CN102894011A - 黄麻链霉菌nf0919菌株代谢产物在防治梨树病害上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明为黄麻链霉菌NF0919菌株（其在CGMCC的保藏编号为CGMCC No.3968，菌种专利号为ZL201010236886.1）发酵液中活性代谢产物的提取方法。代谢产物能有效防治由植物病原真菌梨黑星菌（Venturia piritna）侵染引发的梨黑星病（又称梨疮痂病）和轮纹大茎点菌（Physalospora piricola）侵染引发的梨轮纹病（又称梨瘤皮病、粗皮病）。

Description

黄麻链霉菌NF0919菌株代谢产物在防治梨树病害上的应用

发明领域

本发明涉及一种微生物及用途，更具体地说涉及一种黄麻链霉菌（Streptomyces corchorusii）NF0919菌株代谢产物及其在防治梨树病害上的应用，属于生物农药技术领域。 

背景技术

由植物病原真菌梨黑星菌（Venturia piritna）侵染引发的梨黑星病（又称梨疮痂病）和轮纹大茎点菌（Physalospora piricola）侵染引发的梨轮纹病（又称梨瘤皮病、粗皮病），是梨树上主要的真菌病害。梨病害的防治当前主要通过化学防治来防控，常用以下化学药剂防治：石硫合剂、烯唑醇、百菌清、甲基托布津、腈菌唑、代森锰锌、退菌特、代森铵、嘧菌酯、醚菌酯、苯醚甲环唑、烯肟菌酯、啶酰菌胺、多菌灵、吡唑醚菌酯和咪鲜胺等。长期以来，由于多频次、多剂量施用化学药剂，造成梨树病原真菌对常用化学药剂都产生了不同程度的抗（耐）药性，梨树用药量和用药频率逐年升高，对果品安全产生严重影响。 

目前成功用于防治梨树病害的生物农药专用制剂还没有。文献已报道生物防治梨树病害的生防菌属（种）主要有（1）木霉菌属真菌（Trichoderma spp.）中的绿色木霉（Trichoderma viride）和哈茨木霉（Trichoderma harzianum）；（2）芽孢杆菌属细菌（Bacillus spp.）中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）；（3）假单胞菌属细菌（Pseudomonas spp.）中的荧光假单胞细菌（Pseudomonas fluorescens）等。 

本发明提供的可同时兼治梨轮纹病和梨黑星病的颉颃细菌黄麻链霉菌NF0919菌株，在现有技术中没有提及和公开。 

发明内容

提供黄麻链霉菌（Streptomyces corchorusii）NF0919菌株发酵液中产物的提取方法，及提取物在防治梨黑星病和梨轮纹病上的应用。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明中提供用的黄麻链霉菌NF0919菌株的菌株特征，见专利ZL 201010236886.1。黄麻链霉菌（拉丁文学名为Streptomyces corchorusii）NF0919菌株，已于2010年7月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No. 3968。本发明的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，包括以下步骤：

（A）菌株的活化与一级种子培养液的培养

将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30℃培养10 d，挑取1 cm²大小的菌块接种于50 mL一级种子培养液中（250 mL三角瓶装培养液50 mL），置于170 rpm摇床上30℃振荡培养44～48 h，其中所述的50 mL一级种子培养液的成分为：可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K₂HPO₄  0.2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl 和K₂HPO₄  含量的单位比例为W/V；

（B）二级种子培养液的培养

将步骤（A）所得一级种子培养液按5%（V/V）的接种量接入50 mL二级种子培养液中（250 mL三角瓶装培养液50 mL），170 rpm、30 ℃摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V；所述的50 mL二级种子培养液的成分（W/V）：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.2%，CaCO₃ 0.1%，K₂HPO₄ 0.05%，MgSO₄ 0.05%，淀粉酶0.01%，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO₃ 、K₂HPO₄、MgSO₄ 和淀粉酶含量的单位比例为W/V；

（C）发酵培养液的培养

将步骤（B）所得二级种子培养液按5%（V/V）的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为：溶氧100%，消泡剂1.6 L，搅拌速度为360 rpm, 发酵温度为36 ℃，发酵时间为72 h，pH 6.8～7.2，所述的发酵培养液的成分为（W/V）：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.6%，K₂HPO₄ 0.05%，NaCl 0.2%，MgSO₄ 0.05%，CaCO₃ 0.1%，pH7.2-7.4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K₂HPO₄ 、NaCl 、MgSO₄ 和CaCO₃ 含量的单位比例为W/V；所述的消泡剂为XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂；

（D）NF0919菌株发酵液中代谢产物分离方法 

把步骤（C）所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2.0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35℃真空干燥得提取物。 

本发明的有益效果是： 

本发明提供黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，并证明其提取物可同时兼治梨树多种病害。大田防治结果表明，该菌株代谢产物对梨黑星病和梨轮纹病均有很好的防治效果。

具体实施方式

实施例

本发明中提供用的黄麻链霉菌NF0919菌株的菌株特征，见专利ZL201010236886.1。本发明黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中产物的提取方法，包括以下步骤： 

（A）菌株的活化与一级种子培养液的培养

将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30℃培养10 d，挑取1 cm²大小的菌块接种于50 mL一级种子培养液中（250 mL三角瓶装培养液50 mL），置于170 rpm摇床上30℃振荡培养44～48 h，其中所述的50 mL一级种子培养液的成分为：可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K₂HPO₄  0.2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl 和K₂HPO₄  含量的单位比例为W/V；

（B）二级种子培养液的培养

将步骤（A）所得一级种子培养液按5%（V/V）的接种量接入50 mL二级种子培养液中（250 mL三角瓶装培养液50 mL），170 rpm、30 ℃摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V；所述的50 mL二级种子培养液的成分（W/V）：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.2%，CaCO₃ 0.1%，K₂HPO₄ 0.05%，MgSO₄ 0.05%，淀粉酶0.01%，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO₃ 、K₂HPO₄、MgSO₄ 和淀粉酶含量的单位比例为W/V；

（C）发酵培养液的培养

将步骤（B）所得二级种子培养液按5%（V/V）的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为：溶氧100%，消泡剂1.6 L，搅拌速度为360 rpm, 发酵温度为36 ℃，发酵时间为72 h，pH 6.8～7.2，所述的发酵培养液的成分为（W/V）：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.6%，K₂HPO₄ 0.05%，NaCl 0.2%，MgSO₄ 0.05%，CaCO₃ 0.1%，pH7.2-7.4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K₂HPO₄ 、NaCl 、MgSO₄ 和CaCO₃ 含量的单位比例为W/V；所述的消泡剂为XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂；

（D）NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法

把步骤（C）所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2.0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35℃真空干燥得提取物。

本实施例的实施效果：

NF0919菌株发酵液的提取物对梨黑星病和梨轮纹病的田间防效试验

试验在江苏省句容市镇江农业科学研究所白兔果园进行, 梨树品种为日本爱甘水（6年树龄），试验处理方案如下：

(A) 梨黑星病的防治

药剂处理方法：NF0919菌株发酵液提取物3000倍液，对照药剂为50%多菌灵可湿性粉剂(江苏省绿盾植保农药实验有限公司生产) 1000倍液，空白对照为不防治, 每小区6棵树, 随机区组排列，4次重复。第一期防治时间为幼果期（2011年4月28日）；第二期防治时间为采果前45天左右（2011年6月30日），每期各连续防治4次，防治间隔期都为7天，用水量为每棵树6 Kg。采果时调查病害严重度并计算出病情指数；

(B) 梨轮纹病的防治

药剂处理方法：NF0919菌株发酵液提取物3000倍液，对照药剂为50%多菌灵可湿性粉剂(江苏省绿盾植保农药实验有限公司生产) 1000倍液，空白对照为不防治, 每小区6棵树, 随机区组排列，4次重复。第一期防治时间为落花初果期（2011年4月10日）；第二期防治时间为采果前70天左右（2011年6月10日），每期各连续防治4次，防治间隔期都为10天，用水量为每棵树6 Kg。采果时调查病害严重度并计算出病情指数。

结果与分析：NF0919菌株发酵液提取物3000倍液对梨黑星病和梨轮纹病的防治效果分别为92.21%和69.53%（表1），而对照药剂50%多菌灵可湿性粉剂1000倍液对梨黑星病和梨轮纹病的防治效果分别为57.22%和40.23%（表1）。 

以上结果表明，NF0919菌株发酵液中代谢产物提取物的田间防治效果显著高于对照药剂，NF0919菌株发酵液提取物对梨树两大病害的兼治作用显著。试验中所有处理均未发生药害现象，表明NF0919菌株发酵液中代谢产物使用安全。 

表1  NF0919菌株发酵液的提取物对梨黑星病和梨轮纹病的田间防治试验结果 

注：不同大写字母表示 P < 0.01。

Claims (3)

1.黄麻链霉菌（Streptomyces corchorusii）NF0919菌株（该菌种特性见专利ZL 201010236886.1）发酵液中代谢产物的提取方法。

2.根据权利要求1所述的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取物，在防治梨黑星病和轮纹病上的应用。

3.权利要求1所述的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

（A）菌株的活化与一级种子培养液的培养

将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30℃培养10 d，挑取1 cm²大小的菌块接种于50 mL一级种子培养液中，置于170 rpm摇床上30℃振荡培养44～48 h，其中所述的50 mL一级种子培养液的成分为：可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K₂HPO₄  0.2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl 和K₂HPO₄  含量的单位比例为W/V；

（B）二级种子培养液的培养

将步骤（A）所得一级种子培养液按5%的接种量接入50 mL二级种子培养液中，170 rpm、30 ℃摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V；所述的50 mL二级种子培养液的成分：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.2%，CaCO₃ 0.1%，K₂HPO₄ 0.05%，MgSO₄ 0.05%，淀粉酶0.01%，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO₃ 、K₂HPO₄、MgSO₄ 和淀粉酶含量的单位比例为W/V；

（C）发酵培养液的培养

将步骤（B）所得二级种子培养液按5%的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为：溶氧100%，消泡剂（XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂）1.6 L，搅拌速度为360 rpm, 发酵温度为36 ℃，发酵时间为72 h，pH 6.8～7.2，所述的发酵培养液的成分为：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.6%，K₂HPO₄ 0.05%，NaCl 0.2%，MgSO₄ 0.05%，CaCO₃ 0.1%，pH7.2-7.4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K₂HPO₄ 、NaCl 、MgSO₄ 和CaCO₃ 含量的单位比例为W/V；

（D）NF0919菌株发酵液中代谢产物提取方法

把步骤（C）所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2.0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35℃真空干燥得提取物。