CN110862937B - 一株有抑菌作用的森林伯克霍尔德氏菌mp5菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株有抑菌作用的森林伯克霍尔德氏菌MP5菌株及其应用，本发明通过筛选获得了对灰霉病菌和和尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病有抑制作用的MP5菌株，其具体分类命名为Burkholderia arboris MP5，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019702。本发明经过对灰霉病菌和和尖孢镰刀菌孢子、芽管伸长的实验，证明本发明获得的MP5菌株具有对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的强抑制作用，可以将其制备成防治灰霉病菌和植物枯萎病菌的生防制剂，具有良好的市场应用前景。

Description

一株有抑菌作用的森林伯克霍尔德氏菌MP5菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株有抑菌作用的森林伯克霍尔德氏菌MP5菌株及其应用。

背景技术

灰霉病菌是一种重要植物病原真菌，该病菌在世界范围内广泛分布，被称为第二大破坏性植物病原体，该病菌能够感染番茄、黄瓜、葡萄、草莓等500多种重要的经济作物，可以引起果蔬灰霉病。该病害不仅在寄主植物生长季节可以发生，还可以在农产品的储藏期间发生，因此危害严重。尤其是近年来设施栽培方式的大面积推广，导致该病菌侵染来源广，传播速度快，灰霉病的发生越来越严重，其发生与流行往往造成严重的经济损失。据报道北方设施番茄灰霉病的发生普遍较重，一般年份造成的经济损失可达20％--30％，严重的年份50％以上甚至绝收。灰霉病菌繁殖速度非常快，产生分生孢子的数量非常多，因此很容易发生变异而产生抗药性，目前已对农业生产上常用的苯丙咪唑类、二甲酰亚胺类、氨基甲酸酯类等多种杀菌剂产生抗性，因此不仅导致防效的降低，而且导致药剂使用量不断加大。化学药剂的过度使用，不仅造成农产品农残超标，危害消费者的身体健康，还导致环境污染，破坏生态平衡，影响农业的可持续健康发展。

植物枯萎病的病原为尖孢镰刀菌，尖孢镰刀菌是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种镰刀菌枯萎病的发生。寄主被枯萎病菌侵染后，症状表现多种多样，一般导致维管束褐变，植株萎蔫枯死，球茎和根腐烂，植株生长衰弱等。植物枯萎病是近年来对农业生产造成危害的一种重要的真菌性土传病害，在很多地区已有发生，尤其在作物重荏地发生程度更为严重，直接影响了农作物产量及其经济效益。

生物防治是植物病害防治的重要措施之一，生防菌通过诱导寄主植物抗病性的产生或者通过对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的拮抗作用而到达防治或减轻病害的目的。目前已有木霉菌、枯草芽胞杆菌、沙雷氏菌、链霉菌等多种微生物对灰霉病菌和尖孢镰刀菌拮抗作用的相关报道。生物菌剂或制剂可以减少或替代化学农药的使用，从而既能有效防治病害，又可避免化学农药的使用带来的负面效应。

发明内容

本发明的目的在于提供了一株有抑菌作用的森林伯克霍尔德氏菌MP5菌株及其应用。本发明通过筛选获得了一株能够强烈抑制灰霉病菌和尖孢镰刀菌分生孢子萌发的MP5菌株。并通过接种实验证明，该菌株发酵物的发酵滤液对番茄灰霉病的防治效果为超过92.47％。本发明通过实验结果证明该菌株或其制剂对灰霉病菌和植物枯萎病菌的防治具有广阔的应用前景。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一株有抑菌作用的森林伯克霍尔德氏菌MP5菌株，其分类命名为Burkholderia arboris MP5，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019702。

进一步的：所述MP5菌株具有鞭毛，菌落呈圆形，淡黄绿色，菌落扁平，边缘光滑，表面湿润，菌落直径1.5-2.5毫米。

本发明还提供了所述的森林伯克霍尔德氏菌MP5菌株在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用。

进一步的：所述植物病原菌为灰霉病菌和尖孢镰刀菌。

进一步的：所述MP5菌株的菌液和发酵滤液对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的分生孢子萌发和芽管伸长均具有抑制作用。

进一步的：所述MP5菌株的菌液和发酵滤液对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的分子孢子萌发和芽管伸长的抑制率呈剂量依赖性。

进一步的：所述MP5菌株的菌液中OD₆₀₀＝0.301-0.732时对灰霉病菌和尖孢镰刀菌分生孢子的萌发和芽管的伸长具有较强抑制作用。

进一步的：所述MP5菌株的菌液中OD₆₀₀＝0.492时对灰霉病菌和尖孢镰刀菌分生孢子的萌发和芽管的伸长抑制效果最好。

进一步的：所述MP5菌株的发酵滤液的制备步骤为：将所述MP5菌株接种到液体YEPD培养基中在25℃-28℃下震荡培养96h，然后离心，过滤，获得含有MP5菌株发酵物的发酵滤液。

进一步的：所述MP5菌株在150-200rpm条件下进行震荡培养，所述过滤采用直径0.22um的过滤器进行过滤。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明筛选到对灰霉病菌和尖孢镰刀菌具有抑制作用的MP5菌株，经分类鉴别为Burkholderia arboris，并经过对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的孢子、芽管伸长和离体叶片的实验，证明本发明获得的MP5菌株具有对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的强抑制作用，可以将其制备成防治灰霉病菌和尖孢镰刀菌的生防制剂，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明所述MP5菌株的平板培养照片。

图2是本发明所述MP5菌株的发酵滤液对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的孢子萌发抑制的实验结果。

图3是本发明所述MP5菌株的发酵滤液对灰霉病菌孢子芽管伸长的实验结果。

图4是本发明所述MP5菌株的发酵滤液对尖孢镰刀菌孢子芽管伸长的实验结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。

实施例1

一、菌株的分离与筛选

2017年6月20日于青岛崂山采集番茄根样品20份，将样品转入灭菌处理的研钵中研磨，加无菌水稀释成10ml，继续用无菌水稀释至10^-4-10^-5倍，分别取100ul涂LB平板(胰蛋白胨10克/升，酵母提取物5克/升，氯化钠5克/升，pH7.0)，28℃条件下培养。

挑取单菌落，并将细菌单菌落接种于YEPD(酵母提取物3g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l)液体培养基中25℃-28℃下震荡培养96h，然后4℃9000rpm条件下离心，上清经直径为0.22um的过滤器过滤备用。按照不同比例将滤液加入到YPD培养基，并分别接入灰霉病菌和尖孢镰刀菌的分生孢子接种进行静置培养，以孢子接种到YEPD中作对照，当对照分生孢子萌发率达90％时检测细菌滤液中病菌分生孢子的萌发率，计算出细菌滤液对病菌分生孢子萌发的抑制率，筛选出一株对灰霉病菌和尖孢镰刀菌分生孢子的萌发具有很强抑制力的MP5菌株。其平板培养照片如图1所示，菌落呈圆形，呈淡黄绿色，菌落扁平，边缘光滑，表面湿润，菌落直径1.5-2.5毫米。

二、MP5菌株的分类鉴定

1、分子鉴定：

1)、引物：27F/1492R

27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID No：2)：

1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID No：3)；

2)、PCR反应体系如下：2×PCR Master Mix：12.5ul；引物27f：1ul；引物1492r：1ul；模板：1ul；ddH₂O：9.5ul；

PCR反应程序如下：94℃预变性10min；94℃变性40s、52℃退火40s、72℃延伸1.5min；31个循环，72℃延伸10min；4℃∞。

胶回收PCR产物，进行TA克隆，挑取单菌落送测序公司测序。

3)、经测序，所述MP5菌株的16S rDNA片段序列如下(SEQ ID No：1)：

4)、结论：经过NCBI数据库比对，所述MP5菌株与Burkholderia arboris NKD-1116S rDNA，GenBank：JQ768336.1的序列一致性为99.86％。

2、生理生化鉴定：

参照细菌系统鉴定手册中所描述的生理生化特征方法，选择22种生理生化试验对目的MP5菌株进行鉴定，实验结果如表1所示，确定所筛选到的MP5菌株为Burkholderiaarboris。

表1 MP5菌株的生理生化特征参数

注：+：阳性；-：阴性；W：微弱；∨：不定。

将本发明筛选到的MP5菌株进行菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学保藏中心；保藏日期：2019年9月9日，Burkholderia arboris MP5的保藏编号为CCTCC NO：M 2019702。

三、MP5菌株对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的生防实验

1、MP5菌株的发酵滤液对孢子萌发的抑制作用

实验方法：将挑取的单菌落接种到液体5ml YEPD培养基中(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水1升)26℃，180rpm条件下震荡培养24h。取培养的菌液按5％的体积浓度接种于50ml YEPD培养基中，26℃，180rpm条件下震荡培养96h，然后4℃，12000rpm条件下离心10min，上清经直径为0.22um的过滤器过滤，获得含有MP5菌株发酵物的发酵滤液(所述发酵滤液中不含有MP5菌，仅为MP5菌的发酵产物)。

对所述发酵滤液进行不同浓度的稀释(具体的滤液含量为0％，2％，6％，10％，15％)，采用凹玻片法检测(在灭菌的凹玻片中分别加入不同浓度的滤液50ul，其中灰霉病菌分生孢子的浓度为5.9×10⁵/ml，尖孢镰刀菌的孢子浓度为6.1×10⁵/ml，26℃保湿培养，对照分生孢子萌发率达90％时检测不同浓度的发酵滤液处理中分生孢子的萌发率并计算滤液对分生孢子萌发的抑制率)。

实验结果如图2所示，随着发酵滤液含量的增加，对孢子萌发的抑制率明显提高。当滤液为6％时，就可以基本抑制两种孢子萌发。表明MP5菌株的发酵产物对灰霉孢子和尖孢镰刀菌孢子均具有较强的抑制作用。

2、MP5菌的发酵滤液对芽管伸长的影响：

实验方法：采用同上的凹玻片法进行检测，培养2h-10h后，显微镜观察并测量。实验结果如图3和图4所示，在同一时间点，随着滤液浓度的提高，对两种病菌的孢子芽管伸长的抑制率也越高，即对孢子芽管伸长的抑制率呈剂量依赖性。

3、MP5菌株的发酵滤液对离体叶片的实验：

实验方法：分别用所述不同浓度的发酵滤液喷雾处理长势一致的健康番茄叶片，对照CK用无菌水处理，待叶片上滤液完全晾干后，点接灰霉病菌的分生孢子5.9×10⁵个/ml，26℃保湿处理，3天后调查发病情况，计算病情指数，接种实验的结果如表2所示，MP5菌株的发酵滤液对番茄灰霉病的防治效果可达92.47％，能够有效地对番茄灰霉病进行有效防治。

表2 MP5菌株发酵滤液对灰霉病菌的防治实验结果

4、含有MP5菌的菌液对灰霉病菌和尖孢镰刀菌孢子的抑制作用

本实施例还进行了含有MP5菌株的菌液对灰霉病菌孢子和尖孢镰刀菌孢子萌发的抑制实验、对芽管伸长的抑制实验和离体叶片实验，实验结果表明当菌液中MP5的菌含量为OD₆₀₀＝0.301-0.732时对两种孢子的萌发、芽管的伸长均具有明显的抑制作用，当OD₆₀₀＝0.492时，抑制效果最好，抑制率超过98.6％。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一株有抑菌作用的森林伯克霍尔德氏菌MP5菌株及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> 森林伯克霍尔德氏菌(Burkholderia arboris)

<400> 1

tgcagtcgaa cggcagcacg ggtgcttgca cctggtggcg agtggcgaac gggtgagtaa 60

tacatcggaa catgtcctgt agtgggggat agcccggcga aagccggatt aataccgcat 120

acgatctacg gatgaaagcg ggggaccttc gggcctcgcg ctatagggtt ggccgatggc 180

tgattagcta gttggtgggg taaaggccta ccaaggcgac gatcagtagc tggtctgaga 240

ggacgaccag ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300

ggaattttgg acaatgggcg aaagcctgat ccagcaatgc cgcgtgtgtg aagaaggcct 360

tcgggttgta aagcactttt gtccggaaag aaatccttgg ctctaataca gtcgggggat 420

gacggtaccg gaagaataag caccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 480

ggtgcgagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgtgc gcaggcggtt tgctaagacc 540

gatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcattggt gactggcagg ctagagtatg 600

gcagaggggg gtagaattcc acgtgtagca gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaatacc 660

gatggcgaag gcagccccct gggccaatac tgacgctcat gcacgaaagc gtggggagca 720

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cctaaacgat gtcaactagt tgttggggat 780

tcatttcctt agtaacgtag ctaacgcgtg aagttgaccg cctggggagt acggtcgcaa 840

gattaaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg gtggatgatg tggattaatt 900

cgatgcaacg cgaaaaacct tacctaccct tgacatggtc ggaatcccgc tgagaggtgg 960

gagtgctcga aagagaaccg gcgcacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg1020

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc cttagttgct acgcaagagc1080

actctaagga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat1140

ggcccttatg ggtagggctt cacacgtcat acaatggtcg gaacagaggg ttgccaaccc1200

gcgaggggga gctaatccca gaaaaccgat cgtagtccgg attgcactct gcaactcgag1260

tgcatgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg1320

ggtcttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt ttaccagaag tggctagtct1380

aaccgcaagg aggacggtca ccacggt 1407

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims (8)

1.一株有抑菌作用的森林伯克霍尔德氏菌（Burkholderia arboris）MP5菌株，其特征在于：所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2019702。

2.权利要求1所述的森林伯克霍尔德氏菌MP5菌株在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述植物病原菌为灰霉病菌（Botrytis cinerea）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。

3.根据权利要求2所述的森林伯克霍尔德氏菌MP5菌株在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述MP5菌株的菌液和发酵滤液对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的分生孢子萌发和芽管伸长均具有抑制作用。

4.根据权利要求3所述的森林伯克霍尔德氏菌MP5菌株在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述MP5菌株的菌液和发酵滤液对灰霉病菌和尖孢镰刀菌的分子孢子萌发和芽管伸长的抑制率呈剂量依赖性。

5.根据权利要求4所述的森林伯克霍尔德氏菌MP5菌株在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述MP5菌株的菌液中OD₆₀₀=0.301-0.732时对灰霉病菌和尖孢镰刀菌分生孢子的萌发和芽管的伸长具有较强抑制作用。

6.根据权利要求5所述的森林伯克霍尔德氏菌MP5菌株在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述MP5菌株的菌液中OD₆₀₀=0.492时对灰霉病菌和尖孢镰刀菌分生孢子的萌发和芽管的伸长抑制效果最好。

7.根据权利要求3所述的森林伯克霍尔德氏菌MP5菌株在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述MP5菌株的发酵滤液的制备步骤为：将所述MP5菌株接种到液体YEPD培养基中在25℃-28℃下震荡培养96 h，然后离心，过滤，获得含有MP5菌株发酵物的发酵滤液。

8.根据权利要求7所述的森林伯克霍尔德氏菌MP5菌株在制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用，其特征在于：所述MP5菌株在150-200 rpm条件下进行震荡培养，所述过滤采用直径0.22 um的过滤器进行过滤。

Images