CN116064863A - 样品中细菌菌群组成和绝对含量的检测方法 - Google Patents

样品中细菌菌群组成和绝对含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了样品中细菌菌群组成和绝对含量的检测方法。具体地，本发明提供针对细菌16S rRNA基因拷贝数绝对定量的定量标准品、测序方法及其应用。本发明是在三代Pacbio全长微生物多样性测序的基础上建立的全长16S rRNA基因绝对定量测序技术，相较NGS绝对定量方法，具有精确到“种”水平的分辨率和细菌菌群组成“绝对定量”两大技术优势。

Description

样品中细菌菌群组成和绝对含量的检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学和测序技术领域，具体地说，涉及样品中细菌菌群组成和绝对含量的检测方法。
背景技术
常规扩增子测序存在一定的局限性。下一代测序(NGS)促进了微生物组的研究，并对微生物组在健康和疾病中的作用产生了许多新的见解。然而，NGS的挑战之一涉及所生成数据的组成性质。由于组成数据的总和是一个常数(如100％)，特定微生物分类群对给定条件的响应增加将不可避免地导致其他分类群相对丰度的减少。微生物分类群之间以相对丰度表示的这种相互依赖使得确定那些真正受到干预或疾病状态影响的微生物分类群尤其具有挑战性。
微生物绝对定量方法。早在2017年Vandeputte等提出了定量微生物组图谱Quantitative Microbiome Profiling(QMP)的概念，作为从NGS数据定量微生物绝对丰度的一种方式，以绕过微生物组测序数据的组成结构产生的许多统计和解释的挑战。QMP通过使用流式细胞仪来测定粪便样本的总细菌负荷，然后在考虑细菌总数的情况下对相同采样深度的16S rRNA基因测序数据进行归一化来实现的。相比之下，Jian等使用定量聚合酶链式反应quantitative PCR(QPCR)作为一种简单且具有成本效益的替代方法来确定细菌载量并从NGS数据估计绝对分类群丰度。细胞计数和定量聚合酶链式反应都有各自的优点和局限性，这可能会影响后续的绝对分类单元丰度的估计。流式细胞仪只对完整的微生物细胞进行计数。因此，从理论上讲，当样品中含有大量游离的胞外原核生物DNA时，可能会产生新的偏差。这种游离的DNA在测序过程中被捕获，但在流式细胞仪细胞计数时被排除。如果游离循环DNA的分类组成与完整微生物细胞的组成不同(例如，由于微生物细胞对环境胁迫的抵抗力不同)，这可能会导致在下游分析中引入新的偏倚来源。在定量聚合酶链式反应的基础上计数细菌，会通过提取、纯化和扩增DNA来引入偏差。基于定量聚合酶链式反应的优点是成本效益、简单和可获得性，而灵敏度可能是一个限制。
绝对定量16S测序通过向样品DNA中加入已知拷贝数的synthetic spike-in标准品，微生物DNA和内标序列同时进行PCR扩增，一起进行后续建库测序，根据内标序列数及其拷贝数绘制标准曲线，计算样品中OTU代表序列对应物种的16S rRNA基因绝对拷贝数。spike-ins为人工合成的16S rDNA片段，其设计的可变区与公共数据库中保存的核苷酸序列缺乏一致性，这允许对任何微生物样本的16S-seq数据中的spike-ins reads进行可靠追踪。
目前微生物多样性测序主要是PE250或PE300二代测序(NGS)，但是这只能针对细菌16S rDNA和真菌ITS或18S的某一段可变区(如16S V3+V4，16S V4+V5，16SV4，ITS1，ITS2，18S V4等)进行测序，其最大的问题就是测序读长短。随着三代测序兴起，基于其超长读长的特点，可直接获得全部变异区序列信息，获得真正精确到“种”的分类鉴定。全长16S/18S/ITS测序获得全部变异区域序列信息不仅能提高物种鉴定的分辨率，还能提高样本中微生物组成鉴定的精确度，从而更加真实地还原样本中微生物的群落结构。
发明内容
本发明的目的是提供样品中细菌菌群组成和绝对含量的检测方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一套用于样品中细菌绝对含量检测的内参序列组合，包括第一定量内参序列Q1，第二定量内参序列Q2，第三定量内参序列Q3，第四定量内参序列Q4，第五定量内参序列Q5，第六定量内参序列Q6和第七定量内参序列Q7；它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-7所示。
进一步地，所述定量内参序列和指示内参序列含有以下区段：
(1)F1区段：5’-AGGGTTTGATTGTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO:9)
(2)F3区段：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’(SEQ ID NO:10)
(3)F4区段：5’-GTGTCAGCAGCCGCGGTAA-3’(SEQ ID NO:11)
(4)F5区段：5’-ATTAGATACCCCAGTAGTCC-3’(SEQ ID NO:12)
(5)F6区段：5’-AAACTTAAATGAATTGACGG-3’(SEQ ID NO:13)
(6)F10区段：5’-AAGTCCTAACAAGGTAACCCTA-3’(SEQ ID NO:14)
任选地，所述定量内参序列还含有以下区段：
(1)Q1-B4区段含：5’-TCAGACGATGCGTCAT-3’(SEQ ID NO:15)
(2)Q2-B4区段含：5’-TACTAGAGTAGCACTC-3’(SEQ ID NO:16)
(3)Q3-B4区段含：5’-TGTGTATCAGTACATG-3’(SEQ ID NO:17)
(4)Q4-B4区段含：5’-ACACGCATGACACACT-3’(SEQ ID NO:18)
(5)Q5-B4区段含：5’-GATCTCTACTATATGC-3’(SEQ ID NO:19)
(6)Q6-B4区段含：5’-ATGATGTGCTACATCT-3’(SEQ ID NO:20)
(7)Q7-B4区段含：5’-CTGCGTGCTCTACGAC-3’(SEQ ID NO:21)
优选地，所述定量内参序列还含有以下区段：
I-B4区段含：5’-GCAATACCATGGAAGC-3’(SEQ ID NO:22)
第二方面，本发明提供一种定量标准品，所述定量标准品包含权利要求1所述的内参序列组合和1条如SEQ ID NO:8所示的指示内参序列I。
其中，所述定量内参序列Q1:Q2:Q3:Q4:Q5:Q6:Q7的质量比为(800-1200):(80-120):(80-120):(8-12):(8-12):(1.6-2.4):(1.6-2.4)。
优选地，按定量标准品的总体积计，所述定量参考序列的总浓度为1.2×103-1.2×109拷贝/μl。
优选地，按定量标准品的总体积计，所述指示内参序列I的浓度为1.2×103-1.2×109拷贝/μl。
第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含所述的定量标准品。
第四方面，本发明提供所述定量标准品或所述试剂盒在检测样品中细菌菌群组成及含量中的应用(含非疾病诊断目的)。
第五方面，本发明提供样品中细菌菌群组成和绝对含量的检测方法(含非疾病诊断目的)，流程如图5所示，包括以下步骤：
(1)提取待测样品总DNA(eDNA)；
(2)将获得的总DNA与所述定量标准品按一定比例混合，得到含定量内参序列的DNA样品；
(3)用所述含定量内参序列的DNA样品进行全长16S rRNA基因PCR扩增，得到PCR产物；
(4)将得到的PCR产物进行Pacbio测序文库构建并上机测序，得到待测样品的16SrRNA基因reads和所述定量内参序列的reads；
(5)根据待测样品中所述定量内参序列的实际添加拷贝数和测序reads条数绘制标准曲线；
(6)将待测样品中各OTU(OTU聚类分析执行相似度阈值0.97的标准)代表的reads条数带入标准曲线，获得各OTU的实际拷贝数，从而得到细菌菌群组成的相对丰度和各类细菌的绝对含量(绝对拷贝数信息)。
进一步地，步骤(3)PCR扩增使用的引物为：
27F:5’-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3’
1492R：5’-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3’。
本发明中，所述样品可以来自土壤、粪便。
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
本发明提供一种针对细菌16S rRNA基因拷贝数绝对定量的定量标准品、测序方法及其应用。本发明是在三代Pacbio全长微生物多样性测序的基础上建立的全长16S rRNA基因绝对定量测序技术，相较NGS绝对定量方法，具有精确到“种”水平的分辨率和细菌菌群组成“绝对定量”两大技术优势。
本发明通过向土壤、粪便等环境样品提取的DNA中加入一定量的按特定比例混合的7条定量内参序列，然后对16S rRNA基因V1-V9区域进行PCR扩增，并对扩增产物进行Pacbio测序。以7条定量内参的绝对拷贝数为纵坐标，测序获得的对应reads数为横坐标，绘制标准曲线。将样品中各组分菌种测序获得的reads数带入标准曲线计算，并结合DNA抽提总量及扩增模板量获得各菌种的绝对拷贝数。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中进行定量内参质粒最佳内参序列扩增程序和扩增循环数的条件优化的电泳检测结果。
图2为本发明较佳实施例中不同定量内参使用质粒DNA作为模板，扩增效率差异比较的电泳检测结果。
图3为本发明较佳实施例中进行二代测序分别使用3种浓度的定量内参混合物(Qmix-6、Qmix-5、Qmix-4)，检测同一份标准样品，通过测序获取的“定量参考序列”reads数与对应理论绝对拷贝数在取对数值(log10)后进行绘制标准曲线的结果。
图4为本发明较佳实施例中进行三代测序分别使用3种浓度的定量内参混合物(Qmix-6、Qmix-5、Qmix-4)，检测同一份标准样品，通过测序获取的“定量参考序列”reads数与对应理论绝对拷贝数在取对数值(log10)后进行绘制标准曲线的结果。
图5为本发明检测样品中细菌菌群组成和绝对含量检测方法的实验流程图。
具体实施方式
本发明提供一种针对细菌16S rRNA基因拷贝数绝对定量的定量标准品、测序方法及其应用。本发明是在三代Pacbio全长微生物多样性测序的基础上开发的全长16S rRNA基因绝对定量测序技术，具有精确到“种”水平的分辨率和细菌菌群组成“绝对定量”两大技术优势。
本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一组定量标准品，所述定量标准品包含7条定量内参序列和1条指示内参序列。
(1)第一定量内参序列Q1，所述第一定量内参序列Q1是基于SEQ ID NO:1的序列；
(2)第二定量内参序列Q2，所述第二定量内参序列Q2是基于SEQ ID NO:2的序列；
(3)第三定量内参序列Q3，所述第三定量内参序列Q3是基于SEQ ID NO:3的序列；
(4)第四定量内参序列Q4，所述第四定量内参序列Q4是基于SEQ ID NO:4的序列；
(5)第五定量内参序列Q5，所述第五定量内参序列Q5是基于SEQ ID NO:5的序列；
(6)第六定量内参序列Q6，所述第六定量内参序列Q6是基于SEQ ID NO:6的序列；
(7)第七定量内参序列Q7，所述第七定量内参序列Q7是基于SEQ ID NO:7的序列；
(8)指示内参序列I，所述指示内参序列I是基于SEQ ID NO:8的序列。
第二方面，所述定量内参序列全长1466bp，具有下列结构特点：
F1 B1 F2 B2 F3 B3 F4 B4 F5 B5 F6 B6 F7 B7 F8 B8 F9 B9 F10
其中，F区：固定区，包含扩增引物位点；B区：随机序列区，GC含量35-55％，包含定量参考序列barcode区，用于区分Q1-Q7。
第三方面，所述指示内参序列具有下列结构特点：
F1 R1 F2 R2 F3 R3 F4 R4 F5 R5 F6 R6 F7 R7 F8 R8 F9 R9 F10
其中，F区：固定区，包含扩增引物位点，F1-F10具体序列与定量参考序列相同；R区：随机序列区，GC含量35-55％，R3+R4区缩短0.1kb；R4+R5区缩短0.1kb；考虑R1-R9在B1-B9序列基础上各缩短50bp，共缩短450bp。第四方面，所述定量内参序列和指示内参序列均含有以下固定序列区段：
(1)F1区段：5’-AGGGTTTGATTGTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO:9)
(2)F3区段：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’(SEQ ID NO:10)
(3)F4区段：5’-GTGTCAGCAGCCGCGGTAA-3’(SEQ ID NO:11)
(4)F5区段：5’-ATTAGATACCCCAGTAGTCC-3’(SEQ ID NO:12)
(5)F6区段：5’-AAACTTAAATGAATTGACGG-3’(SEQ ID NO:13)
(6)F10区段：5’-AAGTCCTAACAAGGTAACCCTA-3’(SEQ ID NO:14)
第五方面，所述定量内参还含有以下固定序列区段用于定量内参之间及与指示内参、样品之间的区分：
(1)Q1-B4区段含：5’-TCAGACGATGCGTCAT-3’(SEQ ID NO:15)
(2)Q2-B4区段含：5’-TACTAGAGTAGCACTC-3’(SEQ ID NO:16)
(3)Q3-B4区段含：5’-TGTGTATCAGTACATG-3’(SEQ ID NO:17)
(4)Q4-B4区段含：5’-ACACGCATGACACACT-3’(SEQ ID NO:18)
(5)Q5-B4区段含：5’-GATCTCTACTATATGC-3’(SEQ ID NO:19)
(6)Q6-B4区段含：5’-ATGATGTGCTACATCT-3’(SEQ ID NO:20)
(7)Q7-B4区段含：5’-CTGCGTGCTCTACGAC-3’(SEQ ID NO:21)。
第六方面，所述指示内参还含有以下固定序列区段用于与定量内参及样品之间的区分：I-B4区段5’-GCAATACCATGGAAGC-3’(SEQ ID NO:22)。
第七方面，所述定量内参序列总长度1466bp，除以上固定区段外，其它区段为遵循以下规则的随机序列：GC含量40-55％，F3-F5之间长度400-500bp，F3-F5之间GC含量40-55％，F4-F5之间长度280-320bp，F4-F5之间GC含量在40-55％，F4-F6之间长度400-450bp，F4-F6之间GC含量在40-55％。
第八方面，所述指示内参序列总长度1016bp，除以上固定区段外，其它区段为遵循以下规则的随机序列：GC含量40-55％，F3-F5之间长度300-400bp，F3-F5之间GC含量40-55％，F4-F5之间长度230-270bp，F4-F5之间GC含量在40-55％，F4-F6之间长度300-350bp，F4-F6之间GC含量在40-55％。
第九方面，所述定量内参序列Q1:Q2:Q3:Q4:Q5:Q6:Q7的质量比为(800-1200):(80-120):(80-120):(8-12):(8-12):(1.6-2.4):(1.6-2.4)，总浓度为1.2×103-1.2×109拷贝/μl。
第十方面，所述指示内参序列的浓度为1.2×103-1.2×109拷贝/μl。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现，本发明定量标准品中的7条定量内参序列按一定浓度梯度比例混合后可以准确的检测细菌16S rRNA绝对拷贝数，进而确定样品中细菌菌群的组成和含量。本发明定量标准品中的1条指示内参可按一定浓度比例与样品混合后进行PCR预实验，通过预实验结果可以有效指示后续定量内参序列与样品的混合比例，从而使定量内参的数据量占比(10-50％)处于一个较佳的范围内。
实施例1定量内参序列和指示内参序列的制备
1)采用人工化学基因合成的方式，委托基因合成公司进行定量标准品的序列合成。
2)对合成产物冻干质粒DNA溶解，首先将干粉管4000rpm离心5min后，小心打开管盖，每管加入100μl 0.1×TE，轻弹混匀，每隔几分钟混匀一次，30min后瞬离将液体收集至管底进行Qubit浓度测定。
Figure BDA0003850493950000061
3)以溶解后Q1为模板进行预扩增测试，模板起始量1ng，以内参27F(5’-AGGGTTTGATTGTGGCTCAG-3’)和内参1492R(5’-TAGGGTTACCTTGTTAGGACTT-3’)为引物扩增出全长16S序列，确定最佳内参序列扩增程序和扩增循环数。
扩增体系如下：
Figure BDA0003850493950000062
Figure BDA0003850493950000071
扩增程序：
Figure BDA0003850493950000072
*选择3个条件确定最终合适的循环数。
Qubit检测结果：
Figure BDA0003850493950000073
电泳检测结果见图1。其中，泳道1和2对应于10个循环，泳道3和4对应于15个循环，泳道5和6对应于20个循环。
根据扩增产物浓度和图1电泳检测结果中电泳条带判定，泳道1和2扩增目的片段亮度较弱，且扩增条带亮度和扩增浓度不均一；泳道5和6扩增条带出现非特性扩增，尤其以泳道5最为明显；泳道3和4扩增条带亮度均一，且扩增浓度适中，因此当进行内参序列的质粒正式扩增时，选择14个循环进行扩增。
4)按步骤3)确定的实验条件对Q1-Q7和I1进行第一轮正式扩增，扩增产物用0.7×XP磁珠(XP磁珠购自贝克曼库尔特公司，
Figure BDA0003850493950000074
XP)。
纯化后，使用0.1×TE洗脱。然后进行电泳检测，使用1.8％琼脂糖凝胶，在120V条件下电泳运行45min。
Qubit检测结果：
Figure BDA0003850493950000075
电泳检测结果见图2。从Q1-Q7和I1扩增结果Qubit值和检测电泳图显示，不同的内参使用质粒DNA做模板，扩增效率差异太大，如Q6与Q7的Qubit数值两者相差33.6，从而导致各个内参序列扩增总量不均一，因此质粒DNA不适合直接作为内参添加到实际样品中。
5)由于质粒DNA在扩增效率上的差异，因此使用步骤3确定的实验条件对Q1-Q7和I1进行第二轮正式扩增，而模板使用第一轮扩增产物，扩增使用0.5ng/50μl体系，扩增产物用0.7×XP磁珠纯化后，使用0.1×TE洗脱。
Qubit检测结果：
Figure BDA0003850493950000081
从Q1-Q7和I1扩增结果Qubit值显示，不同内参序列使用第一轮扩增产物做模板，Qubit数值相近，扩增效率基本一致，因此全长内参序列扩增产物适合直接作为定量内参添加到实际样品中。
6)将第一轮和第二轮扩增纯化产物合并后进行二次磁珠纯化(1×XP磁珠)，浓缩体积以满足切胶孔最佳上样量，按照3μg/孔(样品体积30μl)进行切胶纯化，通过
Figure BDA0003850493950000082
DNA Gel Extraction Kit试剂盒对切胶产物回收，完成各条定量内参序列和指示内参序列的制备。
实施例2向标准样品中添加定量参考序列，获得二代测序标准品细菌绝对含量
1)选择标准样品ZymoBIOMICS Microbial Community Standard(Zymo,D6305)，使用Qubit测定浓度，用0.1×TE稀释至1ng/μl作为测试用模板，标准品中8种细菌的16S绝对拷贝数理论值见表1。
2)取1μl标化后的标准样品，制备定量内参序列Q1:Q2:Q3:Q4:Q5:Q6:Q7的混合物，按照质量比1000:100:100:10:10:2:2进行添加，对应浓度为1.2×109拷贝/μl，记为Qmix-9，将Qmix-9进行10倍梯度稀释，分别添加Qmix-6、Qmix-5、Qmix-4各1μl，以此为模板，使用16S V3+V4区域引物进行PCR扩增，构建扩增子文库，使用Illumina Hiseq平台进行2×250bp高通量测序。获取标准样品中各物种16S序列和各“定量参考序列”读序条数，并以“定量参考序列”读序条数和实际拷贝数绘制标准曲线(“定量参考序列”读序条数见表2，绘制的标准曲线，方程及R2值见图3。
3)根据标准曲线计算标准样品中8个物种16S rDNA的绝对含量，结果见表1。
4)结果显示，向样品中添加已知绝对拷贝数的“定量参考序列”能够实现对样品中微生物16S拷贝数的绝对定量。但是，如果“定量参考序列”数量占比过低，则所绘制的标准曲线拟合结果较差；与之相反，若“定量参考序列”数量占比过高，虽然标准曲线拟合较优，但会占用过多的测序数据量，实际样品测序数据量不足，导致样品加测和测序成本升高。因此，“定量参考序列”占总序列的比例直接影响绝对定量的实验结果。
表1二代测序16S标准样品中16S拷贝数的理论值和检出值
Figure BDA0003850493950000091
表2二代测序“定量参考序列”reads数
定量参考序列 Qmix-6 Qmix-5 Qmix-4
inter_ref1 44475 8499 649
inter_ref2 6853 967 77
inter_ref3 4862 709 48
inter_ref4 289 49 4
inter_ref5 480 119 8
inter_ref6 54 15 2
inter_ref7 36 9 1
定量参考序列reads数 57049 10367 789
样品总reads数 156779 159763 159798
定量参考序列比例 36.4％ 6.5％ 0.5％
分别使用3种浓度的“定量参考序列”(Qmix-6、Qmix-5、Qmix-4)，测定标准样品ZymoBIOMICS Microbial Community Standard(Zymo,D6305)中的微生物16S绝对拷贝数实验结果。表1数据显示，添加3种浓度的定量内参Qmix检测出标准样品中16S拷贝数与理论拷贝数的比较，标准样品16S拷贝数检测值和理论值的比值越接近于1，则表示标准样品绝对拷贝数的检测结果更准确，因此Qmix-6和Qmix-5定量准确性优于Qmix-4，而Qmix-4的“定量参考序列”占比过低(0.5％)。图3(A-C)表示添加3种浓度的定量内参Qmix，通过测序获取的“定量参考序列”reads数与对应理论绝对拷贝数在取对数值(log10)后进行绘制的标准曲线。7条“定量参考序列”拷贝数之间为1000：100：100：10：10：2：2梯度关系，其中添加Qmix-6、Qmix-5标准曲线R2值在0.98以上，线性关系较佳，而Qmix-4的“定量参考序列”占比过低，标准曲线R2值在0.98以下，且Qmix-4检测出标准样品中16S拷贝数与理论拷贝数比值为1.42，存在很大偏差，因此添加“定量参考序列”浓度过低时，例如添加Qmix-4的结果，将导致16S拷贝数绝对定量结果的偏差，因此突显增加绝对定量测序预实验的必要性，以确定“定量参考序列”最佳添加比例，例如二代测序可选择以Qmix-6为预实验定量参考序列添加条件，以评判获取最佳标准曲线的线性关系，从而提升绝对定量准确性。
实施例3向标准样品中添加定量参考序列，获得三代测序标准品细菌绝对含量
1)选择标准样品ZymoBIOMICS Microbial Community Standard(Zymo,D6305)，使用Qubit测定浓度，用0.1×TE稀释至1ng/μl作为测试用模板，标准品中8种细菌的16S绝对拷贝数理论值见表3。
2)取1μl标化后的标准样品，分别添加Qmix-6、Qmix-5、Qmix-4各1μl，以此为模板，使用含barcode序列16S全长区域引物(在16S全长通用扩增引物序列结构上添加用于区分样本的标签序列信息，barcode序列即为标签序列)进行PCR扩增。
3)所有扩增产物进行混库、切胶纯化后，采用
Figure BDA0003850493950000102
Express TemplatePrep Kit 2.0试剂盒进行文库构建，使用PacBio SequelII平台进行测序。获取标准样品中各物种16S序列和各“定量参考序列”读序条数，并以“定量参考序列”读序条数和实际拷贝数绘制标准曲线(“定量参考序列”读序条数见表4，绘制的标准曲线，方程及R2值见图4。
4)根据标准曲线计算标准样品中8个物种16S rDNA的绝对含量，结果见表3。
5)结果显示，向样品中添加已知绝对拷贝数的“定量参考序列”能够实现对样品中微生物16S拷贝数的绝对定量。但是相同情况，如果“定量参考序列”数量占比过低，则所绘制的标准曲线拟合结果较差；与之相反，若“定量参考序列”数量占比过高，虽然标准曲线拟合较优，但会占用过多的测序数据量，实际样品测序数据量不足，导致样品加测和测序成本升高。因此，“定量参考序列”占总序列的比例直接影响绝对定量的实验结果；但是三代绝对定量测序优势在于，Pacbio测序获取的16S区域相较于NGS更长，包含16S rDNA的V1-V9区域，可以精准鉴定到“种”水平，因此在扩增子测序分析中，OTU或者ASV水平比二代测序更加精准，以获取更加准确的高水平物种层级的拷贝数情况。
表3三代测序16S标准样品中16S拷贝数的理论值和检出值
Figure BDA0003850493950000101
表4三代测序“定量参考序列”reads数
定量参考序列 Qmix-6 Qmix-5 Qmix-4
inter_ref1 1026 6240 21543
inter_ref2 89 581 2870
inter_ref3 78 573 2850
inter_ref4 6 62 285
inter_ref5 7 53 335
inter_ref6 2 12 74
inter_ref7 0 9 46
定量参考序列reads数 1208 7530 28003
样品总reads数 35401 32584 39754
定量参考序列比例 3.4％ 23.1％ 70.4％
分别使用3种浓度的“定量参考序列”(Qmix-6、Qmix-5、Qmix-4)，测定标准样品ZymoBIOMICS Microbial Community Standard(Zymo,D6305)中的微生物16S绝对拷贝数实验结果。表3数据显示，添加3种浓度的定量内参Qmix检测出标准样品中16S拷贝数与理论拷贝数的比较，标准样品16S拷贝数检测值和理论值的比值越接近于1，则表示标准样品绝对拷贝数的检测结果更准确，因此Qmix-6和Qmix-5的定量准确性优于Qmix-4，而Qmix-4的“定量参考序列”占比过低(3.4％)。图4(D-F)表示添加3种浓度的定量内参Qmix，通过测序获取的“定量参考序列”reads数与对应理论绝对拷贝数在取对数值(log10)后进行绘制的标准曲线。7条“定量参考序列”拷贝数之间为1000：100：100：10：10：2：2梯度关系，因此所绘制的标准曲线斜率应为1。如图2所示，添加Qmix-6、Qmix-5时，斜率接近于1，而添加Qmix-4时，斜率偏离1较多，并且“定量参考序列”所占比例过低(3.4％)，从而影响绝对定量结果的准确性。添加Qmix-6、Qmix-5，标准曲线斜率接近于1，R2值在0.98以上，线性关系较佳，但Qmix-6的“定量参考序列”占比过高(70.4％)，占用过多的测序数据量，从而导致实际样品测序数据量不足。因此向标准样品中添加定量参考序列，能够获取较为准确的16S绝对拷贝数，但添加“定量参考序列”浓度过低时，例如添加Qmix-4的结果，将导致16S拷贝数绝对定量结果的偏差，因此突显增加绝对定量测序预实验的必要性，以确定“定量参考序列”最佳添加比例，例如三代测序可选择Qmix-5为预实验定量参考序列添加条件，既能获取更加准确标准曲线的线性关系，又能保证下机测序数据量满足样品测序要求。
本实施例检测样品中细菌菌群组成和绝对含量检测方法的实验流程见图5。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于样品中细菌绝对含量检测的内参序列组合，其特征在于，包括第一定量内参序列Q1，第二定量内参序列Q2，第三定量内参序列Q3，第四定量内参序列Q4，第五定量内参序列Q5，第六定量内参序列Q6和第七定量内参序列Q7；它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-7所示。
2.一种定量标准品，其特征在于，所述定量标准品包含权利要求1所述的内参序列组合和1条如SEQ ID NO:8所示的指示内参序列I。
3.根据权利要求2所述的定量标准品，其特征在于，所述定量内参序列Q1:Q2:Q3:Q4:Q5:Q6:Q7的质量比为(800-1200):(80-120):(80-120):(8-12):(8-12):(1.6-2.4):(1.6-2.4)。
4.根据权利要求2或3所述的定量标准品，其特征在于，按定量标准品的总体积计，所述定量参考序列的总浓度为1.2×103-1.2×109拷贝/μl。
5.根据权利要求4所述的定量标准品，其特征在于，按定量标准品的总体积计，所述指示内参序列I的浓度为1.2×103-1.2×109拷贝/μl。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2-5任一项所述的定量标准品。
7.权利要求2-5任一项所述定量标准品或权利要求6所述试剂盒在检测样品中细菌菌群组成及含量中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。
8.样品中细菌菌群组成和绝对含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品总DNA；
(2)将获得的总DNA与权利要求2-5任一项所述定量标准品按一定比例混合，得到含定量内参序列的DNA样品；
(3)用所述含定量内参序列的DNA样品进行全长16S rRNA基因PCR扩增，得到PCR产物；
(4)将得到的PCR产物进行Pacbio测序文库构建并上机测序，得到待测样品的16S rRNA基因reads和所述定量内参序列的reads；
(5)根据待测样品中所述定量内参序列的实际添加拷贝数和测序reads条数绘制标准曲线；
(6)将待测样品中各OTU代表的reads条数带入标准曲线，获得各OTU的实际拷贝数，从而得到细菌菌群组成的相对丰度和各类细菌的绝对含量；
所述方法为非疾病诊断目的。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)PCR扩增使用的引物为：
27F:5’-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3’
1492R：5’-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3’。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述样品来自土壤、粪便。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116790779A (zh) * 2023-08-14 2023-09-22 广东美格基因科技有限公司 一种微生物种群绝对丰度定量的内参组合物、试剂盒及方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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