接种法进行接种，每棵松树2000 条，并在30天后观察结果。

表10.阿拉酸式苯-S-甲基制剂对松材线虫病的防治效果

结果如表10所示，与未处理区相比，黑松在叶面喷洒及土壤浇灌中显示出87％及38％的防治率，且与未处理区相比，赤松在叶面喷洒及土壤浇灌中显示出76％及68％的防治率。这确认了阿拉酸式苯-S-甲基不仅对赤松具有防治效果，对黑松也具有防治效果，这意味着活用上述制剂的松材线虫病防治的松树树种的适用范围可更广泛。

<110> 全南大学校产学协力团

釜山大学校产学协力团

<120> 包含阿拉酸式苯-S-甲基作为有效成分的松材线虫病防治用组合物

及利用其的松材线虫防治方法

<130> P20110877WP

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Claims

1.包含阿拉酸式苯-S-甲基或其农药学上可接受的盐作为有效成分在制备一种植物的松材线虫病防治用组合物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，上述植物为松属、冷杉属、云杉属或落叶松属。

3.一种松材线虫病的防治方法，其特征在于，包括将根据权利要求1或权利要求2所述的松材线虫病防治用组合物处理于树木栽植地的步骤。

4.根据权利要求3所述的松材线虫病的防治方法，其特征在于，上述松材线虫病防治用组合物的处理为诱导松树的诱导系统抗性。

5.根据权利要求3所述的松材线虫病的防治方法，其特征在于，上述松材线虫病防治用组合物的处理为土壤浇灌处理或叶面喷洒处理。

6.一种预防或治疗松材线虫病的方法，其特征在于，将根据权利要求1或权利要求2所述的松材线虫病防治用组合物处理于赤松或黑松栽培地。

7.包含阿拉酸式苯-S-甲基或其农药学上可接受的盐作为有效成分在制备用于防治松材线虫病的土壤浇灌或叶面喷洒处理用组合物中的应用。

8.包含阿拉酸式苯-S-甲基或其农药学上可接受的盐作为有效成分在制备用于诱导对松材线虫病的诱导系统抗性的组合物中的应用。