JP5586122B2 - グリホサート耐性テンサイ - Google Patents
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Description
a)テンサイ植物が、NCIMB、Aberdeen(Schottland, V.K.)で寄託されたものであって、かつ、受託番号(accession number)NCIMB41158またはNCIMB41159を有する種子から得られ、および/または
b)630〜700bp、好ましくは664bpのDNAフラグメントが、テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムDNAから、配列番号1のヌクレオチド配列を有する第1プライマーと配列番号2のヌクレオチド配列を有する第2プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができ、および/または
c)3500〜3900bp、好ましくは3706bpのDNAフラグメントが、テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムDNAから、配列番号3のヌクレオチド配列を有する第1プライマーと配列番号4のヌクレオチド配列を有する第2プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができ、および/または
d)270〜300bp、好ましくは288bpのDNAフラグメントが、テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムDNAから、配列番号7のヌクレオチド配列を有する第1プライマーと配列番号8のヌクレオチド配列を有する第2プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができ、および/または
e)710〜790bp、好ましくは751bpのDNAフラグメントが、テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムDNAから、配列番号9のヌクレオチド配列を有する第1プライマーと配列番号10のヌクレオチド配列を有する第2プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができ、および/または
f)990〜1100bp、好ましくは1042bpのDNAフラグメントが、テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムDNAから、配列番号14のヌクレオチド配列を有する第1プライマーと配列番号16のヌクレオチド配列を有する第2プライマーとを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができることを特徴とする。
a)テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムDNAから、配列番号1のヌクレオチド配列を有する第1プライマーと配列番号2のヌクレオチド配列を有する第2プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって、630〜700bp、好ましくは664bpのDNAフラグメントを増幅し、および/または
b)テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムDNAから、配列番号3のヌクレオチド配列を有する第1プライマーと配列番号4のヌクレオチド配列を有する第2プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって、3500〜3900bp、好ましくは3706bpのDNAフラグメントを増幅し、および/または
c)テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムDNAから、配列番号7のヌクレオチド配列を有する第1プライマーと配列番号8のヌクレオチド配列を有する第2プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって、270〜300bp、好ましくは288bpのDNAフラグメントを増幅し、および/または
d)テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムDNAから、配列番号9のヌクレオチド配列を有する第1プライマーと配列番号10のヌクレオチド配列を有する第2プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって、710〜790bp、好ましくは751bpのDNAフラグメントを増幅し、および/または
e)テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムDNAから、配列番号14のヌクレオチド配列を有する第1プライマーと配列番号16のヌクレオチド配列を有する第2プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって、990〜1100bp、好ましくは1042bpのDNAフラグメントを増幅する、
を含む方法によって特徴付けられる。
図1 バイナリーベクターPV−BVGT08を示すマップ。
図2 PCR分析によるH7−1の同定を示す図。18個の植物からのDNA−試料を分析した。ネガティブコントロール=形質転換していないテンサイからのDNA、ポジティブコントロール=H7−1形質転換体からのDNA。
図3 マルチプレックスPCRによるEventH7−1の同定および遺伝子導入されたEventH7−1と非形質転換植物との差異を示す図。54個の植物からのDNA試料を分析した。
図4 制限酵素HindIII、XbaI、ClaI、PstIおよびBamHIの制限酵素部位を有するpFMV−ctp2−CP4−EPSPS−E9−3’−インサートを示す図。
図5 EventH7−1のインサート/コピー数分析を示す図。サザンブロッティングのために、H7−1ゲノムDNA10μgを、PstI、HindIII、XbaI、ClaIおよびBamHIで消化した(レーン3〜7)。ネガティブコントロールとしての形質転換されていないゲノムDNAをBamHIで消化した(レーン8)。ポジティブコントロールとしてのプラスミドPV−BVGT08をBamHIで消化した。レーン2および9はサイズマーカーである。ブロットは、32P−標識CP4−EPSPSのコーディング配列でプローブした。このプローブは、477〜1555bpを含むCP4−EPSPS−遺伝子の内在配列である。
図6 完全なctp2−CP4−EPSPSのコーディング領域を評価するためのH7−1のサザンブロッティング分析を示す図。10μgのH7−1ゲノムDNA、形質転換されていないコントロールDNAおよび形質転換されていないコントロールDNAとPV−BVGT08との混合物を、XbaIおよびHindIII/BamIIIで消化した。ブロットは、32P−標識CP4−EPSPS−PCR−フラグメントをプローブした。
図7 完全なプロモーター領域を評価するためのEventH7−1のサザンブロッティング分析を示す図。10μgのH7−1ゲノムDNA、形質転換されていないコントロールDNAおよび形質転換されていないコントロールDNAとPV−BVGT08との混合物を、HindIII、XbaIおよび/またはSacI/XhoIで消化した。ブロットは、32P−標識プロモーター−フラグメント(HindIII)(=PV−BVGT08−配列、bp7972−8583)または完全なプロモーター−ctp2−CP4−EPSPS−E9−3’−カセット(PmeI/XhoI)(=PV−BVGT08−配列、bp7985−2389)をプローブした。
図8 完全なポリアデニル化(ポリ−A)領域を評価するためのEventH7−1のサザンブロッティング分析を示す図。10μgのH7−1ゲノムDNA、形質転換されていないコントロールDNAおよび形質転換されていないコントロールDNAとPV−BVGT08との混合物を、EcoRI/PstI、XbaI、HindIIIおよびPstIで消化した。ブロットは、32P−標識E9−3’ポリ−A−フラグメント(BamHI/XhoI)(=PV−BVGT08−配列、Bp1702−2389)でプローブした。
図9 EventH7−1中の「骨格」−ベクターDNAを含まないことについて評価するための、プローブとして使用したフラグメントを示す図。
図10 EventH7−1中の「骨格」−ベクターDNAを含まないことについて評価するためのサザンブロット分析を示す図。10μgのH7−1ゲノムDNA、形質転換されていないコントロールDNAおよび形質転換されていないコントロールDNAとPV−BVGT08との混合物を、XbaIで消化した。ブロットは、PV−BVGT08の完全な「骨格」を含む32P−標識フラグメントでプローブした。
図11 PCR−配列とPV−BVGT08−配列との左ボーダー領域(LB)上での比較を示す図。
図12 PCR−配列とPV−BVGT08−配列との右ボーダー領域(RB)上での比較を示す図。
図13 インサートの右結合部位外側のゲノムDNA分析を示す図。それぞれ約50ngの、EventH7−1ゲノムDNA、形質転換されていないコントロールDNAまたは水をPCR−反応のために使用し、その際、2個のプライマーがインサートの外側に存在するプライマーの組合せP1、および一方のプライマーがインサートの内側に存在し、かつもう一方のプライマーがインサートの外側に存在するプライマーの組合せP3を使用した。
図14 インサートの左結合部位の外側のゲノムDNAの分析を示す図。約50ngのH7−1ゲノムDNA、形質転換されていないコントロールDNAおよび水をPCR反応のために使用し、その際、2個のプライマーがインサートの外側に存在するプライマーの組合せP2、および一方のプライマーがインサートの内側に存在し、かつもう一方のプライマーがインサートの外側に存在するプライマーの組合せP4のプライマーを使用した。
図15 H7−1播種培養のための系統図。
図16 ゲノム中に挿入されたDNAが安定に組み込まれているかについて検出するための、Event H7−1のサザンブロット分析を示す図。H7−1のゲノムDNA 10μg(起源となるH7−1−1995形質転換体および3個の後代、H7−1−1996〜1998)および種々の由来からの形質転換されていないコントロールDNAsを、BamHI、XbaIおよびHindIIIで消化した。プロットを、PV−BVGT08(=447〜1555bp)の32P−標識CP4−EPSPS−プローブを用いておこなった。
〜 約
℃ 摂氏度
bindest 2回に亘って蒸留された滅菌水
bp 塩基対
CTAB セチルトリメチルアンモニウムブロミド
DNA デオキシリボ核酸
E.Coli 大腸菌
EDTA エチレンジアミンテトラ酢酸
Fig. 図
h 時間
HCl 塩酸
kb キロ塩基対
Kg キログラム
M、mM モル、ミリモル
min 分
Na2HPO4/NaH2PO4 リン酸ナトリウム
NaCl 塩化ナトリウム
NaOH 水酸化ナトリウム
nt ヌクレオチド
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
pmol ピコモル
RNase リボ核酸−ヌクレアーゼ
RPM 回転数/分
RR Roundup Ready(R)
RT 室温
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
sek 秒
SEVAG クロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)
SSC クエン酸塩標準液
TE トリス−EDTA−緩衝液
TRIS トリス(ヒドロキシメチル)−アミノメタン。
遺伝子型3S0057のテンサイ(Beta vulgaris)は遺伝的に改変され、CP4−5−エノル−ピルビル−シキメート−3−ホスフェート−シンターゼまたはCP4−EPSPSを発現し、これは、除草剤グリホサートに対する耐性を付与するものであって、さらに選択マーカーとしても使用されるものである。これらの形質転換系は、アグロバクテリウム−ツメファシエンス(Agrobacterium-tumefaciens)介在形質転換技術によって、バイナリーベクター PV−BVGT08を用いて製造した。テンサイ−形質転換に使用されたベクターのT−DNAは、以下の配列を左右ボーダー領域間に含む:CP4−EPSPSコーディング配列と結合するシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)EPSPSからの配列からの葉緑体−移行ペプチドコード配列から構成されるコーディング配列、およびゴマノハグサ−モザイクウイルス(Figwort mosaic virus)−プロモーター(pFMV)およびエンドウ(Pisum sativum)からのE9−p3’−転写終結配列。
I.DNA−抽出:
方法1:
新鮮な葉の組織または他の組織を捕集し(1.5ml容器中20〜100mg)、かつ400μl抽出バッファー(以下に示す)を添加した。この組織を、小さい乳鉢を用いて粉砕した。混合物を5秒間に亘ってボルテックスし、かつ室温で30〜60分に亘ってインキュベートした。その後に13000RPMで、1分間に亘って遠心分離をおこなった。DNAを含有する上清を、別の1.5ml反応容器中に注ぎ入れ、かつ320μlのイソプロパノールと一緒に混合した。混合物を、室温で2分間に亘ってインキュベートした。DNA−沈殿物がエタノールの添加によって形成された。13000RPMで、5分に亘っての遠心分離の後に、エタノールをデカントした。試料を空気乾燥させた。沈殿物を400μlのH2OまたはTE−バッファー(以下に示す)中で再懸濁させた。
抽出バッファー(100ml):
20ml 1M トリス(pH7.5)
5ml 5M NaCl
5ml 0.5M EDTA
2.5ml 20%SDS
67.5ml H2O
TE−バッファー:
10mMトリス−HCl(pH8.0)
1mM EDTA
方法2:
新鮮な植物材料(20〜100mg)を、1.5ml−エッペンドルフ容器中に捕集し、かつ500μlのCTAB−バッファー(65℃)(以下に示す)を添加した。混合物を1〜1.5時間に亘って、65℃でインキュベートし、その後に5秒間に亘って遠心分離した。200μlのSEVAGを添加した。混合および13000RPMで10分に亘っての遠心分離の後に、上清を別の1.5ml容器に移した。イソプロパノール1回量(約400μl)を慎重に上清と混合した。その後に、13000RPMで10分に亘っての遠心分離をおこなった。70%エタノール 600μlを添加した。沈殿物を、反応容器を複数回反転させることによって洗浄した。再度、混合物を13000RPMで、2分間に亘って洗浄した。エタノールを慎重に取り除いた。反応容器を反転させ、かつ清浄な紙上で水切りをおこなった。試料を15分に亘って空気乾燥させた。沈殿物を50μlのH2O(以下に示す)中で再懸濁した。
CTAB−バッファー:
1.4M NaCl
20mM EDTA
100mM トリス−HCl
2%(w/v)CTAB
SEVAG:
クロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)
RNase−バッファー:
10mMトリス、15mMNaCl、pH7.5
RNaseA:
10mg RNase/ml RNase−バッファー
(5ml bidest+50mg RNaseA、アリコートを1.5ml容器中に入れ、この容器を100℃で30分に亘って加熱し、−20℃で保存した)
通常は方法1を使用した。これらの方法を用いて、一日当たり、多くの数のDNA試料を抽出することが可能になり、かつDNAの質は許容可能なものであった。方法2は、葉の材料が古い場合か、あるいは、試料のDNAの質に問題がある場合に使用される。方法2は複雑であって、長時間に亘って実施され、かつ少ないDNA収量であるが、高い品質を得ることができるものである。
PCR−反応のために、バッファー+dNTPsの10xバッファー混合物を製造した。方法は以下の通りである:
DNA 0.5μl
プライマー1 1μl(20pmol)
プライマー2 1μl(20pmol)
Taq−ポリメラーゼ1 0.2μl(1U、Oncor Appligene S. A., heidelberg, Deutschland)
バッファー10x濃縮液 2.5μl
水 18.8μl
III.PCRによるH7−1の同定
H7−1の同定は、PCRによりEvent特異的プライマーを用いておこなった:
PCR条件:
94℃、4分 工程1
95℃、30秒 工程2a
55℃、30秒 工程2b
72℃、2分 工程2c
72℃、5分 工程3
4℃、一晩 工程4
反応完了
工程2a〜cについては、34回に亘って繰り返した。
形質転換植物と非形質転換植物とを識別するために、ホモ接合体であるか、あるいはヘミ/ヘテロ接合体であるかを、3個の異なるプライマーを用いてマルチプレックスPCRで試験した。以下のプライマーを使用した。
94℃、2分 工程1
94℃、1秒 工程2a
60℃、45秒 工程2b
72℃、90秒 工程2c
72℃、5分 工程3
4℃、一晩 工程4
反応完了
工程2a〜cについては、34回に亘って繰り返した。
H7−1中に存在する組込まれたDNAを特徴付けするために、分子学的分析をおこなった。特に、インサートの数(テンサイゲノム内部の組込み箇所の数)、コピー数(1箇所でのDNAフラグメントの数)、挿入されたコーディング領域およびこれらの調節要素の完全性、pFMV−プロモーターおよびE9−3’−転写終結配列、形質転換に使用されたベクターの「骨格」配列不含であることおよびインサートの安定な遺伝性について測定した。さらに、DNA−インサートのフランキング配列を同定した。
EventsH7−1のバッチ番号74903Hからの植物組織(1〜3g湿分重量)を、粉砕器および乳鉢を使用して、液体窒素中で、微細な粉末に粉砕した。この粉末を、50ml−オークリッジチューブに移し、かつ7.5mlの予め温められた(60℃)CTAB−バッファー(2%CTAB、100mMトリス−Hcl、20mMEDTA、pH8.0、1.4M NaClおよび0.2%メルカプトエタノール)を添加した。試料を、約30分に亘って65℃でインキュベートし、かつ断続的に混合した。クロロホルム:イソアミルアルコール(24:1 v/v)からの混合物の同量(8ml)を、RTで、試料に添加した。この懸濁液を逆混合し、かつ2個の相を遠心分離(10分、9000rpm)によって分離した。水相を、別の50mlのオークリッジチューブ中に移し、その後にDNAを5mlのイソプロパノールを添加することによって沈殿させた。DNAを、遠心分離(2分、9000rpm)によって沈殿し、かつ上清を除去した。沈殿したDNAを、76%エタノールおよび10mM酢酸アンモニウムからの洗浄溶液を用いて、約20分に亘ってインキュベートした。遠心分離および上清のデカント後に、DNAを真空乾燥させ、かつTE中にpH8.0で、4℃で一晩に亘って再懸濁した。
DNAの定量化は、LKB BiochromUV/可視光スペクトルフォトメータ(Amersham Pharmacia, Freibung, Deutschland)を使用するか、あるいは、二者択一的に、アガロース−ゲル電気泳動後にプログラムRFLPスキャンプログラム(MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland)を用いておこなった。キャリブレーションスタンダードとして、高DNA質量ラダー(Gibco/Life Technologies (Karlsruhe, Deutschland)(Katalog# 10496-016))を使用した。制限酵素は、Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutchland)、Stratagene (Amsterdam, Niederlande) または New England Biolabs (Frankfurt, Deutschland) のものを使用し、かつ製品マニュアルにしたがって使用した。
PV−BVGT08−DNAは、E.Coli−カルチャーから単離した。CP4−EPSPSのコーディング領域と相同的なプローブテンプレート、35S−プロモーター、E9−3’−ポリ−A−領域、35S−ctp2−CP4−EPSPS−E9−3’−カセットおよび“骨格”−領域を、相当する制限酵素で消化し、その後に、アガロース−ゲル電気泳動による分離またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって製造した。生成物を、BIO 101からのGene Clean II キットを用いて精製した(La Jolla, CA)。プローブ(25pg)の32P−dCTPまたは32P−dATPでのラベリングは、MegaprimTM−DNA−ラベリング系を使用しておこなった(Amerscham-Pharmacia Biotech Europe (Freiburg, Deutschland))。
制限酵素を用いて処理したDNA−プローブは、アガロース−ゲル電気泳動によって、〜15時間に亘って、〜35ボルトで分離した。ゲルの撮影後に、DNAは、0.25M HCl−溶液中に15分に亘ってゲルを浸漬することによって清浄化し、0.5M NaOH、1.5M NaClからの変性溶液中で、30分に亘って穏やかに振とうさせながら変性させ、その後に2時間に亘って、2M NaClおよび1M トリス−HCl、pH5.5から成る種々の容量の溶液中に浸漬することによって中和した。アガロースゲルからのDNAsは、StratageneからのPosiBlot Pressure Blotterを用いて、製品マニュアルにしたがって、Hybond−NTM−ナイロンメンブレン(Amerscham Pharmacia Biotech Eurrope, Freiburg, Duetschland)に転写した。フィルターを15分に亘って、2xSSPE(20xSSPE;3.6M NaCl、20mM EDTA、0.2M NaH2PO4/Na2HPO4、pH7.4)中で浸漬させた後に、DNAを、UV光を用いて(トランスイルミネーター、Pharmacia, Freiburg, Deuschland)、1分に亘って露光し、かつ80℃で1時間に亘って、メンブレンを真空オーブン中でベーキングすることによって固定化した。ブロットは、4時間に亘って、50%ホルムアルデヒド、5xSSC、0.1%ラウリルサルコシン、0.02%SDSおよび2%ブロッキング剤(Boehringer Mannheim, Deutschland, Katalog # 1096176)中でプレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、放射性標識したプローブを用いて、新鮮なハイブリダイゼーション溶液中で、16〜18時間に亘って42℃で実施した。ハイブリダイゼーション後にメンブレンを2xSSC中で42℃で5分に亘って、2xSSC中で1%SDSで65℃で20分に亘って、かつ、0.2SSC、0.1%SDSで68℃で15分間x2回に亘って洗浄した。ブロットからのオートラジオグラフィー画像は、ブロットを、Biomax−MSTM−フィルムを使用して、Kodak Biomax MSTM増感フィルターとの組合せで得られた。
動物−および植物DNAの間の結合箇所は、逆PCR−技術を使用することによって同定した。ゲノムDNAは、前記のようにして精製した。DNA約1μgは、別個の反応中で制限エンドヌクレアーゼTaqI、AluI、NdeIIIまたはRsaIで消化した。消化したDNA−フラグメントを、T4−リガーゼによって一晩に亘って再度ライゲートし、その後にPCR−反応をおこなった。種々の逆プライマーの組合せは、Primer-Analysesoftware OLIGO(R)(NBI National Biosciences, Inc., Plymouth Michigan)を使用することによって達成された。
ゲノムDNAは、DNAeasy Plant Mini kit (Qiagen, Duesseldoef, deutschland)を用いて、製品マニュアルにしたがって製造した。約50ngのゲノムDNAを、PCRに使用した。反応を30秒に亘って95℃で、30秒に亘って55℃で、かつ2分に亘って72℃で、35サイクルに亘っておこなった。PCRは、PTC200−サイクラー(Biozym, Oldendorf, Deutschland)中で実施した。PCR生成物は、アガロースゲル電気泳動によって分析した。
インサートの数は、テンサイゲノム中への導入DNAの組み込み部位の数を、H7−1について測定した。インサートの数を測定するために、ゲノムDNAを、制限酵素HindIII、XbaIおよびBamHIを用いて消化した。形質転換されていないコントロール植物からのDNAはネガティブコントロールとして、この場合、これは、同様の遺伝的背景を有するものであるが、HindIIIを用いて消化した。ポジティブコントロールとして、形質転換ベクターのDNA(PV−BVGT08)を使用した。
理論的には、1個の組み込み部位は、挿入されたDNAの1コピー以上から構成されうる。しかしながら、制限酵素分析のフラグメントの大きさに基づいて、これら不可能である。挿入されたDNAの1コピー以上がH7−1中に存在する場合には、付加的なフラフメントを検出することができる。これらは、さらに制限酵素PstIで消化することによって確認される。PstIは、2回に亘って左右ボーダー配列内部を切断する。制限酵素切断部位の一つは、CP4−EPSPSコーディング領域内部に存在し、したがって消化後に、CP4−EPSPS−プローブ含む2個のハイブリダイゼーションフラグメントが予測された。見込まれるフラグメントの一つは、約1.2kbの内部フラグメントに相当する。第2のフラグメントは、ボーダーフラグメントであってもよい。さらにここでは、1コピー以上存在する場合には、付加的なフラグメントが確認可能であってもよい。しかしながら、結果は、予測したようにPstIがDNAを切断した。この内部フラグメント1.2kbおよび付加的なフラグメント1個のみ4.9kbが検出された(図5、レーン3、図4)。
個々の構成要素(P−FMV−プロモーター、ctp2−CP4−EPSPSのコーディング領域およびE9−3’−非翻訳領域)に対してのCP4−EPSPS−遺伝子カセットの完全性は、P−FMVに関しては酵素HindIIIで、ctp2−CP4−EPSPSに関してはHindIII+BamHIで、およびE9−3’−非翻訳領域に関してはEcoRIおよびPstIを用いて消化することによって測定した。付加的な試験は、SacIおよびXhoIを用いて、P−FMV−ctp2−CP4−EPSPS−領域およびE9−p3’−領域に関して実施した。プラスミド−DNAは、形質転換されていないテンサイ植物−DNAと一緒に混合し、かつ形質転換されていないテンサイ−DNAを単独で、ポジティブまたはネガティブコントロールとして、同様の酵素を用いて消化した。
Ti−プラスミドの「骨格」−領域は、T−DNAの外側領域として、左右のボーダー配列によって定められ、この場合、これらは、細菌増殖および細菌選択のためのori−遺伝子および選択遺伝子から構成され、かつアグロバクテリウム−介在形質転換によって、通常の方法で植物ゲノム中にトランスファーされる。「骨格」−ベクターDNAが、EventH7−1中に存在しないことを確認するために、H7−1からのゲノムDNA、形質転換されていないコントロールからのDNA、およびPV−BVGT08−DNAと混合したH7−1からのゲノムDNAを、制限酵素XbaIで消化し、かつ3個重複PCRで得られたプローブを用いて試験し、この場合、これらは、完全な「骨格」−配列を包含するものである。四分の一のプローブは、1個のフラグメント中で完全な「骨格」を構成するものである。
1:bp2730−5370
2:bp5278−6419
3:bp6302−7851
4:bp2730−7851
図10は、サザンブロット分析の結果を示す。レーン6、10、14および18:完全骨格の骨格フラグメントでプローブされたH7−1ゲノムDNAの消化では、ハイブリダイゼーションバンドを示すことはなかった。レーン4、8、12、16および20のみ;PV−BVGT08−DNAと混合したH7−1ゲノムDNAは、予測したように8.6kbのバンドを示した。バンドは、線状化PV−BVGT08−DNAを示した。
アグロバクテリウム−介在形質転換体は、通常の方法で、植物ゲノム中に左右ボーダー間のすべての配列の組み込みを導くものである。組み込まれたプラスミド−DNAの5’−末端および3’−末端は、それぞれ、左または右ボーダー配列の内部または近くに存在する。したがって逆−PCR−技術を使用し、これらの領域を同定する。クローニングされたPCR産物はシークエンシングされ、かつ配列データをPV−BVGT08−配列と比較する。
P1−組合わせ(右ボーダー領域外側のゲノムDNAを分析するためのプライマー、配列番号18、配列番号19):
組み込まれたDNAの安定化を試験するために、起源となる形質転換体−EventH7−1を、非形質転換テンサイ形との自己受粉により得られた系のその3つの後代(64801H、74922Hおよび83002S;図15参照)と比較した。この起源となる形質転換系および後代は、1995、1996、1997および1998年に製造されたものである。
配列番号5
<223>:3’−および5’−フランキング配列を有する挿入DNA
配列番号6
<223>:PCR産物
配列番号11
<223>:PCR産物
配列番号12
<223>:PCR産物
配列番号13
<223>:PCR産物
配列番号17
<223>:PCR産物
Claims (7)
- グリホサート耐性テンサイ植物において、
a)テンサイ植物が、NCIMBに、受託番号NCIMB41158またはNCIMB41159で寄託された種子から得られるか、および/または
b)630〜700bpのDNAフラグメントを、配列番号1のヌクレオチド配列を示す第1プライマーと、配列番号2のヌクレオチド配列を示す第2プライマーとを用いて、テンサイ植物、その部分または種子のゲノムDNAからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させることができ、その際、前記DNAフラグメントは配列番号13のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を示すか、および/または
c)3500〜3900bpのDNAフラグメントを、配列番号3のヌクレオチド配列を示す第1プライマーと、配列番号4のヌクレオチド配列を示す第2プライマーとを用いて、テンサイ植物、その部分または種子のゲノムDNAからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させることができ、その際、前記DNAフラグメントは配列番号6のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を示すか、および/または
d)270〜300bpのDNAフラグメントを、配列番号7のヌクレオチド配列を示す第1プライマーと、配列番号8のヌクレオチド配列を示す第2プライマーとを用いて、テンサイ植物、その部分または種子のゲノムDNAからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させることができ、その際、前記DNAフラグメントは配列番号11のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を示すか、および/または
e)710〜790bpのDNAフラグメントを、配列番号9のヌクレオチド配列を示す第1プライマーと、配列番号10のヌクレオチド配列を示す第2プライマーとを用いて、テンサイ植物、その部分または種子のゲノムDNAからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させることができ、その際、前記DNAフラグメントは配列番号12のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を示すか、および/または
f)990〜1100bpのDNAフラグメントを、配列番号14のヌクレオチド配列を示す第1プライマーと、配列番号16のヌクレオチド配列を示す第2プライマーとを用いて、テンサイ植物、その一部または種子のゲノムDNAからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させることができ、その際、前記DNAフラグメントは配列番号17のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を示すことにより特徴付けられる、グリホサート耐性テンサイ植物。 - 請求項1に記載の植物の種子。
- 請求項1に記載の植物の細胞、組織または部分。
- 方法が、
a)630〜700bpのDNAフラグメントを、テンサイ植物、その一部または種子のゲノムDNAから、配列番号1のヌクレオチド配列を示す第1プライマーと、配列番号2のヌクレオチド配列を示す第2プライマーとを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、その際、前記DNAフラグメントは配列番号13のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を示すか、および/または
b)3500〜3900bpのDNAフラグメントを、テンサイ植物、その一部または種子のゲノムDNAから、配列番号3のヌクレオチド配列を示す第1プライマーと、配列番号4のヌクレオチド配列を示す第2プライマーとを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、その際、前記DNAフラグメントは配列番号6のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を示すか、および/または
c)270〜300bpのDNAフラグメントを、テンサイ植物、その一部または種子のゲノムDNAから、配列番号7のヌクレオチド配列を示す第1プライマーと、配列番号8のヌクレオチド配列を示す第2プライマーとを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、その際、前記DNAフラグメントは配列番号11のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を示すか、および/または
d)710〜790bpのDNAフラグメントを、テンサイ植物、その一部または種子のゲノムDNAから、配列番号9のヌクレオチド配列を示す第1プライマーと、配列番号10のヌクレオチド配列を示す第2プライマーとを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、その際、前記DNAフラグメントは配列番号12のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を示すか、および/または
e)990〜1100bpのDNAフラグメントを、テンサイ植物、その一部または種子のゲノムDNAから、配列番号14のヌクレオチド配列を示す第1プライマーと、配列番号16のヌクレオチド配列を示す第2プライマーとを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、その際、前記DNAフラグメントは配列番号17のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を示すことを特徴とする、1個または複数個の工程を含む、グリホサート耐性テンサイ植物を同定するための方法。 - 形質転換されたグリホサート耐性テンサイ植物、その細胞、組織または一部を同定するための試験キットにおいて、この試験キットが、ポリメラーゼ連鎖反応のための第1プライマーおよび第2プライマーを有する少なくとも1個のプライマー対を含み、その際、第1プライマーは、前記植物ゲノム中に組み込まれた外来DNA中の配列を認識するものであって、かつ第2プライマーは、前記DNAの3’−または5’−フランキング領域中の配列を認識するものであり、その際、植物は、請求項1に記載の植物であることを特徴とする、試験キット。
- ポリメラーゼ連鎖反応のための第1プライマーおよび第2プライマーを含む少なくとも1個のプライマー対を含み、その際、第1プライマーは、植物ゲノム中に組み込まれた外来DNA中の配列を認識するものであり、かつ第2プライマーは、DNAの3’−または5’−フランキング領域中の配列を認識するものである、形質転換されたグリホサート耐性テンサイ植物、その細胞、組織または一部を同定するための試験キットにおいて、
a)第1プライマーが、配列番号1のヌクレオチド配列を示し、かつ第2プライマーが、配列番号2のヌクレオチド配列を示し、その際、前記プライマー対は、テンサイ植物、その部分または種子のゲノムDNAからポリメラーゼ連鎖反応によって、配列番号13のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を示す630〜700bpのDNAフラグメントを増幅させることができるものであり、および/または
b)第1プライマーが、配列番号7のヌクレオチド配列を示し、かつ第2プライマーが、配列番号8のヌクレオチド配列を示し、その際、前記プライマー対は、テンサイ植物、その部分または種子のゲノムDNAからポリメラーゼ連鎖反応によって、配列番号11のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を示す270〜300bpのDNAフラグメントを増幅させることができるものであり、および/または
c)第1プライマーが、配列番号9のヌクレオチド配列を示し、かつ第2プライマーが、配列番号10のヌクレオチド配列を示し、その際、前記プライマー対は、テンサイ植物、その部分または種子のゲノムDNAからポリメラーゼ連鎖反応によって配列番号12のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を示す710〜790bpのDNAフラグメントを増幅させることができるものであり、および/または
d)第1プライマーが、配列番号14のヌクレオチド配列を示し、かつ第2プライマーが、配列番号16のヌクレオチド配列を示し、その際、前記プライマー対は、テンサイ植物、その部分または種子のゲノムDNAからポリメラーゼ連鎖反応によって配列番号17のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を示す990〜1100bpからのDNAフラグメントを増幅させることができるものである、ことを特徴とする、試験キット。 - 第1プライマーおよび第2プライマーが、配列番号5のヌクレオチド配列の一部を形成するヌクレオチド配列を認識する、請求項5または6に記載の試験キット。
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