CN114480220B - 一种贝莱斯芽孢杆菌及其抑制灰葡萄孢菌的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)及其抑制灰葡萄孢菌的方法及其应用。该贝莱斯芽孢杆菌JWYB9保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 24000。本发明通过16S rDNA菌种鉴定来确定JWYB9为贝莱斯芽孢杆菌，在密闭的两分格培养皿中利用JWYB9产生的挥发性有机物进行熏蒸来抑制灰葡萄孢菌，并将该方法应用到采后水果上，达到防止或减少水果腐败变质、延长保质期的目的。优点在于安全性高、方便快捷、绿色环保。该发明在采后活性包装环节的应用潜力巨大。
Description
技术领域
本发明属于生物防治领域，具体涉及一种利用贝莱斯芽孢杆菌产生的挥发性有机物抑制灰葡萄孢菌的方法，及其在水果采后防腐上的应用。
背景技术
水果因其滋味清甜、营养丰富等特点向来深受人们的喜爱，是日常饮食中不可或缺的成分。特别是随着经济科技的高速发展和生活水平的显著提高，人们对水果的安全、美味、营养以及多样性提出了更多更高的要求。作为结果，水果的储存和运输产业面临着巨大的机遇与挑战。如何将水果尽可能新鲜地送到每一位消费者手中，是目前科研人员们尽力研究的关键所在。
水果在采摘后常常会出现水分流失、机械损伤、病原菌侵害等问题，导致水果的腐烂变质，造成水果的大量浪费。最近数据显示全球生产的果蔬约有33％被浪费，产生了巨大的经济损失，其中病原菌侵害是最主要的损耗原因。研究显示即使是在发达国家，果蔬在处理和储存过程中的致病性腐烂率也高达20-25％，而发展中国家会更高。因此采用合适的方法对采后水果上的病原菌进行防治意义重大。
化学杀菌剂具有效率高、成本低和操作简单等特点，一直以来都是预防果蔬采后疾病的最重要的方法。但是随着这些年来人们环境意识的提高，化学杀菌剂给环境带来的严重危害越发引起人们的重视，重新寻找一种高效、安全、绿色的控制措施成为了亟需解决的难题。
近些年来，利用拮抗微生物来防止采后果蔬腐败变质的控制手段逐渐成为一种趋势。芽孢杆菌因其具有高产代谢物的能力而受到了强烈关注，其中其产生的挥发性有机物更是引起了广泛兴趣。曾有研究者分离出短小芽孢杆菌并发现其挥发性有机物对黑胫病菌和赤星病菌有较好的抑制作用。芽孢杆菌产生的具有较强抑菌活性的挥发性有机物，有潜力为采后果蔬的活性包装提供重要资源。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用贝莱斯芽孢杆菌产生的挥发性有机物来抑制灰葡萄孢菌的方法，并展示其在代表性水果葡萄采后防腐上的应用，能够为采后水果的活性包装设计及其他保护手段开阔崭新思路和提供重要资源。
为此，本发明公开了一株能产生较强抑制灰葡萄孢菌效果的挥发性有机物的贝莱斯芽孢杆菌JWYB9。该菌通过16S rDNA菌种鉴定来确定为贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为 CGMCC 24000，保藏日期为2021年11月29日。
本发明还提供了一种所述贝莱斯芽孢杆菌用于抑制灰葡萄孢菌中的应用。优选的，利用贝莱斯芽孢杆菌产生的挥发性有机物在密闭环境空间中抑制灰葡萄孢菌。
更进一步的，利用贝莱斯芽孢杆菌产生的挥发性有机物在密闭环境空间中对水果进行熏蒸以抑制灰葡萄孢菌。
本发明还提供了一种利用所述贝莱斯芽孢杆菌抑制灰葡萄孢菌的方法，其包括如下步骤：
(1)接种环取活化后的贝莱斯芽孢杆菌JWYB9一环于蛋白胨蔗糖液体培养基中，置于30℃-40℃摇床中，培养至吸光值为0.5-0.8，制成芽孢杆菌种子液待用；
(2)取上下分格的容器，在下层中加入蛋白胨蔗糖固体培养基，搅拌均匀后静待；固体培养基布满下层容器底部即可；待固体培养基凝固后在其表面均匀涂满1-5％(v/v)的步骤(1)所得的种子液，30～40℃下放置24h后使用；
(3)将水果放在接种有贝莱斯芽孢杆菌JWYB9的蛋白胨蔗糖固体培养基上方，两者之间使用镂空的隔板上下分离，整个容器利用保鲜膜封好，制成密闭空间，利用芽孢杆菌产生的挥发性有机物对水果进行防腐保鲜处理。
作为本发明的优选方案，所述蛋白胨蔗糖液体培养基配方组成包括：胰蛋白胨10g/L、大豆蛋白胨5g/L、蔗糖5g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠8g/L，121℃高压灭菌20min；
所述蛋白胨蔗糖固体培养基：胰蛋白胨10g/L、大豆蛋白胨5g/L、蔗糖5g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠8g/L、琼脂粉20g/L，121℃高压灭菌20min。
作为本发明的优选方案，每个容器体积应维持在15-20L，单个容器熏蒸水果的质量为1-1.5kg；所述镂空隔板用以分离芽孢杆菌和水果，实现非接触式生物防治。
作为本发明的优选方案，每1-1.5kg水果熏蒸需要使用150mL固体培养基、 1.5mL种子液。
作为本发明的优选方案，所述的水果为葡萄。
本发明具有以下优点：
(1)在放有已经接种灰葡萄孢菌的葡萄的密闭环境中，同时放入接种于蛋白胨蔗糖固体培养基上的贝莱斯芽孢杆菌JWYB9，利用JWYB9产生的包含十五烷、苯乙醇等的挥发性有机物抑制灰葡萄孢菌来达到葡萄防腐的效果。特殊挥发性成分组合，不与水果直接接触，安全性高。
(2)厌氧好氧环境均可产气，可与其他防腐手段结合使用，适用面广。
(3)操作方便，与目前化学保鲜手段相比绿色环保。
附图说明
图1贝莱斯芽孢杆菌JWYB9与相似菌株16S rDNA序列的系统发育树。
图2贝莱斯芽孢杆菌JWYB9对灰葡萄孢菌的体外抑制效果。
图3贝莱斯芽孢杆菌JWYB9对接种灰葡萄孢菌的葡萄的发病率的抑制情况。
具体实施方式
下面是对本发明的实例作详细说明。
实例1：贝莱斯芽孢杆菌JWYB9产生的挥发性有机物对灰葡萄孢菌的体外抑制效果。
1.生防贝莱斯芽孢杆菌JWYB9：
(1)菌株来源：贝莱斯芽孢杆菌JWYB9分离自中药材虎杖片。其具体分离方法为在生理盐水中加入少量虎杖片振荡过夜放置；随后80℃下水浴10min，吸取100μL菌液涂布牛肉膏蛋白胨固体培养基，置于37℃培养24h；最后挑取固体培养基上的单菌落镜检，镜检合格后保藏。
(2)菌种鉴定：经16S rDNA测序得到长度为1369bp的序列。将该结果在 NCBI进行Blast比对，获得与该菌株16S rDNA同源的标准序列数据，使用MEGA 软件作系统发育分析。结果如图1所示，鉴定该菌为贝莱斯芽孢杆菌。
(3)活化：蘸取少量冻存于-80℃环境中的贝莱斯芽孢杆菌JWYB9，于蛋白胨蔗糖固体培养基上划线，放入37℃培养箱中过夜培养。挑取少量过夜培养的固体培养基上的JWYB9接种至蛋白胨蔗糖液体培养基中，37℃培养12h后活化结束。
(4)芽孢杆菌菌液制备：吸取100μL活化后的贝莱斯芽孢杆菌JWYB9接种至蛋白胨蔗糖液体培养基中，置于37℃摇床，180rpm培养至吸光值为0.6，制成芽孢杆菌菌液待用。
2.生防贝莱斯芽孢杆菌JWYB9挥发物组成：
将37℃摇床培养12h后获得的JWYB9芽孢杆菌菌液，开口放置于自封袋中，自封袋封口后气体平衡4h，采用固相萃取头吸附自封袋中的密闭气体，使用顶空-固相微萃取气质联用仪(HS-SPME-GC-MS)测定其挥发物组成(表1)。结果显示，JWYB9挥发物中包含醇、酚、酮、烃、醛、酯、酸以及其他多种成分，在施用于果品过程中共同发挥防霉作用。
表1 贝莱斯芽孢杆菌JWYB9挥发物主要气体成分表
3.病原菌灰葡萄孢菌：
(1)活化：挑取少量保存于4℃冰箱中的灰葡萄孢菌于PDA固体培养基上， 25℃划线培养5-6d后活化完成。
(2)菌块制备：挑取少量活化好的灰葡萄孢菌于1mL生理盐水中，显微镜下血细胞计数板计数，稀释至1×108孢子/mL，制成孢子悬液。取100μL孢子悬液于PDA固体培养基上涂布，25℃划线培养5-6d。将培养好的灰葡萄孢菌利用无菌打孔器打成直径为5mm的菌块待用。
4.培养基成分：
(1)牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、琼脂粉20g/L，121℃高压灭菌20min。
(2)蛋白胨蔗糖液体培养基：胰蛋白胨10g/L、大豆蛋白胨5g/L、蔗糖5g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠8g/L，121℃高压灭菌20min。
(3)蛋白胨蔗糖固体培养基：胰蛋白胨10g/L、大豆蛋白胨5g/L、蔗糖5g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠8g/L、琼脂粉20g/L，121℃高压灭菌20min。
(4)PDA固体培养基：新鲜马铃薯200g/L(去皮后沸水蒸煮20min，经8 层纱布过滤除去沉淀)、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，121℃高压灭菌20min。
5.两分格培养皿体外熏蒸抑菌实验：
取两分格培养皿，一侧在蛋白胨蔗糖固体培养基上涂布100μL芽孢杆菌菌液，另一侧在PDA固体培养基上放置灰葡萄孢菌菌块。将两分格培养皿盖好，并用封口膜封口，形成密闭环境。放置于25℃温度下培养6-7d，培养结束后观察贝莱斯芽孢杆菌JWYB9产生的挥发性有机物对灰葡萄孢菌的抑制情况。抑制率的计算公式如下所示。
6.实验结果和分析：
实验结果如表2和图2所示，结果显示贝莱斯芽孢杆菌JWYB9产生的挥发性有机物对灰葡萄孢菌的抑制效果明显，抑制率为71.51％。
表2 贝莱斯芽孢杆菌JWYB9产生的挥发性有机物对灰葡萄孢菌的抑制率
实例2：贝莱斯芽孢杆菌JWYB9产生的挥发性有机物在采后葡萄上的非接触式应用。
1.生防贝莱斯芽孢杆菌JWYB9：
(1)活化和芽孢杆菌菌液的制备同实例1。
(2)取100μL制备好的芽孢杆菌菌液涂布于蛋白胨蔗糖固体培养基上待用。
2.病原菌灰葡萄孢菌：
(1)活化同实例1
(2)孢子悬液制备：挑取少量活化好的灰葡萄孢菌于1mL生理盐水中，显微镜下血细胞计数板计数，稀释至1×105孢子/mL，制成孢子悬液。
3.水果：
挑选没有任何可见损伤和腐烂情况的巨峰葡萄，成熟度和大小要均匀。将巨峰葡萄用0.2％次氯酸钠溶液消毒5min，并用去离子水冲洗2遍。消毒后小心去除巨峰葡萄的果梗，以顶部的小洞作为伤口。
4.葡萄体内生防实验：
在巨峰葡萄顶部的伤口中接种10μL浓度为105孢子/mL的孢子悬液。静置 2h后将巨峰葡萄以12个为一组放入1.7L的保鲜盒中。实验组保鲜盒顶部粘有涂布芽孢杆菌菌液的蛋白胨蔗糖固体培养基，不与巨峰葡萄直接接触。对照组涂布生理盐水。每组实验三个重复。将保鲜盒密封好，放入温度为25℃的培养室中培养。自贮藏后的第2天开始记录巨峰葡萄的发病率。发病率的计算公式如下所示。
5.实验结果与分析：
实验结果如表3和图3所示。对照组在第2天的发病率就高达77.78％，并在第4天全部发病。而实验组第2天的发病率仅为39.58％，差不多为对照组的一半；第3天和第4天的发病率与对照组相比下降了25.69％和16.67％；且直到第6天仍没有全部发病。由此而观之，贝莱斯芽孢杆菌JWYB9产生的挥发性有机物对接种灰葡萄孢菌的巨峰葡萄的发病情况具有明显的抑制效果。
表3 贝莱斯芽孢杆菌JWYB9产生的挥发性有机物对葡萄发病率的影响
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），其特征在于，其保藏名称为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）JWYB9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 24000，保藏日期为2021年11月29日。
2.一种权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）用于抑制灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：利用贝莱斯芽孢杆菌产生的挥发性有机物在密闭环境空间中对水果进行熏蒸以抑制灰葡萄孢菌。
4.一种利用权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）抑制灰葡萄孢菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）接种环取活化后的贝莱斯芽孢杆菌JWYB9一环于蛋白胨蔗糖液体培养基中，置于30℃-40℃摇床中，培养至吸光值为0.5-0.8，制成芽孢杆菌种子液待用；
（2）取上下分格的容器，在下层中加入蛋白胨蔗糖固体培养基，搅拌均匀后静待；固体培养基布满下层容器底部即可；待固体培养基凝固后在其表面均匀涂满1-5%（v/v）的步骤（1）所得的种子液，30~40℃下放置24 h后使用；
（3）将水果放在接种有贝莱斯芽孢杆菌JWYB9的蛋白胨蔗糖固体培养基上方，两者之间使用镂空的隔板上下分离，整个容器利用保鲜膜封好，制成密闭空间，利用芽孢杆菌产生的挥发性有机物对水果进行防腐保鲜处理。
5.根据权利要求4所述的利用贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）抑制灰葡萄孢菌的方法，其特征在于：
所述蛋白胨蔗糖液体培养基配方组成包括：胰蛋白胨10 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、蔗糖5g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠8 g/L，121℃高压灭菌20 min；
所述蛋白胨蔗糖固体培养基配方组成包括：胰蛋白胨10 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、蔗糖5g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠8 g/L、琼脂粉20 g/L，121℃高压灭菌20 min。
6.根据权利要求4所述的利用贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）抑制灰葡萄孢菌的方法，其特征在于：每个容器体积应维持在15-20 L，单个容器熏蒸水果的质量为1-1.5kg；所述镂空隔板用以分离芽孢杆菌和水果，实现非接触式生物防治。
7.根据权利要求4所述的利用贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）抑制灰葡萄孢菌的方法，其特征在于：每1-1.5 kg水果熏蒸需要使用150 mL固体培养基、1.5 mL种子液。
8.权利要求4所述利用贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）抑制灰葡萄孢菌的方法，其特征在于所述的水果为葡萄。
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