CN114908003B

CN114908003B - 一株具有广谱抑菌性的弗氏葡糖杆菌mp262及其应用

Info

Publication number: CN114908003B
Application number: CN202210409366.9A
Authority: CN
Inventors: 梁文星; 刘子瑜; 田俊婕; 王光远; 苗振港
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2022-04-19
Filing date: 2022-04-19
Publication date: 2023-05-02
Anticipated expiration: 2042-04-19
Also published as: CN114908003A

Abstract

本发明公开了一株具有广谱抑菌性的弗氏葡糖杆菌MP262及其应用。所述弗氏葡糖杆菌MP262分类命名为弗氏葡糖杆菌Gluconobacter frateurii，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2022263。所述弗氏葡糖杆菌MP262不仅对植物病原细菌（青枯雷尔氏菌）有显著抑制效果，同时对植物病原卵菌（烟草疫霉、辣椒疫霉），以及植物病原真菌（尖孢镰刀菌、多主棒孢霉、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌、葡萄座腔菌、链格孢菌）等多种植物病原真菌也表现出广谱的抑菌活性。可以将其制备植物病害生防制剂，应用于多种植物病害的防治，具有良好的市场应用前景。

Description

一株具有广谱抑菌性的弗氏葡糖杆菌MP262及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有广谱抑菌性的弗氏葡糖杆菌MP262及其应用。

背景技术

植物病害主要由植物病原菌引起，引起农业生产重大经济损失。其中，由青枯雷尔氏菌引起的植物青枯病、疫霉菌引起的植物疫霉病、以及灰葡萄孢菌等引起的植物真菌病是比较常见的植物病害。

植物青枯病是青枯雷尔氏菌引起的毁灭性土传病害，该菌能够寄生于50多个科、数百种植物，每年都给多种农作物和经济作物造成巨大的经济损失，特别是该菌侵染姜引起姜瘟，是姜生产的重大危害病原菌之一。植物青枯病病害是世界范围内广泛分布的细菌性土传根茎病害。青枯雷尔氏菌一般从植株的根部伤口入侵，到达木质部产生大量的胞外多糖，堵塞维管束组织使营养不能正常供给，致使叶片萎蔫发黄，生长发育缓慢，最终死亡。

植物疫霉种类很多，烟草疫霉和辣椒疫霉是常见的疫霉菌，可以对植物生长引起毁灭性病害，是世界性的土传病害。烟草疫霉和辣椒疫霉寄主广范，也可侵染番茄、茄子、黄瓜、等多种作物。近年来，病害有逐渐加重的趋势，造成巨大的经济损失。

灰葡萄孢菌是一种重要的空气传播的植物病原菌，寄主范围广泛导致500多种植物病变，包括番茄、草莓、苹果等重要经济作物。该病菌引起的灰霉病在世界范围内广泛存在，可以致使植物的产量下降、质量下降，造成严重的经济损失。尖孢镰刀菌是一种能够引起150多种植物枯萎病和根腐病的土传病原真菌，对植物根的破坏力非常严重，严重影响植物的产量和品质，可造成重大的损失。另外，尖孢镰刀菌、多主棒孢霉、禾谷镰刀菌、葡萄座腔菌、链格孢菌等病原真菌也对农业生产造成巨大危害。

目前，主要通过化学方法来防治这些病原真菌引起的病害。化学防治虽然对植物病害具有较好的防治效果，但会使致病菌抗药性提高、土壤环境质量下降、土壤生物群落的多样性降低。而生物防治因其具有安全、无公害、高效、环保等优点成为研究防治植物病害的热点，是非常具有潜力的防止手段。并且随着食品安全的备受关注，为了环境的安全和人类的健康，越来越多的化学杀菌剂被禁止，运用生防制剂代替化学杀菌剂是未来的发展方向。

发明内容

本发明的目的在于提供了一株具有广谱抑菌性的弗氏葡糖杆菌MP262及其应用。所述弗氏葡糖杆菌MP262对青枯雷尔氏菌、烟草疫霉、辣椒疫霉、尖孢镰刀菌、多主棒孢霉、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌、葡萄座腔菌、链格孢菌的生长具有强烈的抑制作用。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一株具有广谱抑菌性的弗氏葡糖杆菌MP262，其分类命名为弗氏葡糖杆菌Gluconobacter frateurii，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M2022263。

进一步的，所述弗氏葡糖杆菌MP262的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步的，所述弗氏葡糖杆菌MP262的菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑、湿润；培养初期呈乳白色，后期呈淡黄色。

本发明还提供了所述的弗氏葡糖杆菌MP262在用于制备防治植物病原菌引起的植物病害的生防菌剂中的应用。

进一步的，所述植物病原菌为青枯雷尔氏菌、烟草疫霉、辣椒疫霉、尖孢镰刀菌、多主棒孢霉、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌、葡萄座腔菌、链格孢菌。

进一步的，所述弗氏葡糖杆菌MP262对青枯雷尔氏菌、烟草疫霉、辣椒疫霉、尖孢镰刀菌、多主棒孢霉、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌、葡萄座腔菌、链格孢菌的生长均具有显著的抑制作用。

进一步的，所述弗氏葡糖杆菌MP262能够有效地抑制灰葡萄孢菌和尖孢镰刀菌的孢子萌发和芽管伸长。

进一步的，所述植物病害包括青枯雷尔氏菌引起的植物青枯病；烟草疫霉、辣椒疫霉引起的植物疫霉病；多主棒孢霉引起的植物叶斑病；尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病；灰葡萄孢菌引起的植物灰霉病；葡萄座腔菌引起的植物枝干病害；链格孢菌引起的植物叶枯病。

进一步的，所述生防菌剂中包含弗氏葡糖杆菌MP262发酵滤液。

进一步的，所述弗氏葡糖杆菌MP262的发酵滤液在生防菌剂中的浓度为20％～70％。

进一步的，所述弗氏葡糖杆菌MP262发酵滤液的制备步骤为：将弗氏葡糖杆菌MP262接种到PD液体培养基中在28℃，180rpm震荡培养24h，然后离心，上清液经直径为0.22μm的过滤器过滤，获得含有弗氏葡糖杆菌MP262的发酵滤液。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：

本发明筛选到一株对多种植物病原菌具有显著抑制作用的弗氏葡糖杆菌MP262，并经过对多种病原菌的生长抑制实验、发酵滤液对灰葡萄孢菌和尖孢镰刀菌的孢子萌发和芽管伸长实验、发酵滤液对青枯雷尔氏生长抑制实验，证明本发明获得的弗氏葡糖杆菌MP262不仅能高效防治青枯雷尔氏植物病原细菌，该菌株发酵物的发酵滤液对灰葡萄孢菌、尖孢镰刀菌的孢子萌发芽管伸长有强烈抑制作用，该菌株或其制剂对青枯雷尔氏菌、烟草疫霉、辣椒疫霉、尖孢镰刀菌、多主棒孢霉、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌、葡萄座腔菌、链格孢菌引起的植物病害，可以将其制备成防治植物疫霉病、植物青枯病和植物真菌病的生防制剂，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1是弗氏葡糖杆菌MP262的平板培养照片；

图2是弗氏葡糖杆菌MP262的16S rDNA序列扩增示意图；

图3是弗氏葡糖杆菌MP262对青枯雷尔氏菌生长抑制结果；

图4是弗氏葡糖杆菌MP262发酵滤液对青枯雷尔氏菌生长的抑制结果；

图5是弗氏葡糖杆菌MP262对尖孢镰刀菌菌丝生长抑制结果；

图6是弗氏葡糖杆菌MP262对多主棒孢霉菌丝生长抑制结果；

图7是弗氏葡糖杆菌MP262对禾谷镰刀菌菌丝生长抑制结果；

图8是弗氏葡糖杆菌MP262对灰葡萄孢菌菌丝生长抑制结果；

图9是弗氏葡糖杆菌MP262对辣椒疫霉菌丝生长抑制结果；

图10是弗氏葡糖杆菌MP262对葡萄座腔菌菌丝生长抑制结果；

图11是弗氏葡糖杆菌MP262对烟草疫霉菌丝生长抑制结果；

图12是弗氏葡糖杆菌MP262对链格孢菌菌丝生长抑制结果；

图13是弗氏葡糖杆菌MP262发酵滤液对灰葡萄孢菌孢子萌发和芽管伸长的实验结果；

图14是弗氏葡糖杆菌MP262发酵滤液对尖孢镰刀菌孢子萌发和芽管伸长的实验结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一、菌株的分离与筛选

2019年9月于青岛崂山采集不同植物叶片、根以及花瓣等样品，除去病变及坏死部分剪碎待用。将样品接入马铃薯葡萄糖液体(potato dextrose，PD)培养基中(马铃薯200g洗净切块，加入适当水煮沸20～30min，纱布过滤取土豆汁，再加入葡萄糖20g，定容至1000ml，自然pH)，28℃，180rpm震荡培养2d。取上述培养液用无菌水适当稀释，在PDA平板(PD培养液中添加2％琼脂)上进行涂布分离，28℃培养2d后挑取单菌落，再次进行划线分离，得到纯培养菌株。

用无菌棉棒蘸取青枯雷尔氏菌菌液后，将其涂布在PDA平板表面，然后再接种分离得到不同菌株，测试不同菌株对青枯雷尔氏菌生长的抑制情况，筛选出一株对青枯雷尔氏菌生长具有很强抑制力的菌株，编号MP262。

菌株MP262的平板培养照片如图1所示，菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑、湿润；培养初期呈乳白色，后期呈淡黄色。

二、MP262菌株的分类鉴定

采用16S rDNA分子特征鉴定方法进行PCR序列测定：

(1)、16S rDNA序列引物

27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID No.1)；

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID No.2)：

(2)、PCR反应体系如下：TransStart FastPfu DNA Polymerase：1μl；5×TransStart FastPfu Buffer 10μl；High Pure dNTPs(2.5mM)：4μl；27F：2μl；1492R：2μl；模板：1μl；ddH₂O：30μl；

PCR反应程序如下：95℃预变性2min；95℃变性20s、55℃退火20s、72℃延伸1min；35个循环，72℃复性；PCR产物电泳如图2所示。胶回收PCR产物，进行TA克隆，挑取单菌落送测序公司测序。

(3)、经测序，MP262菌株的16S rDNA序列如下所示：

(4)、结论：经过NCBI数据库比对，待检测MP262菌株与弗氏葡糖杆菌(Gluconobacter frateurii strain HDC-07)菌株的16S rDNA(GenBank：OK036474.1)的序列相似度为99.85％；与弗氏葡糖杆菌(Gluconobacter frateurii strain PFY16)菌株16SrDNA(GenBank：MT799962.1)的序列相似度为99.78％；最终确定MP262菌株为弗氏葡糖杆菌(Gluconobacter frateurii)。

将本发明筛选到的弗氏葡糖杆菌MP262菌株进行菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2022年3月15日，弗氏葡糖杆菌Gluconobacter frateurii MP262的保藏编号为CCTCC NO：M 2022263。

三、MP262菌株对青枯雷尔氏菌的抑制

用无菌棉棒蘸取青枯雷尔氏菌菌液后，将其涂布在平板表面，然后在平板中央接种MP262菌株。将培养皿倒置于培养箱(26～28℃)中培养1～2天，测定MP262菌株对青枯雷尔氏菌的抑菌作用。

测试结果如图3所示，MP262菌株的菌落周围出现明显的抑菌圈，表明MP262菌株对青枯雷尔氏菌的生长有显著的抑制效果。

四、MP262菌株发酵滤液对青枯雷尔氏菌的抑制

实验方法：挑取MP262菌株接种到PD液体培养基28℃，180rpm震荡培养24h，然后12000rpm条件下离心15min，上清用直径为0.22μm的细菌过滤器过滤，获得含有MP262菌株发酵物的发酵滤液(所述发酵滤液中不含有菌体，仅为发酵产物)。

在PD液体培养基中添加不同体积(5％和10％)的MP262菌株发酵滤液，对照组添加相同体积的PD液体培养基；然后接种青枯雷尔氏菌，28℃，180rpm条件下培养24h，每隔12小时测一次OD₆₀₀值。测定MP262菌株发酵滤液对青枯雷尔氏菌的生长抑制作用。

结果如图4所示，不加MP262菌株发酵滤液的对照组，青枯雷尔氏菌生长良好。当发酵滤液含量达到5％，就可以基本完全抑制青枯雷尔氏菌的生长。当发酵滤液含量达到10％时，培养24h后，抑菌率超过97％。表明MP262菌株发酵滤液对青枯病菌的生长有极强的抑制作用。

实施例2、MP262菌株对多种植物病原菌的生防实验

实验方法：将MP262菌株在PDA平板上26℃活化培养2天备用；8种植物病原菌(尖孢镰刀菌、多主棒孢霉、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌、辣椒疫霉、葡萄座腔菌、烟草疫霉、链格孢菌)分别在PDA平板上26～28℃活化培养3～7天，然后用打孔器在活化好的菌株菌丝边缘(生长状况尽量一致)打取圆形菌饼(直径0.60cm)，再用接种针分别将MP262菌株和病原菌菌饼挑至新的平板，以空白菌饼为对照，然后将培养皿倒置于培养箱(26～28℃)中培养3～7天，待空白组长满板时，测定菌丝的生长情况，计算MP262菌株对8种植物病原菌生长的抑制率。

结果如图5-图12所示，MP262菌株对尖孢镰刀菌、多主棒孢霉、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌、辣椒疫霉、葡萄座腔菌、烟草疫霉、链格孢菌的菌丝生长都有显著的抑制作用(图中间为病原菌，四周为MP262菌株)。结果证明，MP262菌株对上述8种植物病原菌均具有明显的抑菌效果。进一步分析MP262菌株对每种病原菌的抑制率，结果如表1所示，其中MP262菌株对辣椒疫霉的抑制率最高。

表1：MP262对多种病原菌的抑制率

实施例3、MP262发酵滤液对灰葡萄孢菌和尖孢镰刀菌孢子萌发和芽管伸长的抑制作用

实验方法：将实施例1制备的MP262菌株发酵物的发酵滤液，采用凹玻片法检测(在灭菌的凹玻片中分别加入不同浓度的滤液50μl，其中灰葡萄孢菌孢子浓度为8.6×10⁵个/ml，尖孢镰刀菌孢子浓度为9×10⁶个/ml，26℃保湿培养灰葡萄孢菌孢子培养4h，尖孢镰刀菌培养8h，检测不同浓度发酵滤液处理的孢子萌发率并测量芽管的长度。

1、MP262菌株的发酵滤液对灰葡萄孢菌孢子萌发和芽管伸长的抑制

结果如图13所示，随着MP262菌株发酵滤液含量的增加，对灰葡萄孢菌孢子萌发的抑制率明显提高。当发酵滤液达到60％时，灰葡萄孢菌孢子的萌发率仅为51.82％。经过测量孢子芽管的长度，发现随着滤液浓度的提高，对芽管伸长的抑制率也越高，当发酵滤液达到60％时，芽管长度仅为3.5μm，说明MP262菌株的发酵滤液能够有效地抑制灰葡萄孢菌的孢子萌发和芽管伸长，且抑制率呈剂量依赖性。

2、MP262菌株的发酵滤液对尖孢镰刀菌孢子萌发和芽管伸长的抑制

结果如图14所示，随着MP262发酵滤液浓度的升高，尖孢镰刀菌孢子的萌发率和芽管长度呈现下降趋势，当MP262菌株的发酵滤液浓度为60％时，尖孢镰刀菌孢子的萌发率只有7％，而芽管长仅为1.67μm。说明MP262菌株的发酵滤液能够有效地抑制尖孢镰刀菌的孢子萌发和芽管伸长，且抑制率呈剂量依赖性。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一株具有广谱抑菌性的弗氏葡糖杆菌MP262及其应用

<141> 2022-04-19

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1384

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagtcgcagc ttaccatgca gtcgcacgga tctttcggga ttagtggcgg acgggtgagt 60

aacgcgtagg gatctatcca tgggtggggg acaactccgg gaaactggag ctaataccgc 120

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ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg 300

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gttggttcga ccttaagccg gtgagcgaac cgcaaggacg cagccgacca cggacgtacg 1380

cgtt 1384

Claims

1.一株具有广谱抑菌性的弗氏葡糖杆菌MP262，其特征在于：其分类命名为弗氏葡糖杆菌Gluconobacter frateurii，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2022263。

2.权利要求1所述的弗氏葡糖杆菌MP262在用于制备防治植物病原菌引起的植物病害的生防菌剂中的应用，其特征在于：所述植物病原菌为青枯雷尔氏菌、烟草疫霉、辣椒疫霉、尖孢镰刀菌、多主棒孢霉、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌、葡萄座腔菌和链格孢菌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述弗氏葡糖杆菌MP262对青枯雷尔氏菌、烟草疫霉、辣椒疫霉、尖孢镰刀菌、多主棒孢霉、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌、葡萄座腔菌和链格孢菌的生长均具有显著的抑制作用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物病害包括青枯雷尔氏菌引起的植物青枯病；烟草疫霉、辣椒疫霉引起的植物疫霉病；多主棒孢霉引起的植物叶斑病；尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病；灰葡萄孢菌引起的植物灰霉病；葡萄座腔菌引起的植物枝干病害；链格孢菌引起的植物叶枯病。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述生防菌剂中包含弗氏葡糖杆菌MP262发酵滤液。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述弗氏葡糖杆菌MP262的发酵滤液在生防菌剂中的浓度为20%~70%。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述弗氏葡糖杆菌MP262发酵滤液的制备步骤为：将弗氏葡糖杆菌MP262接种到PD液体培养基中在28℃，180 rpm震荡培养24 h，然后离心，上清液经直径为0.22 μm的过滤器过滤，获得含有弗氏葡糖杆菌MP262的发酵滤液。