CN117844939A - 一种微生物种群绝对丰度定量的内参组合物、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微生物种群绝对丰度定量的内参组合物、试剂盒及方法，内参组合物包括SEQ ID No.1‑SEQ ID No.8所示的8条内参序列，SEQ ID No.1‑SEQ ID No.8具有由低到高的浓度梯度，且内参组合物与样本的占比为10％‑30％。通过向环境样本中添加不同浓度梯度的内参DNA，量化不同微生物群落间的绝对含量，在PCR反应过程中，内参DNA分子产生预期大小的扩增子，结合内参DNA的拷贝数和测序输出的reads数，建立内参DNA拷贝数和reads间的标准曲线，进一步可计算出样本中各菌群拷贝数的绝对丰度，可以准确估算单位样品中物种的绝对丰度。本方法一次扩增实验，可以同时得到相对定量和绝对定量结果两份分析结果，节省样品与内参DNA用量，最大程度上节省测序成本。

Description

一种微生物种群绝对丰度定量的内参组合物、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术及组学分析领域，具体地，涉及一种微生物种群绝对丰度定量的内参组合物、试剂盒及方法。

背景技术

微生物是地球上最为丰富的生物资源，在土壤、植物生长发育、食品发酵和人类活动等方面发挥着重要作用，它们推动着全球元素循环、生态环境治理、生物制药和疾病诊断及预防等方向的发展，影响着人类的免疫、消化及心理健康等方面。

随着二代测序技术的发展，对微生物群落多样性及进化的研究和认知已经大大提高，然而，微生物群落的准确表征一直是一个具有挑战性的问题，基于16S rRNA、18SrRNA和ITS基因的扩增子测序是微生物生态学中测量特定微生物群落结构和特征分布的常用工具。

通过提取样品中的DNA，对16S或ITS基因区域进行PCR扩增，通过构建文库，基于Illumina、PacBio等测序平台测序，然后结合生物信息学方法进行序列分析和物种注释，可以了解样品的群落组成情况，进一步通过alpha和beta多样性分析可以进一步比较样品之间的差异性。相较于二代测序只选择1-2个高变区进行测序，三代测序可以获得全长的16S或ITS序列，更多变异区信息可以提高物种鉴定的分辨率，还可以提高对于群落组成的鉴定精度，更加真实的还原样本中微生物群落结构。扩增子测序方法对研究水体、土壤、空气和肠道粪便等环境中的微生物群落组成分析有重要的指导作用，同时也是系统发育和生态学研究中广泛使用的方法。

常规扩增子测序技术虽然其具有高通量，低花费，可客观还原菌群结构及相对丰度比例的巨大优势，但目前大部分的扩增子测序技术由于技术的限制，仅产生相对丰度的数据，只能描述某个物种占整个环境样本中的百分比，无法表示这个物种在环境群落中的绝对含量，会导致OTU分析中的高假阳性率和相关分析偏差，无法体现样本中物种的真实数量和组间样本的真实差异微生物群落的绝对丰度变化，这是扩增子测序技术所面临的重要问题。例如，物种S在样本A和样本B中分别占有10％和20％的比例，当样本A、B微生物总量一致时，A样本中的物种S绝对丰度高于B样本；若A样本(10⁹cells/g)中微生物总量少于B样本(10¹⁰cells/g)时，A样本中的物种S绝对丰度则低于B样本。

因此，实现矫正扩增子测序偏差，较为精准的确定微生物种群丰度，增加样品间可比性，进一步真实反映样本中物种的真实数量和组间样本的真实差异，使测序结果更为准确可信，以弥补常规扩增子测序技术方法的不足，对于全面研究与了解环境微生物群落结构及其分类学具有十分重要的意义。

发明内容

针对目前所存在的技术问题，本发明提供了一种微生物种群绝对丰度定量的内参组合物、试剂盒及方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术手段：

本发明的第一方面提供了一种微生物种群绝对丰度定量的内参组合物，所述内参组合物包括如SEQ ID No.1-SEQ ID No.8所示的8条内参序列。

进一步地，所述内参组合物中SEQ ID No.1-SEQ ID No.8具有由低到高的浓度梯度，且内参组合物与样本的占比为10％-30％，在一些具体实施方案中，所述内参组合物中SEQ ID No.1-SEQ ID No.8浓度梯度比例为1：3：6：15：30：60：150：300。内参DNA序列的设计需要包含原核生物通用引物结合位点、与体内靶标长度和GC含量相同的优化合成填充序列以及一个易于获取和处理的克隆载体，所设计的序列通过NCBI验证，与自然界已知的自然物种序列无匹配关系。

进一步地，还包括由正向引物SEQ ID No.9和反向引物SEQ ID No.11；正向引物SEQ ID No.11和反向引物SEQ ID No.12；正向引物SEQ ID No.13和反向引物SEQ IDNo.14；正向引物SEQ ID No.15和反向引物SEQ ID No.16组成的4对引物对中的一对。在一些具体实施方案中，所述引物对兼容16S及ITS扩增区域，引物名称与引物序列的对应关系为：ITS3-F对应序列SEQ ID No.9；ITS4-R对应序列SEQ ID No.10；27F对应序列SEQ ID No.11；1492R对应序列SEQ ID No.12；ITS1F对应序列SEQ ID No.13；ITS4R对应序列SEQ IDNo.14；338F对应序列SEQ ID No.15；806R对应序列SEQ IDNo.16。

在一些具体实施方案中，采用27F对应序列SEQ ID No.11为正向引物；1492R对应序列SEQ ID No.12为反向引物，进行16S全长扩增。

本发明的第二方面提供了一种微生物种群绝对丰度定量试剂盒，所述试剂盒包括前文所述的内参组合物。

本发明的第三方面提供了一种微生物种群绝对丰度定量方法，包括如下步骤：

S1.按照权利要求1所述的内参序列合成内参DNA；

S2.样本DNA提取：

S3.将满足权利要求2的内参组合物添加到样本DNA中，添加权利要求3所述的引物对，混合均匀后进行PCR扩增，获得PCR产物；在一些具体实施方案中，S3包括利用带不同barcode的引物进行扩增，得到不同PCR扩增产物，barcode为在正向引物和反向引物的前面增加的几个不同的碱基，作为barcode标签，用来标记和区分不同的PCR扩增产物；

S4.构建文库及上机测序：对S3扩增后的PCR产物进行纯化后进行文库构建并测序；在一些具体实施方案中，S4包括对得到的不同PCR扩增产物进行浓度比对，并按照等量原则将各PCR产物混合后进行纯化。建库文库要求每个PCR产物的总量相同、片段相近，根据测定的浓度，对每个PCR产物取体积混合。

S5.下机数据质控；在一些具体实施方案中，采用二代测序，下机数据质控包括去除接头序列、低质量及重复序列等，得到高质量测序数据；在一些具体实施方案中，采用三代测序，下机数据质控包括序列校正、去除低质量及短序列，得到高质量测序数据。

S6.构建标准曲线：对质控合格的下机数据通过比对内参序列数据库，输出内参DNA的OTU表后，基于内参DNA的拷贝数和下机测序的内参序列reads数据，构建内参DNA拷贝数和reads数间的标准曲线；

S7.定量结果输出。

进一步地，S1还包括如下步骤：对合成的内参DNA进行浓度测定，准确计算内参DNA拷贝数。

进一步地，S6还包括拷贝数校正步骤：根据构建的标准曲线，对样本菌群的拷贝数做进一步校正，计算样本中各菌群的绝对拷贝数。

进一步地，S6后还包括如下步骤：对质控合格的下机数据，过滤内参序列，得到高质量的非内参有效序列用于物种分析。

在一些具体实施方案中，样本类型为土壤、水体、酒糟、酒醅、窖泥、粪便等；样本DNA提取采用行业内已知的提取方法，根据不同类型的样本选择合适的DNA提取方法，以提高DNA浓度和总量。

在一些具体实施方案中，得到高质量的非内参有效序列用于OTU丰度分析，OTU聚类分析，物种注释分析以及统计分析等。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明方法适用范围广，可覆盖不同类型的样本，并可以选择结合二代测序和三代测序不同的测序方法的优势，对样本中不同菌群的含量进行准确定量。

2、本发明方法通过向环境样本中添加不同浓度梯度的内参DNA，可以量化不同微生物群落间的绝对含量；在PCR反应过程中，内参DNA分子会产生预期大小的扩增子，结合内参DNA的拷贝数和测序输出的reads数，建立内参DNA拷贝数(log拷贝数)和reads(logreads)间的标准曲线，便可进一步计算出样本中各菌群拷贝数的绝对丰度，可以准确估算单位样品中物种的绝对丰度。

3、本发明方法通过构建内参系统，可以使操作步骤中待测样品与内参系统所经历的处理条件一致，使两者扩增效率尽可能的接近，从而实现绝对定量。

4、本发明方法可以避免因样本中不同微生物浓度之间可能存在的差异而造成的扩增过程中的速率差异，从而确保了计算结果更为准确。

5、本发明的方法一次扩增实验，可以同时得到相对定量和绝对定量结果两份分析结果，节省样品与内参DNA用量，最大程度上节省测序成本。

附图说明

图1为实施例2中实验组1的标准曲线图；

图2为实施例2中实验组2的标准曲线图；

图3为实施例2中实验组3的标准曲线图；

图4为实施例2中样本菌群定量结果对比图；

图5为实施例3中酒醅样本未经校正的菌群相对含量堆积图；

图6为实施例3中酒醅样本实验组1的标准曲线图；

图7为实施例3中酒醅样本实验组2的标准曲线图；

图8为实施例3中酒醅样本实验组3的标准曲线图；

图9为实施例3中酒醅样本经标曲校正后菌群绝对含量堆积图。

具体实施方式

除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。

关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。

术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

实施例1内参DNA的设计及合成

内参DNA序列的设计需要包含原核生物通用引物结合位点、与体内靶标长度和GC含量相同的优化合成填充序列以及一个易于获取和处理的克隆载体，所设计的序列通过NCBI验证，与自然界已知的自然物种序列无匹配关系。

本发明设计的内参DNA序列见表1，内参DNA序列插入质粒中，扩大培养后进行质粒抽提。

表1内参DNA序列

按照上述表1中的内参DNA的序列，送至上海生工生物工程股份有限公司按照标准合成操作流程进行合成，得到8条内参序列，构建的内参序列中，G+C含量真菌区48％，细菌区54％，总占比约为51％，设计的序列plasmid-2中识别序列包括GACCTGTA和CGTGTAGG，序列plasmid-3中识别序列包括ATGTAACT和GACACTAC，序列plasmid-4中识别序列包括GTTTCAGA和TGCATACA；序列plasmid-5中识别序列包括CACAGGAT和CAGTCTGG；序列plasmid-6中识别序列包括TAGCTGCC和TGGCACCT；序列plasmid-7中识别序列包括AGCGAATG和CAAGGTGA；序列plasmid-8中识别序列包括TATGCTGC和AAAGATAC。用于区别和识别内参基因，在测序过程中，可基于识别序列识别出每个内参的reads数。对合成后的内参DNA使用Thermo NanoDrop仪器和琼脂糖电泳进行浓度测定和质量检测，并计算各内参DNA的理论拷贝数，如表2所示。

表2内参DNA浓度及拷贝数

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针对本发明设计的内参DNA序列，还设计了兼容16S及ITS扩增区域的对应引物，引物名称及引物序列和条带大小信息如表3所示。

表3兼容的16S及ITS扩增区域及对应引物

实施例2内参DNA添加梯度探究

1、单一内参添加实验

所用样本及信息如表4所示。

表4单一内参梯度实验样本信息

实验设计

所用质粒：表2中的plasmid-1。

实验方法：样本DNA的Qubit浓度见表4，分成两个实验组，向每个样本DNA中添加1个浓度的内参DNA，单一内参设置8个不同浓度实验：每ug样本DNA投入内参DNA量(pg)如表5所示；实验组1和实验组2每组分别设置8个实验，每个实验设置3组平行，进行16S全长扩增并测序。数据下机后统计每组实验中的内参DNA的占比情况，取平均值做统计，结果如表5所示。

表5单一内参添加梯度实验内参DNA的占比情况

实验分析：内参DNA添加过多或过少均会造成测序上的误差，为避免扩大这种误差的影响，从整体实验结果上看，实验组设置的梯度范围是合理的，但还需要做细微调整，在实验组2中，添加浓度跨度较大。

2、多内参梯度添加预实验

所用样本及信息如表6所示。

表6多内参梯度筛选样本信息

实验设计

所用质粒：表2中的plasmid 1-plasmid 8。

实验设计：按照下表，分为4个实验组，内参DNA添加梯度如表，向样本DNA中添加8个不同浓度的内参DNA，每组实验设置3组平行，混合均匀后进行16S全长扩增并测序。根据下机的reads数，统计每组内参的占比情况，取平均值做统计。结果如表7所示。

表7多内参添加梯度实验内参DNA的占比情况

实验分析：根据每组实验内参占比的数据来看，以实验组1的添加梯度较为合适。

实施例3人工模拟群落16S全长扩增的准确定量检测

选取4种纯菌样本，样品名称分别为：30-1-1、QXD-8、D39、Q41，使用细菌DNA提取试剂盒(方舟生物)对这4个纯菌样本基因组DNA进行抽提。

核酸提取后，使用Thermo Nanodrop和Qubit两种仪器以及琼脂糖电泳分别进行核酸浓度的测定和质量检测，按照体积1：1：1：1将4种纯菌样本DNA混合均匀，复刻人工模拟的群落，使用Qubit测定浓度，测定的样本核酸浓度，样本核酸浓度见表8。

同时将提取到的样本DNA送至天一辉远科技有限公司做qPCR绝对定量，测定每个样本的16S拷贝数。

表8 4种纯菌样本DNA浓度及拷贝数

向混合均匀的人工模拟群落DNA中梯度添加拷贝数和浓度已知的8个内参DNA，内参DNA的添加梯度见表9。

表9内参DNA添加梯度

混合均匀后，添加带barcode的特异性引物对，进行16S rRNA全长PCR扩增。其中：正向引物27F，序列为：AGRGTTYGATYMTGGCTCAG；

反向引物1492R，序列为：RGYTACCTTGTTACGACTT，

PCR扩增体系为：扩增用酶25μL，引物2.5μL，样本DNA用量见表8，内参DNA用量见表9，H₂O补足至50μL体积。

PCR扩增程序为：98℃，30s；98℃，10s；62℃，30s；72℃，1min，27个循环；72℃，5min；4℃保存。

对于人工模拟的群落样本，设置3组平行实验：实验组1、实验组2、实验组3，与平行实验对应设置的不添加内参DNA的3组对照实验：对照组1、对照组2、对照组3。3组平行实验中，引物添加不同barcode作为标签。其中，实验组1中barcode为B192；实验组2中barcode为B193；实验组3中barcode为B194。

对实验组1，实验组2，实验组3梯度添加内参及引物扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测产物的扩增效果及条带范围，然后利用GeneTools Analysis Software对PCR产物进行浓度对比后，按照等量原则计算各样品所需混样体积，将各PCR产物混合后进行Qubit定量。

按照16S Amplification SMRTLibrary Preparation标准流程进行建库操作，并使用PacBio平台对构建的扩增子文库进行高通量测序。

对下机并质控合格后的数据通过比对内参序列数据库，输出内参DNA的OTU表后，基于内参DNA的拷贝数和下机测序的内参序列reads数据，构建内参DNA拷贝数(log拷贝数)和reads(log reads)间的标准曲线，实验组和对照组的下机数据见表10，构建的标准曲线、方程及R²值见表11和图1-3。

表10内参DNA的下机reads数

表11内参DNA拷贝数和reads间的标准曲线方程

对质控合格的下机数据过滤内参序列，得到高质量的非内参有效序列用于后续OTU聚类分析和物种注释分析。

根据构建好的标准曲线，对样本菌群的拷贝数做进一步校正，计算样本中各菌群的绝对拷贝数，实验组和对照组的样本下机的reads数及校正后的绝对拷贝数结果见表12。

表12样本下机reads数及经标曲校正后的菌群绝对拷贝数

结果表明，向样本DNA中梯度添加拷贝数和浓度已知的内参序列，构建内参系统，可以实现对样本中微生物菌群16S拷贝数的绝对定量，对比结果见表13和图4；添加的内参序列比例占全部测序reads数结果见表14。

表13样本拷贝数比例理论值与检出值对比结果

表14内参DNA下机的reads总数及占总测序reads数的比例

若内参添加量整体偏低，标准曲线拟合结果较差；相反，过高内参序列的添加会占用更多测序数据量，会导致测序成本上升，所以，内参的添加比例会对绝对定量实验的结果有一定影响，建议内参占比介于10％-30％。

实施例4酒醅样本16S全长扩增的准确定量检测

为了评价本发明方法的准确性和适用性，采集1例酒醅样本，按照实施例3的方法对该例样本进行定量检测实验。

使用土壤DNA小量提取试剂盒(方舟生物)对酒醅样本DNA进行抽提，DNA浓度经Qubit精准定量并标化后，向DNA中梯度添加内参DNA，并通过添加带不同barcode的特异性引物对进行三次平行实验，获得实验组1，实验组2，实验组3对应的PCR扩增产物，并对PCR产物构建测序文库进行高通量测序。按照实施例3中的方法对下机数据进行分析，未校正的菌群相对含量堆积图见图5，内参系统构建的标准曲线见图6-8；校正后的菌群绝对拷贝数如表15和菌群结构堆积图9。

表15酒醅样本经标曲校正后的菌群绝对拷贝数

结果显示，本发明方法能够有效检测真实酒醅样本中各分类水平16S的绝对拷贝数，且重复间具有极高的一致性，及本发明方法检出结果具有较高的可重复性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种微生物种群绝对丰度定量的内参组合物，其特征在于：所述内参组合物包括如SEQ ID No.1-SEQ ID No.8所示的8条内参序列。

2.根据权利要求1所述的微生物种群绝对丰度定量的内参组合，其特征在于：所述内参组合物中SEQ ID No.1-SEQ ID No.8具有由低到高的浓度梯度，且内参组合物与样本的占比为10％-30％。

3.根据权利要求1所述的一种微生物种群绝对丰度定量的内参组合物，其特征在于：还包括引物，所述引物为正向引物SEQ ID No.9和反向引物SEQ ID No.11；正向引物SEQ IDNo.11和反向引物SEQ ID No.12；正向引物SEQ ID No.13和反向引物SEQ ID No.14；正向引物SEQ ID No.15和反向引物SEQ ID No.16组成的4对引物对中的一对。

4.一种微生物种群绝对丰度定量试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的内参组合物。

5.一种微生物种群绝对丰度定量方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1.按照权利要求1所述的内参序列合成内参DNA；

S2.样本DNA提取：

S3.将满足权利要求2的内参组合物添加到样本DNA中，添加权利要求3所述的引物对，混合均匀后进行PCR扩增，获得PCR产物；

S4.构建文库及上机测序：对S3扩增后的PCR产物进行纯化后进行文库构建并测序；

S5.下机数据质控；

S6.构建标准曲线：对质控合格的下机数据通过比对内参序列数据库，输出内参DNA的OTU表后，基于内参DNA的拷贝数和下机测序的内参序列reads数据，构建内参DNA拷贝数和reads数间的标准曲线；

S7.定量结果输出。

6.根据权利要求5所述的一种微生物种群绝对丰度定量方法，其特征在于：S1还包括如下步骤：对合成的内参DNA进行浓度测定，准确计算内参DNA拷贝数。

7.根据权利要求5所述的一种微生物种群绝对丰度定量方法，其特征在于：S6还包括拷贝数校正步骤：根据构建的标准曲线，对样本菌群的拷贝数做进一步校正，计算样本中各菌群的绝对拷贝数。

8.根据权利要求5所述的一种微生物种群绝对丰度定量方法，其特征在于：S6后还包括如下步骤：对质控合格的下机数据，过滤内参序列，得到高质量的非内参有效序列用于物种信息分析。