WO2021195792A1

WO2021195792A1 - Composición probiótica con efecto biocontrolador y bioestimulante para aplicación agrícola que comprende dos cepas de bacterias weissella confusa; método de obtención; formulación que la contiene y uso de la misma

Info

Publication number: WO2021195792A1
Application number: PCT/CL2020/050031
Authority: WO
Inventors: Erica Castro Inostroza; Ernesto Antonio Moya Elizondo; Rodrigo BÓRQUEZ YÁÑEZ; María José PARRA MORAGA; Jaime COFRÉ RUBILAR; Juan Pablo MELLADO; Maria José AGUAYO; Alexandra ROZAS; Yessenia Stefany VEGA ORREGO
Original assignee: Universidad San Sebastian; Universidad De Concepcion
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2021-10-07

Abstract

La invención provee una composición probiótica que comprende dos microorganismos ácido lácticos de Weisella confusa en alta concentración para uso en agricultura e industrias relacionadas. En una realización preferente de la invención se provee una formulación deshidratada que puede ser aplicada durante el proceso de siembra, embadurnando o tratando tubérculos y semillas o puede ser suspendido en agua y asperjado durante el desarrollo de la planta. La composición de la invención permite proteger los cultivos de papas de la colonización e infestación del hongo P. infestans (control del tizón tardío de la papa) y además estimula el desarrollo vegetal, incrementando los indicadores de rendimiento, y fortalece las características del suelo, mejorando su composición de microbios benéficos.

Description

COMPOSICIÓN PROBIÓTICA CON EFECTO BIOCONTROLADOR Y BIOESTIMULANTE PARA APLICACIÓN AGRÍCOLA QUE COMPRENDE DOS CEPAS DE BACTERIAS WEISSELLA CONFUSA; MÉTODO DE OBTENCIÓN; FORMULACIÓN QUE LA CONTIENE Y USO DE LA MISMA

MEMORIA DESCRIPTIVA

CAMPO TÉCNICO

La invención apunta a una composición probiótica para elaborar formulaciones de uso agrícola como biocontrolador, que permite proteger los cultivos del ataque de ciertos patógenos, a la vez que actúa como un bioestimulante del desarrollo vegetal.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El rubro agrícola es uno de los pilares del desarrollo económico en muchos países, no obstante, a pesar del buen rendimiento que puede lograr este sector, variables no contraladas relacionadas a los cultivos de frutas y hortalizas pueden afectar significativamente el rendimiento y productividad de éstos, particularmente por la proliferación de plagas.

Las enfermedades son un verdadero problema para la producción agrícola, afectando los cultivos, generando deterioros en la producción y enormes pérdidas económicas. Por otra parte, la cancelación del registro de algunos pesticidas, la desaprobación pública de estos productos sintéticos, la resistencia que generan ciertos patógenos a los agroquímicos y la expansión de la agricultura orgánica, han llevado a buscar formas alternativas de controlar las plagas. A partir de ello surge el interés por implementar una producción agrícola limpia y sustentable, promoviendo el empleo de métodos biológicos para la protección de los cultivos, como una alternativa al uso de agroquímicos, protegiendo el ambiente y las personas.

En paralelo, además de prevenir la infestación por patógenos, la agricultura permanentemente busca incrementar el rendimiento de la producción. En este ámbito, surge el uso de productos bioestimulantes que complementan la nutrición de los cultivos, y que comprenden sustancias o microorganismo que permiten mejorar la absorción y asimilación de nutrientes y la tolerancia al estrés biótico o abiótico, entre otras características agronómicas. Los bioestimulantes se pueden usar directamente en los cultivos, o pueden ser aplicados en el suelo o agua de riego.

Así, la agricultura orgánica se ve incentivada por la demanda de productos orgánicos de parte de los consumidores, por el interés de reducir la contaminación de los suelos y las aguas subterráneas y por el interés de los agricultores que buscan tecnologías sostenibles para proteger su salud y la de sus familias. i En el ámbito mundial, uno de los cultivos más importante es la papa ( Solanum tuberosum). Este recurso es afectado por diversas enfermedades, incluyendo el tizón tardío asociado a Phytophthora infestans De Bary, plaga que puede llegar a ser devastadora y difícil de controlar, con elevadas pérdidas de las plantaciones. Por esto, una gran diversidad de productos químicos, se emplean en el manejo productivo de este tubérculo. Por esto, tendencias más amigables se han incorporado en los últimos años, tales como el empleo de compost húmedo con el propósito de aumentar la resistencia a la infección de P. Infestans por medio del incremento de bacterias antagónicas en la superficie del tubérculo, así como el uso de control biológico a través de enzimas microbianas que degradan la pared celular de este hongo patógeno, o directamente la aplicación de bacterias biocontroladoras.

Dentro de los agentes químicos utilizados para el control de los hongos patógenos, la mayoría de ellos es de uso preventivo. En el caso de Phytophthora infestans (y de otros organismos fitopatógenos) se utilizan fungicidas comerciales que contienen compuestos tales como clorotalonilo, mancozeb, zoxamida, dazomet, sulfato de cobre pentahidratado, caldo bordelés, captan, mandipropramida, hidróxido de cobre, hidróxido cúprico, óxido cuproso, etaboxam, famoxadona, cimoxanilo, metalaxilo, amisulbrom, clorhidrato de propamocarb, fluopicolida, propineb, forfonatos de sodio, fosfonatos de potasio, fosfonatos de amonio, valifenalato, ametoctradina, oxatiapiprolina, y famoxadona; los productos comerciales también pueden comprender microorganismos tales como Bacillus subtilis cepa QST 713, Tríchoderma harzianum cepa Queule, Tríchoderma virens cepa Sherwood, y Tríchoderma parceramosum cepa Trailes.

En el estado del arte existen diversos desarrollos en la línea de biocontroladores y/o bioestimulantes, tales como los que se presentan a continuación.

En el documento de patente MX 20160017087 se describe a un agente biocontrolador de hongos, nematodos e insectos fitopatógenos, específicamente, a un método para producir un consorcio bacteriano y un medio de cultivo para obtener un biofungicida, el cual contiene un consorcio de las nuevas cepas aisladas de Bacillus subtilis, las cuales se han denominado como: Bk-Bs-01 , Bk-Bs-02 y Bk-Bs-03. El producto actúa como antogonista contra hongos fitopatógenos entre los que se señalan los géneros: Phytophthora, Rhizoctonia, Fusarium, Alternaría, Sclerotium, Sclerotinia y Botrytis. La invención también incluye el medio de cultivo líquido para obtener el biofungicida, el cual se constituye de almidón de patata, dextrosa, extracto de levadura y sales minerales. En este documento no se utilizan bacterias ácido lácticas ni se entregan antecedentes de una acción bioestimulante o de mejoras en algún parámetro productivo en conjunto con la actividad biofungicida del producto descrito.

Por otra parte, en el documento CN 201510232193 se describe la cepa AB-4 de Lactobacillus plantarum, la cual muestra una capacidad inhibitoria efectiva para los patógenos Fusariun oxysporum y Phytophthora drechsleri. Dentro de las pruebas realizas se menciona que la cepa presenta una buena estabilidad térmica, tras ser sometido hasta 100°C, y el sobrenadante fermentado obtenido tiene propiedades de almacenamiento aceptables manteniendo su actividad bacteriostática después de almacenarse a temperatura ambiente durante 20 días. Así, si bien se menciona una bacteria del tipo ácido láctica, se trata de una única cepa que no demuestra ser efectiva contra Phytophthora infestaos ni tampoco muestra que tenga un efecto bioestimulante sobre los cultivos.

La invención descrita en CN 201810980816 se refiere a un licor o líquido de fermentación a base de Lactobacillus pentosus (CGMCC No. 1919), el cual puede ser usado para preparar un producto biocontrolador de patógenos transmitidos por el suelo, en específico su aplicación en la inhibición de Phytophthora capsici, alcanzando una efectividad de un 87%. Al igual que el ejemplo anterior, en este documento se menciona una bacteria del tipo ácido láctica, sin abordar que tenga actividad contra Phytophthora infestaos ni tampoco enseña un efecto bioestimulante sobre los cultivos.

En cuanto a la invención divulgada en CN 109666462, allí se describe la capacidad de prevención y tratamiento de la bacteria Bacillus veiezensis (cepa SNB55) para enfermedades producidas por virus y hongos en plantas, entre ellas Phytophthora capsici. Además, de lo mencionado, favorece el crecimiento de las mismas. En este sentido, la utilización de este microorganismo no genera toxicidad ni patogenicidad en las plantas, siendo un desarrollo respetuoso con el medio ambiente y no comprometiendo la salud de las personas. Este desarrollo proveería una acción conjunta de biocontrolador y bioestimulante, pero en otro tipo de patógeno, por lo tanto se trata de un problema técnico diferente al abordado en la presente invención.

Finalmente, en el documento US 201815893058 se presentan de semillas tratadas con un consorcio formado por el antagonista fúngico Trichoderma víreos y por el antagonista bacteriano Bacillus amyloliquefaciens, los que en conjunto al ser aplicados actúan biocontroladores, bioplaguicidas o biofungicidas. Junto con el efecto mencionado, además se aumenta el rendimiento de las plantas. Los hongos fitopatógenos en los cuales actúa son los del género Fusarium, Phythium, Phytophthora y Penicillium, en los cultivos de tomate, pimientos, soya, girasol, trigo, maíz y también en césped. Tal como en el documento anterior, se proveería una acción conjunta de biocontrolador y bioestimulante, pero en otro tipo de patógenos y además no se muestra que tengan actividad sobre tubérculos, por lo también se trata de un problema técnico diferente al de la presente invención.

En relación al uso de bacterias lácticas en aplicaciones agrícolas, a partir de la literatura científica se conoce, por ejemplo, el uso de un liofilizado de sobrenadante de la cepa Lactobacillus amyiovorus JG2, que ha sido probado in vitro, para la inhibición crecimiento micelial de Phytophthora infestans, utilizando sobrenadantes al 12,5% en cultivos líquidos (Guo J. et al., 2014).

Además de ello, también es posible mencionar el uso de Lactobacillus plantarum cepa IMAU10014, también analizado en pruebas in vitro, en donde se obtuvo como resultado que los metabolitos producidos por dicha cepa, tales como ácido 3-feniláctico, ácido bencenoacético, y éster 2-propenílico generan actividad anti-oomiceto contra Phytophthora drechsleri Tucker (Wang H. et al., 2012).

En el artículo de Axel et al. (2012) se aborda una revisión del control ecológico de bacterias ácido lácticas (BAL) en tizón tardío, en donde se indica que obtener productos que logren un efectivo control de Phytophthora infestans ha sido un problema de difícil resolución, en donde los biopesticidas logran inhibir el patógeno in vitro, pero no logran un buen desempeño en campo. Incluso se menciona que la composición de tales biocontroladores no es consistentes entre distintos batch elaborados. Por lo tanto, el proveer de biocontroladores efectivos contra el tizón tardío se aborda como un problema aún no resuelto de forma satisfactoria en la industria.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Cinética de crecimiento de las cepas USS9F y USS31 F en medio con peptona de pescado y parámetros de Gompertz obtenidos.

Figura 2. Pérdida logarítmica de la viabilidad durante el almacenamiento a 4°C de la cepa USS9F y USS31 F.

Figura 3. Ensayo de inhibición en placa en medio ACM, donde se observa inhibición en el crecimiento micelial de pseudo-hongo Phytophthora ¡nfestans por las bacterias ácido lácticas USS31 F, USS7F, USS8F y USS9F (correspondientes a los rótulos 31 , 7, 8 y 9, respectivamente).

Figura 4. Porcentaje de germinación en semillas de maíz tratadas con las distintas formulaciones (USS9F, USS31 F y mezcla de ambas) y control.

Figura 5. Porcentaje de germinación en semillas de ají tratadas con las distintas formulaciones (USS9F, USS31 F y mezcla de ambas) y control.

Figura 6. Altura promedio en plantas de papas tratadas con las distintas formulaciones (USS9F, USS31 F, USS7F) y control (OF).

Figura 7. Porcentaje de infección foliar en plantas inoculadas con P. ¡nfestans y tratadas con formulaciones basadas en cepas lácticas (USS9F, USS31 F, USS7F) y grupo control tratado con agua (OF).

Figura 8. Infección foliar en plantas inoculadas con P. ¡nfestans y tratadas posteriormente con formulaciones basadas en cepas lácticas (USS31 F, USS9F) y grupo control tratado con agua (Control (-)).

Figura 9. Porcentaje de atizonamiento observado en tres fechas de evaluación para el experimento de evaluación de infestación por P. ¡nfestans y rendimiento en condiciones controladas en papa cv. Pukara-INIA durante la temporada 2019-2020.

Figura 10. Rendimiento por 10 m² observado para el experimento de evaluación de infección por P. ¡nfestans y rendimiento en condiciones controladas en papa cv. Pukara-INIA durante la temporada 2019-2020.

Figura 11. Recuento microbiológico de bacterias ácido lácticas totales en hojas para el experimento de evaluación de infección por P. ¡nfestans y rendimiento en condiciones controladas en papa cv. Pukara-INIA durante la temporada 2019-2020.

Figura 12. Porcentaje de atizonamiento observado en dos fechas de evaluación para un experimento en papa cv. Patagonia-INIA durante ensayo de evaluación de infección por P. ¡nfestans y rendimiento en condiciones durante la temporada 2019-2020. Figura 13. Porcentaje de control de tizón tardío de la papa observado en dos fechas de evaluación para un experimento en papa cv. Patagonia-INIA durante ensayo de evaluación de infección por P. ¡nfestans y rendimiento en condiciones durante la temporada 2019-2020.

Figura 14. Rendimiento por 9 m² observado para un experimento en papa cv. Patagonia-INIA para un experimento en papa cv. Patagonia-INIA durante ensayo de evaluación de infestación por P. ¡nfestans y rendimiento en condiciones durante la temporada 2019-2020.

Figura 15. Comparación de productividad en términos de peso entre tratamientos por predio evaluado.

Figura 16. Comparación de productividad en términos de cantidad entre tratamientos por predio evaluado. Figura 17. Altura de las plantas de ají tratadas con las distintas formulaciones (USS9F, USS31 F y mezcla de ambas) y control.

Figura 18. Altura de las plantas de maíz tratadas con las distintas formulaciones (USS9F, USS31 F y mezcla de ambas) y control.

Figura 19. Promedio del tamaño de las mazorcas de maíz cultivadas en campo y tratadas con las distintas formulaciones (USS9F, USS31 F y mezcla de ambas) y control.

Figura 20. Promedio del tamaño de las mazorcas de maíz cultivadas en macetas y tratadas con las distintas formulaciones (USS9F, USS31 F y mezcla de ambas) y control.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención es una solución científico-tecnológica a la vanguardia de la agricultura moderna que emplea bacterias ácido lácticas (BAL), aisladas a partir de los microambientes de plantas de papas sanas, sin antecedentes de P. ¡nfestans o tizón tardío, para elaborar una composición natural e inocua para el medioambiente, que favorece el desarrollo vegetal, incrementando la producción de los cultivos.

La presente invención se refiere al uso de un producto derivado de microorganismos ácido lácticos correspondiente a dos cepas de Weisella confusa, previamente correspondiente a la denominación Lactobacillus confusus: cepas USS9F cuyo número de depósito es DSM33454 y la cepa USS31 F cuyo número de depósito es DSM33455, en la prevención y control del hongo parásito Phytophthora ¡nfestans y otros hongos asociados al cultivo de papa.

Se describe el método de obtención de la biomasa bacteriana deshidratada de las cepas USS9F y USS31 F, además del método para obtener el polvo para resuspensión y su empleo como producto biotecnológico.

Las cepas bacterianas utilizada en la formulación fueron depositada en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbFI, en Alemania, bajo el número de depósito DSM33454 (cepa USS9F) y DSM33455 (cepa USS31 F), con fines de patentamiento.

Las cepas bacterianas USS9F y USS31 F, ambas con reconocidas propiedades probióticas, son cultivadas en medio de cultivo no comercial, son deshidratadas mediante un proceso de liofilización, lo cual le confiere a la formulación final una alta concentración de microorganismos, estable durante el tiempo. Se comprobó que la formualción es inocua para el humano y el medio ambiente. La presente invención provee entonces una composición innovadora y representa un método alternativo de prevención y control de infestaciones por el hongo P. ¡nfestans en cultivos de papas que además tiene acción bioestimulante para los cultivos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Durante el desarrollo de la presente invención se muestrearon 13 predios, obteniendo un total de 130 cepas aisladas. Se efectuó una caracterización de estos aislados, donde metabólicamente, la mayor parte de los microorganismos aislados corresponden al grupo homofermentativo facultativo, grupo que se destaca por su alta producción de ácido láctico, lo cual es una característica promisoria en antibiosis, lo que representó un potencial concreto de estas cepas en las pruebas de inhibición del crecimiento del fitopatógeno P. ¡nfestans. Como una medida de seguridad en la aplicación de nuestras cepas bacterianas a cultivos y probable consumo humano, se efectuó una prueba cualitativa de actividad hemolítica, encontrando principalmente cepas con ausencia de la propiedad de hemolizar hematíes, y algunos microorganismos con capacidad hemolítica leve o fuerte, siendo estos microorganismos plenamente identificados y descartados.

Las pruebas realizadas contemplaron:

• Evaluación de la inhibición de P. infestans en pruebas en invernadero.

• Comparación del efecto de las cepas respecto de productos químicos y biológicos.

• Pruebas de campo para evaluar rendimiento (en términos de unidades y kilogramos) en cultivos de papas y en otros tipos de siembras.

• Pruebas de actividad hemolítica y de inocuidad in vitro (en células nucleares de sangre periférica humana) e in vivo (en modelos murinos).

• Caracterización de las cepas en función de: producción de H2O2, adherencia de las cepas lácticas (hidrofobicidad de la superficie bacteriana), susceptibilidad antibiótica, identificación de cepas mediante PCR.

La caracterización efectuada, permitió seleccionar un total de 25 microorganismos con el mayor potencial biotecnológico. Tras las pruebas de interacción de las cepas aisladas y P. infestans, los resultados experimentales mostraron que cuatro de ellas presentaron inhibición sobre el crecimiento micelial de P. infestans, después de 15 días de co-cultivo, y correspondieron a las cepas USS7F, USS8F y USS9F, aisladas desde cáscara de papa y la superficie de una lombriz. Adicionalmente, la cepa rotulada USS31 F, que fue obtenida desde flores de papa cv. Cardinal, presentó inhibición sobre el crecimiento micelial.

Finalmente se seleccionaron dos de esas cepas, correspondientes a las cepas denominadas USS9F y USS31 F, que si bien podrían ser utilizadas individualmente, presentan efectos sinérgicos para su acción combinada como biocontrolador y bioestimulante para cultivos agrícolas.

Método de Preparación de la Composición

Cultivo bacteriano

Las cepas se pueden preservar en frío, tras lo cual se pueden activar, por ejemplo, incubando a 30°C en cultivo estático durante 24 h seguido de traspaso y cultivo por 12 h. Luego se centrifuga el medio y se rescata el pellet, re-suspendiéndolo en suero fisiológico previo a la etapa de cultivo. Para el cultivo de las cepas bacterianas USS9F y USS31 F, se empleó un medio de cultivo estéril a base de lactosuero hidrolizado, utilizando peptona de caseína como fuente de nitrógeno, alcanzando una viabilidad del orden de 1 E09 [UFC/ml] Posteriormente se reemplazó la fuente de nitrógeno en la formulación por peptona de pescado. Se obtuvo una viabilidad del orden de 1 E09 [UFC/ml] bajo las mismas condiciones de temperatura y tiempo de cultivo, a una temperatura de 28-30^eC durante 15-17 horas, según se observa en las figuras y parámetros obtenidos por el modelo de Gompertz (Figura 1 ).

Deshidratado

A fin de lograr la estabilización de las cepas, se realiza la deshidratación de los mismos mediante liofilización, alcanzando un estado de latencia al volverse más lento su metabolismo. Para el proceso de secado por liofilización, con las cepas USS9F y USS31 F una vez finalizado el cultivo en el medio modificado con peptona de pescado, se utilizaron tres sólidos protectores: leche descremada, lactosuero y peptona de pescado con distintos costos asociados.

Los sólidos protectores, crioprotectores o coformulantes tienen un rol fundamental en la estabilidad de la formulación, esto porque tienen facilidad para atravesar la membrana celular y acumularse intracelularmente, facilitando el flujo de agua a través de la membrana celular y protegiendo de la acción del frío las estructuras moleculares y supramoleculares a través de diferentes formas de acción. Además, los coformulantes sirven para compensar la diferencia de presión osmótica que se genera cuando empieza a congelarse la superficie de la célula, evitando una pérdida excesiva de agua que podría provocar la deshidratación y destrucción de las células.

Se realizaron pruebas con estos sólidos protectores en distinta concentración, obteniendo que la menor disminución de la viabilidad, en ciclos logarítmicos inmediatamente después de la liofilización, se obtiene para una concentración de sólidos al 15% p/v.

El tiempo de liofilización fue de entre 48 y 72 horas, obteniendo una viabilidad del orden de 1 E10 [UFC/ml]

FORMULACIÓN

Tabla 1. Coformulantes utilizados para secado por liofilización, para biomasa obtenida desde 1 L de medio de cultivo.

Peptona de pescado 15 22, 5g

Se comprobó que no existen diferencias significativas entre los medios protectores inmediatamente después del secado por liofilización, obteniendo valores de viabilidad del orden de 1 E10 [UFC/ml] Las cepas USS9F y USS31 F cultivadas en medio modificado con peptona de pescado y liofilizadas con distintos crioprotectores fueron almacenadas a 4°C.

Las cepas se conservan preferentemente envasadas al vacío en bolsas no permeables, para protegerlas de la humedad, oxígeno y luz.

Tabla 2: Viabilidad durante el almacenamiento a 4°C de las cepas USS9F y USS31 F

Para todos los casos se observa la disminución de viabilidad en más de un ciclo logarítmico para el tiempo de almacenamiento considerado de 170 días (Figura 2).

Por lo tanto, la microencapsulacion por liofilización de las cepas de acuerdo a la presente invención comprende las etapas de:

• concentrar de las bacterias cultivadas, por ejemplo, mediante centrifugación;

• resuspender el pellet en agua destilada;

• adicionar el agente crioprotector, en una concentración de sólidos al 15% p/v;

• congelar la mezcla de pellet resuspendido y crioprotector; y

• liofilizar durante 48 a 72 horas.

Usos

Las composiciones de acuerdo a la invención se pueden utilizar en agricultura como bioestimulante y/o biocontrolador en diversas formulaciones para ser aplicada de forma preventiva en zonas extensas de cultivo agrícola por cualquier método disponible en la técnica, ya sea mediante el embadurnado o tratamiento del tubérculo o semillas y/o aspersión de forma manual o motorizada, empapado de material vegetal, o incorporación directa en suelos o mezclas de siembra en invernadero, macetas, campo, etc. Al ser un producto estable, permite su preparación in situ. Es recomendable además su aplicación suplementaria después de eventos climáticos propicios para la invasión del pseudo-hongo o frente a una condición de estrés, dado que es un producto natural, no existiendo restricción en su dosificación.

Adicionalmente, la formulación permite un incremento en el rendimiento de los cultivos tratados, fenómeno que se podría atribuir a la modulación de la microbiota que forma parte de la rizósfera y filósfera. Lo que se traduce en promover la germinación de las semillas, el crecimiento de las plantas y el tamaño de los frutos en cultivos agrícolas.

La composición de la invención se puede usar en una amplia gama de cultivos agrícolas, especialmente hortalizas, tales como: papas, tomate, pimentón, berenjena, maíz, ají, haba, arveja, entre otros.

EJEMPLOS

A continuación, se presentan algunos ejemplos a modo de ilustración, sin por esto restringir el alcance de la invención.

Ejemplo 1 : Preparación y estabilización de cepas

1 ) Las cepas USS9F y USS31 F fueron activadas desde el cepario en que son mantenidas: a) Se traspasaron 100 pL de cada cepa, almacenada a -20°C, a tubos con 4 mL de medio MRS (agar de Man, Rogosa y Sharpe) estéril, incubando a 30°C por 24 horas, en cultivo estático. b) Cumplido el tiempo se realizó un nuevo traspaso de 100 pL del tubo anterior a un nuevo tubo con 4 mL de medio MRS estéril, incubando a 30°C por 12 horas, en cultivo estático.

2) Preparación del medio de cultivo para generación de biomasa: a) Se empleó un medio a base de derivados de suero de queso, que corresponde a un medio específico para el cultivo de cepas de Lactobacillus sp, elaborado a partir de permeado de suero (como fuente carbonada además otros nutrientes como lo son nitrógeno orgánico, minerales y micronutrientes), a la que se adiciona una enzima lactasa, peptona de caseína, extracto de levadura, dihidrógeno fosfato de potasio, acetato de sodio y Tween-80 (descrito en la solicitud de patente chilena N°1940-2005 y concedida con registro N°51.722). b) Inicialmente el suero de queso es hidrolizado, agregando 2 mL/L de enzima MAXILACT L-2000 y llevando a estufa por 90 min a 42°C con agitación constante. c) A continuación, se agregan y disuelven los demás componentes propios del medio. d) El medio es esterilizado en equipo autoclave a 121 5°C por 15 minutos.

3) Preparación del inoculo madre para generación de biomasa de las cepas seleccionadas: a) Los tubos con la cepa activada, obtenidos en el punto 1 , se centrifugan a 5000 rpm por 10 minutos. b) Se elimina el sobrenadante y el pellet obtenido es resuspendido en 300 pL de suero fisiológico. c) De esta suspensión se toman aproximadamente 75 pL y se traspasan a un tubo con 4 mL de suero fisiológico estéril. d) A continuación se mide la densidad óptica a 625 nm, ajustando según corresponda, hasta obtener una absorbancia (A) entre 0,5 - 0,6.

4) Generación de biomasa de las cepas seleccionadas: a) El medio esterilizado, descrito en punto 2, es inoculado con 350 pL de inoculo (A: 0,5- 0,6) por cada 200 mL de medio de cultivo. b) Ya inoculado, el medio es incubado a 30°C con agitación contante por 15 horas.

Tras 15 horas de cultivo según (b), las cepas USS9F y USS31 F alcanzan una viabilidad del orden de 1 E09 [UFC/ml]

Obtención del preparado en polvo por microencapsulación mediante liofilización i) Trascurrido el tiempo de crecimiento, punto 4 anterior, se realiza una concentración de las bacterias, por ejemplo, mediante la centrifugación del medio. ii) El pellet obtenido en (i), es resuspendido en agua destilada estéril, llevando el contenido separado de 1 L de cultivo a 150 mL. iii) Se agrega 15% p/v de crioprotector, por ejemplo, de leche descremada. iv) El medio concentrado con crioprotector es distribuido en balones de vidrio con cuello esmerilado y congelado. v) Ya congelado, se procede a la liofilización, donde se separa el agua mediante la sublimación del hielo a presión reducida, siendo el tiempo de secado entre 48 y 72 horas. vi) El rendimiento en liofilización para ambas cepas es del 100%, obteniendo una viabilidad del orden de 1 E10 [UFC/ml]

Ejemplo 2: Antibiosis cepas ácido lácticas con P. infestans

Los enfrentamientos múltiples se hicieron en diferentes medios para ver la compatibilidad de crecimiento de ambos microorganismos en diferentes medios (APD, LAPTg, MRS, ACM). Dado que P. infestans, sólo tuvo un buen crecimiento sobre medio ACM, los cultivos múltiples se hicieron en dicho medio ya que las cepas bacterianas pudieron desarrollarse en él sin inconvenientes. Todos los experimentos de enfrentamiento se realizaron a 20°C, en triplicado y el experimento fue replicado.

Los resultados experimentales mostraron un claro efecto antagónico de cuatro cepas ácido lácticas sobre el crecimiento micelial de P. infestans, después de 15 días de co-cultivo. Estas correspondieron a las cepas rotuladas con 7, 8 y 9, correspondientes a las cepas USS7F, USS8F y USS9F, mientras la cepa rotulada 31 (cepa USS31 F), presentó inhibición sobre el crecimiento del micelio del pseudo-hongo (Figura 3).

Ejemplo 3: Rol bioestimulante de la formulación

Se investigó el rol estimulante del crecimiento de los tratamientos USS9F, USS31 F y mezcla de ellos, respecto al control; se realizaron ensayos de germinación y posterior establecimiento y crecimiento de plantas de ají y maíz. Para la realización de este experimentos se utilizaron placas Petri estériles con papel absorbente empapado de los formulados con las cepas de la presente invención. En cada placa se dispusieron 3 semillas para maíz y 4 semillas para ají, cada una en cuadriplicado. Diariamente fueron monitoreadas y mantenidas con suficiente formulado para lograr la inhibición de las semillas y así lograr la salida de la dormancia. Una vez registrada la emergencia radicular se midió diariamente su crecimiento.

Respecto al ensayo de germinación del maíz, las semillas no tratadas (control) tardan en promedio 2 días más en germinar que las tratadas con los formulados con las cepas de la presente invención. La tendencia muestra que el formulado basado en la cepa USS9F mejora el tiempo de emergencia y también se logra que todas las semillas germinen (Figura 4).

Respecto a la germinación de semillas de ají, se pudo observar que la dormancia es más sostenida que en el maíz, el día 5 de la observación inician las primeras emergencias radiculares (Figura 5). Las semillas tratadas con los formulados con cepas de la presente invención germinan más rápido y en mayor cantidad que las semillas control (agua), al igual que en maíz, se observó que el formulado USS9F tiene mejores características de bioestimulante del crecimiento (Figuras 4 y 5).

Ejemplo 4: Ensayo de desafío con P. infestans en condiciones controladas.

El ensayo fue iniciado el 15 de julio de 2019, para ello se utilizaron papa semilla certificada por el INIA tipo Pukara, las que se sembraron en macetas de 10 L con sustrato Turba/Perlita con conductividad eléctrica de 1 ,2 y pH 6,2. Las condiciones de temperatura y humedad fueron controladas y registradas entre 10-20°C y 70% HFL Se utilizaron 4 tratamientos que incluyen formulados desarrollados a partir de las cepas USS9F, USS7F y USS31 F aisladas y desarrolladas en este proyecto, más el control (agua) con 2 modos de aplicación: directamente a semilla previo a la siembra y por aspersión al follaje. Se emplearon 5 macetas por cada grupo experimental. Una vez que la planta emergió, se realizaron aplicaciones por aspersión desde el 10 de septiembre utilizando 1 g de formulado por litro de agua con periodicidad de 20 días.

El 8 de octubre se realizó la primera inoculación de P. infestans a una concentración de 10⁵- 10⁶/mL esporangios, los cuales fueron calibrados con cámara Neubauer, donde la suspensión se aplicó en la tercera hoja desde el ápice de la planta. Luego de la inoculación, las plantas fueron aisladas en bolsa plástica para permitir un aumento en la humedad que permitiera la infección. Esta inoculación se repitió el 15 de octubre. Al finalizar el experimento se registraron las alturas de las plantas. Para corroborar la presencia del agente etiológico en las plantas infestadas, se recolectaron muestras de hojas, tallo y tubérculos con daño ocasionado supuestamente por Phythophthora en bolsas plásticas. Estas muestras se mantuvieron refrigeradas (4°C) hasta su procesamiento, el cual consistió en extraer segmentos segmentos de las zonas de avance de daño en hojas y tallos, sin desinfectar, los cuales fueron dispuestos en placas Petri plásticas de 90 mm. Los segmentos fueron cubiertos con una rodaja de papa sana (Solanum tuberosum) posteriormente se tapó la placa rotulando la muestra y se procedió a incubar a 20°C por 5 días o hasta que se observó crecimiento indicativo de P. infestans.

Los resultados de este experimento de desafío mostraron un efecto positivo de la aplicación de las cepas lácticas, se observó diferencias significativas en cuanto a la altura promedio de plantas tratadas con las formulaciones basadas en las cepas USS9F, USS31 F y USS7F en relación a las plantas tratadas con agua (tratamiento control) (Figura 6).

Respecto a la tasa de infestación de tizón, el hongo fitopatógeno afectó de mayor manera a las plantas control respecto de las plantas tratadas con los formulados, observándose que la mayor protección se logró con la aplicación de la cepa USS9F (Figuras 7 y 8).

Ejemplo 5: Ensayo de evaluación de infestación por P. infestans y rendimiento en condiciones controladas

El experimento contó con siete tratamientos, incluyendo los formulados desarrollados a partir de las cepas USS9F y USS31 F, una Pseudomonas protegens cepa Ca6 y aplicaciones del fungicida Carbendazima (8% p/p) y Mancozeb (64% p/p) [Anagran Plus DP, ANASAC Chile S.A.], en dosis de 2 kg ton^-1 de tubérculo semilla, además de propamocarb (Infinito®, Bayer S.A.) para el control de P. infestans en dosis comercial de 1 ,6 L ha^-1, siendo aplicados al follaje en tres ocasiones en ambos experimentos. Estos tratamientos fueron distribuidos en un diseño de bloques completos al azar con cuatro repeticiones. Estos experimentos fueron establecidos el 24 de septiembre de 2019 con papa cv. Pukara-INIA. La siembra se realizó plantando los tubérculos de forma manual con un marco de plantación a 0,75 y 1 m entre hilera y 0,24 m sobre hilera, y con una profundidad de 0,30 m, considerando un total de 25 papas por hilera y cuatro hileras por parcela. La aplicación de los tratamientos bacterianos a los tubérculos semillas se hicieron aplicando el surco de plantación con una bomba de espalda aplicándose en línea recta por el surco sobre los tubérculos semilla y suelo utilizando una boquilla anti deriva de baja presión. En el caso del fungicida el tratamiento de semilla se realizó colocando los tubérculos semillas en un saco plástico que se sacudió hasta observar el cubrimiento de todos los tubérculos por los tratamientos. Las aplicaciones al follaje de los tratamientos se realizaron el 21 de noviembre, 13 y 16 de diciembre de 2019. Se evaluó de forma visual el porcentaje del área afectada con síntomas de atizonamiento en dos ocasiones, y con estas evaluaciones se integraron para determinar el área de la curva de progreso de la enfermedad (AUDPC) para cada repetición y tratamiento. La cosecha del experimento fue el 10 de marzo de 2020. La cosecha se realizó en las dos hileras centrales de cada parcela experimental y se determinó el rendimiento en una superficie de 9 y 10 m². Previo a la cosecha, el día 07 de febrero, se realizó la aplicación de un herbicida desecante dicloruro de paraquat (Paraquat 276 SL[AGROSPEC S.A,] en dosis de 2,5 L ha ¹), para favorecer el curado de los tubérculos y reducir la cantidad de follaje para facilitar la cosecha. Los datos porcentuales obtenidos fueron transformados mediante la transformación de Bliss (Raíz cuadrada del valor más 0,05) y los datos de AUDPC y rendimiento fueron sometidos a un análisis de varianza (Andeva) y una prueba de separación de medias de diferencias mínimas significativas (LSD de Fischer), con un 90 o 95% de confianza dependiendo del coeficiente de variación observado en el Andeva.

Los resultados mostraron que no hubo mayores diferencias entre los tratamientos en las dos primeras evaluaciones realizadas el 16 y 31 de diciembre (P>0,10). Estas dos evaluaciones se hicieron una el mismo día en que las plantas fueron inoculadas con P. infestans, la primera, y 15 días después de dicha inoculación, la segunda, alcanzado el experimento niveles de infección o atizonamiento del follaje promedio de 6,5% al inicio y 24,9% en la segunda evaluación. Sin embargo, en la tercera evaluación realizada el 14 de enero de 2020, permitió observar diferencias significativas entre los tratamientos (P = 0,04: C.V.: 8,97; Figura 9). En esta evaluación la cepa USS9F redujo la infección en un 35,1%, y fue diferente del control tratado con agua y del control tratado con fungicidas, el cual no fue diferente del testigo, y que se diferenció de este control en sólo un 5,5% menos de infección: Las otras bacterias alcanzaron niveles de reducción del atizonamiento con respeto al testigo en esta tercera evaluación del 7,4% para 31 USS, 25,9% para la mezcla de las cepas 9 y 31 , un 16,6% para Ca6 y un 20,3% al usar todas las cepas bacterianas en conjunto. En cuanto a la evaluación de rendimiento, no se observaron diferencias entre tratamientos al considerar los gramos cosechados en 10 m² de parcela (P= 0,339; C.V.: 26.3; Figura 10), alcanzando el experimento en esta superficie un rendimiento promedio de 16,8 kg. No obstante lo anterior, la cepa USS31 F logró en promedio un 21 ,7% más de rendimiento que el control, lo cual implicaría en una hectárea 3,6 ton ha-1 adicionales, lo cual puede ser valorizado en un ingreso adicional de 720 mil pesos por ha para un productor al utilizarlo. Del mismo modo, todos los tratamientos que tuvieron la bacteria USS31 F sobrepasaron el rendimiento del control y al mezclarla con otras bacterias lograron 1 ,13 y 2,9 ton ha-1 .

En este experimento se efectuaron recuentos microbiológicos en hojas (Figura 11 ). Se puede observar que existe presencia de bacterias ácido lácticas tanto en el grupo control como en las plantas tratadas con las cepas USS9F y USS31 F, los mayores recuentos se observaron al aplicar la cepa USS9F, donde se observó recuentos algo mayores Log 2.5 UFC/g. En muestras de papas de este ensayo, se observó una predominancia de bacterias ácido lácticas en plantas tratadas con la formulación en base a la cepa USS31 F, alcanzando casi los 2 ciclos logarítmicos por gramo de muestra, mientras el grupo control mostró recuentos menores.

EJEMPLO 6: Ensayo de evaluación de infestación por P. infestans y rendimiento en condiciones de campo

El ensayo fue establecido el 16 de octubre de 2019, con papa Patagonia-INIA. La siembra se realizó plantando en parcelas de 18 m² (6 m x 3 m), colocando los tubérculos de forma manual con un marco de plantación a 0,75 y 1 m entre hilera y 0,24 m sobre hilera, y con una profundidad de 0,30 m, considerando un total de 25 papas por hilera y cuatro hileras por parcela. La aplicación de los tratamientos bacterianos a los tubérculos semillas se hicieron aplicando el surco de plantación con una bomba de espalda aplicándose en línea recta por el surco sobre los tubérculos semilla y suelo utilizando una boquilla anti deriva de baja presión. En el caso del fungicida el tratamiento de semilla se realizó colocando los tubérculos semillas en un saco plástico que se sacudió hasta observar el cubrimiento de todos los tubérculos por los tratamientos. Las aplicaciones al follaje de los tratamientos se realizaron el 05 y 17 de diciembre de 2019 y el 28 de enero de 2020. Las aplicaciones se hicieron con una motopulverizadora STIHL SR 450, con boquillas ULV (Ultra bajo volumen) y un mojamiento de 400 L ha^-1.

En ambos experimentos se evaluó de forma visual el porcentaje del área afectada con síntomas de atizonamiento en dos ocasiones, y con estas evaluaciones se integraron para determinar el área de la curva de progreso de la enfermedad (AUDPC) para cada repetición y tratamiento. La cosecha del experimento se realizó de forma manual el 04 de marzo de 2020. La cosecha se realizó en las dos hileras centrales de cada parcela experimental y se determinó el rendimiento en una superficie de 9 y 10 m². Previo a la cosecha, el día 20 de febrero de 2020, se realizó la aplicación de un herbicida desecante dicloruro de paraquat (Paraquat 276 SL[AGROSPEC S.A,] en dosis de 2,5 L ha^-1), para favorecer el curado de los tubérculos y reducir la cantidad de follaje para facilitar la cosecha. Los datos porcentuales obtenidos fueron transformados mediante la transformación de Bliss (Raíz cuadrada del valor más 0,05) y los datos de AUDPC y rendimiento fueron sometidos a un análisis de varianza (andeva) y una prueba de separación de medias de diferencias mínimas significativas (LSD de Fischer), con un 90 o 95% de confianza dependiendo del coeficiente de variación observado en el andeva.

Los resultados del experimento en lo referente al atizonamiento mostraron que en la primera evaluación hubo diferencias significativas entre tratamientos (P <0,05), observándose que la mezcla de las cepas USS9F y USS31 F fueron significativamente diferentes del control en el daño causado por tizones y similares a los obtenidos por el tratado con el fungicida propamocarb (Figura 12), alcanzando esta mezcla una reducción del atizonamiento con respecto al control sólo tratado con agua del 62,2 % (Figura 13). La cepa USS31 F, logró una reducción promedio de la infección por tizón del 42,3% con respecto al control a pesar de no mostrar diferencias significativas con este tratamiento ni con el tratamiento tratado con fungicida.

En lo referido a la evaluación de rendimiento, en cuanto al peso obtenido en los 9 m², se observó que no hubo diferencias significativas entre tratamientos, teniendo un rendimiento promedio el experimento de 23,7 kg por parcela (P = 0,232; C.V.: 12,7). No obstante lo anterior, el control presentó el menor rendimiento promedio por parcela, mientras los tratados con bacterias y fungicida presentaron una tendencia a tener un mayor rendimiento. Interesante es notar que el tratamientos que presentó el menor nivel de infección por tizón tardío, asociado la mezcla de las cepas USS9F y USS31 F, alcanzaron el mayor rendimiento promedio, siendo un 34,1% mayor al control (Figura 14).

EJEMPLO 7: Mejoramiento de rendimiento en cosechas

Al comparar los predios en base de peso total de papas producidas con los tratamientos aplicados, se puede observar claramente la menor producción de biomasa de tubérculos de las plantas control, evidenciando el posible rol de estimulante de crecimiento de los tratamientos con los formulados con las cepas de la presente invención (Figura 15). Por otra parte, la misma tendencia se muestra en el número de papas producido por tratamiento, donde cada predio muestra un aumento de la producción de tubérculos en plantas tratadas con los formulados (Figura 16). EJEMPLO 8: Efecto bioestimulante en el crecimiento de las plantas

Para la realización de estas evaluaciones, los germinados obtenidos de acuerdo al Ejemplo 3 fueron sembrados en macetas de 2 L para ajíes y 10 L para maíz con sustrato turba/vermiculita y regados según requerimiento. En cada tratamiento se utilizaron 5 réplicas. Las aplicaciones de los tratamientos se realizaron por aspersión cada 15 días.

La altura promedio de las plantas de ají a los 10 días de germinados es mayor en las plantas con tratamiento que el control, mientras el tratamiento USS9F es que a los 30 días dobla la altura que las plantas control (Figura 17).

En el caso de las plantas de maíz se puede observar que en los primeros días de establecimiento de las plántulas las tratadas son mas altas que el control. Esta característica se marca aún más en los 25 días desde la germinación ya que las plantas con el tratamiento USS9F dobla en promedio la altura de las plantas control. Si bien estas diferencias tienden a desaparecer desde los 80 días, el aplicar formulados con las cepas de la presente invención generaría una ventaja en la sobrevivencia en el campo (Figura 18).

Respecto al experimento en campo, este se realizó en base a bloques con 10 plantas por tratamiento/hilera con 4 réplicas. Los tratamientos se aplicaron cada 20 días. Si bien las diferencias no son significativas en crecimiento en altura hay una pequeña tendencia en a que los tratamientos USS9F y USS31 sean mas altas que las no tratadas. Esto es consistente con la tendencia de los resultados en las plantas evaluadas en el laboratorio.

EJEMPLO 9: Efecto bioestimulante en el tamaño de las mazorcas

Para esta evaluación se midieron las mazorcas del tratamiento del Ejemplo 8 como un proxi de producción de las plantas tratadas.

En la Figura 19 se observa que los tratamientos USS9F y USS31 F presentan diferencias en la longitud de la mazorca de las plantas en el predio donde también se observaron plantas con 2 mazorcas por planta solo en aquellas tratadas con USS31 F.

El mismo patrón se repite en el experimento de maceta (Figura 20) donde el tratamiento USS31 F destaca por generar en promedio mazorcas 6cm mas grandes que las de plantas control. El numero de mazorcas generadas es consistente con lo evaluado en campo, donde solo el tratamiento USS31 F presenta plantas con 2 mazorcas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición probiótica con efecto biocontrolador y bioestimulante para aplicación agrícola, CARACTERIZADA porque comprende dos cepas de bacterias Weisella confusa correspondientes a la cepa Weisella confusa depósito DSM33454 y la cepa Weisella confusa depósito DSM33455.

2. Una composición de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADA porque comprende al menos 1E10 [UFC/ml] de cada una de las cepas de Weisella confusa.

3. Una composición de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, CARACTERIZADA porque las cepas de Weisella confusa son cultivadas en medio de cultivo estéril a base de lactosuero hidrolizado, que contiene peptona de caseína o por peptona de pescado como fuente de nitrógeno.

4. Una formulación para uso agrícola, CARACTERIZADA porque comprende la composición de acuerdo a la reivindicación 1 donde las bacterias han sido liofilizadas.

5. Una formulación para uso agrícola de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADA porque además comprende crioprotectores o coformulantes.

6. Una formulación para uso agrícola de acuerdo a la reivindicación 5, CARACTERIZADA porque la concentración de crioprotectores adicionados es de 15% p/v.

7. Una formulación para uso agrícola de acuerdo a la reivindicación 5 o 6, CARACTERIZADA porque los crioprotectores se seleccionan de entre leche descremada, lactosuero y peptona de pescado.

8. Método para elaborar una formulación para uso agrícola de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, CARACTERIZADA porque comprende las etapas de: a) concentrar de las bacterias cultivadas, recolectando el pellet de bacterias; b) resuspender el pellet en agua destilada; c) adicionar el agente crioprotector, en una concentración de sólidos al 15% p/v; d) congelar la mezcla de pellet resuspendido y crioprotector; y e) liofilizar durante 48 a 72 horas.

9. Uso de la composición de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque sirve para elaborar formulaciones probióticas bioestimulantes y biocontroladoras para el manejo de fitopatógenos en cultivos agrícolas.

10. Uso de acuerdo a la reivindicación 9, CARACTERIZADO porque la formulación sirve para el tratamiento de P. infestans o tizón tardío u otros hongos asociados a cultivos agrícolas.

11. Uso de acuerdo a la reivindicación 9, CARACTERIZADO porque la formulación sirve como bioestimulante para promover la germinación de las semillas, el crecimiento de las plantas y el tamaño de los frutos en cultivos agrícolas.

12. Uso de acuerdo a las reivindicaciones 9 a 11, CARACTERIZADO porque el cultivo agrícola corresponde a papas, tomate, pimentón, berenjena, maíz, ají, haba, o arveja.

13. Uso de la composición de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque sirve para elaborar formulaciones para aplicación directa en semillas.

14. Uso de la composición de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADA porque sirve para elaborar formulaciones para aspersión directa sobre cultivo y/o suelos.