CN115846395A - 一种构建煤矿恢复区植物-微生物群落联合修复体系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于煤矿恢复区修复技术领域，为了解重金属、PAHs对不同利用方式下修复植物及土壤微生物群落多样性的影响，提供一种构建煤矿恢复区植物‑微生物群落联合修复体系的方法。采用样方调查方法，调查矸石恢复区植被群落组成与结构特征；采用Miseq高通量测序技术，检测矸石区土壤中细菌群落的组成及多样性，分析矿区堆积、修复不同阶段与修复区不同季节微生物群落的组成、分布及其多样性特征，并分析其差异性，用共进化策略筛选高效降解污染物的植物根际‑微生物生态群落；构建土壤‑植物‑微生物高效降解体系。筛选出可富集重金属、有较强固氮作用的植物，找出耐受重金属或可降解PAHs的优势菌属，有助于该地区矸石山的进一步修复。

Description

一种构建煤矿恢复区植物-微生物群落联合修复体系的方法

技术领域

本发明属于煤矿恢复区修复技术领域，具体涉及一种构建煤矿恢复区植物-微生物群落联合修复体系的方法。

背景技术

当前，主流的土壤修复技术主要分为物理修复（固化/稳定、热脱附和电动修复）、化学修复（土壤淋洗、氧化还原）和生物修复（植物、动物、微生物修复）。其中，生物修复技术作为一种高效、低成本和环境友好型的修复技术，克服了物理化学修复费用高、效果不明显、易产生二次污染的缺点，逐渐成为研究热点。通过对2010-2020年间矸石修复文献进行统计，60%以上为生物修复。植物-微生物修复技术是利用土壤-植物-微生物组成复合体系，直接或间接地吸收和降解土壤中污染物质的一种污染治理技术。植物-微生物联合修复技术以植物修复技术为基础，包括植物稳定、植物提取、植物挥发、植物降解四个过程（图1）。重金属主要靠植物提取，可通过添加微生物强化植物修复作用。而对于土壤PAHs，植物提取的贡献通常可忽略不计（<0.4%），主要为根际降解过程，即利用植物的根增强根际微生物和真菌活性间接降解多环芳烃。

在矸石区，植物-微生物修复技术已得到广泛应用，大量文献筛选了适合某一矿区修复的植物（黑麦草、紫花苜蓿、高羊茅等）与微生物（Magnaporthe oryzae、Burkholderia sp），效果良好。但复合污染矿区修复后期主要污染物尚不明确，修复前后生态风险及健康风险的对比较少。污染地区土壤植物、微生物与自然生态系统不同，煤矿复垦区修复往往通过对生态系统加以人为干预、控制和管理，最终建立一个具有高生产力的、稳定的植物群落，最终达到保护与持续利用这两大目标。

土壤微生物群落的多样性是决定土壤质量的关键要素，它往往受污染物种类、气候变化、氮沉降等因素的干扰，改变病原体、有益生物的多样性、密度和病害虫负荷，最终对生态系统的功能以及人群健康产生影响。2015年，发表于Nature上的一篇文献构建了一个概念框架，指出土地使用和管理决策会改变土壤生物多样性进而影响人群健康。矸石堆积和修复后理化性质和污染物含量存在差异，微生物群落结构不断调整以适应不同的生境大量研究表明，与未污染对比，矿区土壤微生物多样性和群落存在显著变化，重金属耐受性强的生物占主导地位。但关于矿区土壤潜在病原细菌的调查较少，其污染物-微生物-人群健康之间的关联尚不明确。

发明内容

本发明为了解重金属、PAHs对不同利用方式下修复植物及土壤微生物群落多样性的影响，提供了一种构建煤矿恢复区植物-微生物群落联合修复体系的方法，筛选出可富集重金属、有较强固氮作用的植物，找出耐受重金属或可降解PAHs的优势菌属，从而有助于该地区矸石山的进一步修复。

本发明由如下技术方案实现的：一种构建煤矿恢复区植物-微生物群落联合修复体系的方法，采用样方调查方法，调查矸石恢复区植被群落组成与结构特征；采用 Miseq高通量测序技术，检测矸石区土壤中细菌群落的组成及多样性，分析矿区堆积、修复不同阶段与修复区不同季节微生物群落的组成、分布及其多样性特征，并分析其差异性，采用共进化策略筛选高效降解污染物的植物根际-微生物生态群落；最终构建土壤-植物-微生物高效降解体系。

采用 Miseq 高通量测序技术，检测矸石区土壤中细菌群落的组成及多样性，具体方法为：采用通用引物 338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3’）和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3’）提取土壤微生物基因组DNA，16S rDNA PCR扩增，然后构建文库并进行 Miseq 高通量测序，Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析；

微生物多样性分析为：α多样性：sobs为群落丰富度实际观测值；Shannon和Simpson指数反映物种均匀度，Shannon 指数描述个体出现的紊乱和不确定性，Simpson指数为随机取样的两个OUT属于不同种的概率，Shannon指数数值越大，Simpson指数数值越小，群落物种分配的均匀度越高；chao和Ace指数反映群落丰富度，两指数通过不同算法估计群落中所含OUT数目，数值越大物种数越多；β多样性：反映不同样本间群落组成的差异性：，通过样本相似距离值衡量；NMDS为非约束性排序分析，将多维空间的研究对象简化到低维空间进行定位分析和归类，反映菌群相似性和差异性；通过NMDS 衡量样本的β多样性，用weighted_normalized_unifrac距离，考虑样本间进化关系和物种丰度；

微生物群落结构：对细菌OTU进行注释分类，通过细菌群落柱状图进行分析，以门作为分类学水平进行分析，将相对丰度< 1% 的门归入其它，以属作为分类学水平进行分析，将平均丰度小于1.5%的菌属归入其它，得到微生物群落结构；

差异性分析：LEfSe分析用于区别两个或两个以上生物条件或者是类群，找到与丰度有显著性差异的类群，用线性判别分析LDA估算组即物种丰度对差异影响的大小，从门到科水平，研究LDA阈值高于2的物种，得到不同区域土壤微生物组间差异性，通过Wilcox秩和检验在属水平前进行组间差异显著性检验，通过fdr多重检验校正。

采用共进化策略筛选高效降解污染物的植物根际-微生物生态群落，具体方法为：采用多元回归分析了解土壤中重金属、PAHs含量对微生物α多样性指数的影响，选择shannon指数代表微生物均匀度，chao指数解释微生物丰富度，利用多元回归分析逐步法向后剔除法对污染物含量与多样性指数之间进行分析，得公式：shannon=3.648+ 0.054Pb；chao=2560.7+ 40.7As+13.1 Nap- 260.0Ace+236 Flu；结果显示：Pb含量越高各微生物相对丰度差异越小，难以形成优势菌群；As、Nap、Ace和Flu对微生物丰富度有影响；

测定不同丰度区间OTU、相对丰度前30的属、病原菌和益生菌了解微生物群落结构的影响：微生物与重金属、PAHs含量的Spearman相关性，反映其对微生物群落结构的影响，选择相对丰度高于0.1%的OTU，将其分为：>1%为高丰度、0.5%-1%中等丰度和0.1%-0.5%低丰度,分析不同丰度区间OTU与污染物Spearman相关性；

进一步分析重金属对不同类别的微生物的毒性作用，从属水平选取相对丰度前30的微生物，并与污染物进行相关性分析；接着选取门分类学水平总丰度前30的物种与重金属、PAHs，并计算物种之间的斯皮尔曼等级相关系数，反映物种之间的相关性；使用Spearman相关性进行分析污染物对病原菌和益生菌的影响；

对微生物功能进行预测：选择Tax4Fun功能预测KEGG 通路在第 2级的主要功能及其层次聚类，BugBase表型预测确定微生物样本中存在的高水平表型，通过预测的16S拷贝数对OTU进行归一化，然后预测微生物表型；FAPROTAX 功能预测分析原核生物代谢及生态功能，将原核生物分类群映射到化学异养（chemoheterotrophy）、需氧化学异养（aerobic_chemoheterotrophy）、发酵（fermentation）生态相关功能；

对主控污染物胁迫下植物响应的检测，选取恢复区旱季0-800m不同距离的土壤样品，通过模式植物大麦毒性指标了解植物响应状况，具体方法为：通过土培，观察大麦幼苗的生长指标即根长、芽长、生物量、叶绿素，氧化应激指标即MDA、CAT、POD、SOD、GSH以及遗传毒性指标即有丝分裂指数、微核的变化；对植物毒性指标与土壤重金属含量指标进行相关性分析，从而得到土壤植物毒性评估。

构建土壤-植物-微生物高效降解体系具体方法为：对于即将修复的矸石堆积区，Pb、As、Cu和PAHs含量较高，理化性质差，采取豆科植物+马赛菌属修复模式；对于Pb、PAHs污染的矸石恢复区，采取Pb超积累植物+经济作物+假单胞菌。

所述Pb超积累植物为商陆、Thysanolaena latifolia或Mimosa pudica。

本发明立足于山西省煤矿恢复区土壤污染现状，及国家对土壤污染调查、土壤环境安全及环境风险提出的新要求（GB15618-2018和GB36600-2018），选择对主控污染物具有一定修复潜力的土著植物，采用共进化策略筛选高效降解污染物的植物根际-微生物生态群落；最终构建土壤-植物-微生物高效降解体系，揭示其在煤矿恢复区土壤修复中的重要作用及生态化学过程，实现快速、经济、有效、安全的污染土壤原位修复应用。本发明旨在补足典型工业污染场地风险管控中的技术缺环，为资源循环新兴产业的发展提供支撑。

附图说明

图1为植物-微生物联合修复HMs-PAHs示意图；图2为植物、微生物多样性分析技术路线图；图3为基于NMSD的细菌群落β多样性分析；图4：（A）堆积区雨季（B）恢复区雨季和（C）恢复区旱季门水平优势菌群分析；图5为Lefse多级物种差异判别分析，注：不同颜色节点表示在对应组别中显著富集，且对组间差异存在显著影响的微生物类群；淡黄色节点表示在不同分组中均无显著差异，或对组间差异无显著影响的微生物类群；图6为堆积区和恢复区土壤微生物组间差异显著性检验性；图7为相对丰度前30属与污染物相关性热图；图8为矿区土壤污染物与微生物相关性网络图；注：图中节点的大小表示物种丰度大小，不同颜色表示不同的物种；连线表示Spearman 相关性，红色为正相关，绿色为负相关，线的粗细表示相关性系数的大小，线越粗，表示物种之间的相关性越高；线越多，表示该节点之间的联系越密切；图9为病原菌、益生菌与污染物相关性热图；注：黑色字体为病原菌，蓝色字体为益生菌；图10为Tax4Fun 2级功能衍生热图和层次聚类比较；图11：（A）BugBase表型预测和（B）FAPROTAX 功能预测；图12为矸石恢复区土壤对大麦幼苗（A）芽长、（B）根长、（C）芽重和（D）根重的影响；图13为恢复区土壤对大麦叶片（A）叶绿素a、（B）叶绿素b和（C）总叶绿素含量的影响；图14为恢复区土壤对大麦叶片丙二醛含量的影响；图15为恢复区土壤对大麦叶片（A）SOD、（B）CAT、（C）POD和（D）GSH活性的影响；图16为恢复区土壤对大麦根尖细胞微核率的影响。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。本领域技术人员意识到的通过常规实验就能了解到的描述的特定实施方案的等同技术，都将包含在本申请中。

一、煤矿恢复区修复植物多样性分析：在温带气候中，草和豆类物种最适合用于退化地点修复。在热带地区草类、豆类甚至乔木都可种植。这几种植物各有优势，草的生长范围广阔，适应性强；豆科植物可通过根瘤菌进行固氮，供给植物更多营养；乔木最大的优势是固土，减少水土流失。恢复区主要修复植物见表1，共有8科13属13种，豆科植物占物种总数的50%。主要分乔木、灌木、地被植物三类。

表1：恢复区主要修复植物

二、煤矿恢复区微生物多样性分析

1、土壤微生物基因组 DNA 的提取和 16S rDNA PCR扩增

从-80℃冰箱中取出预存土样，提取基因组 DNA，用 NanoDrop2000 超微量分光光度计检测提取液中 DNA 浓度和纯度（OD260/OD280），通过琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 完整性。以提取的 DNA 为模板，扩增细菌16S rDNA V3-V4区，通用引物为 338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3’）和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3’）。PCR 试验采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，PCR仪为 ABI GeneAmp 9700型，反应条件：95°C 3min，95°C 30s， 72°C 45s，72°C 10 min，共27个循环。琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，将大小正确、浓度合适的条带切割下来，并纯化回收。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluor -ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合用于后续实验。

2、文库构建和上机测序：通过 PCR 将 Illumina 官方接头序列添加至目标区域外端，使用凝胶回收试剂盒切胶回收 PCR 产物，Tris-HCl 缓冲液洗脱，2% 琼脂糖电泳检测，加氢氧化钠变性，产生单链DNA片段，完成文库构建，并进行Miseq 测序 。

3、生物信息分析：Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析。

4、微生物多样性指数分析：通过对土壤样品中细菌16S rRNA基因llumina MiSeq测序，获得优化序列 776548 条，物种注释得到38个门，132个纲，316个目，501个科，984个属，1992种，5775个OTU。Good's覆盖率均在97.5%以上，测序已覆盖了样品中所有物种，本次测序结果可以代表样本真实情况。

α多样性可反映微生物群落内部多样性，常通过一些指数来表征。sobs为群落丰富度实际观测值；Shannon和Simpson指数反映物种均匀度，Shannon 指数描述个体出现的紊乱和不确定性， Simpson指数为随机取样的两个OUT属于不同种的概率，Shannon指数数值越大，Simpson指数数值越小，群落物种分配的均匀度越高。chao和Ace指数反映群落丰富度，两指数通过不同算法估计群落中所含OUT数目，数值越大物种数越多。表2为细菌α多样性结果。

表2：土壤细菌群落α多样性

不同区域（D雨季、H雨季），堆积区sobs值高于恢复区，其实际物种数较多，两区域细菌均匀度和丰富度无统计学差异，不同季节（H雨季、H旱季），雨季微生物均匀度和丰富度较高。本发明选取的矸石堆积区人为扰动大，一方面相较于其它矸石山污染较轻，多数微生物生长不受限制，另一方面，该堆积区准备覆土修复，属于恢复初期α多样性可能增加，因而两处微生物多样性和丰富度无显著差异。

本发明通过NMDS 衡量样本的β多样性，用weighted_normalized_unifrac距离，考虑样本间进化关系和物种丰度。不同区域样本中，堆积区样本差异较大，恢复区样本差异较小，堆积区D3、D4微生物与恢复区相近。不同季节中，雨季样本差异较小，旱季差异较大。

5、微生物群落结构分析：为了解细菌群落组成情况，对细菌OTU进行注释分类，通过细菌群落柱状图进行分析。

以门作为分类学水平进行分析，将相对丰度< 1% 的门归入其它，共获得14种主要细菌。如图4，采样点土壤中相对丰度较高的细菌依次为放线菌门（Actinobacteria），变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria），厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota），黏细菌（Myxobacteria）、芽孢杆菌门（Patesclbacteria）、蓝细菌门（Cyanobacteria），恐球菌（deinococcota）、浮霉菌门（planctomycetota）、嗜甲基菌（Methyloirabilota），WPS-2。

总体来看，不同区域，矸石堆积区微生物包括14个门，矸石恢复区微生物为10个，两个优势菌群放线菌门、变形菌门在堆积区占比0.6左右，在恢复区占比高于0.7，恢复区微生物群落稳定；不同季节，雨季优势菌占比更高。我们推测恢复区微生物经多年竞争、共生，已形成结构稳定的微生物群落，部分处于劣势的微生物已被淘汰。

以属作为分类学水平进行分析，将平均丰度小于1.5%的菌属归入其它，共获得26个菌属。相对丰度较高且明确命名的属包括节杆菌属（Arthrobacter）、芽球菌（Blastococcus）、马赛菌属(Massilia)、类诺卡氏菌属（Nocardioides）、微枝形杆菌属（Microvirga）、微红微球菌（Rubellimicrobium）、芽孢杆菌（Bacillus）、链霉菌属（Treptomyces）、红杆菌（Solirubrobacte）、链霉菌属（Streptomyces）、假单胞菌属（Pseudomonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）。与门水平相似，不同区域属水平上也表现为，恢复区优势菌群占比较高，恢复区旱雨两季优势属占比均在0.4-0.6之间，差异较小。不同距离处，在堆积区和恢复区（雨季）均随距离增加相对丰度升高，新草螺菌（Noviherbaspirillum）在在堆积区随距离增加相对丰度升高，在恢复区（雨季）则相反。

6、样本间差异比较：LEfSe分析可以用于区别两个或两个以上生物条件（或者是类群），找到与丰度有显著性差异的类群，用线性判别分析（LDA）估算组（物种）丰度对差异影响的大小。本研究选择从门到科水平，研究LDA阈值高于2的物种，结果如图5。堆积区雨季有22种微生物富集，恢复区雨季有9种，恢复区旱季有12种。

为进一步了解堆积区和恢复区微生物差异，通过Wilcox秩和检验在属水平前进行组间差异显著性检验，通过fdr多重检验校正。结果如图6所示，显示堆积区马赛菌属（Massilia）、微枝形杆菌属（Microvirga）较低。马赛菌为富营养菌，易于在氮、磷和有机物等营养物质充足时生长，有利于提高植物抗病性，如产生几丁质酶抑制青枯菌，从而提高甜菜幼苗的抗病性。微枝杆菌属α-变形杆菌门的根瘤菌，是一种能够结瘤固氮的共生根瘤菌。

通过16S rRNA测序研究土壤的微生物多样性群落、组成多样性。结果显示：矸石恢复区植被共有8科13属13种，豆科植物占物种总数的50%。植被主要分乔木、灌木、地被植物三类。微生物α多样性显示，实际物种数堆积区高于恢复区，但微生物均匀度和丰富度无显著差异；恢复区雨季微生物物种高于旱季，且雨季微生物均匀度和丰富度较高。矸石区及周边土壤微生物群落，门水平主要有放线菌门，变形菌门，绿弯菌门，酸杆菌门，芽单胞菌门，厚壁菌门；属水平主要有节杆菌属、假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、芽球菌。堆积区优势菌群相对丰度较低。矸石山近处、周边重金属污染高处假单胞菌、鞘氨醇单胞菌含量较高。样本间差异比较中，LEfSe分析显示堆积区有更多特征微生物富集，相较于堆积区，恢复区马赛菌属和微枝形杆菌属显著富集。

三、主控污染物胁迫下微生物响应

1、主控污染物对微生物多样性的影响

A、污染物对微生物α多样性的影响：为了解土壤中重金属、PAHs含量对微生物α多样性的影响，对该矸石区（包含堆积区雨季、恢复区雨季和恢复区旱季）污染物含量和多样性进行分析，选择shannon指数代表微生物均匀度，chao指数解释微生物丰富度，利用多元回归分析逐步法向后剔除法对污染物含量与多样性指数之间进行分析。得出式子如下：shannon=3.648+ 0.054Pb；chao=2560.7+ 40.7As+13.1 Nap- 260.0Ace+236 Flu。显示了重金属、PAHs对微生物shannon指数的影响，结果显示在该矸石区微生物均匀度受Pb影响，即Pb含量越高各微生物相对丰度差异越小，难以形成优势菌群。重金属、PAHs对微生物chao指数的影响，结果显示As、Nap、Ace和Flu对微生物丰富度有影响。

B、污染物对微生物群落结构的影响

污染物对不同丰度区间OTU的影响：微生物与重金属、PAHs含量的Spearman相关性，可反映其对微生物群落结构的影响。选择相对丰度高于0.1%的374个OTU，将其分为高丰度（>1%）、中等丰度（0.5%-1%）和低丰度（0.1%-0.5%）,分析不同丰度区间OTU与污染物Spearman相关性。经统计，高、中底丰度OTU各有14、39和321个。整体来看，与重金属显著相关的OTU数量为12~37，重金属影响排序为As >Zn >Cd >Cu >Pb >Cr，As、Cd、Cu和Zn为负相关为正相关的2.7-6.4倍，而Cr和Pb正负相关数相同。对高丰度的微生物Cd和Pb影响较大，且主要为负相关；Cd、Cu和Zn对中等丰度微生物影响较大，OTU显著相关性占比相同，Cd和Cu均为负相关；低丰度微生物中，As和Zn的影响较大。与重金属相比，PAHs显著相关的OTU数量较少，范围为7~29，Flt、Pyr和BaP的影响较大占20%以上，Nap影响最小为6个，其次是Flu有8个。高丰度的微生物受Phe和Chy影响较大，中等丰度微生物受BbF和Chy影响较大，低丰度微生物主要受Acy影响。总体而言，该区域相对丰度值高于0.1%的微生物受重金属影响较大。

表3：不同丰度区间OTU与污染物显著相关性百分比

污染物对相对丰度前30属的影响：为进一步分析重金属对不同类别的微生物的毒性作用，我们从属水平选取相对丰度前30的微生物，并与污染物进行相关性分析（图7）。重金属与相对丰度前30的微生物均为负相关关系，重金属显著相关数量排序为Pb（4）>Cd、Cu（3）>Zn、As、Cr（2），PAHs中Nap与微生物相对丰度无关，从Phe开始LMW、MMW、HMW与微生物相关性结果相似。马赛菌属与Cd、Cr、Pb和多数PAHs显著负相关，新草菌属（Noviherbaspirillum）与Pb和多种PAHs显著负相关，此外，黏附杆菌（Adhaeribacter）和节杆菌属（Arthrobacter）也与多种PAHs显著负相关。

物种相关性网络图主要反映某一环境条件下各分类水平的物种相关性。选取门分类学水平总丰度前30的物种与重金属、PAHs，并计算物种之间的斯皮尔曼等级相关系数，以反映物种之间的相关性。如图8，已明确分类的微生物中，假单胞菌属（Pseudomonas）与多数污染物呈负相关，假单胞菌能够降解烃类，如菲，苯并[ a ]蒽和苯并[ a ] 芘，也与碳循环的在地表和地下沉积物还原铁的耦合。分枝杆菌能够代谢多种PAH，例如萘，蒽，荧蒽，菲，苯[ a ]蒽。其次链霉菌属（Streptomyces）和纤维单胞菌属（Celluomonas）也显示与污染物的负相关关系。

2、污染物对病原菌和益生菌的影响：为了阐明矸石恢复区及周边土壤重金属、PAHs含量与机会病原菌、益生菌的关系，使用Spearman相关性进行分析。

病原菌、益生菌与污染物相关性分析显示（图9），污染物与病原菌的相关性更强，Pb和两种病原菌正相关，BkF、BaP等7种PAHs与1种病原菌显著正相关，这里军团菌（Legionella）与重金属Pb和多数PAHs显著正相关，军团菌为革兰氏阴性菌，广泛存在于水生系统和土壤中，在游泳池、工业冷却液、废水处理厂均有发现，通过摄入污染水源进入人体，爆发源通常为维护不善的冷却塔，该属常见的致病微生物为嗜肺军团菌，可引起肺炎型疾病。Pb的另一个显著正相关微生物为棒状杆菌（Corynebacterium），其典型病原菌为白喉棒状杆菌，通过接触开放创疮、飞沫、污染表面传播，进入鼻炎通道，对人体呼吸系统产生不良影响。

有研究显示，低浓度的重金属会促进微生物生长。一般来说，土壤病原菌生长遵循生存-致病权衡规律，即当胁迫增强时，病原细菌必须提升其抵御胁迫能力以保证自身的生存，这往往伴有细胞结构改变导致的资源摄入能力降低、毒性基因丢失、毒性基因表达准确度的降低以及有害突变的增加等，即生存成本提高，这样分配给致病相关特性（如生长、繁殖、毒性因子等）的资源相对减少，即表现为致病能力下降。军团菌与多种污染物呈显著正相关，胁迫减小，生存成本降低，致病能力可能会提高，造成周边居民健康风险。

四、微生物功能预测

1、预测方法：16S rRNA基因可以对系统发育标记基因进行分析，但不能提高群落功能能力的直接证据，因此，利用微生物功能预测分析群落功能。微生物功能预测方法包括PICRUSt功能预测（PICRUSt1和PICRUSt2）、Tax4Fun功能预测、BugBase表型预测、FAPROTAX功能预测等。

其中，PICRUSt功能预测和Tax4Fun功能预测均可以根据KEGG数据库的信息，可以获得KO、Pathway、EC信息，研究比较了3种常用的微生物群落功能预测工具的表现，发现与宏基因组比较，预测工具针对土壤等环境样本使用时会产生较大的误差，但各预测软件的结果准确性并没有本质的区别，发现两者差异较小，可选用一种进行分析。此外Tax4Fun功能预测以SILVA数据库为基础，最后一次更新于2015年，而PICRUSt功能预测以GreenGene为基础，更新于2013年，因此本发明选择Tax4Fun功能预测。BugBase表型预测可以确定微生物样本中存在的高水平表型。过程为通过预测的16S拷贝数对OTU进行归一化，然后使用提供的预先计算的文件预测微生物表型。FAPROTAX 功能预测主要分析原核生物代谢及生态功能。它以人工培养的代表文献为基础，人工构建数据库，将原核生物分类群（如属或种）映射到代谢或其他生态相关功能（如硝化与反硝化，硫、氮、氢和碳循环，致病性等）。

2、微生物功能预测结果：基于Tax4Fun功能预测KEGG 通路在第 2级的主要功能及其层次聚类结果如图10所示。聚类分析结果表明，土壤样品可以根据群落功能分为两组，一组为雨季，一组为旱季。恢复区矸石山处感染性疾病病毒（Infection disease viral）丰度极高。受高含量污染物影响，堆积区农田微生物排泄系统（Excertory system）和免疫系统（Immune system）丰度较高。

BugBase表型预测涉及的表型相对丰度由高到低排序为生物膜形成（Forming_Biofilm）、氧化胁迫耐受（Stress_Oxidative Tolerant）、移动元件（Containing_MobileElement）、革兰氏阳性（Gram Positive）、革兰氏阴性（Gram Negative）、致病性（Pathogenic）、、氧需求（Oxygen Utilizing）及七大类。

BugBase表型预测结果显示（图11A），恢复区存在更多的厌氧（Aerobic）过程，堆积区潜在致病性（Potentially_Pathogenic）相对丰度更高。

FAPROTAX 功能预测微生物注释到53个生态功能类群，选取占比高于1%的前12个功能进行分析（图11B）。恢复区化学异养（chemoheterotrophy）、需氧化学异养（aerobic_chemoheterotrophy）显著高于堆积区，堆积区发酵（fermentation）显著高于恢复区。

污染物与微生物α多样性指数多元回归分析表明，shannon指数受Pb影响，chao受As、Nap、Ace和Flu影响。该区域相对丰度值高于0.1%的微生物受重金属影响较大，Cd和Pb对高丰度的微生物影响较大，Cd、Cu和Zn对中等丰度微生物影响较大，As和Zn主要影响低丰度微生物，PAHs中高丰度的微生物受Phe和Chy影响较大，中等丰度微生物受BbF和Chy影响较大，低丰度微生物主要受Acy影响。在相对丰度前30的属中马赛菌属、新草菌属、黏附杆菌和节杆菌属与Pb和多种PAHs显著负相关。恢复区矸石山处感染性疾病病毒丰度极高，堆积区农田微生物排泄系统和免疫系统丰度较高。结合病原菌相关兴奋，军团菌和棒状杆菌可能是该区域主要潜在致病菌。

五、主控污染物胁迫下植物响应：为了解矸石区土壤污染物对植物的影响，我们选取恢复区旱季0~800m不同距离的土壤样品，通过模式植物大麦毒性指标了解植物响应状况。

1、土壤样本采集：在距矸石山的下游0m、100m、200m、400m、600m、800m处采样。对照土壤采自距矿区5km外的未受污染的地点。每个采样点去除表层土壤后，然后通过梅花布点法采集3~5个子样本，采样深度为0~20 cm，四分法充分混匀土壤，去除石头和植物残留物后，所有收集的样品均存储在密封的聚乙烯袋中，并在自然干燥条件下移至实验室。

2、大麦种子的处理：大麦种子发芽前用3％（v/v）的H₂O₂溶液表面灭菌30min，用去离子水冲洗干净。然后将种子在蒸馏水中浸泡4~6小时。随后挑选颗粒饱满的种子移至潮湿的滤纸上发芽。36~48 h后，选择根长为1.5~2 cm左右的大麦种子移植入圆形塑料花盆中（上部直径9cm，下部直径7cm，高度为7cm），每盆放置10粒种子，且每盆称取距矸石山不同距离的200g土样。所有试验组以光照：黑暗周期为12 h:12 h的条件下在25±1℃的恒温培养箱中生长。实验过程中每天定时添加蒸馏水。

3、大麦幼苗生长实验：大麦种子种植7天后，收集各处理组幼苗并测量其茎叶长和根长，此外，将每组的所有幼苗用蒸馏水洗涤并干燥，然后剪下茎叶和根部称重（新鲜重量）。

4、叶绿素含量的测定：大麦幼苗暴露7天后，采集新鲜叶片（0.1 g）剪碎后浸入10mL提取液中（95%乙醇：80%丙酮=1:1），然后在黑暗室温条件下浸提18 h，提取上清液在酶标仪645 nm和663 nm处测量吸光度。叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量的计算公式如下：叶绿素a（mg/g）=（12.7A ₆₆₃-2.69A ₆₄₅）×V/W/1000；叶绿素b（mg/g）=（22.9A ₆₄₅-4.68A ₆₆₃）×V/W/1000；总叶绿素（mg/g）=叶绿素a+叶绿素b。

5、氧化应激反应测定：暴露7天后，将重量为0.1g的新鲜叶片在研钵中用预冷的磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH=7.4）研磨匀浆，随后将匀浆液在4℃下以3000转/分钟离心10min提取上清液以测定。大麦叶片中MDA、SOD、POD、CAT和GSH的活性使用试剂盒以测定。另外，使用Bradford法测定上清液中的蛋白含量，结果以U/mg蛋白表达。

6、大麦根尖有丝分裂指数和微核的测定：大麦幼苗暴露2天后，将其根系从土壤中移出并用自来水彻底冲洗，除去粘附在根部的土壤，然后自根尖顶端切下1~1.5cm长的幼根并用卡诺固定液（乙醇：乙酸=3:1）固定24小时，随后转入70％的乙醇中保存。取固定好的根部用蒸馏水冲洗后加入适量1 mol/L的盐酸，放入60℃的水浴中水解8分钟。用Schiff试剂染色后，将根尖分生组织切下并滴入45％的乙酸，加盖玻片，常规压片。有丝分裂指数（MI）表示为有丝分裂细胞在根尖细胞总数（1000个细胞）中所占的百分比，微核率（MN）表示为每1000个细胞中含有微核的细胞数。每个处理约观察5000个根尖细胞。并使用带有内置数码相机的光学显微镜以1000倍的放大倍率观察并记录。

7、数据统计与分析：采用Origin 8.0统计软件对数据进行分析，结果描述为三个独立实验的平均值±标准偏差（SD）。使用单因素方差分析（One-way ANOVA）分析处理组之间的显著性差异，然后进行Fisher最小显著差异（LSD）检验。为了确定重金属与植物毒性之间的关系，使用了Pearson相关性检验。*p<0.05代表具有显著性差异。

六、恢复区周边土壤植物毒性评估

1、恢复区周边土壤对大麦幼苗生长的影响：为了更好的评估矸石山恢复区及其周边土壤污染对植物生长的危害，运用了植物毒性评估方法来全面预测调查区域的植物毒性。

图12为矸石山恢复区下游不同距离土壤对大麦幼苗芽长、根长、芽重与根重的影响。总体来说，四个生长指标随着距矸石山距离的增加呈现出先降低后上升再降低的趋势，所有土壤暴露组与对照组相比均有显著性差异。在100 m土壤的暴露下，大麦幼苗的芽长达到最低，比对照组减少了36%。大麦根长在800 m土壤的暴露下达到最低值，比对照组减少了27%。在矸石山恢复区不同距离土壤的暴露下，大麦幼苗的芽重显著降低（p<0.001），在200m土壤的处理下达到最低值，为对照组芽重的39%，同时，在距矸石山0 m的土壤暴露下，根重达到了最低值，比对照组显著降低了约34%。

2、恢复区周边土壤对大麦幼苗叶绿素含量的影响：不同距离土壤样品处理7天后，大麦叶片叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量的变化如图13所示。在0 m、100 m、400 m和600m土壤的暴露下，大麦叶绿素a含量显著降低，与对照组相比分别降低了19%、12%、20%和17%，在400m时达到最低。而不同土壤处理组下的叶绿素b的含量与对照组相比无任何显著性变化，说明叶绿素b对土壤中的污染物不敏感。大麦幼苗总叶绿素含量在0 m、400 m和600 m土壤的暴露下同样显著降低（p<0.05），比对照组减少了16%、12%和11%。

3、恢复区周边土壤对大麦幼苗丙二醛含量的影响：图14为矸石山下游不同距离土壤暴露7天后，大麦幼苗丙二醛含量变化大小。随着距矸石山距离的增加，大麦幼苗丙二醛含量逐渐升高，其在200 m土壤的暴露下，达到了对照组土壤的2.06倍。而MDA的含量在400m、600 m和800 m土壤的暴露下无显著变化。

4、恢复区周边土壤对大麦幼苗抗氧化防御系统中酶系与非酶系的影响：为了抵抗外界污染环境引起的植物损伤，植物自身保护系统会产生一系列抗氧化防御酶与非酶来抵御污染物的胁迫，它们的活性水平可作为植物逆境生长和受危害的显著指标。因此，接下来测量了大麦幼苗体内SOD、CAT、POD和GSH的活性。如图15所示，POD活性在200 m和800 m土壤的暴露下显著上升（p<0.01），分别比对照组增加了约30%与35%。SOD的活性只有在200 m土壤的暴露下才呈现出显著上升的趋势（p<0.01），比对照组增加了约33%。在所有土壤处理组的暴露下，大麦幼苗的CAT活性均显著下降（p<0.001），0 m、100 m、200 m、400 m、600 m和800 m的CAT活性比对照组降低了约46%、43%、36%、48%、34%和44%。非酶类GSH的活性随着距矸石山距离的增加，总体呈现出先上升后下降的趋势，和POD的活性变化趋势基本一致，在200 m和800 m土壤的暴露下，GSH的活性相比对照显著上升了约1.81倍和1.16倍。

5、恢复区周边土壤对大麦根尖有丝分裂指数的影响：表4为矸石山下游不同距离的土壤对大麦根尖细胞48h有丝分裂指数的影响。仅在0 m和200 m土壤的暴露下，有丝分裂指数相比对照组有显著降低，分别降低了21%和24%。在有丝分裂相分布中，不同距离的土壤暴露组中的前期指数相比对照组均有显著性降低，且随着距离的增加，呈现出先降低后上升的趋势，与前文中生长指标的变化具有相似的一致性。在0 m、100 m、200 m、400 m、600 m和800 m的土壤暴露下，前期指数分别降低了46%、71%、77%、64%、51%和65%。中期、后期和末期指数相比对照组无显著变化。

表4：矸石山下游不同距离的土壤对大麦根尖细胞48h有丝分裂指数的影响

6、恢复区周边土壤对大麦根尖细胞微核的影响：矸石山周边的重金属污染土壤除了能够抑制大麦根尖有丝分裂指数，同时能够在细胞中诱导微核的发生。如图16所示，矸石山下游不同距离的土壤均能够显著诱导大麦根尖微核的产生，0 m、100 m、200 m、400 m、600 m和800 m土壤的微核相比对照分别增加了约8.6、7.4、12.2、7.4、11和6倍。这一结果说明细胞遗传毒性中微核的发生率是植物遭受外界污染环境胁迫的敏感监测工具。

7、恢复区周边土壤重金属含量与植物毒性之间的相关关系：为了查明恢复区污染土壤中重金属与植物毒性的关系，接下来使用了皮尔森相关系数来解释它们之间的关系。如表5所示，大麦幼苗的芽长和根长与6种重金属之间没有发现显著的相关性，而芽重与Cr元素呈显著的正相关（p<0.01），根重与As元素呈正相关（p <0.05）。同时还观察到Cu元素与大麦幼苗中叶绿素b和总叶绿素含量呈显著的负相关，说明土壤中Cu元素的存在能够影响大麦叶片光合作用的进行。此外，Pb和Zn与根尖微核的发生率之间分别为显著的负相关和正相关关系，并且本研究土壤中Pb和Zn的含量明显高于山西省土壤背景值，并且具有一定的潜在生态风险，因此，这些结果说明微核实验是检测重金属污染土壤的敏感指标。

表5：恢复区土壤重金属含量与植物毒性之间的相关关系

结果如下：距矸石山不同距离的土壤均导致大麦幼苗的生长受抑，根长、根重、芽长和芽重均显著下降，在200 m土壤的暴露下达到最低值；暴露于0 m、400 m和600 m土壤后，大麦叶片总叶绿素含量显著降低；暴露于100 m和200 m土壤后，大麦幼苗中的MDA含量显著升高；在不同距离的土壤暴露下，大麦叶片中SOD、POD和GSH的活性被显著诱导，而CAT的活性显著降低；暴露于0 m和200 m污染土壤中大麦根尖的有丝分裂指数显著降低，并且暴露于不同距离的土壤后，所有处理组的微核率显著上升；相关性分析表明，大麦芽重与Cr元素呈显著的正相关，根重与As元素呈正相关，Cu元素与叶绿素b和总叶绿素含量呈显著的负相关，Pb和Zn与根尖微核的发生率之间分别为显著的负相关和正相关关系。

七、煤矿恢复区后期生态修复：矿区开采对环境造成的破坏是不可逆的，威胁到生态和人体健康，其生态修复是漫长的。矿区植物-微生物修复不仅能够改善土壤结构，提高土壤质量，减少土壤污染物含量，同时，对提高当地生物多样性，提升当地生态系统稳定性也具有重要作用。

由主控污染物生态风险和健康风险结果，该矸石恢复区后期修复重点是Pb和PAHs，这些污染物在矸石区周边农田处也有较高含量，Pb含量高于山西省土壤背景值的2倍，低环、中环PAHs含量超过可忽略风险值，部分高环PAHs（如BbF、BaP）甚至还存在致癌风险。如果不能在后期工作中给予针对性修复，这些主控污染物降解或去除效率极低，将会延长生态恢复时间，对周边居民健康产生严重威胁。因此，我们需要进一步利用好植物-微生物联合修复模式，加快矸石区生态系统的恢复与重建。

1、植物配置及选择：近年来，大量学者基于盆栽实验引入高富集植物，进通过田间实验测试修复效果，但从长远来看，本地物种更具修复潜力。在温带气候中，草和豆类物种最适合用于退化地点修复。在热带地区草类、豆类甚至乔木都可种植。这几种植物各有优势，草的生长范围广阔，适应性强；豆科植物可通过根瘤菌进行固氮，供给植物更多营养；乔木最大的优势是固土，减少水土流失。我国矿区常用修复植物见表6。

表6：矿区修复常用植物物种

2、微生物配置及选择：微生物通常用植物根瘤菌、菌根真菌、原土分离的根际微生物以及非共生微生物。已有大量研究分离出用于修复的微生物，如表7。根瘤菌是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，它本身离体生长慢且无固氮能力。在侵染豆科植物根部后，根瘤菌可以从单独细菌发展成含10⁸个菌体的根瘤，每个植株有100左右根瘤，可以固定空气中分子的态氮形成氨，为植物提供氮素营养，改良土壤。根瘤菌可以改善共生植物对重金属的抵抗力和植物提取能力然而，重金属对根瘤菌结瘤率影响远大于对植物生长的影响。重金属浓度过高，直接对根瘤菌结瘤产生强抑制，从而难以形成联合修复体系。菌根真菌在土壤中分布广泛，在森林、农田、草原、沙漠、盐碱地、工业污染区生态系统中均有发现，菌根真菌应用广泛，但受土壤环境、共生植物种类、污染物种类与浓度的影响，其修复效果不一。原土根际微生物的数量取决于根系分泌物的组成、植物种类、根系类型、植物年龄以及土壤类型。很多根际微生物属于植物生长促进细菌(PGPB)，它们定居在植物根的不同生态位，能够比单一物种/菌株更有效地降解污染物，但不具有广泛适用性。但大多数土壤微生物 (> 99％) 尚未被培养出来，但它们可能在植物修复中起着重要作用。

表7：矿区修复微生物物种

3、不同复垦阶段矸石山修复措施：对于即将修复的矸石堆积区，采取豆科植物+马赛菌属。

植被演替顺序为低矮的灌木丛到混合灌木、针叶、落叶树种，矿区植被复垦优先选用一年生草本植物，该区域豆科植物较多且长势良好。微生物多样性均显示马赛菌属与污染物呈负相关，该菌有重金属抗性和PAHs降解能力，且在恢复区含量明显升高，而相较于单一微生物多微生物菌剂适用性更强。因此，该矿区后期可通过豆科植物（如紫花苜蓿）结合含马赛菌属的菌剂进行后续修复。

对于Pb、PAHs污染的矸石恢复区，采取Pb超积累植物+经济作物+假单胞菌。

超富集植物Pteris vittata L.和经济植物蓖麻 (Ricinus community L.)联合种植时，既可以提高重金属As、Cd的提取率，也可以提高 Pteris vittata L的产量。因此我们可以考虑Pb超积累植物与蓖麻、苜蓿（饲料）等经济作物联合种植。Pb超积累草本植物商陆（Phytolacca Acinosa Roxb）中Pb的积累可随着PbCl₂浓度的增加而增加；当PbCl₂含量达到最高浓度200 mg/kg时，地上部分Pb含量最高为1.763 mg/g DW，可利用商陆结合Thysanolaena latifolia和Mimosa pudica等Pb超积累植物。绿藻假单胞菌表现出溶解磷酸盐和固定铅的能力。此外假单胞菌对PAHs也表现出高效降解能力。

因此，该矿区恢复区后期可通过Pb超积累植物+经济作物+假单胞菌进行后续修复。

本发明立足于山西省煤矿恢复区土壤污染现状，分析主控污染物胁迫下植物与微生物多样性响应，筛选并构建高效降解主控污染物的植物-微生物群落修复体系。主要结论如下：

植物、微生物多样性分析表明，矸石恢复区植被共有8科13属13种，豆科植物占物种总数的50%。矸石区及周边土壤微生物群落，门水平主要有放线菌门，变形菌门，绿弯菌门，酸杆菌门，芽单胞菌门，厚壁菌门；属水平主要有节杆菌属、假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、芽球菌。堆积区优势菌群相对丰度较低。矸石山近处、周边重金属污染高处假单胞菌、鞘氨醇单胞菌含量较高。堆积区有更多特征微生物富集，相较于堆积区，恢复区马赛菌属和微枝形杆菌属显著富集。

污染物胁迫下，微生物α多样性shannon指数受Pb影响，chao受As、Nap、Ace和Flu影响，微生物结构相对丰度值高于0.1%的微生物受重金属影响较大，Cd和Pb对高丰度的微生物影响较大，Cd、Cu和Zn对中等丰度微生物影响较大，As和Zn主要影响低丰度微生物，PAHs中高丰度的微生物受Phe和Chy影响较大，中等丰度微生物受BbF和Chy影响较大，低丰度微生物主要受Acy影响。在相对丰度前30的属中马赛菌属、新草菌属、黏附杆菌和节杆菌属与Pb和多种PAHs显著负相关。恢复区矸石山处感染性疾病病毒丰度极高，堆积区农田微生物排泄系统和免疫系统丰度较高。结合病原菌相关性分析，军团菌和棒状杆菌可能是该区域主要潜在致病菌。

植物毒性实验表明，距矸石山不同距离的土壤均导致大麦幼苗的生长受抑，根长、根重、芽长和芽重均显著下降，大麦叶片总叶绿素含量显著降低，大麦叶片中SOD、POD和GSH的活性被显著诱导，而CAT的活性显著降低；暴露于0m和200m污染土壤中，大麦幼苗中的MDA含量显著升高，有丝分裂指数显著降低，并且暴露于不同距离的土壤后，所有处理组的微核率显著上升。相关性分析表明，大麦芽重与Cr元素呈显著的正相关，根重与As元素呈正相关，Cu元素与叶绿素b和总叶绿素含量呈显著的负相关，Pb和Zn与根尖微核的发生率之间分别为显著的负相关和正相关关系。

根据本发明结果提出以下建议：进一步利用好植物-微生物联合修复模式，加快矸石区生态系统的恢复与重建。对于即将修复的矸石堆积区，Pb、As、Cu和PAHs含量较高，理化性质差，可采取豆科植物+马赛菌属修复模式；对于Pb、PAHs污染的矸石恢复区，采取Pb超积累植物+经济作物+假单胞菌。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种构建煤矿恢复区植物-微生物群落联合修复体系的方法，其特征在于：采用样方调查方法，调查矸石恢复区植被群落组成与结构特征；采用 Miseq 高通量测序技术，检测矸石区土壤中细菌群落的组成及多样性，分析矿区堆积、修复不同阶段与修复区不同季节微生物群落的组成、分布及其多样性特征，并分析其差异性，采用共进化策略筛选高效降解污染物的植物根际-微生物生态群落；最终构建土壤-植物-微生物高效降解体系。

2.根据权利要求1所述的一种构建煤矿恢复区植物-微生物群落联合修复体系的方法，其特征在于：采用 Miseq 高通量测序技术，检测矸石区土壤中细菌群落的组成及多样性，具体方法为：采用通用引物 338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3’）和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3’）提取土壤微生物基因组DNA，16S rDNA PCR扩增，然后构建文库并进行 Miseq 高通量测序，Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析；

微生物多样性分析为：α多样性：sobs为群落丰富度实际观测值；Shannon和Simpson指数反映物种均匀度，Shannon 指数描述个体出现的紊乱和不确定性，Simpson指数为随机取样的两个OUT属于不同种的概率，Shannon指数数值越大，Simpson指数数值越小，群落物种分配的均匀度越高；chao和Ace指数反映群落丰富度，两指数通过不同算法估计群落中所含OUT数目，数值越大物种数越多；β多样性：反映不同样本间群落组成的差异性：，通过样本相似距离值衡量；NMDS为非约束性排序分析，将多维空间的研究对象简化到低维空间进行定位分析和归类，反映菌群相似性和差异性；通过NMDS 衡量样本的β多样性，用weighted_normalized_unifrac距离，考虑样本间进化关系和物种丰度；

微生物群落结构：对细菌OTU进行注释分类，通过细菌群落柱状图进行分析，以门作为分类学水平进行分析，将相对丰度< 1% 的门归入其它，以属作为分类学水平进行分析，将平均丰度小于1.5%的菌属归入其它，得到微生物群落结构；

差异性分析：LEfSe分析用于区别两个或两个以上生物条件或者是类群，找到与丰度有显著性差异的类群，用线性判别分析LDA估算组即物种丰度对差异影响的大小，从门到科水平，研究LDA阈值高于2的物种，得到不同区域土壤微生物组间差异性，通过Wilcox秩和检验在属水平前进行组间差异显著性检验，通过fdr多重检验校正。

3.根据权利要求1所述的一种构建煤矿恢复区植物-微生物群落联合修复体系的方法，其特征在于：采用共进化策略筛选高效降解污染物的植物根际-微生物生态群落，具体方法为：采用多元回归分析了解土壤中重金属、PAHs含量对微生物α多样性指数的影响，选择shannon指数代表微生物均匀度，chao指数解释微生物丰富度，利用多元回归分析逐步法向后剔除法对污染物含量与多样性指数之间进行分析，得公式：shannon=3.648+ 0.054Pb；chao=2560.7+ 40.7As+13.1 Nap- 260.0Ace+236 Flu；结果显示：Pb含量越高各微生物相对丰度差异越小，难以形成优势菌群；As、Nap、Ace和Flu对微生物丰富度有影响；

测定不同丰度区间OTU、相对丰度前30的属、病原菌和益生菌了解微生物群落结构的影响：微生物与重金属、PAHs含量的Spearman相关性，反映其对微生物群落结构的影响，选择相对丰度高于0.1%的OTU，将其分为：>1%为高丰度、0.5%-1%中等丰度和0.1%-0.5%低丰度,分析不同丰度区间OTU与污染物Spearman相关性；

进一步分析重金属对不同类别的微生物的毒性作用，从属水平选取相对丰度前30的微生物，并与污染物进行相关性分析；接着选取门分类学水平总丰度前30的物种与重金属、PAHs，并计算物种之间的斯皮尔曼等级相关系数，反映物种之间的相关性；使用Spearman相关性进行分析污染物对病原菌和益生菌的影响；

对微生物功能进行预测：选择Tax4Fun功能预测KEGG 通路在第 2级的主要功能及其层次聚类，BugBase表型预测确定微生物样本中存在的高水平表型，通过预测的16S拷贝数对OTU进行归一化，然后预测微生物表型；FAPROTAX 功能预测分析原核生物代谢及生态功能，将原核生物分类群映射到化学异养（chemoheterotrophy）、需氧化学异养（aerobic_chemoheterotrophy）、发酵（fermentation）生态相关功能。

4.根据权利要求1所述的一种构建煤矿恢复区植物-微生物群落联合修复体系的方法，其特征在于：构建土壤-植物-微生物高效降解体系具体方法为：对于即将修复的矸石堆积区，Pb、As、Cu和PAHs含量较高，理化性质差，采取豆科植物+马赛菌属修复模式；对于Pb、PAHs污染的矸石恢复区，采取Pb超积累植物+经济作物+假单胞菌。

5.根据权利要求4所述的一种构建煤矿恢复区植物-微生物群落联合修复体系的方法，其特征在于：所述Pb超积累植物为商陆、Thysanolaena latifolia或Mimosa pudica。

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