KR101676917B1 - 항진균 및 살충용 토종벌 유래 ick 펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항균 및 살충성 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 동양꿀벌, 토종벌인 Apis cerana 유래의 ICK 펩타이드의 항균 및 살충 기능의 최초 발견에 기초한, 항진균 및 살충성 독소로서의 기능을 갖는 토종벌 유래의 ICK(inhibitor cysteine knot, AcICK) 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

항진균 및 살충용 토종벌 유래 ICK 펩타이드 {Inhibitor cysteine knot(AcICK) from Apis cerana having antifungal and insecticidal activity}

본 발명은 항진균 및 살충용 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 동양꿀벌(토종벌) Apis cerana 유래의 ICK(inhibitor cysteine knot, AcICK) 펩타이드의 항진균 및 살충 기능의 최초 발견에 기초한, 항진균 및 살충성 독소로서의 기능을 갖는 토종벌 유래의 ICK 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

생물체에는 생체의 선천성 면역계(innate immunity) 및 숙주방어(host defense)에 중요한 역할을 담당하는 항균 펩타이드가 존재한다는 것이 최근 들어 많이 알려지고 있다. 특히, 곤충, 양서류 및 포유동물을 포함한 각종 생물체는 이들의 진화과정에서 각종 병원성 미생물의 감염에 대응하여 여러 종류의 펩타이드를 이용, 면역 방어계(Immune defence)를 가지고 있다는 것이 알려지고 있다.

이러한 가운데 최근 들어 분석방법 및 구조결정법의 발달에 의하여 수많은 항균 펩타이드가 밝혀지고 있으며, 이 중 몇몇 항균 펩타이드는 각종 미생물에 대한 항생 활성의 작용 기작이 표적세포(target cell)의 인지질 이중층막(phospholipid layer membrane)과의 결합에 관련되어 있고, 펩타이드의 양쪽 친매성(amphipathic)에 의한 세포막상의 ion channel 또는 pore의 형성이 세포막의 막전위를 변화시키거나, 세포막을 파괴하여 결국에는 세포의 사멸(cell lysis)에 이르게 한다고 밝혀지고 있다.

항균 펩타이드는 기존의 항생제보다 넓은 범위의 미생물에 대하여 강한 항균력을 나타내고 있으며, 항생제 내성을 유발시키는 기존의 항생제와는 다른 활성기작으로 항균 활성을 나타내는 특징을 보임에 따라 항균 활성이 우수한 신규한 항균 펩타이드에 대한 연구가 강하게 대두되고 있다.

항균 펩타이드가 항균 활성을 가지는 작용 기작을 보면, 크게 2가지의 기작이 알려져 있는데, 첫째는 항균 펩타이드들이 균의 세포막에 결합하면 세포막의 투과성을 증가시켜 막전위를 파괴하고 세포대사를 멈추게 하는 작용 기작을 통해 항균 활성을 나타내며, 둘째는 항균 펩타이드들이 균 세포내로 침투하여 DNA 또는 RNA와 결합함으로써 전사(transcription) 또는 번역(translation)을 억제하는 작용기작을 통해 항균활성을 나타내지만 현재 이들에 대한 연구는 거의 전무한 상태이다

이러한 항균 펩타이드들은 짧은 시간 내에 비특이적이면서도 효과적인 물리적 방법으로 세포막을 파괴하는 작용 기작을 가지고 있어서, 미생물의 세포벽이나 세포내 고분자 합성을 저해하는 기존의 항생제들과는 달리, 미생물들이 항균 펩타이드에 대한 내성을 갖게 되기는 매우 어렵다.

현재까지 연구된 결과들에 의하면, 동물 및 식물 등으로부터 약 2,000 종 이상의 많은 항균 펩타이드가 분리되었는데, 대표적인 항균 펩타이드로서 세크로핀(cecropin), 머게이닌(magainin), 봄비닌(bombinin), 디펜신(defensin), 타키플레신(tachyplesin) 및 부포린(buforin) 등이 알려져 있다. 이들 항균 펩타이드들은 공통적으로 17-24개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 그람 음성균 및 그람 양성균 뿐만 아니라 원핵생물 또는 곰팡이 등에 대해서도 항균력을 가지며 일부는 암세포와 바이러스에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다

한편, 이러한 항균 펩타이드는 농업에서도 그 사용이 요구되고 있는데, 농작물은 고착생활을 함으로서 끊임없이 수많은 병원균들의 공격을 받게 되고 여러 가지 질병에 걸리게 되어 엄청난 수확량의 감소를 유발하게 된다. 이러한 병원균에 의한 농작물의 피해는 농업 생산성에 가장 큰 영향을 주는 중요한 요인일 뿐만 아니라 생산성 향상을 위하여 사용하는 농약으로 인해 환경오염이라는 심각한 문제를 야기시키고 있다(Sherman JD et al., Arch. Environ. Health., 52, 332-333, 1997).

지금까지는 원하는 수준의 방제를 보장하기 위하여 화학적인 살충제에 가장 많이 의존하고 있다. 이러한 살충제는 토양 위에 결합되거나 또는 토양 속으로 삽입되나 살충제의 지속적인 사용은 내성 곤충이 진화하는 것을 허용하여 왔다. 매우 많은 개체수의 유충, 폭우, 및 살충제 적용 장비의 부적절한 측정과 같은 상황들이 만족스럽지 못한 통제를 초래할 수 있다. 또한, 살충제의 사용은 종종 토양과 표면 및 지하 수원의 오염과 같은 환경적인 관심사를 야기한다. 특히, 농약을 살포하는 농민들의 경우 맹독성의 농약을 인체에 흡입함으로써 인체 내의 축적과 불치의 유전병이 생성되게 되고, 잔류농약의 흡수에 의한 소비자들에게도 치명적인 건강상의 손실을 유발시키게 된다(London et al., Scan. J., Work. Environ. Health., 24, 18-29, 1998).

따라서, 현재 화학적 살충제에 대한 유해성에 대한 우려가 점점 높아지고 있다. 세계적으로 농약의 잔류 독성과 환경오염으로 인하여 여러 가지 문제점이 나타나자 인류의 건강을 지키기 위하여 우선 독성이 강한 유기합성 농약의 사용을 자제하기로 국제적인 합의가 도출되기도 하였다. 이러한 국제 협약에 의하여 전 세계는 2004년에 지난 10년 전에 사용하던 화학합성 유기인계, 유기염소계 살충제의 50%까지 생산이 감축되었고, 2010년까지 다시 유기인계, 유기염소계 살충제의 생산을 50% 감소시키기로 한 국제적 협의에 동의하여 현재 실행 단계에 있다.

이에 본 발명자들은, 항균 및/또는 살충 기능을 가지는 펩타이드를 찾기 위하여 예의 노력한 결과, 동양종 꿀벌인 토종벌(Apis cerana) 유래 ICK 펩타이드의 분자적 특성과 충체에서의 항세균 활성 및 독소로서의 살충 기능을 최초로 발견하고 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

1. Alberola, J., Rodriguez, A., Francino, O., Roura, X., Rivas, L and Andreu, D. 2004. Safety and effocacy of antimicrobial peptides against naturally acquired leishmaniasis. Antimicrob. Agents Chemother 48 : 641-643. 2. Andreu, D. and L. Rivas. 1998. Animal antimicrobial peptides : an overview. Biopolymers 47, 415-433.

본 발명은 최초로 토종벌 유래의 ICK 펩타이드의 항진균 및 살충성 독소로서의 용도 발견에 기초한 것으로,

본 발명의 주요한 목적은 항진균 및 살충성 기능을 가지는 토종벌 유래의 특정 ICK 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 토종벌 유래의 특정 ICK 펩타이드를 함유하는 항진균 또는 살충성 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 또는 조성물을 이용한 살균 또는 살충 방법을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

항진균 및 살충성 기능을 가지는, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 토종벌(Apis cerana) 유래 ICK 펩타이드(Inhibitor cysteine knot; AcICK); 및 이를 유효성분으로 함유하는 항진균 또는 살충 조성물을 제공한다.

이 때, 상기 항진균 활성은 아스퍼질러스 푸미가테스(Aspergillus fumigates), 아스퍼질러스 파라스티커스(Aspergillus parasiticus), 페니실리움 베르루코숨 바. 베르루코숨(Penicillium verrucosum var. verrucosum), 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium. oxysporum), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 트리코데르마 바르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride), 보트리티스 시네리아(Botritis cinerea), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 디디멜라 브리오니애(Didymella bryoniae) 및 캔디다 알비칸(C.albicans)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지고,

또한, 곤충 병원성 진균인 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana), 메탈히지움 아니소프리애(Metarrhizium anisopliae), 이사리아 자바니카(Isaria javanica), 엔토모파가 마이마이가(Entomophaga maimaiga), 벌티시리움 레카니이(Verticillium lecanii) 및 노무라애 리레이이(Nomuraea rileyi)로 이루어진 군 중에서 선택되는 곤충 병원성 진균에 대해서도 항진균 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.

나아가, 항진균 활성뿐만 아니라, 해충 방제의 살충 활성도 가지는데, 예를 들어, 농작물의 해충인 벼멸구(BPH : Brown PlantHopper), 점박이응애(TSSM : Two Spotted SpiderMite), 담배거세미나방 (TCW : Tobacco CutWorm), 청벌레, 굴파리, 진딧물, 배나무이, 파밤나방, 심식나방, 총채벌레, 온실가루이, 민달팽이, 진딧물, 벼물바구미, 이화명나방 및 혹명나방으로 이루어진 군 중에서 선택되는 해충 등에 대해서 독소로 기능함으로써 우수한 살충 효과를 나타낸다.

본 발명의 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열은 이를 코딩하는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.

특히, 토종벌(Apis cerana) 유래 ICK 펩타이드를 코딩하는, 이러한 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 발현 벡터를 이용하여, 재조합 AcICK를 발현시킬 수 있는데, 이 때, 가장 바람직하게는 베큘로 바이러스 벡터 시스템을 이용한다.

이처럼, 본 발명은 토종벌(Apis cerana) 유래 ICK 펩타이드의 항진균 및 살충성 독소로서의 기능에 대하여 최초로 규명한 사실에 기초한 것으로, 이러한 토종벌(Apis cerana) 유래 ICK 펩타이드의 항진균 및 살충 기능의 다양한 이용을 제공한다.

본 발명의 토종벌 유래의 ICK 펩타이드는 우수한 항균 활성 및 면역 관련 기능을 가지므로 천연 항생제로서 유용할 뿐만 아니라, 살충력을 가지는 독소로서의 기능도 가지므로 해충 방제를 위한 미생물제제로서도 유용할 것이다.

도 1은 토종벌 유래의 ICK 펩타이드와 다른 종에서 알려진 ICK 펩타이드와 상동성을 나타낸 그림이다[시그널 펩타이드 영역; N-말단의 ICK fold 영역; C-말단 영역; 검정색 원(solid circle): 보전된 이황화 결합을 이루는 시스테인 잔기].
도 2는 본 발명의 토종벌 유래의 ICK 펩타이드 유전자를 발현시켜 분리한 재조합 단백질의 전기영동 결과(A); 토종벌 유래의 ICK 펩타이드의 세균 및 곰팡이에 대한 결합능을 나타낸 웨스턴블랏 분석 결과(B); 및 공초점 현미경으로 관찰한 사진(C)이다.
도 3은 토종벌 일벌의 표피세포, 지방체, 장, 근육 및 독샘 조직의 전체 RNA로부터 AcICK가 전사되는 조직을 관찰한 노던블랏 분석 결과(A); 및 곰팡이 Beauveria bassiana를 일벌에 감염시킨 후 AcICK 전사량을 분석한 결과(B)이다.
도 4는 AcICK 항체를 이용하여 AcICK가 독샘(A) 및 독액(B)에 존재하는지를 확인한 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 5는 누에유충을 이용하여 재조합 AcICK 펩타이드의 살충성 독소로서의 기능을 확인한 결과이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"펩타이드", "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위하여 본 명세서에 상호호환적으로 사용된다. 또한, 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산뿐 아니라 자연 발생 아미노산 중합체의 유사체 또는 모방체인 아미노산 중합체에 적용된다. 또한, 용어는 예를 들어, 탄수화물 잔기의 첨가에 의하여 당단백질을 형성하도록 변형되거나 인산화된 아미노산 중합체를 포함할 수 있다. (폴리)펩타이드 및 단백질은 자연-발생 및 비-재조합 세포에 의해 생성될 수 있거나, (폴리)펩타이드 및 단백질은 유전적으로 조작된 세포 또는 재조합 세포에 의해 생성될 수 있다. (폴리)펩타이드 및 단백질은 나이브 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자 또는 나이브 서열의 하나 이상의 아미노산으로부터의 결실, 이에 대한 첨가 및/또는 이의 치환을 갖는 분자를 포함할 수 있다

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

"코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은, 통상적인 염기쌍과 코돈 용법 관계에 따라, 발현이 요구되는 특정 유전자 생성물 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 서열, 이의 상보체, 또는 이들의 일부분을 지칭한다. 코딩 서열은 성숙 mRNA를 제공하기 위해 세포의 생화학 기구에 의해 함께 연결되는 게놈 DNA 또는 미성숙 1차 RNA 전사체에서의 엑손을 포함한다. 안티센스(antisense) 가닥은 상기 핵산의 상보체이고, 코딩 서열은 이들로부터 추정될 수 있다. 코딩 서열은, 적절한 길이의 전사체가 생성되고 적절한 리딩 프레임에서 번역되어 목적하는 기능 생성물이 생성되도록, 전사 조절 요소 및 번역 개시 및 종결 코돈과의 관계에 놓인다

"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 또는 "핵산(nucleic acid)"이라는 용어는 리보뉴클레오티드 뿐만 아니라 디옥시리보뉴클레오티드 등 온갖 길이의 뉴클레오티드 중합체를 의미한다. 이 용어는 분자의 1차적 구조만을 의미하고, 따라서 이중 또는 단일 사슬의 DNA 또는 RNA를 의미한다. 이것은 또한 변형의 알려진 유형, 예를 들어 당해 분야에서 알려진 표지(label), 메틸화, "caps", 유사체의 하나 혹은 그 이상의 자연 발생의 뉴클레오티드 치환, 탈결합(예: methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoamidate, carbarnate, 등)과 결합(예:phosphorothioate, phosphorodithioate, 등), 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드(signal peptide), poly-Llysine,등) 등의 부속물을 포함하는 것, 삽입물(예: 아크리딘, Psolalen, 등)을 가지는 것, 킬레이트(예: 금속원소, 방사성 금속원소, 붕소, 산화 금속원소, 등)을 가지는 것, 알킬화합물을 가지는 것, 변형된 결합(예: alpha anomeric 핵산, 등)을 가지는 것, 또한 폴리뉴클레오티드의 비변형을 포함한 뉴클레오티드간 변형을 의미한다. 일반적으로, 본 발명에 의해 제공되는 핵산 부분은 지놈(genome)의 파편과 짧은 올리고뉴클레오티드 결합자 또는 일련의 올리고뉴클레오티드, 미생물 또는 바이러스 오페론(operon)이나 진핵세포 유전자로부터 유도된 조절인자(regulatory element)를 포함하는 재조합 전사 단위로 발현될 수 있는 합성 핵산을 제공하는 특유의 뉴클레오티드들로 뭉쳐질 것이다

"기능적 등가물"이라는 용어는 예를 들어, 기준(reference) 서열로부터 하나 또는 그 이상의 치환, 결실 또는 부가, 기준(reference) 서열과 실험(subject) 서열 사이의 다양한 기능적 비유사성을 낳지 않는 실제 효과(net effect) 등 변화된 돌연변이 서열의 뉴클레오티드와 핵산서열 모두를 의미한다. 통상적으로, 그런 실질적 등가물인 서열은 단지 약 35%(즉, 실질적으로 등가적인 서열에서의 각 잔기 치환, 부가 및 결실의 숫자는 상응하는 기준 서열과 비교하고 실질적으로 등가적인 서열에서의 나머지 전체 숫자로 나누었을 때 약 0.35 또는 그 이하이다) 정도로 본 명세서에 나열된 것에서부터 다양하다. 그런 서열은 나열된 서열과 65%의 서열 동일성을 갖는다. 본 발명에 따른 실질적 등가물인, 예를 들어 돌연변이, 아미노산 서열은 나열된 아미노산 서열과 바람직하게는 최소한 80%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 90%의 서열 동일성을 갖는다. 실질적 등가물인 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 유전자 암호의 중복(redundancy) 또는 축퇴(degeneracy)를 고려할 때, 더 낮은 백분율의 서열 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 최소한 약 65%의 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 약 75%의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95%의 동일성을 가져야 한다. 본 발명의 목적을 위해서는, 실질적으로 등가적인 생물학적 활성과 실질적으로 등가적인 합성 특징을 가지는 서열들은 실질적 등가물로 취급된다. 등가물을 결정하기 위해, 성숙 서열(예를 들어, 위(spurious) 종결코돈(stop codon)을 제조하는 돌연변이를 통한)의 절단(truncation)은 무시되어야 한다.

"형질전환, 형질감염 또는 트랜스펙션"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다. 그리고 외부 DNA 등이 도입된 세포 등을 '형질전환체'라고 한다.

"벡터" 라는 용어는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.

"숙주 세포"는 하나 이상의 DNA 또는 벡터가 도입되는 진핵 또는 원핵 세포를 가리키며, 특정 대상 세포만이 아니라 그 자손 혹은 잠재적 자손까지도 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 어떤 변형이 돌연변이 혹은 환경적 영향 때문에 후속 세대에 일어날 수 있기 때문에 사실 상기 자손은 부모 세포와 동일하지는 않지만, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 용어의 범주 내에서 여전히 포함된다.

"항균(antibacterial)제"는 박테리아(bacteria)에 대한 살균 또는 제균 활성을 갖는, 합성되거나 변형된 작용제를 지칭한다. 이와 관련해서 "활성" 작용제는 브루셀라 등 그람-음성균의 성장을 억제할 것이다. 용어 "성장을 억제하는"은 특정 박테리아의 집단의 수가 증가하는 속도를 감소시키는 것을 나타낸다. 따라서, 상기 용어는 박테리아 집단이 증가하긴 하지만 느린 속도로 증가하는 상황 뿐만 아니라, 집단에서 세균의 수가 감소되거나 심지어 집단이 제거되는 상황을 포함한다. 효소 활성 검정이 억제제를 스크리닝하는데 사용되는 경우, 효소 억제와 성장 억제를 상호관련시키기 위해 화합물에 대해 흡수/유출, 용해도, 반감기 등을 변경시킬 수 있다.

"항진균(antifungal)제" 진균(fungi)에 대한 살균 또는 제균 활성을 갖는, 합성되거나 변형된 작용제를 지칭한다. 진균(fungi)은 효모와 사상균 그리고 버섯 등을 포함하는 진핵생물로서, 사람과 동물에 질병을 유발하는 인수 공통 균으로 감염량, 침입경로, 숙주의 면역상태 등 균의 숙주 노출상태에 따라 감염여부가 결정된다. 진균에 의한 질병은 대체로 첫째, 특정 진균 항원의 감작에 의한 과민성 질환(hypersensitivity diseases), 둘째, 진균이 생산하는 진균독소(mycotoxin)에 의한 진균독소증(mycotoxicosis)과 셋째, 숙주조직에 균체가 침범하여 감염을 일으키는 진균증(mycosis, mycoses) 등 3가지 방법에 의하여 유발한다.

"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 촉진제의 유효량은 관련 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

<ICK>

본 발명은 특정 ICK(Inhibitor cysteine knot) 펩타이드의 신규 용도에 관한 것으로, 특히, 동양 꿀벌인 토종벌 Apis cerana 유래의 ICK 펩타이드 및 이의 항진균 및 살충 용도에 관한 것이다.

ICK(Inhibitor cysteine knot) 접힘 구조를 가지는 펩타이드는 작고 3개의 이황화 결합에 의해 안정적인 세 개의 베타-시트로 구성된 공통의 구조 형태를 가지고[Zhu et al., FASEB J. 17:1765-1717(2003); Tian et al., BMC Genomics. 11:187(2010); Zhang and Zhu, Dev. Comp. Immunol. 38:262-274(2012)], 식물과 동물을 포함한 다양한 종에서 발견되고 있다[Osaki et al., J. Biol. Chem. 274:26172-26178(1999); Fujitani et al., J. Biol. Chem. 277:23651-23657(2002); Barbault et al., Biochemistry 42:14434-14442(2003); Escoubas and Rash, Toxicon 43:555-574(2004); Tian et al., BMC Genomics. 11:187(2010); Horita et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 411:738-744(2011); Gilly et al., J. Exp. Biol. 214:147-161(2011); Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:10478-10483(2011), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:8906-8911(2013); Zhang and Zhu, Dev. Comp. Immunol. 38:262-274(2012), Chan et al., Peptides 39:29-35(2013); Gao et al., Biosci. Rep. 33:e00047(2013); He et al., PLoS ONE 8:e75334(2013)].

또한 식물, 곤충 및 다른 절지동물로부터 알려진 ICK 펩타이드가 다양한 기능에 관여하고 있음을 보여주는데, 기능적으로 ICK 펩타이드는 크게 두 개의 그룹으로 나누어진다. 즉, 전갈이나 거미와 같이 독을 분비하는 동물 유래 독소와; 투구게, 곤충 및 식물 유래 항세균 펩타이드로 구분할 수 있고[Tian et al., BMC Genomics. 11:187(2010); Zhang and Zhu, Dev. Comp. Immunol. 38:262-274(2012)], 이는 ICK 펩타이드가 선천성 면역에 관여하고 있음을 의미한다[Tian et al., BMC Genomics. 11:187(2010). 예를 들어, 전갈과 거미 독소 ICK는 세포내 레이디닌 수용체[Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:8906-8911(2013)]와 캅사이신 수용체[Siemens et al., Nature 444:208-212(2006)]를 각각 활성화시키고, 식물에서 알려진 ICK 펩타이드는 열원열 말라리아 원충인 Plasmodium falsiparum에 대한 항말라이아 활성과 암세포에 대한 세포독성을 나타내는 것으로 보고되고 있다[Chan et al., Peptides 39:29-35(2013)].

그러나, 데이터베이스에 서양꿀벌인 Apis mellifera 유래 ICK 펩타이드, amickin의 유전자 서열이 밝혀졌음에도 불구하고 아직까지 벌 유래 ICK 펩타이드의 기능에 대한 연구결과가 없다. 또한, 벌 유래 ICK 펩타이드의 항진균 및 살충성 독소로서의 기능에 대하여 보고된 바가 없는 실정이다.

본 발명자들은 벌, 특히 바람직하게는 동양꿀벌인 Apis cerana 유래 ICK 펩타이드의 항진균 및 살충성 독소로서의 기능에 대하여 처음으로 규명하였다.

토종벌 충체로부터 추출한 poly(A) 및 mRNA를 이용하여 cDNA 라이브러리[Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 430:144-149(2013); Toxicon 76:110-117(2013)]를 제작하고, 유전자 발현 꼬리표(expressed sequence tags, ESTs)를 분석하였다. 토종벌 ESTs 분석에 의해 토종벌 유래의 AcICK 펩타이드를 코딩하는 유전자의 cDNA를 클로닝하였고, 이를 서열번호 1로 표시하여 기재하였다. 또한, 토종벌 유래의 AcICK 펩타이드를 코딩하는 cDNA로부터 번역한 아미노산 서열의 데이터베이스 분석 결과를 서열번호 2로 표시하여 나타내었다.

토종벌 유래의 AcICK 펩타이드를 코딩하는 유전자(AcICK)는 토종벌에서 처음 분리된 것으로 아직까지 그 특징이 보고되고 있지 아니한 바, 본 발명에서 최초로 토종벌 유래의 AcICK의 서열을 밝혀, 상기 유전자는 NCBI GenBank database에 승인번호 KJ530970 (cDNA)을 2014년 5월 17일에 등록되었다. 상기 토종벌(Apis cerana) 유래의 AcICK 유전자가 코딩하는 아미노산 서열은 NCBI GenBank database에 등록된 ICK 펩타이드 아미노산 서열과 높은 상동성을 가진다.

본 발명의 토종벌 유래의 AcICK의 cDNA를 분리하여 염기서열을 분석한 결과 얻어진 토종벌 유래의 AcICK 유전자의 cDNA는 종결코돈까지 그 길이가 225 bp인 서열번호 1의 염기서열을 가지며, 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열이 코딩하는 단백질은 75개의 아미노산으로 이루어져 있는데 21개의 시그널 펩타이드 영역, 29개의 아미노산으로 구성되며 6개의 시스테인 구조를 포함한 N-말단의 ICK fold 영역과 24개의 아미노산으로 구성된 C-말단 영역을 가진다. 곤충세포에서 발현시킨 재조합 AcICK 펩타이드는 전기영동 상에서 6.6 kDa의 분자량을 가진다.

그러나, 본 발명은 이러한 서열로 한정하는 것은 아니며, 이의 기능적 동등체를 포함한다. 즉, 본 발명은 상기 ICK 펩타이드 서열과 적어도 90% 동일한, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴크레오타이드 서열; 또는 그러한 예시적인 서열과 상보적인 뉴크레오타이드를 포함하는 분리된 폴리뉴크레오타이드를 포함한다.

<서열번호 1>

ATGTCCAAGTTTATACTTCTCGTTTGCATCCTTTTGCTGACTACGAACATCGTTTCAGCTGCCTCCAAGTGTGGCAGACACGGTGATTCCTGCGTGTCCAGCTCCGACTGTTGCCCCGGCACATGGTGTCACACATATGCGAACAGGTGTCAAGTGAGGATCACAGAGGAGGAGCTGATGAAGCAGCGTGAAAAGATCCTTGGTAGAAAGGGGAAAGATTATTAA

<서열번호 2>

MSKFILLVCILLLTTNIVSAASKCGRHGDSCVSSSDCCPGTWCHTYANRCQVRITEEELMKQREKILGRKGKDY

<항진균 및 살충 기능>

본 발명은 일 관점에서 Apis cerana 유래 ICK 펩타이드의 항진균 용도에 관한 것이다. 특히, 박테리아 등에 대한 항균 용도가 아닌, 곰팡이, 즉 진균(fungi) 특이적으로 성장을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예서는 토종벌 유래의 재조합 AcICK가 곰팡이 특이적으로 B. bassiana 및 F. graminearum의 세포막에 결합하고 성장억제 활성을 나타내는 반면, E. coli 및 B. thuringiensis에는 그러한 활성을 보이지 않음을 확인하였다.

펩타이드가 병원균에 작용하는 기작은 기존 항생제들의 작용기전과 매우 다르다. 이들은 주로 미생물의 세포표면에 결합한 후, 세포막에 pore를 형성함으로써 세포막의 정상적 투과특성을 교란하여 병원체를 빠른 속도로 죽게 한다(Pharmacol. Rev. 55: 27-55, 2003). 또한 이들은 고등동물 체내에서 후천성 면역반응을 매개하는 신호분자로서도 작용한다고 보고되었다(J. Leukoc. Biol. 60: 415-422, 1996).이러한 특성으로 인해 항균 또는 항진균 펩타이드는 항생제 내성균을 제어할 수 있는 신규 항생제나 새로운 생체 면역 활성인자로 이용할 수 있을 것으로 주목받고 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서 Apis cerana 유래 ICK 펩타이드의 독소로서의 살충 용도에 관한 것이다.

독소의 한 가지 특성은 살충 활성이다. 특정 구현에서, 이러한 독소는 초시류 및/또는 인시류 해충에 대하여 활성을 가진다. 본 발명의 독소 펩타이드는 그들의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열에 의해 더 정의될 수 있다. 상기 분자들의 서열은 특정한 예시화된 서열에 대한 상동성(homology)에 의해서 뿐만 아니라, 특정한 예시화된 프로브 및 프라이머와 혼성화하거나 또는 그에 의해 증폭되는 능력에 의해서 정의될 수 있다. 여기에서 제공되는 독소는 또한 특정 항체와의 면역반응성에 근거하여 확인될 수도 있다

본 발명의 일 실시예에서는 토종벌 유래 AcICK가 독샘에서 발현되어 독낭에 저장되고, 누에 유충을 마비시키고 최종적으로 죽게 하는 것을 확인함으로써 곤충에 대한 뛰어난 살충력을 가지는 것을 확인하였다.

<구체예>

그러므로, 본 발명은 항진균 및 살충성 독소로서의 기능을 갖는 토종벌(Apis cerana)유래의 AcICK 펩타이드의 다양한 이용 태양을 포함한다.

일 구체예로서, 본 발명은 토종벌 유래의 AcICK 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이에 따른 형질전환체를 제공한다.

"재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다.

"벡터(vector)"는 외부의 유전 물질을 다른 세포로 옮기는데 사용되는 전달 수단인 DNA 분자이다. 대표적으로 플라스미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 코스미드 벡터, 인공 염색체를 이용한 벡터(예컨대, YAC, BAC) 등이 존재한다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET, pEGFP, pCR 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

상기 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 진핵세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 진핵세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. .

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 [Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)] 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 [pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980)]가 조절 부위로서 이용될 수 있다. 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명에서는 가장 바람직하게는 베큘로 바이러스 시스템(baculovirus expression vector system; BEVS)을 이용한다. 베큘로 바이러스 시스템은 곤충세포에서 특이적으로 외래 유전자를 발현하기 위해 광범위하게 이용되는 단백질 발현 체계로서 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus(AcNPV)로 부터 유래된 곤충 특이적 바이러스를 사용한다. BEVS는 동물세포를 이용한 단백질 발현 체계보다 더 많은 양의 단백질을 생산할 수있고, 대장균을 이용한 발현 체계보다 고품질의 목적하는 단백질 생산 가능성이 더욱 큰 것이 장점으로 알려져 있다

또한, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

다른 구체예로서, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환시킨 형질전환체 및 이를 이용하여 발현시킨 재조합 토종벌 유래 ICK 펩타이드(AcICK)를 제공한다.

"형질감염 또는 트랜스펙션"은 바이러스 벡터 또는 기타 전달 수단을 이용하여 외부물질을 진핵 세포 내로 도입하는 것을 의미한다. 동물 세포의 형질감염은 전형적으로 세포 원형질막 내 일시적인 구명 또는 "홀"을 개방하여 물질이 흡수되도록 하는 것을 수반한다. 유전자 물질 또는 항체와 같은 단백질을 형질감염시킬 수 있다. 전기천공법 외에, 양이온성 지질을 상기 물질과 혼합하여, 세포 원형질막과 융합하고 내부에 카르고를 침적하는 리포솜을 생산함으로써 형질감염을 수행할 수 있다.

형질감염에 대한 직접적인 접근은 유전자 물질이 불활성 고체(통상적으로 금) 나노입자와 커플링된 다음 표적세포의 핵 내로 직접적으로 "샷"되는 유전자 총(gene gun)이다. 유전자 물질은 또한 바이러스를 매개체로 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 경우, 그 기법은 바이러스 형질도입(transduction)으로 불리우며, 세포는 형질도입되는 것으로 말하여진다. 형질감염의 다른 방법은 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기천공법(electroporation), 열충격(heat shock), 마그네토펙션(magnetofection) 및 Lipofectamine, Dojindo Hilymax,Fugene, jetPEI, Effectene 또는 DreamFect과 같은 형질감염 시약을 포함할 수 있다

이러한 재조합 DNA기술을 통해 과거 자연 상태부터 미량으로 밖에 얻을 수 없던 의료용 단백질 또는 산업용 효소 등을 대량으로 합성할 수 있다.

또 다른 구체예로서, 본 발명은 토종벌 유래의 AcICK 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항진균 또는 살충 조성물을 제공한다.

항진균용 조성물이란 진균 특이적인 성장 억제제를 총칭하는 의미로 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항균제,살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 따라서 상기 항진균용 조성물은 약학적 조성물, 식품용 조성물 및 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

상기 항진균 조성물을 약학적 조성물로 사용할 경우, 바람직하게는 하기와 같은 진균 감염증의 치료 또는 예방용 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 진균 감염증에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 본 발명의 ICK 펩타이드 이외에 제형 및 사용방법에 따라 약리학적으로 사용가능한 담체나 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 조성물 단독으로 또는 진균 원인균에 의한 감염의 치료제로서의 효능 증진을 위해 다른 약학적 활성성분과 조합하여 투여될 수 있다. 이 경우 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 ICK 펩타이드의 함량은 0.001 내지 10 중량%일 수 있다. 그러나 상기 용량은 사용방법 및 사용목적에 따라 ICK 펩타이드의 함량을 적절히 조절할 수 있다

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 이의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으므로 하기 기술한 바에 한정되는 것은 아니다. 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 침제(INFUSIONS), 정제(TABLETS), 주사제(INJECTIONS), 캅셀제(CAPSULES) 및 환제(PILLS) 등이 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 방법에 따라 다양한 형태로 제형화 될 수 있다.

상기 약리학적으로 허용가능한 담체, 또는 희석제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등의 부형제는 제형에 따라 통상의 물질을 사용할 수 있으며, 제제화하는 경우 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제를 사용할 수 있다. 대표적인 희석제 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르, 리퀴드 파라틴 및 생리식염수을 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량 또는 사용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 바람직하며, 예컨대 1일 유효 투여량은 통상적으로 성인(70 kg)의 경우, 10 내지 5000 mg/kg이며 바람직하게는 100 내지 3000 mg/kg이고, 하루 1 내지 수회 투여될 수 있으며, 바람직하게는 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다

투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동가능하기 때문에, 상기 투여량이 변화될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 본 발명의 범위로 한정되는 것은 아니다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.

한편, 본 발명의 "살충 조성물"은 해충 방제용 조성물로서 해충의 예에는 바람직하게는 나비 목 해충 또는 딱정벌레목 해충일 수 있으나 이에 제한되지 않고 적용 가능한 모든 일반적인 해충에 사용 가능하다

해충 방제용 조성물로 제조함에 있어서 예를 들어, 에스테르 화합물, 포화 탄화수소 및 에스테르 그리고 필요에 따라 기타 살충 활성 성분, 살비 활성 성분, 반발적 활성 성분, 상승제, 향미제 등을 실온 또는 가열 하에 혼합 및 용해함으로써 제조될 수 있다.

상기 조성물이 해충 방제를 위해 사용되는 경우, 그 자체로 또는 상기 조성물을 포함하는 해충 방제제 제형의 형태로 적용될 수 있는데 제형에는 예를 들어, 오일, 유제, 수-분산가능한 분말, 플로어블제(flowable agent)(수성 현탁액, 수성 유제 등), 분말, 과립, 에어로솔, 가열된 증기화제(살충 코일(insecticide coil), 전기 살충 매트(matt), 액체-흡수 샤프트(shaft)를 가진 가열된 살충-증기화제 등), 가열된 훈증제(자기-연소형 훈증제, 화학-반응형 훈증제, 다공-세라믹판 훈증제 등), 비가열된 증기화제(수지 증기화제, 함침지 증기화제 등), 분무제(포깅(fogging) 등), ULV 제, 및 유독성 먹이(poisonous bait)가 포함된다.

본 발명의 조성물들은 토종벌 유래의 AcICK 펩타이드와 함께 항진균 또는 살충력 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 그리고, 액상 및 분말상태로도 사용할 수 있고, 사용시 250 ~ 1,200 배로 희석하여 사용한다. 직접 분무법으로 적용시에는 살충효과가 24 시간 내에 크게 나타나, 그 효과 또한 빠르며, 천적곤충 및 인축에는 전혀 해가 나타나지 않아 환경보전 기능도 있는 종합 미생물 방제제이다.

본 발명의 항진균 활성과 살충활성을 가지는 펩타이드 또는 조성물들은 다음과 같은 동식물에 해를 입히는 진균 및 해충에 대해 항진균 및 살충효과가 뛰어나다.

예를 들어, 식물 병원성 진균인 아스퍼질러스 푸미가테스(Aspergillus fumigates), 아스퍼질러스 파라스티커스(Aspergillus parasiticus), 페니실리움 베르루코숨 바. 베르루코숨(Penicillium verrucosum var. verrucosum), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium. oxysporum), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 트리코데르마 바르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride), 보트리티스 시네리아(Botritis cinerea), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 디디멜라 브리오니애(Didymella bryoniae) 및 캔디다 알비칸(C.albicans) 등에 항진균 활성이 뛰어나다.

그리고, 곤충 병원성 진균인 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana), 메탈히지움 아니소프리애(Metarrhizium anisopliae), 이사리아 자바니카(Isaria javanica), 엔토모파가 마이마이가(Entomophaga maimaiga), 벌티시리움 레카니이(Verticillium lecanii) 및 노무라애 리레이이(Nomuraea rileyi) 등에 항진균 활성이 뛰어나다.

또한, 농작물의 해충인 벼멸구(BPH : Brown PlantHopper), 점박이응애(TSSM : Two Spotted SpiderMite), 담배거세미나방 (TCW : Tobacco CutWorm), 청벌레, 굴파리, 진딧물, 배나무이, 파밤나방, 심식나방, 총채벌레, 온실가루이, 민달팽이, 진딧물, 벼물바구미, 이화명나방, 혹명나방 등에 살충활성이 뛰어나다

이처럼, 본 발명은 항진균 및 살충성 독소로서의 기능을 갖는 토종벌(Apis cerana)유래의 ICK 펩타이드 및 이의 다양한 용도를 모두 포함한다.

<실시예>

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 토종벌 유래의 AcICK 펩타이드를 코딩하는 유전자 클로닝

토종벌(Apis cerana) 충체로부터 추출한 poly(A) 및 mRNA를 이용하여 상용화된 키트인 Uni-ZAP XR 벡터와 Gigapack III Gold Packing Extract(Stratagene 사, 미국)에 의해 cDNA 라이브러리를 제작하고, 유전자 발현 꼬리표(expressed sequence tags, ESTs)를 분석하였다.

DNA 추출은 상용화 키트인 Wizard mini-preparation 키트(Promega 사, 미국)를 사용하였다. DNA 염기서열은 자동화 DNA 서열분석기(Applied Biosystems 사, 미국)로 서열을 분석하였다. 그 염기서열들은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)의 BLAST 프로그램에 의해 비교하였다.

그리고, 토종벌 ESTs 분석에 의해 74개의 아미노산을 코딩하고 있는 토종벌 유래의 AcICK 유전자의 cDNA를 클로닝하였고, 이를 서열번호 1로 표시하여 나타내었다. 또한, 토종벌 유래의 AcICK 펩타이드의 cDNA로부터 번역한 아미노산 서열의 데이터베이스 분석 결과를 서열번호 2로 표시하여 나타내었다.

상기 서열의 BLAST 프로그램에 의해 분석결과를 도 1에 도시하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 벌을 포함한 곤충 및 투구게로부터 보고된 ICK 펩타이드들과 비교적 높은 상동성을 보이며, 3개의 이황화 결합(disulfide bond)을 이루는 시스테인(cysteine) 잔기 및 N-말단의 ICK fold 영역이 잘 보전되어 있음을 확인하였다.

실시예 2 : 재조합 발현 벡터 제작 및 재조합 바이러스 제작

2-1. 토종벌 유래의 AcICK 펩타이드 발현

토종벌 유래의 AcICK 펩타이드를 발현하기 위하여, 토종벌 유래의 AcICK 펩타이드 cDNA를 곤충 베큘로바이러스(Autographa californica nucleopolyhedrovirus) 전이벡터 pBAC8(Clontech 사, 미국)에 삽입한 뒤, 전이벡터 (500 ng)와 비에이시고자 (bAcGOZA) 바이러스 DNA (100 ng) [Je et al., Biotechnol. Lett., 23:575-582(2001)]를 함께 리포펙틴(Lipofectin; Clonetech 사)을 이용하여 곤충세포주 Sf9(Spodoptera frugiperda 9)에 공-형질감염(co-transfection)하였다.

5일 후 배양액을 수거하여 토종벌 유래의 AcICK 펩타이드를 발현하는 재조합 베큘로 바이러스를 제작하였다. 재조합 베큘로바이러스는 Sf9 세포주에서 증식하였고, 재조합 AcICK는 MagneHisTM protein purification system(Promega 사, 미국)을 이용하여 분리하였다.

분리된 토종벌 유래의 재조합 AcICK 펩타이드 전기영동사진은 도 2A에 나타내었다.

도 2A에 나타난 바와 같이, 토종벌 유래의 재조합 AcICK 펩타이드는 전기영동 상에서 6.6 kDa의 분자량을 나타내는 염색 결과를 확인할 수 있었다.

2-2 재조합 AcICK 펩타이드의 미생물 결합능 및 항미생물 활성 검정

본 발명의 토종벌 유래의 ICK 펩타이드의 항세균제로서의 사용 가능성을 확인하기 위하여, AcICK의 결합능을 확인하였다.

보다 구체적으로, Bacillus subtilis, B. thuringiensis, 및 Escherichia coli를 Luria-Bertani(LB) 배지에 그리고 Beauveria bassiana 및 Fusarium graminearum는 potato dextrose broth에서 배양하였다.

배양액이 OD600에서 0.4에 이르렀을 때, 세균 및 곰팡이를 수거하여 PBS를 이용하여 세척하고 0.8 ㎍의 AcICK 재조합 펩타이드를 포함한 40 ㎕에 미생물과 혼합하여 상온에서 10분간 반응시켰다.

10분 후, 원심분리하여 상등액과 미생물을 분리시키고 미생물을 다시 PBS로 세척하여 각각의 미생물과 상등액을 15% SDS-PAGE를 실시하고 His-tag 항체를 이용하여 웨스턴블랏 분석을 실시하였다.

그 결과를 도 2 B에 도시하였다. AcICK는 E. coli 및 B. thuringiensis를 제외한 곰팡이 B. bassiana 및 F. graminearum에 결합하였다.

한편, AcICK의 결합능을 가시적으로 확인하기 위하여 세균과 AcICK를 반응시키고 미생물을 슬라이드위에 고정시켰다. His-tag 항체 및 형광 항체를 이용하여 염색시키고 공초점 현미경을 이용하여 관찰 및 사진 촬영 하였다.

그 결과, 웨스턴블랏 분석 결과와 같이, E. coli 및 B. thuringiensis를 제외한 곰팡이에 AcICK가 결합되어 있음을 확인하였다(도 2C).

이처럼, 도 2B 및 C의 결과를 통해, 토종벌 유래의 재조합 AcICK는 곰팡이 특이적으로 B. bassiana 및 F. graminearum의 세포막에 결합한다는 것 확인할 수 있었다.

본 발명의 토종벌 유래의 AcICK 펩타이드의 항세균 활성을 확인하기 위하여, 그람양성균 B. thuringiensis와 그람음성균 E. coli에 대한 성장 억제 활성을 조사하였다. 96-well 플레이트에 여러 가지 농도의 AcICK 재조합 펩타이드와 세균(105cfu/ml) 200 ㎕를 혼합하여 37℃에서 24시간 동안 220 rpm의 속도로 진탕 배양하고 595 nm에서 세균 성장 저해 활성을 측정하였다.

거기에 더하여 곰팡이에 대한 항진균 활성을 조사하기 위하여, 2×10⁴ conidia/ml 200 ㎕의 B. bassiana 및 F. graminearum를 여러 가지 농도의 AcICK 재조합 펩타이드와 혼합하여 22℃에서 48시간 동안 220 rpm의 속도로 진탕배양하고 595 nm에서 곰팡이 성장 저해 활성을 측정하였다.

하기 표 1에 나타난 바와 같이 E. coli 및 B. thuringiensis에서는 성장 억제 활성을 확인할 수 없었으나, 곤충병원균인 B. bassiana 및 식물병원균인 F. graminearum의 50% 성장 억제 활성 IC₅₀은 6.33±0.82 μM 및 8.96±0.56 μM로 확인되었다.

[표 1]

이러한 결과를 통해, 토종벌 유래 AcICK 재조합 펩타이드는 곰팡이 특이적으로 결합함을 확인하였고, 이를 이용하여 곰팡이의 성장을 억제할 수 있음을 확인하였다.

실시예 3 : 토종벌 유래 AcICK 의 선천적 면역 관련성

AcICK가 항진균 활성을 나타냄으로 이 유전자가 곰팡이 감염에 의한 선천적 면역에 관련되어 있음을 증명하기 위하여 먼저, 토종벌 일벌의 어느 조직에서 발현되는지를 분석하기 위해 노던블랏을 실시하였다.

토종벌을 얼음위에서 입체 현미경(Zeiss, Jena, 독일)을 이용하여 표피, 지방체, 장, 근육 및 독샘 조직을 분리하고 PBS 용액에 세척 후, Total RNA Extraction Kit(Promega, 미국)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였다.

각각의 전체 RNA를 5㎍씩 1% formaldehyde agarose gel에 전기영동하고 나일론 종이막(Schleicher & Schuell, Dassel, 독일)에 전이시켰다. AcICK cDNA를 방사성 동위원소[α-32P] dCTP로 Prime-It II Random Primer Labeling Kit(Stratagene, La Jolla, CA, 미국)을 사용하여 표지하고 probe로 사용하였다.

이렇게 제작된 probe를 사용하여 hybridization을 실시한 후, 나일론 종이막은 0.1% SDS 및 0.2×SSC 용액으로 30분간 65℃에서 세척하고 X-ray 필름에 노출시켰다.

그 결과, 도 3 A에 도시한 바와 같이, AcICK 유전자는 표피, 지방체 및 독샘에서 발현됨을 확인하였다.

또한, AcICK가 곰팡이에 의해 발현이 증가되는지를 알아보기 위하여 토종벌의 복부 2번째 마디에 5㎕ PBS 또는 5×10³ B. bassiana 포자를 포함한 5㎕ PBS를 주사하고 1, 3 및 5시간째 표피, 지방체 및 독샘을 분리하여 상기의 방법과 같은 방법으로 전체 RNA를 분리하고 노던블랏을 실시하였다.

그 결과, 도 3 B에 도시한 바와 같이, 표피 및 지방체에서 AcICK가 발현이 증가하였으며 독샘에서는 발현 차이를 나타내지 않았다. 특히, 지방체에서 발현량이 증가하는 것으로 나타나 AcICK가 곰팡이에 대하여 선천적 면역 기능을 하는 것으로 나타났다.

실시예 4 : 토종벌 유래 AcICK 의 살충성 활성 검정

조직 노던블랏 분석에서 AcICK가 독샘에서도 발현되었으므로 AcICK 펩타이드가 독 성분인지를 분석하기 위하여 곤충세포로부터 발현 및 정제한 AcICK 재조합 펩타이드에 대한 항체를 마우스로부터 제작하였다. 이렇게 제작된 AcICK 항체는 토종벌 독샘 및 독 단백질의 웨스턴블랏 분석에 사용하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 봐와 같이 독샘 및 독 성분에 존재하였다. 이러한 결과는 독샘에서 발현되어 독 낭에 저장되는 것으로 나타났다.

AcICK가 토종벌 독성분이므로 전갈 유래 ICK [Horita et al., (2011); Smith et al., (2011)]와 마찬가지로 살충성 기능을 가지는 지를 검정하기 위하여 3령 2일째 누에 유충을 대상으로 살충력을 검정하였다.

유충의 6번째와 7번째 마디에 AcICK 재조합 펩타이드를 0.25 또는 0.5㎍씩 주사를 하고 12시간 동안 사충수를 조사하고 50%가 생존하는 시간(ST50)을 분석하였다.

그 결과, ST50은 0.25 또는 0.5㎍의 AcICK 처리구에서 각각 3.75 시간과 16.01분으로 나타났다(도 5A). 또한 AcICK 재조합 펩타이드는 누에 유충을 마비시키고 최종적으로 죽게 하는 것으로 나타났다(도 5B).

상기의 결과, 토종벌 유래 AcICK 재조합 펩타이드는 대상 곤충을 마비시켜 죽게 하는 뛰어난 살충력을 가지는 것으로 확인되었다.

<110> Dong-a university <120> Inhibitor cysteine knot(AcICK) from Apis cerana having antifungal or insecticidal activity <130> PN1407-191 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 225 <212> DNA <213> Apis cerana <400> 1 atgtccaagt ttatacttct cgtttgcatc cttttgctga ctacgaacat cgtttcagct 60 gcctccaagt gtggcagaca cggtgattcc tgcgtgtcca gctccgactg ttgccccggc 120 acatggtgtc acacatatgc gaacaggtgt caagtgagga tcacagagga ggagctgatg 180 aagcagcgtg aaaagatcct tggtagaaag gggaaagatt attaa 225 <210> 2 <211> 74 <212> PRT <213> Apis cerana <400> 2 Met Ser Lys Phe Ile Leu Leu Val Cys Ile Leu Leu Leu Thr Thr Asn 1 5 10 15 Ile Val Ser Ala Ala Ser Lys Cys Gly Arg His Gly Asp Ser Cys Val 20 25 30 Ser Ser Ser Asp Cys Cys Pro Gly Thr Trp Cys His Thr Tyr Ala Asn 35 40 45 Arg Cys Gln Val Arg Ile Thr Glu Glu Glu Leu Met Lys Gln Arg Glu 50 55 60 Lys Ile Leu Gly Arg Lys Gly Lys Asp Tyr 65 70

Claims (9)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 토종벌(Apis cerana) 유래 ICK 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항진균 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 조성물은 아스퍼질러스 푸미가테스(Aspergillus fumigates), 아스퍼질러스 파라스티커스(Aspergillus parasiticus), 페니실리움 베르루코숨 바. 베르루코숨(Penicillium verrucosum var. verrucosum), 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium. oxysporum), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 트리코데르마 바르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride), 보트리티스 시네리아(Botritis cinerea), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 디디멜라 브리오니애(Didymella bryoniae) 및 캔디다 알비칸(C.albicans)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항진균 조성물.
   
5. 제3항에 있어서,
   상기 조성물은 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana), 메탈히지움 아니소프리애(Metarrhizium anisopliae), 이사리아 자바니카(Isaria javanica), 엔토모파가 마이마이가(Entomophaga maimaiga), 벌티시리움 레카니이(Verticillium lecanii) 및 노무라애 리레이이(Nomuraea rileyi)로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 곤충 병원성 진균에 대해 항진균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항진균 조성물.
   
6. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 토종벌(Apis cerana) 유래 ICK 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 살충 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 조성물은 농작물의 해충인 벼멸구(BPH : Brown PlantHopper), 점박이응애(TSSM : Two Spotted SpiderMite), 담배거세미나방 (TCW : Tobacco CutWorm), 청벌레, 굴파리, 진딧물, 배나무이, 파밤나방, 심식나방, 총채벌레, 온실가루이, 민달팽이, 진딧물, 벼물바구미, 이화명나방 및 혹명나방으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 해충에 대해 살충 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 살충 조성물.
   
   
   
8. 삭제
9. 삭제

Images