CN114289499A - 一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法，包括：(1)石油降解菌的筛选、富集与培养，其中以苯作为诱导和筛选条件；(2)混合培养细菌多样性分析；(3)混合细菌石油污染物降解能力测定；(4)混合细菌对土壤石油污染物降解效果的确定以及最优化降解体系构建；(5)土壤宏基因组学测序及其数据分析；(6)土壤宏基因组学分析关键降解酶丰度组间差异性；(7)氢供体降解系统构建方法。本发明在常温及低温条件下通过原位土著细菌实现的石油烃降解，即苯诱导混合细菌优化降解和氢供体降解。氢供体降解可以持续进行，并缓慢恢复土壤的微生态环境；修复土壤生态过程中无二次污染。

Description

一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法

技术领域

本发明属于环境污染物微生物学技术处理和修复领域，具体地说，涉及一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法。本发明的主要微生物群体属于细菌，而且是兼性营养型细菌，既可以利用现成的有机物，又可以利用石油烃类有机物，并且能够耐受石油烃等有毒物质的胁迫。

背景技术

石油是现代社会最重要的化石能源之一，由于现代全球工业化的迅速发展，被人类称为“工业血液”的石油的需求突飞猛进。随着开采、运输、精炼和利用，导致大量石油泄漏到环境中，造成经济损失和资源浪费。在自然界里，存在几百或者上千种微生物可以降解石油。微生物之所以能够降解石油烃是因为微生物的群落与物种的组成。有文章报道，菌群在石油污染的环境里，可以降解与利用烃类化合物的微生物，其数量将快速增加。Atlas报告说，一般的情况时，石油烃降解菌通常仅是微生物群落的1％。在存在石油污染的情况下，则能够有效的提升降解菌数量，使其占比达到10％。所以受到石油污染时，降解石油微生物种群将会出现明显的变化，有逐步扩展的趋势，导致石油污染区降解菌的数量大幅度增加。而降解菌的数量和污染程度之间表现为正相关性，即在石油污染更严重时，则往往会形成数量更大的石油降解菌。如今，国内外有许多关于单一的菌种对油污土壤进行生物降解的报道，在应用中不容易实现较好的降解效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法，利用苯诱导富集，获得了具有丰富单加氧酶以及双加氧酶的纯培养和混合微生物，对石油烃进行全面的降解，通过测定降解率确定纯培养以及混合微生物的降解作用优势。同时利用Illumina Hiseq平台的宏基因组测序方法分析污染土壤的微生物群落演替特征，能够更加有效地识别参与的微生物类群、种类，分析降解的规律。创新性地提出继续采用氢供体降解的方法，完成石油烃的持续降解。

为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案来实现：

一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法，其技术构思如下：

以阜新DL油库石油污染土壤为土著微生物来源，采用苯连续诱导培养，获得土著兼性营养型混合微生物，用这些原位混合微生物降解其所在土壤环境的石油污染物。用重量法与气相色谱质谱(GC-MS)法结合测定石油烃含量并确定降解率。土壤的修复前后pH、有机质、有效磷和阳离子交换率等测定并记录。与此土著微生物降解过程并行的是利用土壤环境宏基因组学方法，分析60天时间里的对照组、纯培养降解组和混合微生物降解组的组间代谢差异基因丰度变化情况，根据主要氧化酶基因丰度的变化规律确定了后续的氢供体降解系统的必要性。氢供体降解系统完成了混合细菌降解的未尽之能。

具体按照以下工艺步骤进行：

(1)兼性营养型土著混合微生物的获得。DL油库(E121.5544,N41.9095)附近石油污染土壤降解菌的筛选、富集培养。培养采用改良的基础盐培养基(MSM)，其组成如下所示：改良的基础盐培养基(MSM)：(NH₄)₂SO₄ 2.0～3.0g/L；MgSO₄·7H₂O 0.2～0.3g/L；CaCl₂·2H₂O 0.01～0.5g/L；FeSO₄·7H₂O 0.001～0.01/L；Na₂HPO₄·12H₂O 1.5～2.0g/L；KH₂PO₄1.5～2.0g/L；蒸馏水1000ml；另外需要加入葡萄糖0.5～2.0g/L、胰蛋白胨0.5～3.0g/L。121℃灭菌20～40分钟。苯作为降解性微生物的诱导剂，需要0.22μm孔径的滤膜过滤除菌后加入培养基中，并调整终浓度至150～200mg/L。基于相同的方式再将菌液3次转接富集培养。

(2)混合培养细菌群落结构多样性的识别。步骤(1)中培养所得的细菌群落通过16S rRNA基因作为群落结构识别的靶位点。其微生物群落组成丰度分别为肠球菌属(Enterococcus)79％±3％、不动杆菌属(Acinetobacter)15％±3％、芽孢杆菌属(Bacillus)3％±3％、克雷伯氏菌属(Klebsiella)2％等，其成员类型以兼性营养型为主。

(3)生化降解能力测定实验：用纯菌(不动杆菌)和混合菌对阜新DL油库的石油进行降解实验，利用分光光度计和气相色谱-质谱法(GC/MS)联合对降解前后的石油进行组分变化分析，主要分析石油组分里的正构烷烃、多环芳烃以及总石油烃含量。

(4)最优化石油污染土壤的降解体系的构建。根据单因素优化结果构建的降解系统组成成分有以下各项：取100g土(土壤石油浓度100g/kg)，接种量10％～20％(V/W)，即10～20mL菌液(浓度大约在1×10^7～8个/mL)；pH为6.5～7.5；牛肉膏用量0.4～0.6％(W/W)。

实验室自然条件下60天结束降解，在此期间，每天浇水20～30mL保持土壤含水量在20％～30％的湿润条件，有利于细菌生理生化反应的顺利进行以完成降解。

(5)降解前后土壤的宏基因组序列存在特征性。宏基因组学原始序列提交至NCBI数据库，检索号为SRX13239659、SRX13239660、SRX13239661、SRX13239662、SRX13239663、SRX13239664、SRX13239665、SRX13239666和SRX13239667。

(6)土壤宏基因组学测序及其数据分析。土壤宏基因组学分析发现对照组、单菌降解组和混菌降解组存在关键降解酶基因丰度差异，这种差异表现在代谢基因丰度有明显变化。即随着污染物的浓度降低，对照组、单菌降解组和混菌降解组的加氧酶丰度依次降低；而与此相反的是脱氢酶丰度依次升高。依此理论提出构建氢供体降解系统以完成后续石油烃降解。

(7)土壤石油烃氢供体降解系统的构建。混合细菌降解结束后立刻构建氢供体降解系统。方法如下：用植物粉碎机将无氧堆肥松针土磨碎成20目的粉末。松针土的有机碳和有机质经测定分别为21.95g/kg和37.83g/kg。称取磨碎的松针土10～20g与100g土壤充分混匀。每天加入20～30mL水并搅拌均匀以保持原有微生物活性，确保脱氢酶继续发挥氧化作用。

优选的，所述的步骤(2)和(4)的苯诱导下的土著原位微生物群落结构的利用；还包括步骤(6)所述的土著微生物群落中氧化酶丰度变化分析方法，并根据氧化酶基因丰度分析结果构建了步骤(6)中所述的石油污染物持续降解系统。

由上，本发明的特殊之处在于让降解性微生物持续发挥作用，直至石油污染物无害降解并矿。本发明从阜新DL油库周边(E121.5544,N41.9095)的石油污染土壤内提取得到石油降解菌(纯菌与混合菌)，利用苯诱导富集，获得了具有丰富单加氧酶以及双加氧酶的纯培养和混合微生物，对石油烃进行全面的降解，通过测定降解率确定纯培养以及混合微生物的降解作用优势。

同时利用Illumina Hiseq平台的宏基因组测序方法分析污染土壤的微生物群落演替特征，能够更加有效地识别参与的微生物类群、种类，分析降解的规律。根据本发明的宏基因组学分析结果发现微生物降解中、后期强氧化酶丰度减弱，弱氧化酶丰度增强的变化趋势。因此，本发明创新性地提出继续采用氢供体降解的方法，完成石油烃的持续降解。以期达到石油污染土壤彻底修复的目的。氢供体主要是堆肥物质，富含小分子的供氢体，作为脱氢酶的底物，继续完成后续的降解。本发明的基因丰度分析方法为有效降解土壤石油污染提供了理论基础与技术支持。

与现有技术相比，本发明至少具有以下技术优势：

(1)本发明属于环境友好型技术，修复土壤生态过程中无二次污染。由于土壤修复实验过程中没有添加其他化学物质，例如助剂盐类、活性剂或者螯合剂等，不会因为添加剂的数量和用量造成二次污染，所以对土壤生态系统的恢复没有不良影响。

(2)本发明针对土壤目标降解物采用了富集诱导技术，所以对污染物类型具有一定的靶向性，避免了土壤其他属性的破坏，加快生态重建的速度，提高生态系统的安全性。

(3)本发明中氢供体降解方法是依据基因底物法设计出来的。根据宏基因组学的测序数据分析发现，混合细菌降解后期土壤微生物群落内即时的脱氢酶基因丰度升高，强氧化酶(加氧酶)丰度降低。脱氢酶的基因底物是氢供体，故此采用氢供体降解系统，精准地提供了基因底物，有效地完成残留石油烃的降解修复。

(4)无氧堆肥松针土兼具底物和营养供给双重功效。松针土在本发明中的应用不仅提供了氢供体，而且，松针土内的其他营养成分也有利于土壤微生态平衡的重建。本发明方法可以在许多场所进行了实施，对客观环境不具有选择性。本方法建议使用原位混合微生物，所以必须因地制宜地进行修复。土壤的自然属性对本方法不具有影响。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍。

图1为本发明方法流程框图；

图2为混合细菌在属水平上群落丰度的百分示意图；

图3为土壤样品NR物种群落热图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。

实施例1。一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法，如图1所示，按照以下工艺步骤进行：

(1)石油降解菌的筛选、富集与培养：

(1.1)培养基配制是本发明的基础部分。改良的基础盐培养基(MSM)：在配制过程中严格依据MSM标准配比，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L；MgSO₄·7H₂O 0.2g/L；CaCl₂·2H₂O 0.01g/L；FeSO₄·7H₂O 0.001g/L；Na₂HPO₄·12H₂O 1.5g/L；KH₂PO₄ 1.5g/L；蒸馏水1000ml；改良的培养基需要加入葡萄糖0.5g/L、胰蛋白胨0.5g/L。121℃灭菌20～40分钟。

(1.2)样品采集。采集油库附近(E121.5544,N41.9095)且距离地面0～60cm的污染土样10份，同一平面多点采集。样品采集完毕后立即被运送到一个恒温约为4℃的冰箱中，在此土样中分离提取的微生物均属于当地土壤的土著微生物，适应该处生长的地质条件，对于该环境的物质分解和土壤降解具有有效性。

(1.3)耐苯胁迫细菌的选择性富集培养。

该步骤主要目的是获得能够降解苯的细菌，可以耐受苯胁迫。这类微生物群体一般具有苯代谢途径上的关键酶，如单加氧酶、双加氧酶和苯环羟化酶。这些关键酶可以降解烷烃、烯烃和多环芳烃等物质。其中多环芳烃往往是石油污染场地的核心毒性物质，因此，细菌产生的双加氧酶对于降解的成败至关重要。

取采集新鲜的土样2g接入配好的20mL改良MSM培养基中，以0.22μm孔径滤膜除菌苯筛选因素，最终浓度为150～200mg/L，初始培养时瓶口需要用硅胶和三层塑料箔密封，以防止苯挥发。以100～120转/分的速度在25～30℃下10～12小时可振荡至浑浊状态。基于相同的方式再将菌液3次转接富集。从这里得到的混合细菌培养液作为石油污染物降解的出发菌液。

(2)混合细菌培养多样性分析：

取10～15mL细菌培养液提取混合细菌基因组DNA，标记为COC21、COC22和COC23等三个重复样品，以16S rRNA基因进行多样性测序分析。根据测序结果获得的属水平上的群落组成如图2所示。3个平行样本高通量测序后共检测出4个优势细菌属，其物种组成大体上一致，分别为肠球菌属(Enterococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)等，其成员类型以兼性营养型为主。其物种丰度分别为79％、15％、3％、2％。

(3)混合细菌石油污染物降解能力测定：

取2mL处于对数生长期的混合菌液接入含200μL石油的20mL液体MSM培养基中，作为实验组。对照组则是不加菌液，其他条件完全相同，为确保实验数据的准确性，设立三个重复。80～100转/分摇床培养培养3～4天。结束降解后是用二氯甲烷在分液漏斗中进行萃取分离。石油浓度使用气相色谱质谱联用仪(GC/MS采用DB-5石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm)测量，定性定量地分析石油降解率由被降解物与初始量的比值确定。

混合菌对于正构烷烃、多环芳烃的降解率不同，二者分别是10％～20％、35％～45％；而纯菌(不动杆菌Acinetobacter sp.GDMCC 61755)与此对应降解率分别是5％～10％、20％～30％(见表1)。测根据上述结果可知，纯菌和混合菌对石油中多环芳烃的降解率要高于正构烷烃，且混合菌对石油烃的降解效果要好于纯菌。因此，本发明确定的石油污染物降解方案是采用土著且混合的细菌作为降解主体。

表1细菌对石油降解率统计表

(4)混合细菌对土壤石油污染物降解效果的确定以及最优化降解系统的构建：

(4.1)实验材料。取石油污染土壤，分为三组，即对照组(D1、D2、D3)、纯菌(不动杆菌GDMCC 61755)降解实验组(DS1、DS2、DS3)、混合细菌降解实验组(DC1、DC2、DC3)；每组设立三个平行样品以减小误差。

(4.2)最优化降解体系的构建。

根据单因素优化结果构建的降解系统组成成分有以下各项：取100g土(土壤石油浓度100g/kg)，接种量10％(V/W)，即10mL菌液(浓度大约在1×10⁷个/mL)；pH为6.5～7.5；牛肉膏用量0.4％(W/W)。

实验室自然条件下60天结束降解，在此期间，每天浇水20mL保持土壤含水量在20％～30％的湿润条件，有利于细菌生理生化反应的顺利进行以完成降解。

(4.3)降解率测定和土壤的宏基因组学测序。

在结束降解时充分混匀每个土壤样品，土壤用分光光度计(波长256nm)和GC-MS法结合进行总石油烃测定，总石油烃的萃取采用二氯甲烷(ACS)，测定方法参照国家标准HJ1021-2019。用于石油烃测定的取过筛样土5g溶于20mL二氯甲烷，充分震荡并离心3～5分钟。滤液用0.22μm滤膜过滤处理以去除颗粒物质，取1μL进样测试。

芳烃色谱/质谱条件以及测定参数：采用岛津公司气相色谱质谱联用仪(GCMS-2010plus)；色谱柱型号：DB-5石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口：设置280℃的温度；升温过程：初温50℃，保持3min，以2/分钟摄氏度的速率升至40℃，然后以25/分钟摄氏度的速率升至300℃，保持5分钟；载气(He)流速为1.4ml/分钟，进样量为1μl；不分流进样；质谱条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量70ev；传输线温度：260℃；离子源温度230℃。

实验测得土壤体积在(4×4×4cm)即16cm³的情况下60～90天的挥发率(10～20％)，最后测定的混合细菌实验(DC)组(含挥发率)降解率71.2％；纯菌实验(DS)组在降解率49.6％。

从每个样品中各取2g留待宏基因组学测序，整个过程4℃保存并运送至上海美吉生物医药公司用Illumina Hiseq测序的平台进行宏基因组学测序。

(4.4)修复前后土壤理化性质。表2说明虽然土壤中石油烃有降解发生，但是土壤的有机营养物消耗严重，其原因是有机物胁迫导致微生物过度消耗引起的。所以后续的修复方法应该有营养物的补充为宜。

表2土壤基本理化性质

测试项	对照组	纯菌降解组	混合菌降解组
				pH(水土质量比5:1)	7.24	7.01	6.68
有机质(g/kg)	10.06	8.94	7.22
				有效磷(mg/kg)	57.455	38.768	36.917
阳离子交换量(cmol/kg)	22.787	21.629	20.156

(5)土壤宏基因组学测序数据分析：

(5.1)每个样品的测序数据量

每个样品测序数据量12G，数据现存储NCBI平台，在PRJNA782219下的检索号分别是SRX13239659、SRX13239660、SRX13239661、SRX13239662、SRX13239663、SRX13239664、SRX13239665、SRX13239666和SRX13239667。原始序列的信息总结在下表3中。

表3原始数据统计

样品名称	插入片段(bp)	读长(bp)	序列读数	原始碱基数(bp)
					D1	470	150	91617924	13834306524
D2	470	150	119299866	18014279766
					D3	470	150	97471830	14718246330
DS1	490	150	101714586	15358902486
					DS2	490	150	100214128	15132333328
DS3	490	150	93109442	14059525742
					DC1	490	150	115172126	17390991026
DC2	490	150	99711828	15056486028
					DC3	490	150	116440054	17582448154

(5.2)序列拼接与基因预测

质量控制后得到高质量的序列，序列组成了片段，为了得到全部的基因信息，因此组装序列和预测功能基因，其结果见表4。在序列拼接时主要采用SOAPdenovo(1.06)软件，结合k-mer间的overlap关系可以获得contigs；接着需要得到scaffolds，在此过程中主要采用了两reads的pair-end。在此基础上根据gap的位置即可得到新的contigs；在上述操作完成之后，统计长度高于300bp的contigs，继而得到最优的组装结果，得到各样品的组装结果统计表和组装结果contigs长度分布图。基因预测需要MetaGene对拼接结果中的contigs来进行ORF的预测。选择出核酸的长度比100bp大的基因，然后翻译成氨基酸序列进行后续分析比对。

表4测序数据拼接结果统计

样品名称	大片段	大片段碱基数(bp)	N50(bp)	N90(bp)	Max(bp)	Min(bp)
							D1	634577	425819636	673	347	444937	300
D2	1305286	764084075	571	341	94213	300
							D3	657110	467231857	742	350	373904	300
DS1	1156757	861872846	815	363	189704	300
							DS2	1093936	808257806	804	361	189677	300
DS3	1062374	779292801	797	362	189647	300
							DC1	1212247	932991304	850	368	516682	300
DC2	1141089	873173877	838	368	516682	300
							DC3	1275158	918532515	759	358	516682	300

把contigs直接翻译成氨基酸的序列，在相邻的起始-终止密码子间，得到开放阅读框。ORF主要指的是始于起始密码，在没有中断终止密码子的条件下编码DNA序列的碱基序列。每一个ORF都可以编码一条肽链，所以对ORF进行预测是非常关键的。ORF预测结果见表5。

(5.3)构建非冗余基因集

基因序列聚类是构建冗余基因集的首要步骤。宏基因组测序得到的基因信息是冗余的，基于非冗余基因集的方式可以对全部基因的整体信息进行描述，通过这种方式能够有效地降低样本计算量，同时涉及到了环境内的所有基因信息。对于所有的基因序列，借助于CD-HIT实现聚类分析(90％identity、90％coverage)，根据各个类别的最长基因来建立非冗余基因集，继而对各个样本之间的异同进行准确分析。基因丰度计算采用SOAPaligner工具，针对各个样本的非冗余基因集、高质量reads进行比对(95％identity)，继而得到丰度的相关信息。

表5基因(ORF)预测统计

(5.4)物种与功能注释

NR(non-redundant)数据库物种注释过程中利用了DIAMOND软件；COG(Clustersof Orthologous Groups of proteins)功能注释分析了同源基因序列的相似性。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)功能注释是本发明的重点，这个过程主要分析石油烃代谢途径和过程，在代谢过程中的参与代谢的基因名称、功能和基因丰度变化是重要关注的模块。KEGG代谢分析过程也使用了DIAMOND，并将参数设置为blastp,E value≤1e-5。

如图3所示，从不同样本优势菌属的丰度来看，假单胞菌属(Pseudomonas)、假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、贪噬菌属(Variovorax)在石油降解的过程中，其丰度逐渐降低，它们的丰度在土壤中与石油烃的浓度成正相关；而鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、短波单胞菌属(Brevundimonas)的丰度逐渐升高，这表明石油污染土壤在石油降解菌的作用下，其群落丰度会发生变化。后四个菌属丰度变化与石油烃的含量成负相关趋势。

在图3中，横、纵坐标分别是物种占比以及样本名称，其中颜色、长度代表不同的信息，分别是对应着具体的物种及其占比，在属水平上，9个土壤样本高通量测序后共检测出52个细菌属。未经过石油降解菌降解的土壤样本，也就是对照样本中的优势菌属有假单胞菌属(18％)、假黄单胞菌属(13％)、贪噬菌属(5％)、无色杆菌属(3％)、鞘氨醇单胞菌属(1％)等。经过石油降解细菌降解的土壤样本，即实验样本，样本中的优势菌属有假单胞菌属(5％)、假黄假黄单胞菌属(4％)、短波单胞菌属(6％)、鞘氨醇单胞菌属(6％)、无色杆菌(4％)、热单胞菌属(5％)、溶杆菌属(4％)等，所以优势菌属在石油烃的降解过程中存在明显的演替过程。

在图3中，从土壤微生物群落组成来看修复效果，实验组与对照组相比，其微生物丰度持续升高，微生物群落结构趋向复杂和牢固；这有利于土壤理化性质的恢复，实现生物修复目标。对照组的微生物群落结构组成十分简单，微生物菌属的类型较少，其原因是受石油烃胁迫而引起微生物死亡，造成土壤微生物环境恶化，不利于微生物的生存。

与石油烃代谢有关的KEGG代谢通路注释对本发明来说至关重要。结合获取到的非冗余基因集中的基因信息，进一步与GENES和KEGG数据库进行对比。根据最终的结果可以获取到较多的信息，包括催化酶的信息以及物质转化路径的相关信息等。现总结在表6中。

表6有机污染物降解途径统计

根据污染物的结构特征，样品中测定的有机污染物降解途径分为三类：烷烃、芳香烃与多环芳烃。从表5中可以看出，在这些代谢途径中，多环芳烃降解基因与萘降解基因的数量趋于逐渐减少，由于随着石油降解菌的功能发挥，土壤中污染物的含量将越来越少，底物的数量减少使得相应微生物菌群的数量也将随之而减少；可见，土壤中的理化因素决定了微生物群落的演替，而有机污染物浓度就是其中的一个核心驱动力。氯代烷烃与氯代烯烃、二恶英以及二甲苯等代谢途径也符合这一规律。ko00625、ko00624、ko00642和ko00633等代谢途径上的基因丰度总体变化趋势就是本发明石油烃后续降解系统构建的依据。土壤环境宏基因组学的基因丰度变化数据可以成为微生物浓度变化的指示方向。

(6)土壤宏基因组学分析发现关键降解酶丰度存在着组间差异性：

对于烷烃、烯烃和多环芳烃的降解与单加氧酶和双加氧酶密切相关，该酶能够实现对于C-C双键的切割，实现开环降解；基于单加氧酶可以实现对于链烷烃的降解，并完成链烃的羟基化，使其进入代谢循环过程。所以通过了解加氧酶的变化，有助于充分分析微生物对石油烃的降解。根据宏基因组学数据挖掘关键酶的组间差异性，对于石油烃的彻底降解十分必要。从表7可以看出，随着微生物对石油烃降解过程的深入进行，G1、G2、G3各组间单加氧酶和双加氧酶的丰度依次降低。与此相反的是，G1、G2、G3各组间脱氢酶丰度依次升高。G1(绿色)表示污染样品；G2(红色)表示纯培养细菌降解样品；G3(蓝色)表示混合菌降解样品。这说明纯菌和混合菌在油污的胁迫下，具有丰富的加氧酶，其丰度一直处于高度表达态势，以确保对其所在环境的污染物呈现氧化态势，而随着油污胁迫的减弱，加氧酶丰度降低，脱氢酶则表现优势。根据这一点有理由预测，石油烃降解的中后期，添加氢供体丰度的无氧堆肥物质有助于油污彻底降解。

(7)土壤石油烃氢供体降解系统的构建：

根据宏基因组学分析结果发现，石油烃代谢途径的关键酶，即加氧酶在降解中后期丰度降低，而脱氢酶类的丰度上升，因此为了充分实现残留的石油烃持续降解，可以构建基于基因底物的持续降解系统，即氢供体降解系统。即向降解系统中加入无氧堆肥物质-松针土；松针土含有大量的腐殖质，可以作为供氢体使用。另外由于石油污染土壤的理化性质呈恶化趋势，松针土的加入同时起到了添加营养元素的作用，有利于土壤微生物生态环境的健康恢复。

氢供体降解系统构建方法如下：

(7.1)混匀土壤：将混菌降解实验组的全部土壤混合均匀。分为两组，一组加入氢供体，一组留作对照，每组设三个重复，每份样品称取土壤100g。土壤中石油烃浓度测定方法与前面提到的(4.3)测定方法相同。

(7.2)氢供体降解系统构成：称取磨碎的松针土10～20g与100g土壤充分混匀，装入纸杯中，以烧杯微宇宙形式进行降解30天，期间保持实验室自然温度(15℃)和空气条件下。每天加入20～30mL水并搅拌均匀以保持原有微生物活性，确保原有细菌的脱氢酶继续发挥氧化作用。实验前，先用植物粉碎机将无氧堆肥松针土磨碎成20目的粉末。松针土的有机碳和有机质经测定分别为21.95g/kg和37.83g/kg。

(7.3)氢供体降解系统石油烃测定：测定方法与前面提到的(4.3)测定方法相同。最后测得的氢供体石油烃降解率在26.1％。除了提供氢供体以外，松针土还能够提供氮、磷、钾等营养元素，这些元素也是土壤微生物生长所必需。土壤原有的氮、磷、钾等元素在石油烃污染之初，为了抵抗有毒污染物的胁迫，被微生物消耗殆尽。氢供体系统不仅能

表7石油烃代谢通路关键酶组间差异表

注：

够完成石油烃的持续降解，补充完善细菌降解，还能修复并改善污染土壤的理化性质。土壤石油污染物的初始浓度已经在土著混合微生物的作用下，浓度有所降低，所以氢供体降解系统内微生物的生存环境极大地改善，污染物胁迫作用显著降低，细菌体内的脱氢酶能够以(松针土)氢供体为底物缓慢而持续发挥对残余石油污染物的氧化作用，进而完成石油烃的深度降解率。氢供体降解系统的组成以及降解条件总结在表8中。

表8氢供体土壤降解系统组成及条件总结表

本发明的土壤石油烃总去除率：总石油烃去除率＝混合细菌降解率+混合细菌降解后残留石油烃含量×氢供体降解系统的石油烃降解率＝混合细菌降解率+(100％—混合细菌降解率)×氢供体降解系统的石油烃降解率＝71.2％+(1-71.2％)×26.1％＝78.72％。

实施例2。为本发明一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法的应用例。照以下工艺步骤进行：

(1)混合细菌用培养基配制是本发明的基础部分。改良的基础盐培养基(MSM)：在配制过程中严格依据MSM标准配比，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L；MgSO₄·7H₂O 0.2g/L；CaCl₂·2H₂O0.01g/L；FeSO₄·7H₂O 0.001g/L；Na₂HPO₄·12H₂O 1.5g/L；KH₂PO₄ 1.5g/L；蒸馏水1000ml；改良的培养基需要加入葡萄糖0.5g/L、胰蛋白胨0.5g/L。121℃灭菌20～40分钟。

(2)样品采集。大连化工厂原址附近(E121.6051,N38.9579)且距离地面60～200cm的污染土样10份，同一平面多点采集。样品采集完毕后立即被运送到一个恒温约为4℃的冰箱中，在此土样中分离提取的微生物均属于当地土壤的土著微生物，适应该处生长的地质条件，对于该环境的物质分解和土壤降解具有有效性。

(3)耐苯胁迫细菌的选择性富集培养。

取采集新鲜的土样2g接入配好的20mL改良MSM培养基中，以0.22μm孔径滤膜除菌苯酚作为筛选因素，最终浓度为150～200mg/L以诱导加氧酶产生。以100～120转/分的速度在25～30℃下10～12小时可振荡至浑浊状态。基于相同的方式将菌液一次转接富集。从这里得到的混合细菌培养液作为石油污染物降解的出发菌液。(注：苯与苯酚诱导筛选作用相同，都是为了获取产生加氧酶的细菌)

(4)最优化降解体系的构建。

根据单因素优化结果构建的降解系统组成成分有以下各项：取100g土(土壤石油浓度130g/kg)，接种量10％～20％(V/W)，即10mL～20菌液mL(浓度大约在1×10⁷个/mL)；pH为6.5～7.5；牛肉膏用量0.4％～0.6％(W/W)。

实验室自然条件下60天结束降解，在此期间，每天浇水20mL保持土壤含水量在20％～30％的湿润条件，有利于细菌生理生化反应的顺利进行以完成降解。

(5)混合细菌石油污染物降解能力测定。

土壤石油浓度使用气相色谱质谱联用仪测量，定性定量地分析石油降解率由被降解物与初始量的比值确定。混合菌对于土壤石油烃平均(含挥发)降解率在78.3％；其中C20直链烃降解率为43.1％，环烃降解率10.5％。

(6)大连土壤石油污染样品氢供体降解系统构建方法。

①混匀土壤：将混菌降解实验组的全部土壤混合均匀。分为两组，一组加入氢供体，一组留作对照，每组设三个重复，每份样品称取土壤100g。

②氢供体降解系统构成：称取磨碎的松针土10～20g与100g土壤充分混匀，装入纸杯中，以烧杯微宇宙形式进行降解30天，期间保持实验室自然温度(15℃)和空气条件下。每天加入20～30mL水并搅拌均匀以保持原有微生物活性，确保原有细菌的脱氢酶继续发挥氧化作用。实验前，先用植物粉碎机将无氧堆肥松针土磨碎成20目的粉末。松针土的有机碳和有机质经测定分别为21.95g/kg和37.83g/kg。

③氢供体降解系统石油烃测定：测定方法与前面提到的(4.3)测定方法相同。最后测得的大连样品氢供体石油烃(含挥发)降解率在25.4％。松针土无氧堆肥过程中产生了大量小分子醇、醛类物质，可以作为供氢体，同时还能够提供氮、磷、钾等营养元素，这些元素也是土壤微生物生长所必需。由于氢供体降解系统内，石油污染物浓度降低，微生物的生存环境改善，污染物胁迫作用降低，所以降解率有所提高。

(7)大连土壤样品总石油烃降解率计算。

大连化工厂土壤样品的氢供体降解系统的石油烃降解率在25.4％，结合原来的混合细菌石油烃降解率78.3％，大连土壤样品总石油烃降解率在83.81％。

总石油烃去除率＝混合细菌降解率+混合细菌降解后残留石油烃含量×氢供体降解系统的石油烃降解率＝混合细菌降解率+(100％—混合细菌降解率)×氢供体降解系统的石油烃降解率＝78.3％+(1-78.3％)×25.4％＝83.81％。

整个发明的两批样品总石油烃去除率78.72％～83.81％。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)DL油库附近石油污染土壤降解菌的筛选、富集培养：培养采用改良的基础盐培养基，其组成如下：(NH₄)₂SO₄ 2.0～3.0g/L；MgSO₄·7H₂O 0.2～0.3g/L；CaCl ₂·2H₂O 0.01～0.5g/L；FeSO₄·7H₂O 0.001～0.01/L；Na₂HPO₄·12H₂O 1.5～2.0g/L；KH₂PO₄ 1.5～2.0g/L；蒸馏水1000ml；另外需要加入葡萄糖0.5～2.0g/L、胰蛋白胨0.5～3.0g/L；121℃灭菌20～40分钟；苯作为降解性微生物的诱导剂，需要0.22μm孔径的滤膜过滤除菌后加入培养基中，并调整终浓度至150～200mg/L；基于相同的方式再将菌液3次转接富集培养；

(2)混合培养细菌群落结构多样性的识别：步骤(1)中培养所得的细菌群落通过16SrRNA基因作为群落结构识别的靶位点，其微生物群落组成丰度分别为肠球菌属79％±3％、不动杆菌属15％±3％、芽孢杆菌属3％±3％、克雷伯氏菌属2％等，其成员类型以兼性营养型为主；

(3)生化降解能力测定实验：用纯菌和混合菌对DL油库的石油进行降解实验，利用分光光度计和气相色谱-质谱法联合对降解前后的石油进行组分变化分析，主要分析石油组分里的正构烷烃、多环芳烃以及总石油烃含量；

(4)最优化石油污染土壤的降解体系的构建：根据单因素优化结果构建的降解系统组成成分有以下各项：取100g土，接种量10％～20％V/W；pH为6.5～7.5；牛肉膏用量0.4～0.6％W/W；

实验室自然条件下60天结束降解，在此期间，每天浇水20～30mL保持土壤含水量在20％～30％的湿润条件；

(5)降解前后土壤的宏基因组序列存在特征性：宏基因组学原始序列提交至NCBI数据库，检索号为SRX13239659、SRX13239660、SRX13239661、SRX13239662、SRX13239663、SRX13239664、SRX13239665、SRX13239666和SRX13239667；

(6)土壤宏基因组学测序及其数据分析：土壤宏基因组学分析发现对照组、单菌降解组和混菌降解组存在关键降解酶基因丰度差异，即随着污染物的浓度降低，对照组、单菌降解组和混菌降解组的加氧酶丰度依次降低，而与此相反的是脱氢酶丰度依次升高，依此理论提出构建氢供体降解系统以完成后续石油烃降解；

(7)土壤石油烃氢供体降解系统的构建：混合细菌降解结束后立刻构建氢供体降解系统；方法包括：用植物粉碎机将无氧堆肥松针土磨碎成20目的粉末，松针土的有机碳和有机质经测定分别为21.95g/kg和37.83g/kg，称取磨碎的松针土10～20g与100g土壤充分混匀；每天加入20～30mL水并搅拌均匀以保持原有微生物活性，确保脱氢酶继续发挥氧化作用。

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