CN106399183A - 一种好氧反硝化菌及其应用 - Google Patents

一种好氧反硝化菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种好氧反硝化菌及其应用，所述好氧反硝化菌的培养方法包括以下步骤：从养猪场的污泥中提取出菌种；在实验室中采用平板画线法进行纯化；纯化6‑8代，得到目标菌种。所述好氧反硝化菌的污水处理方法，通过高分子材料对好氧反硝化菌进行包被，形成稳定结构，投入污水中进行氮的降解。本发明的方法简单，好氧反硝化菌处理效率较高，较好的解决了传统生物脱氮的污水处理系统中由于高效分解微生物的浓度较低，很难发挥污水处理的最大作用，处理效果不理想的问题。

Description

一种好氧反硝化菌及其应用
技术领域
本发明属于污水处理领域，尤其涉及一种好氧反硝化菌及其应用。
背景技术
污水处理厂中污水的主要污染物是悬浮颗粒物、有机物、磷和氮，前三者一般通过强化生化反应、化学絮凝沉淀等方法去除，效果较为显著，但对总氮的去除较难达到一级A标准。主要原因是总氮的去除多数通过微生物的氨化、硝化和反硝化过程来实现，而传统生物脱氮的污水处理系统中由于高效分解微生物的浓度较低，很难发挥污水处理的最大作用，处理效果不理想。
综上所述，传统生物脱氮的污水处理系统中由于高效分解微生物的浓度较低，很难发挥污水处理的最大作用，处理效果不理想。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种好氧反硝化菌及其应用，旨在解决传统生物脱氮的污水处理系统中由于高效分解微生物的浓度较低，很难发挥污水处理的最大作用，处理效果不理想的问题。
本发明是这样实现的，一种好氧反硝化菌的培养方法，所述好氧反硝化菌的培养方法包括以下步骤：
步骤一，从养猪场的污泥中提取出菌种；
步骤二，在实验室中采用平板画线法进行纯化；
步骤三，纯化6-8代，得到目标菌种。
进一步，所述纯化采用了以下培养基：
氨化细菌分离培养基:NaCl 0.25g/L，蛋白胨5g/L，K2HPO40.5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，超纯水1000mL，pH为7.2，在1×105Pa灭菌20min；以2％(质量分数)的琼脂糖做平板分离支持物；
硝化细菌分离培养基:柠檬酸钠7.66g/L，CaCl2·H2O 0.03g/L，FeSO4·7H2O0.03g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，硫酸铵1.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，NaCl 0.3g/L，pH7.2-7.4；琼脂20g/L；；
反硝化细菌分离培养基；
DM基础培养基，KH2PO41.5g/L；MgSO4·7H2O 0.01g/L；Na2HPO47.9g/L；微量元素溶液2ml；去离子水1000mL；pH7.0-7.5；柠檬酸钠5.66g/L；NaNO30.8415g/L；
溴甲基酚蓝培养基，KH2PO41.5g/L；MgSO4·7H2O 0.01g/L；Na2HPO47.9g/L；微量元素溶液2ml；去离子水1000mL；pH7.0-7.5；柠檬酸钠5.66g/L；NaNO30.8415g/L；1mL BTB和2.5％琼脂，蒸馏水溶解并调节pH 7.0-7.3。
进一步，所述微量元素溶液：乙二胺四乙酸50.0g，ZnSO42.2g，CaCl25.5g，MnCl2·4H2O5.06g，FeSO4·7H2O 5.0g，CuSO4·5H2O 1.57g，CoCl2·6H2O1.61g，溶解后用蒸馏水定容至1L，pH7.0。
本发明的另一目的在于提供一种由所述好氧反硝化菌的培养方法培养的好氧反硝化菌。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述好氧反硝化菌的污水处理方法，所述污水处理方法通过高分子材料对好氧反硝化菌进行包被，形成稳定结构，投入污水中进行氮的降解。
本发明提供的好氧反硝化菌及其应用，采用选择性培养基，通过对氮源的控制来达到筛选具有相应功能的细菌。分别以硫酸铵、硝酸钠为唯一氮源来筛选具有硝化性能和反硝化性能的细菌。在整个脱氮流程中，通过铵根离子、硝酸根离子这些介于两种不同脱氮作用之间的转折离子的浓度，来初步判断该菌株的氨化、硝化、反硝化能力，以及初步推断出这些作用的速度与其限制因素。
附图说明
图1是本发明实施例提供的好氧反硝化菌的培养方法流程图。
图2是本发明实施例提供的D2菌在氨化培养基中生长曲线示意图。
图3是本发明实施例提供的D2菌在硝化培养基中生长曲线示意图。
图4是本发明实施例提供的D2菌在DM培养基中生长曲线示意图。
图5是本发明实施例提供的D2菌于氨化培养基中脱氮性能曲线示意图。
图6是本发明实施例提供的D2菌于硝化培养基中脱氮性能曲线示意图。
图7是本发明实施例提供的D2菌于DM培养基中脱氮性能曲线示意图。
图8是本发明实施例提供的菌株种属情况图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的好氧反硝化菌的培养方法包括以下步骤：
S101：从养猪场的污泥中提取出菌种；
S102：在实验室中采用平板画线法进行纯化；
S103：纯化6-8代，得到目标菌种。
在步骤S102中纯化采用了以下培养基：
氨化细菌分离培养基:NaCl 0.25g/L，蛋白胨5g/L，K2HPO40.5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，超纯水1000mL，pH为7.2，在1×105Pa灭菌20min。以2％(质量分数)的琼脂糖做平板分离支持物。
硝化细菌分离培养基:
柠檬酸钠7.66g/L，CaCl2·H2O 0.03g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，硫酸铵1.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，NaCl 0.3g/L，pH7.2-7.4。琼脂20g/L；硫酸铵为实验中氨氮的来源。
反硝化细菌分离培养基:
DM基础培养基
KH2PO41.5g/L；MgSO4·7H2O 0.01g/L；Na2HPO47.9g/L；微量元素溶液2ml；去离子水1000mL；pH7.0-7.5；柠檬酸钠5.66g/L；NaNO30.8415g/L。
微量元素溶液配方：EDTA(乙二胺四乙酸)50.0g，ZnSO42.2g，CaCl25.5g，MnCl2·4H2O5.06g，FeSO4·7H2O 5.0g，CuSO4·5H2O 1.57g，CoCl2·6H2O1.61g，溶解后用蒸馏水定容至1L，pH7.0。
BTB(溴甲基酚蓝)培养基
在DM培养基的基础上添加1mL BTB(1％溶解于酒精)和2.5％琼脂，蒸馏水溶解并调节pH 7.0-7.3。
本发明丧失了提供的好氧反硝化菌应用于污水处理，具体方法为：
通过高分子材料对菌种进行包被，形成稳定结构，投入污水中进行氮的降解。
下面结合具体实施例对本发明的应用效果作详细的描述。
实施例1
本发明实施例以武夷山养猪场废水池活性污泥为材料，采用好氧反硝化菌培养基，纯化出7株好氧反硝化菌。
利用氨化、硝化培养基鉴定出菌种具有氨化、硝化性能。测定D2菌在氨化、硝化和DM培养基三种生长环境中的菌种生长动力学曲线和脱氮性能曲线，近一步分析该菌的脱氮性能，该菌在三种培养基中总氮脱除率为22.50％、66.85％、55.40％。初步确定，D2菌具有独立完成整个脱氮流程的能力。
D2菌在氨化培养基中生长曲线见图2。
根据曲线可以看出D2菌在氨化培养基中从OD600大约在0.2的时候开始进入对数期，约6h后进入稳定期。由此曲线可以初步判断D2菌的氨化性能良好。
D2菌在硝化培养基中生长曲线见图3。
根据曲线可以看出D2菌在硝化培养基中从OD600大约在0.2的时候开始进入对数期，约24h进入稳定期。由此曲线可以初步判断D2菌的硝化性能不如氨化性能反应剧烈，需要更长的时间才能进入平稳期。
D2菌在DM培养基中生长曲线见图4。
根据曲线可以看出D2菌在DM培养基中从OD600大约在0.2的时候开始进入对数期，约21h进入稳定期。由此曲线可以初步判断D2菌的反硝化性能不如氨化性能反应剧烈，需要较长的时间才能进入平稳期。
D2菌于氨化培养基中脱氮性能曲线见图5。
根据NH4 +含量基不变，结合生长曲线可以推测D2菌的氨化性能稳定，并且氨化转化速度较快。但是，NO3 -含量起伏变化很大，初步推测氨化培养基中D2菌的硝化、反硝化性能受到了不同程度的限制。由于该菌为异养菌，推测有可能是跟碳源不断减少有关系。
D2菌于硝化培养基中脱氮性能曲线见图6。
根据图中NH4 +含量平稳递减，结合生长曲线中NH4 +含量曲线可以推测D2菌的硝化作用转化作用性能稳定。但是，NO3 -含量起伏变化很大，初步推断硝培养基中D2菌的反硝化性能受到了不同程度的限制。由于该菌为异养菌，推测有可能是跟碳源不断减少有关系。
D2菌于DM培养基中脱氮性能曲线见图7。
根据图中NO3 -含量平稳递减，结合DM培养基中D2生长曲线可以推测D2菌的反硝化转化作用性能稳定。NO3 -含量起伏变化很大，可以初步断定为是碳源不足引起的。
D2菌于氨化、硝化和DM培养基中总脱氮率
接种后从0h开始，每隔12h取样一次，氨化培养基取样至24h，硝化培养基和DM培养基培养至36h，然后测总氮含量，并计算出脱氮率，结果如表1所示。
表1 D2菌12h、24h、36h总氮降解率
依据菌株的EzBioCloud检索结果7株菌均为pseudomonas koreensis。其中，D2的相似度最高，为99.28，长度为1248bp。将D2菌株与3株功能相似菌株(通过查阅文献选择的具有异养硝化好氧反硝化性能的不同种属的三株菌：FJ387168、KU140418、FJ897172)、3株相似度最高菌株(在数据库中选取相似度最高的三株菌：HG764746、AF468452、AM293565)的16S rDNA一起构建系统发育树。采用Mega7.0软件的邻位连接(Neighbour Joining，NJ)法构建系统发育树分析该菌遗传学特征，确定菌株的种属情况以及其在遗传学上的进化地位，结果如图8所示。从图中可能看出，该菌被分到pseudomonas属下的一个分支，此结果与同源性比对结果相一致，可以判定该菌属于假单胞菌属。
性能比对
某些微生物(如固氮菌、硫细菌、氢细菌等)能利用空气中分子态的氮或利用无机氮化物如铵盐、硝酸盐合成有机物。多数细菌则必须供给蛋白胨、氨基酸等有机氮化物才能生长。本实验采用选择性培养基，通过对氮源的控制来达到筛选具有相应功能的细菌。分别以硫酸铵、硝酸钠为唯一氮源来筛选具有硝化性能和反硝化性能的细菌。在整个脱氮流程中，通过铵根离子、硝酸根离子这些介于两种不同脱氮作用之间的转折离子的浓度，来初步判断该菌株的氨化、硝化、反硝化能力，以及初步推断出这些作用的速度与其限制因素。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种好氧反硝化菌的培养方法，其特征在于，所述好氧反硝化菌的培养方法包括以下步骤：
步骤一，从养猪场的污泥中提取出菌种；
步骤二，在实验室中采用平板画线法进行纯化；
步骤三，纯化6-8代，得到目标菌种。
2.如权利要求1所述的好氧反硝化菌的培养方法，其特征在于，所述纯化采用了以下培养基：
氨化细菌分离培养基:NaCl 0.25g/L，蛋白胨5g/L，K2HPO4 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，超纯水1000mL，pH为7.2，在1×105Pa灭菌20min；以2％(质量分数)的琼脂糖做平板分离支持物；
硝化细菌分离培养基:柠檬酸钠7.66g/L，CaCl2·H2O 0.03g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，硫酸铵1.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，NaCl 0.3g/L，pH7.2-7.4；琼脂20g/L；；
反硝化细菌分离培养基；
DM基础培养基，KH2PO4 1.5g/L；MgSO4·7H2O 0.01g/L；Na2HPO4 7.9g/L；微量元素溶液2ml；去离子水1000mL；pH7.0-7.5；柠檬酸钠5.66g/L；NaNO3 0.8415g/L；
溴甲基酚蓝培养基，KH2PO4 1.5g/L；MgSO4·7H2O 0.01g/L；Na2HPO4 7.9g/L；微量元素溶液2ml；去离子水1000mL；pH7.0-7.5；柠檬酸钠5.66g/L；NaNO30.8415g/L；1mL BTB和2.5％琼脂，蒸馏水溶解并调节pH 7.0-7.3。
3.如权利要求2所述的好氧反硝化菌的培养方法，其特征在于，所述微量元素溶液：乙二胺四乙酸50.0g，ZnSO4 2.2g，CaCl2 5.5g，MnCl2·4H2O 5.06g，FeSO4·7H2O 5.0g，CuSO4·5H2O 1.57g，CoCl2·6H2O 1.61g，溶解后用蒸馏水定容至1L，pH7.0。
4.一种由权利要求1～3任意一项所述好氧反硝化菌的培养方法培养的好氧反硝化菌。
5.一种利用权利要求4所述好氧反硝化菌的污水处理方法，其特征在于，所述污水处理方法通过高分子材料对好氧反硝化菌进行包被，形成稳定结构，投入污水中进行氮的降解。
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