ES2900515T3 - Métodos para conferir o mejorar la resistencia a los herbicidas sobre plantas y/o algas con variantes de protoporfirinógeno oxidasa - Google Patents

Abstract

Un método para conferir o mejorar la resistencia a los herbicidas sobre una planta o alga, el método incluye transformar una planta, alga, célula vegetal, protoplasto, callo, hipocótilo, semilla, cotiledón, o brote con un gen que codifica que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, en el que el herbicida es un herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para conferir o mejorar la resistencia a los herbicidas sobre plantas y/o algas con variantes de protoporfirinógeno oxidasa

[Campo Técnico]

Se proporcionan métodos para conferir y/o mejorar la resistencia a los herbicidas sobre plantas y/o algas que incluyen cultivos agrícolas al introducir variantes de protoporfirinógeno oxidasa derivadas de procariotas.

[Técnica Antecedente]

Una ruta biosintética de porfirina sirve para la síntesis de clorofila y hemo que desempeñan una función vital en el metabolismo de las plantas y tiene lugar en el cloroplasto. En esta ruta, la protoporfirinógeno IX oxidasa (en lo sucesivo, PPO; EC: 1.3.3.4) cataliza la oxidación del protoporfirinógeno IX a protoporfirina IX. Después de la oxidación del protoporfirinógeno IX a protoporfirina IX, la protoporfirina IX se une al magnesio mediante Mg-quelatasa para sintetizar la clorofila, y se une al hierro mediante la Fe-quelatasa para sintetizar el hemo.

Por lo tanto, cuando se inhibe la actividad de PPO, se inhibe la síntesis de clorofilas y hemo y el sustrato de protoporfirinógeno IX sale de la ruta biosintética normal de porfirina, lo que da como resultado la rápida exportación de protoporfirinógeno IX desde el cloroplasto hasta el citoplasma y la acumulación de protoporfirina IX citoplasmática provocada por la oxidación. La protoporfirina IX acumulada de esta genera oxígeno singlete altamente reactivo (1O²) en presencia de moléculas de luz y oxígeno para destruir la membrana celular, lo que conduce rápidamente a la muerte de las células vegetales. En base a este principio, se han desarrollado herbicidas que inhiben la actividad de la PPO. Hasta el momento existen 9 familias de herbicidas, que incluyen pirimidinadionas, difenil-éteres, fenilpirazoles, N-fenilftalimidas, tiadiazoles, oxadiazoles, triazolinonas, oxazolidinadionas y otros herbicidas, que se clasifican de acuerdo con sus estructuras químicas.

El documento US 8129589 B2 se refiere a protoporfirinógeno oxidasas que tienen actividad de impartir resistencia contra acifluorfen y genes del mismo.

El documento WO 2010/027506 se refiere a la resistencia a herbicidas diseñados genéticamente para mantener cultivos axénicos.

El número de acceso de EBI. EMBL: AFZ43049 se refiere a protoporfirinógeno oxidasa de Halothece sp. PCC 7418. Lermontova et al. (PLANT PHYSIOLOGY, vol. 122, n° 1, 1 de enero de 2000 (2000-01-01), páginas 75-84) se refiere a la sobreexpresión de protoporfirinógeno IX oxidasa de plastidios que conduce a resistencia al herbicida de difeniléter acifluorfen.

El documento WO 2013/189984 A2 se refiere a plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas.

El número de acceso de EBI. EMBL: AFZ07847 se refiere a la protoporfirinógeno oxidasa de Oscillatoria nigro-viridis PCC 7112.

Kato et al. (PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 107, no. 38, 7 de septiembre de 2010, páginas 16649-16654) se refiere a la identificación de un gen para la actividad de protoporfirinógeno IX oxidasa en la cianobacteria Synechocystis sp. PCC6803.

Adicionalmente, para prevenir los efectos de estos herbicidas sobre el crecimiento de los cultivos mientras se utilizan los herbicidas, subsiste la necesidad de proporcionar resistencia a los herbicidas para los cultivos.

Mientras tanto, como organismos fotosintéticos, las algas tienen la capacidad de transformar la luz solar en energía que se puede utilizar para sintetizar una variedad de compuestos útiles. A través de la fijación fotosintética de carbono, las algas pueden convertir CO² en azúcar, almidón, lípidos, grasas u otras biomoléculas, por ejemplo, eliminando de esta manera un gas de efecto invernadero de la atmósfera. Adicionalmente, se pueden utilizar cultivos de algas a gran escala para producir una variedad de biomoléculas para uso como enzimas industriales, compuestos terapéuticos y proteínas, productos nutricionales, productos comerciales o productos combustibles, por ejemplo.

Un problema importante en los cultivos de algas a gran escala en biorreactores o estanques abiertos o cerrados es que se pueden contaminar por otras especies de algas, hongos y bacterias altamente competitivas pero no deseadas, así como por rotíferos y otros zooplancton que devoran las especies deseadas en los cultivos.

Por tanto, subsiste la necesidad de conferir resistencia a herbicidas a las algas, con el fin de que las algas resistentes a herbicidas puedan crecer en presencia del herbicida a una concentración que impide el crecimiento de organismos competidores que no albergan el gen de resistencia a herbicidas.

[Divulgación]

[Problema técnico]

Se observa que el gen PPO de tipo hemY derivado de procariotas confería una amplia resistencia a herbicidas contra 9 tipos de herbicidas que inhiben PPO. Además, se verifica que este gen se expresa en plantas o algas, y confiere un rasgo de resistencia a herbicidas en las plantas o algas. En base a esto, se proporcionan métodos para conferir y/o mejorar la resistencia a los herbicidas sobre plantas que incluyen cultivos agrícolas o algas al introducir variantes de protoporfirinógeno oxidasa derivadas de procariotas que consisten en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, en la que el herbicida es un herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa.

La presente invención proporciona métodos, transformantes y progenie de plantas como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto , la invención proporciona un método para conferir o mejorar la resistencia a los herbicidas sobre una planta o alga, el método incluye transformar una planta, alga, célula vegetal, protoplasto, callo, hipocótilo, semilla, cotiledón, o brote con un gen que codifica un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, en el que el herbicida es un herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa.

En una realización, el gen es un gen que consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de nucleótidos que tiene 95% o más de homología con la misma.

En otro aspecto, la invención proporciona un transformante que tiene resistencia a un herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa, en el que el transformante comprende un gen que codifica un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, y en el que el transformante es una planta, célula vegetal, protoplasto, callo, hipocótilo, semilla, cotiledón, brote, o, alga.

En otro aspecto, la invención proporciona una progenie de la planta transformante de la invención, en la que dicha progenie comprende un gen que codifica un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, y en la que dicha progenie muestra resistencia a un herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa.

El gen del método, transformante o progenie de la invención puede incluir un gen que contiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de nucleótidos que tiene 95% o más de homología con la misma.

En una realización de ejemplo, el gen del método, transformante o progenie de la invención se puede incluir en un vector de casete de gen de expresión de planta recombinante o un vector de casete de gen de expresión de algas recombinante.

El herbicida es un herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa.

En otra realización de ejemplo, el herbicida puede ser uno o más seleccionado del grupo que consiste en pirimidinadionas, difenil-éteres, fenilpirazoles, N-fenilftalimidas, tiadiazoles, oxadiazoles, triazolinonas, oxazolidinadionas, y cualquier combinación de los mismos.

En otra realización de ejemplo, el herbicida puede ser uno o más seleccionado del grupo que consiste en butafenacilo, saflufenacilo, benzfendizona, tiafenacilo, fomesafeno, oxifluorfeno, aclonifen, acifluorfen, bifenox, etoxifeno, lactofeno, clometoxifeno, clorintrofeno, fluoroglicofeno-etilo, halosafeno, piraflufeno-etilo, fluazolato, flumioxazin, cinidonetilo, flumiclorac-pentilo, flutiacet, tidiazimin, oxadiargilo, oxadiazon, carfentrazona, sulfentrazona, azafenidin, pentoxazona, piraclonil, flufenpir-etilo, profluazol y cualquier combinación de los mismos.

En otra realización de ejemplo, la planta puede ser de plantas monocotiledóneas, plantas dicotiledóneas, plantas herbáceas, o/y plantas leñosas.

En otra realización de ejemplo, la planta o el alga se puede diseñar genéticamente para contener adicionalmente un segundo polipéptido o un segundo gen que codifica los correspondientes péptidos, que por lo tanto tiene más amp0lia resistencia a los herbicidas contra el segundo herbicida.

En otra realización de ejemplo, el segundo herbicida puede incluir un herbicida que inhibe la división celular, un herbicida que inhibe la fotosíntesis, un herbicida que inhibe la síntesis de aminoácidos, un herbicida que inhibe los plastidios, y un herbicida que inhibe la membrana celular, pero no se limita a estos.

En otra realización de ejemplo, el segundo herbicida se puede4 ejemplificar por glifosato, glufosinato, dicamba, 2,4-D(ácido 2,4-Diclorofenoxiacético), isoxaflutol, herbicida que inhibe la ALS (acetolactato sintasa), un herbicida que inhibe el fotosistema II, un herbicida a base de fenilurea, un herbicida a base de bromoxinil o cualquier combinación de los mismos, pero no se limita a estos.

En otra realización de ejemplo, el segundo polipéptido que confiere resistencia a herbicida en una planta o un alga se puede ejemplificar por los péptidos que confieren resistencia a los herbicidas con uno o más seleccionados del grupo que consiste en EPSPS (5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa resistente a glifosato) resistente a herbicidas de glifosato, GOX (glifosato oxidasa), GAT (glifosato-N-acetiltransferasa), o glifosato descarboxilasa; PAT (fosfinotricina-N-acetiltransferasa resistente herbicida a glufosinato); DMO (monooxigenasa) resistente a herbicida dicamba; 2,4-D monooxigenasa o AAD (ariloxialcanoato dioxigenasa) resistente a herbicida 2,4-D; ALS (Acetolactato sintasa) resistente a herbicida a base de sulfonilurea que inhibe ALS, AHAS (acetohidroxiácido sintasa), o AtAHASL (Subunidad Grande de Acetohidroxiácido sintasa); herbicida que inhibe la proteína D1 del fotosistema II resistente al fotosistema II; citocromo P450 resistente a herbicida a base de fenilurea; HPPD (Hidroxilfenilpiruvato dioxigenasa) resistente a herbicida que inhibe plastidios; nitrilasa resistente al herbicida bromoxinil; y cualquier combinación de los mismos, pero no se limita a estos.

Adicionalmente, el gen que codifica el segundo polipéptido que confiere resistencia a herbicida se puede ejemplificar por uno o más seleccionados del grupo de nucleótidos que consiste en los genes CP4 EPSPS, EPSPS(AG), MEPSPS, 2MEPSPS, GOXV247, GAT4601, o GAT4621 resistentes al herbicida glifosato; gen BAR, PAT, o PAT(SYN) resistente al herbicida glufosinato; gen DMO resistente a herbicida dicamba; gen AAD-1 o AAD-12 resistente al herbicida 2,4-D; ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, CSR1, CSR1-1, CSR1-2, SURA, o SURB resistentes a herbicida a base de sulfonilurea que inhibe ALS; gen PSBA resistente a herbicida que inhibe el fotosistema II; gen CYP76B 1 resistente al herbicida fenilurea; gen HPPDPF W336 resistente al herbicida de isoxaflutol; gen BXN resistente al herbicida bromoxinil; y cualquier combinación de los mismos, pero no se limita a estos.

Se divulga un organismo genéticamente modificado que alberga una resistencia a los herbicidas nueva o novedosa o/y mejorada, o clon o progenies del mismo, el transformante o el clon o progenie del mismo que expresa uno o más seleccionados del grupo que consiste en los polipéptidos que contienen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, o el gen que codifica el polipéptido; el polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, o el gen que codifica el polipéptido; el polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o la secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, o el gen que codifica el polipéptido; y cualquier combinación de los mismos.

Las dianas para la modificación genética son un alga, célula vegetal, protoplasto, callo, hipocótilo, semilla, cotiledón, brote, o planta.

Se divulga un método para generar una planta o un alga modificada genéticamente que muestra un resistencia a los herbicidas novedosa o novedosa o/y mejorada, los métodos incluyen los procedimientos de transformar un alga, célula vegetal, protoplasto, callo, hipocótilo, semilla, cotiledón, brote, o planta que expresa uno o más seleccionados del grupo que consiste en el polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, o el gen que codifica el polipéptido correspondiente; el polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, o el gen que codifica el polipéptido correspondiente; el polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o la secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, o el gen que codifica el polipéptido correspondiente; y cualquier combinación de los mismos.

Otra realización proporciona un método para conferir y/o mejorar la resistencia a los herbicidas en una planta o un alga, el método incluye transformar un alga, célula vegetal, protoplasto, callo, un hipocótilo, semilla, cotiledón, brote, o planta con un gen que codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, en el que el herbicida es un herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa.

Se divulga un método para controlar malezas en una tierra de cultivo. El método incluye el procedimiento de proporcionara la tierra de cultivo una planta modificada genéticamente que contiene el polipéptido o gen seleccionado del grupo que consiste en el polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma o el gen que codifica el polipéptido correspondiente; el polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, o el gen que codifica el polipéptido; el polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o la secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, o el gen que codifica el polipéptido; y cualquier combinación de los mismos, y luego aplicar una dosificación efectiva del herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasas a la tierra de cultivo.

En una divulgación, se puede realizar la aplicación de una dosificación efectiva de un herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa a la tierra de cultivo al aplicar dos o más de los herbicidas que inhiben la protoporfirinógeno oxidasa en combinación en una dosificación efectiva de los mismos, de forma secuencial o simultánea.

En otra realización de ejemplo, la planta se puede modificar genéticamente para expresar un segundo polipéptido que confiere resistencia a herbicida o un gen que codifica los correspondientes péptidos. En una divulgación, dos herbicidas, herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa y el segundo herbicida, se pueden aplicar a la tierra de cultivo en una dosificación efectiva de los mismos, de forma secuencial o simultánea.

Se divulga un método para controlar especies acuáticas no deseadas en un medio de cultivo. El método incluye el procedimiento de proporcionar al medio de cultivo un alga modificada genéticamente que contiene el polipéptido o gen seleccionado del grupo que consiste en el polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma o el gen que codifica el polipéptido correspondiente; el polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, o el gen que codifica el polipéptido; el polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o la secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, o el gen que codifica el polipéptido; y cualquier combinación de los mismos, y luego aplicar una dosificación efectiva del herbicidas que inhiben la protoporfirinógeno oxidasa al medio de cultivo.

[Solución Técnica]

Aún otras realizaciones proporcionan un transformante que tiene resistencia a un herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa, el transformante es transformado con un gen que codifica un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, y en el que el transformante es una planta, célula vegetal, protoplasto, callo, hipocótilo, semilla, cotiledón, brote, o, alga.

Aún otras realizaciones proporcionan un método para preparar una planta o un alga que tiene resistencia a los herbicidas, el método incluye transformar un alga, una célula vegetal, un protoplasto, un callo, un hipocótilo, una semilla, un cotiledón, un brote o una planta con un gen que codifica un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, en el que el herbicida es un herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa.

Las realizaciones proporcionan un método para conferir y/o mejorar la resistencia a los herbicidas sobre una planta o un alga, el método incluye transformar un alga, una célula vegetal, un protoplasto, un callo, un hipocótilo, una semilla, un cotiledón, un brote, o una planta con un gen que codifica un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, en el que el herbicida es un herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa.

En adelante, la presente invención se describirá en más detalle.

Se divulga PPO derivada de Oscillatoria nigro-viridis PCC 7112, que se denomina CyPP02, una secuencia de aminoácidos de la misma representada por la SEQ ID NO: 1, y un gen que codifica los correspondientes péptidos representado por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2.

Se divulga la PPO derivada de la cepa Lyngbya sp. PCC 8106, que se denomina CyPP04, una secuencia de aminoácidos de la misma representada por la SEQ ID NO: 3, y un gen que codifica los correspondientes péptidos representado por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4.

Se divulgan la PPO derivada de la cepa Halothece sp. PCC 7418, que se denomina CyPP08, una secuencia de aminoácidos de la misma representada por la SEQ ID NO: 5, y un gen que codifica los correspondientes péptidos representado por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6.

Se divulgan la PPO derivada de la cepa Microcoleus vaginatus, que se denomina CyPPO12, una secuencia de aminoácidos de la misma representada por la SEQ ID NO: 7, y un gen que codifica los correspondientes péptidos representado por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8. La secuencia de aminoácidos de CyPP012 tiene 94% de homología de secuencia con aquel de CyPPO2.

Las secuencias del listado de secuencias, que no se citan en las reivindicaciones, están incluídas con propósitos comparativos.

Las proteínas de PPO resistentes a herbicida del método, transformante o progenie de la invención en el presente documento puede incluir una alteración que no altera generalmente la actividad de las moléculas que proporcionan dicha proteína consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma. Dicha alteración puede incluir la sustitución, supresión, adición, y/o inserción de aminoácidos. Por ejemplo, los intercambios de aminoácidos en proteínas y péptidos, que no alteran generalmente la actividad de las moléculas, son conocidos en la técnica. Los intercambios que ocurren más comúnmente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, en ambas direcciones, pero no se limitan a ellas. La proteína, si se desea, se puede modificar mediante fosforilación, sulfatación, acrilación, glicosilación, metilación, farnesilación, etc. Además, las variantes de proteína pueden incluir una proteína que tiene una estabilidad estructural aumentada contra calor, pH, etc. o tiene una actividad aumentada por alteración o modificación de la secuencia de aminoácidos.

Adicionalmente, la proteína de PPO resistente a herbicidas puede ser una variante que tiene una actividad biológica equivalente a aquella del polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. La variante puede incluir la sustitución, supresión, adición, y/o inserción de aminoácidos, en comparación con una proteína tipo silvestre o de punto de referencia, y tiene una actividad biológica similar o equivalente a aquella de la proteína tipo silvestre o de referencia. En este contexto, el término “homología de secuencia” se refiere al grado de similitud a secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos tipo silvestre o de referencia. Cualquier proteína se puede incluir en el alcance de la presente invención, siempre y cuando incluya residuos de aminoácidos que tienen 95% o más, 98% o más, o 99% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la proteína de PPO resistente a herbicidas del método, transformante o progenie de la invención en el presente documento (es decir de la SEQ ID NO: 1), y también retiene una actividad biológica equivalente al polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Dicha proteína equivalente puede incluir un sitio activo equivalente a aquel de la proteína deseada. Las comparaciones de homología se pueden realizar visualmente o con la ayuda de programas de comparación fácilmente disponibles. Estos programas informáticos disponibles comercialmente pueden calcular el porcentaje (%) de homología entre dos o más secuencias, y la homología (%) se puede calcular sobre secuencias contiguas. El alineamiento de secuencias para comparación se puede realizar mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA.

Adicionalmente, el gen de PPO resistente a herbicida utilizado puede incluir una molécula de ácido nucleico que incluye codones funcionalmente equivalentes a la secuencia de nucleótidos del gen que codifica el polipéptido correspondiente que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o codones que codifican los aminoácidos idénticos (mediante degeneración de codones) o codones que codifican aminoácidos biológicamente equivalentes. Adicionalmente, el alcance del método, transformante o progenie de la presente invención también puede incluir una molécula de ácido nucleico, que codifica una proteína que retiene una actividad biológicamente equivalente a aquella de la proteína de PPO resistente a herbicidas, y también incluye nucleótidos que tienen al menos 95% o más, 98% o más, o 99% o más de identidad con los mismos cuando la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína es PPO resistente a herbicidas del método, transformante o progenie de la invención en el presente documento y cualquier otra secuencia de nucleótidos diferente se alinean para un máximo de emparejamiento, y las secuencias alineadas se analizan utilizando un algoritmo generalmente utilizado en la técnica.

En una realización de ejemplo, la proteína de PPO resistente a herbicidas del método, transformante o progenie de la invención en el presente documento incluye un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o 98% o más de homología con la misma.

Adicionalmente, el gen PPO resistente a herbicidas del método, transformante o progenie de la invención incluye un gen que codifica el polipéptido correspondiente que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de aminoácidos que tiene 95% o 98% o más de homología con la misma.

El gen puede ser, por ejemplo un gen que consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de nucleótidos que tiene 95% o 98% o más de homología con la misma.

La proteína de PPO resistente a herbicidas se puede obtener de una fuente natural mediante extracción y purificación utilizando métodos ampliamente conocidos en la técnica. Alternativamente, se puede obtener como una proteína sintética preparada mediante síntesis química o como una proteína recombinante preparada mediante una tecnología de recombinación genética. Cuando se sintetiza químicamente, la proteína se puede obtener mediante un método de síntesis de polipéptidos ampliamente conocido en la técnica. Cuando se utiliza la tecnología de recombinación genética, el ácido nucleico que codifica la proteína de PPO resistente a herbicidas se inserta en un vector de expresión adecuado, este vector se transforma en una célula anfitriona, la célula anfitriona se cultiva para expresar la proteína deseada y luego la proteína resistente a herbicidas. La proteína de PPO se recupera de la célula anfitriona. Después de que la proteína se expresa en una célula anfitriona seleccionada, se pueden utilizar técnicas generales de separación bioquímica, por ejemplo, tratamiento con un agente de precipitación de proteínas (salificación), centrifugación, disrupción ultrasónica, ultrafiltración, diálisis, cromatografía tal como cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y similares para el aislamiento y purificación de los mismos. Generalmente, para separar la proteína con una alta pureza, estos métodos se pueden utilizar en combinación.

La molécula de ácido nucleico de PPO resistente a herbicidas se puede aislar o preparar utilizando técnicas de biología molecular estándar, por ejemplo, un método de síntesis química o recombinación. Alternativamente, se puede utilizar uno disponible comercialmente.

Se encontró que las proteínas de PPO exhiben una amplia resistencia a herbicidas contra 9 familias representativas de herbicidas que inhiben la actividad de PPO clasificados de acuerdo con sus estructuras químicas en un sistema de prueba de resistencia a herbicidas que utiliza E. coli BT3 deficiente en PPO (APPO). También se encontró que las proteínas se pueden expresaren hojas de tabaco mediante transformación mediada por Agrobacterium, y también se pueden expresar en el cloroplasto de una planta al utilizar un péptido de tránsito (TP). Adicionalmente, se encontró que las proteínas de PPO también se pueden expresar en Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia) mediante un vector de expresión vegetal. Aunque las plantas transformadas se tratan con herbicidas inhibidores de la actividad de PPO, se observa la germinación y el crecimiento de las plantas. Adicionalmente, un estudio de herencia confirmó la herencia de los rasgos resistentes a herbicidas anteriores a la siguiente generación.

Por tanto, la proteína de PPO del método, transformante o progenie de la presente invención se puede introducir en una planta o un alga, utilizándose de esta manera para potenciar la resistencia a herbicidas de la planta o el alga de la invención.

Como se utiliza en el presente documento, el “herbicida” se refiere a un ingrediente activo que destruye, controla o modifica adversamente de otro modo el crecimiento de plantas o algas y es un herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa. Como se utiliza en el presente documento, la “tolerancia a herbicidas” o “resistencia a herbicidas” significa que incluso después del tratamiento de un herbicida que normalmente destruye una planta o alga normal o de tipo silvestre o normalmente inhibe el crecimiento de la misma, la inhibición del crecimiento de la planta o alga se debilita o elimina, en comparación con el de la planta o alga normal o de tipo silvestre, y por lo tanto, la planta o el alga continúa creciendo. El herbicida es un herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa (PPO) de una planta. Dicho herbicida inhibidor de PPO se puede clasificaren pirimidindionas, difeniléteres, fenilpirazoles, N-fenilftalimidas, tiadiazoles, oxadiazoles, triazolinonas, oxazolidindionas y otros herbicidas de acuerdo con sus estructuras químicas. En una realización de ejemplo, el herbicida a base de pirimidindiona incluye butafenacilo, saflufenacilo, benzfendizona y tiafenacilo, pero no se limita a estos.

El herbicida a base de difenil-éter incluye fomesafeno, oxifluorfeno, aclonifen, acifluorfen, bifenox, etoxifeno, lactofeno, clorometoxifeno, clorintrofeno, fluoroglicofeno-etilo y halosafeno, pero no se limita a estos.

El herbicida a base de fenilpirazol incluye piraflufen-etilo y fluazolato, pero no se limita a estos.

El herbicida a base de fenilftalimida incluye flumioxazina, cinidon-etilo y flumiclorac-pentilo, pero no se limita a estos. El herbicida a base de tiadiazol incluye flutiacet y tidiazimina, pero no se limita a estos.

El herbicida a base de oxadiazol incluye oxadiargilo y oxadiazon, pero no se limita a estos.

El herbicida a base de triazolinona incluye carfentrazona, sulfentrazona y azafenidina, pero no se limita a estos. El herbicida a base de oxazolidindiona incluye pentoxazona, pero no se limita a este.

Otros herbicidas incluyen piraclonil, flufenpir-etilo y profluazol, pero no se limita a estos.

El gen PPO resistente a herbicidas del método, transformante o progenie de la presente invención se puede introducir en la planta o las algas mediante varios métodos conocidos en la técnica, y preferiblemente, utilizando un vector de expresión para la transformación de plantas o algas.

Un promotor apropiado que se puede incluir en el vector puede ser cualquier promotor generalmente utilizado en la técnica para la introducción del gen en la planta o el alga. Por ejemplo, el promotor para la transformación de plantas puede incluir un promotor SP6, un promotor T7, un promotor T3, un promotor PM, un promotor de ubiquitina de maíz, un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), un promotor de nopalina sintasa (nos), un promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia, un promotor del virus baciliforme de la caña de azúcar, un promotor del virus del moteado amarillo de la commelina, un promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO), un promotor de la triosefosfato isomerasa citosólica del arroz (TPI), un promotor de adenina fosforribosiltransferasa (APRT) de Arabidopsis, un promotor de octopina sintasa y un promotor de BCB (proteína de unión a cobre azul), pero no se limita a estos.

Adicionalmente, el vector para la transformación de plantas puede incluir una secuencia de señal poli A que provoca la poliadenilación del terminal 3' y, por ejemplo, puede incluir el extremo 3' de NOS derivado de un gen de nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, un terminador de octopina sintasa derivado de un gen de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, extremo 3' del gen inhibidor de proteasa I o II de tomate o papa, un terminador CaMV 35S, un terminador de a-amilasa de arroz RAmyl A y un terminador de faseolina, pero no se limita a estos.

Adicionalmente, el promotor para la transformación de algas puede ser un promotor específico de cloroplasto, un promotor nuclear, un promotor constitutivo o un promotor inducible. El gen que codifica la PPO resistente a herbicidas del método, transformante o progenie de la invención en el presente documento se puede ligar operativamente a una UTR 5' o UTR 3' que funciona en el núcleo del alga. Adicionalmente, el vector para la transformación de algas puede incluir una secuencia reguladora de la transcripción para la expresión del gen en el núcleo del alga. Un gen recombinante que confiere resistencia a herbicidas se puede integrar en el genoma nuclear o el genoma del cloroplasto de un alga anfitriona. Un gen recombinante que confiere resistencia a herbicidas se puede integrar en el genoma nuclear o genoma del cloroplasto de un alga anfitriona eucariota.

En el vector, un péptido de tránsito necesario para dirigirse a los cloroplastos se puede ligar al extremo 5' del gen PPO para expresar el gen PPO resistente a herbicidas en los cloroplastos.

Opcionalmente, el vector puede incluir adicionalmente un gen que codifica el marcador seleccionable como molécula informadora, y el ejemplo del marcador seleccionable puede incluir antibióticos (por ejemplo, neomicina, carbenicilina, kanamicina, espectinomicina, higromicina, bleomicina, cloranfenicol, etc.) o genes resistentes a herbicidas (glifosato, glufosinato, fosfinotricina, etc.), pero no se limita a estos.

Adicionalmente, el vector recombinante para la expresión de plantas puede incluir un vector binario de Agrobacterium, un vector de cointegración o un vector general que no tiene región de T-ADN pero que está diseñado para expresarse en la planta. De ellos, el vector binario se refiere a un vector que contiene dos sistemas de vectores separados que albergan un plásmido responsable de la migración que consiste en el borde izquierdo (LB) y el borde derecho (RB) en el plásmido Ti (inducible por tumor), y el otro plásmido para la transferencia de genes diana, y el vector puede incluir una región promotora y una secuencia señal de poliadenilación para la expresión en plantas.

Cuando se utiliza el vector binario o el vector de cointegración, una cepa para la transformación del vector recombinante en la planta es preferiblemente Agrobacterium (transformación mediada por Agrobacterium). A este respecto, se pueden utilizar Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. Además, cuando se utiliza el vector que no tiene región de T-ADN, se puede utilizar electroporación, bombardeo de micropartículas, absorción mediada por polietilenglicol, etc. para la introducción del plásmido recombinante en la planta.

La planta transformada con el gen mediante el método anterior se puede volver a diferenciar en una planta mediante inducción de callos, rizogénesis y aclimatación del suelo utilizando una técnica estándar conocida en el arte.

La planta sometida a transformación en el presente documento se entiende por un significado que incluye una célula vegetal (que contiene una célula cultivada en suspensión), un protoplasto, un callo, un hipocótilo, una semilla, un cotiledón, un brote y una planta madura.

Adicionalmente, el alcance del transformante vegetal incluye un transformante introducido con el gen así como un clon o progenie del mismo (generación T1, generación T2 o cualquier generación posterior). Por ejemplo, la planta transformada también incluye una planta que tiene los rasgos heredados de resistencia a herbicidas como progenie sexual y asexual de la planta transformada con el gen que codifica un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95 % o mayor homología con el mismo. El alcance de la presente invención también incluye todos los mutantes y variantes que muestran las características de la planta transformada inicial, junto con todos los productos de hibridación y fusión de la planta transformada con el gen que codifica un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. o una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la misma. Adicionalmente, el alcance de la presente invención también incluye una parte de la planta, tal como una semilla, una flor, un tallo, un fruto, una hoja, una raíz, un tubérculo, una raíz tuberosa, que se origina a partir de una planta transformada. que se transforma de antemano mediante el método de la presente invención, o una progenie del mismo, y se compone de al menos una parte de las células transformadas.

La planta a la que se aplica la presente invención no se limita particularmente a plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, sino que las incluye. Adicionalmente, la planta incluye plantas herbáceas o plantas leñosas. La planta monocotiledónea puede incluir plantas que pertenecen a la familia Alismataceae, Hydrocharitaceae, Juncaginaceae, Scheuchzeriaceae, Potamogetonaceae, Najadaceae, Zosteraceae, Liliaceae, Haemodoraceae, Agavaceae, Amaryllidaceae, Dioscoreaceae, Pontederiaceae, Iridaceae, Burmanniaceae, Juncaceae, Commelinaceae, Eriocaulaceae, Gramineae Poaceae, Araceae, Lemnaceae, Sparganiaceae, Typhaceae, Cyperaceae, Musaceae, Zingiberaceae, Cannaceae, Orchidaceae, pero no se limita a estas.

La planta dicotiledónea puede incluir plantas que pertenecen a la familia Diapensiaceae, Clethraceae, Pyrolaceae, Ericaceae, Myrsinaceae, Primulaceae, Plumbaginaceae, Ebenaceae, Styracaceae, Symplocaceae, Symplocaceae, Oleaceae, Loganiaceae, Gentianaceae, Menyanthaceae, Apocynaceae, Asclepiadaceae, Rubiaceae, Polemoniaceae, Convolvulaceae, Boraginaceae, Verbenaceae, Labiatae, Solanaceae, Scrophulariaceae, Bignoniaceae, Acanthaceae, Pedaliaceae, Orobanchaceae, Gesneriaceae, Lentibulariaceae, Phrymaceae, Plantaginaceae, Caprifoliaceae, Adoxaceae, Valerianaceae, Dipsacaceae, Campanulaceae, Compositae, Myricaceae, Juglandaceae, Salicaceae, Betulaceae, Fagaceae, Ulmaceae, Moraceae, Urticaceae, Santalaceae, Loranthaceae, Polygonaceae, Phytolaccaceae, Nyctaginaceae, Aizoaceae, Portulacaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae, Amaranthaceae, Cactaceae, Magnoliaceae, Illiciaceae, Lauraceae, Cercidiphyllaceae, Ranunculaceae, Berberidaceae, Lardizabalaceae, Menispermaceae, Nymphaeaceae, Ceratophyllaceae, Cabombaceae, Saururaceae, Piperaceae, Chloranthaceae, Aristolochiaceae, Actinidiaceae, Theaceae, Guttiferae, Droseraceae, Papaveraceae, Capparidaceae, Cruciferae, Platanaceae, Hamamelidaceae, Crassulaceae, Saxifragaceae, Eucommiaceae, Pittosporaceae, Rosaceae, Leguminosae, Oxalidaceae, Geraniaceae, Tropaeolaceae, Zygophyllaceae, Linaceae, Euphorbiaceae, Callitrichaceae, Rutaceae, Simaroubaceae, Meliaceae, Polygalaceae, Anacardiaceae, Aceraceae, Sapindaceae, Hippocastanaceae, Sabiaceae, Balsaminaceae, Aquifoliaceae, Celastraceae, Staphyleaceae, Buxaceae, Empetraceae, Rhamnaceae, Vitaceae, Elaeocarpaceae, Tiliaceae, Malvaceae, Sterculiaceae, Thymelaeaceae, Elaeagnaceae, Flacourtiaceae, Violaceae, Passifloraceae, Tamaricaceae, Elatinaceae, Begoniaceae, Cucurbitaceae, Lythraceae, Punicaceae, Onagraceae, Haloragaceae, Alangiaceae, Cornaceae, Araliaceae, Umbelliferae(Apiaceae), pero no se limita a estas.

En una realización de ejemplo, la planta incluye cultivos alimenticios tales como arroz, trigo, cebada, maíz, soja, patata, trigo, fríjol rojo, avena y sorgo; cultivos de hortalizas tales como Arabidopsis thaliana, col china, rábano, pimiento rojo, fresa, tomate, sandía, pepino, col, melón oriental, calabaza, cebolla galesa, cebolla y zanahoria; cultivos para uso especial tales como ginseng, tabaco, algodón, suelo, forrajes, sésamo, caña de azúcar, remolacha azucarera, Perilla sp., maní, colza, pasto y ricino; árboles frutales tales como árbol de manzano, árbol de pera, árbol de azufaifo, árbol de melocotón, árbol de kiwi, árbol de uva, árbol de cítricos, árbol de palosanto, árbol de ciruela, árbol de albaricoque y árbol de plátano; plantas leñosas tales como pino, aceite de palma y eucalipto; cultivos con flores tales como rosa, gladiolo, gerbera, clavel, crisantemo, lirio y tulipán; y cultivos forrajeros tales como raigrás, trébol rojo, hierba huerta, alfalfa, festuca alta y riograss perenne, pero no se limita a estos. Ejemplos específicos de la planta pueden incluir plantas dicotiledóneas tales como Arabidopsis thaliana, patata, berenjena, tabaco, pimiento rojo, tomate, bardana, margarita corona, lechuga, flor de globo, espinaca, acelga, batata, apio, zanahoria, apio de agua, perejil, repollo chino, repollo, rábano, sandía, melón oriental, pepino, calabaza, zapallo, fresa, soja, frijoles mungo, fríjol rojo y guisantes, pero no se limita a estos.

El alga, a la que se aplica la presente invención, no se limita particularmente a, pero incluye alga procariota o alga eucariota. En algunas realizaciones, el alga puede ser cianobacteria, algas verdes, algas rojas, algas pardas, macroalgas o microalgas.

La cianobacteria puede ser de los filos Chroococcales (que incluyen Aphanocapsa, Aphanotece, Chamaesiphon, Chondrocystis, Chroococcus, Chroogloeocystis, Crocosphaera, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanodictyon, Cyanosarcina, Cyanothece, Dactylococcopsis, Gloeocapsa, Gloeothece, Halothece, Johannesbaptistia, Merismopedia, Microcystis, Radiocystis, Rhabdoderma, Snowella, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Woronichinia), Gloeobacteria, Nostocales (que incluyen Microchaetaceae, Nostocaceae, Rivulariaceae, Scytonemataceae), Oscillatoriales (que incluyen Arthronema, Arthrospira, Blennothrix, Crinalium, Geitlerinema, Halomicronema, Halospirulina, Hydrocoleum, Jaaginema, Katagnymene, Komvophoron, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus,Oscillatoria, Phormidium, Planktothricoides, Planktothrix, Plectonema, Pseudanabaena, Pseudophormidium, Schizothrix, Spirulina, Starria, Symploca, Trichodesmium, Tychonema), Pleurocapsales (que incluyen Chroococcidiopsis, Dermocarpa, Dermocarpella, Myxosarcina, Pleurocapsa, Solentia, Stanieria, Xenococcus), Proclorales, o Stigonematales (que incluyen Capsosira, Clorogloeopsis, Fischerella, Hapalosiphon, Mastigocladopsis, Mastigocladus, Nostochopsis, Stigonema, Symphyonema, Symphonemopsis, Umezakia, Westiellopsis).

El alga puede comprender además una especie de Chlorophyta, Chlamydomonas, Volvacales, Dunaliella, Scenedesmus, Chlorella o Hematococcm.

El alga también puede comprender Phaeodactylum tricornutum, Amphiprora hyaline, Amphora spp., Chaetoceros muelleri, Navicula saprophila, Nitzschia communis, Scenedesmus dimorphus, Scenedesmus obliquus, Tetraselmis suecica, Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris, Haematococcus pluvialis, Neochloris oleoabundans, Synechococcus elongatus, Botryococcus braunii, Gloeobacter violaceus, Synechocystis, Thermosynechococcus elongatus, Nannocloropsis oculata, Nannochloropsis salina, Nannochloropsis gaditana, Isochrysis galbana, Botryococcus sudeticus, Euglena gracilis, Neochloris oleoabundans, Nitzschia palea, Pleurochrysis carterae, Tetraselmis chuii, Pavlova spp., Aphanocapsa spp., Synechosystis spp. Nannochloris spp. Sin embargo, para un experto en la técnica está claro que esta lista no es exclusiva, sino que también se pueden utilizar otros géneros y especies.

La planta o el alga introducida con la PPO resistente a herbicida del método, transformante o progenie de la invención en el presente documento pueden exhibir resistencia contra dos o más de herbicidas que inhiben la PPO.

Por lo tanto, en una divulgación, se pueden utilizar dos o más de los herbicidas que inhiben PPO de forma secuencial o simultánea para controlar malezas y/o especies acuáticas no deseadas.

Por ejemplo, se divulgan métodos para controlar malezas en una tierra de cultivo, el método incluye proporcionar a la tierra de cultivo una planta que incluye la proteína de PPO resistente a herbicidas o el gen que codifica los correspondientes péptidos, y luego aplicar dos o más de los herbicidas que inhiben la protoporfirinógeno oxidasa a la tierra de cultivo en una dosificación efectiva de forma secuencial o simultánea.

Adicionalmente, se divulgan métodos para controlar especies acuáticas no deseadas en un medio de cultivo, el método incluye proporcionar el medio de cultivo con un alga que incluye la proteína de PPO resistente a herbicidas o el gen que codifica los correspondientes péptidos, y luego aplicar dos o más de los herbicidas que inhiben la protoporfirinógeno oxidasa al medio de cultivo en una dosificación efectiva de forma secuencial o simultánea.

Adicionalmente, se puede utilizar la proteína o gen de PPO resistente a herbicidas del método, transformante o progenie de la invención en el presente documento en combinación de un segundo polipéptido resistente a herbicida o un gen que codifica los correspondientes péptidos.

Por lo tanto, la planta o el alga introducidos con la PPO resistente a herbicidas del método, transformante o progenie de la presente invención pueden exhibir resistencia contra dos o más herbicidas que son diferentes entre sí en el mecanismo de acción. Se pueden utilizar de forma secuencial o simultánea dos o más herbicidas diferentes, que incluyen el herbicida que inhibe la PPO, que son diferentes entre sí en el mecanismo de acción, controlando de esta manera las malezas y/o especies acuáticas no deseadas. En lo sucesivo, el herbicida que es diferente del herbicida que inhibe la PPO en el mecanismo de acción se denomina “segundo herbicida”.

Se divulga una composición de péptidos o nucleótidos para conferir o/y mejorar la resistencia a herbicidas en una planta o un alga, la composición incluye la proteína de PPO resistente a herbicidas descrita anteriormente o un gen que codifica el péptido correspondiente; y el segundo polipéptido resistente a herbicidas o gen que codifica el péptido correspondiente.

En las realizaciones, se proporcionan un transformante o una progenie de la planta transformante como se describió anteriormente, que tiene resistencia a los herbicidas novedosa o/y mejorada, el transformante, o la progenie de la planta transformante, incluye un gen que codifica un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma; y el segundo polipéptido resistente a herbicida o un gen que codifica el péptido correspondiente.

Adicionalmente, se proporcionan métodos para preparar una planta o un alga que tiene resistencia a los herbicidas novedosa o/y mejorada como se describió anteriormente, el método incluye transformar un alga, una célula vegetal, protoplasto, callo, hipocótilo, semilla, cotiledón, brote o planta con un gen que codifica un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma; y el segundo polipéptido resistente a herbicida o un gen que codifica el péptido correspondiente.

Se divulgan métodos para controlar malezas en una tierra de cultivo, el método incluye proporcionar a la tierra de cultivo la planta que incluye la proteína de PPO resistente a herbicidas descrita anteriormente o un gen que codifica el péptido correspondiente; y el segundo polipéptido resistente a herbicida o un gen que codifica el péptido correspondiente, y aplicar el herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa y el segundo herbicida a la tierra de cultivo en una dosificación efectiva de los mismos, de forma secuencial o simultánea.

Se divulgan métodos para controlar especies acuáticas no deseadas en un medio de cultivo, el método incluye proporcionar un medio de cultivo con el alga que incluye la proteína de PPO resistente a herbicidas descrita anteriormente o un gen que codifica el péptido correspondiente; y el segundo polipéptido resistente a herbicida o un gen que codifica el péptido correspondiente, y aplicar el herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa y el segundo herbicida al medio de cultivo en una dosificación efectiva de los mismos, de forma secuencial o simultánea.

En una realización de ejemplo, la planta o el alga pueden incluir adicionalmente el segundo polipéptido resistente a herbicida o un gen que codifica el péptido correspondiente, que por lo tanto tiene resistencia novedosa o/y mejorada contra el segundo herbicida.

En otra realización de ejemplo, el segundo herbicida puede incluir herbicidas que inhiben la división celular, herbicidas que inhiben la fotosíntesis, herbicidas que inhiben la síntesis de aminoácidos, herbicidas que inhiben los plastidios, herbicidas que inhiben la membrana celular, y/o cualquier combinación de los mismos, pero no se limita a estos. El segundo herbicida se puede ejemplificar por glifosato, glufosinato, dicamba, 2,4-D(ácido 2,4-Diclorofenoxiacético), herbicidas que inhiben la ALS (acetolactato sintasa) (por ejemplo, imidazolidinona, sulfonilurea, triazol pirimidina, sulfonanilida, pirimidina tiobenzoato, etc.), herbicidas que inhiben el fotosistema II, herbicidas a base de fenilurea, herbicidas que inhiben los plastidios, herbicida a base de bromoxinilos, y/o cualquier combinación de los mismos, pero no se limita a estos.

En aún otra realización de ejemplo, se puede ejemplificar el segundo polipéptido resistente a herbicida seleccionado del grupo que consiste en EPSPS resistente a herbicidas de glifosato(5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa resistente a glifosato), GOX(glifosato oxidasa), GAT (glifosato-N-acetiltransferasa) o glifosato descarboxilasa; PAT (fosfinotricina-N-acetiltransferasa resistente herbicida a glufosinato); DMO (monooxigenasa) resistente a herbicida dicamba; 2,4-D monooxigenasa o AAD (ariloxialcanoato dioxigenasa) resistente a herbicida 2,4-D; ALS(Acetolactato sintasa), AHAS (acetohidroxiácido sintasa), o AtAHASL (subunidad Grande de Acetohidroxiácido ) resistentes a herbicidas a base de sulfonilurea que inhiben la ALS; herbicida que inhibe la proteína D1 del fotosistema II resistente al fotosistema II; citocromo P450 resistente a herbicidas a base de fenilurea; HPPD (Hidroxilfenilpiruvato dioxigenasa) resistente a herbicida que inhibe los plastidios; nitrilasa resistente al herbicida bromoxinil; y cualquier combinación de los mismos, pero no se limita a estos.

Adicionalmente, se puede ejemplificar el gen que codifica el segundo polipéptido resistente a herbicida seleccionado del grupo que consiste en, los genes EPSPS(AG), MEPSPS, 2MEPSPS, GOXV247, GAT4601 o GAT4621 CP4 EPSPS resistentes al herbicida glifosato; genes BAR, PAT o PAT(SYN) resistentes al herbicida glufosinato; gen DMO resistente a herbicida dicamba ; gen AAD-1 o AAD-12 resistente al herbicida 2,4-D; ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, CSR1, CSR1-1, CSR1-2, SURA o SURB resistentes a herbicidas a base de sulfonilurea que inhiben la ALS; gen PSBA resistente a herbicida que inhibe el fotosistema II; gen CYP76B1 resistente al herbicida fenilurea; gen HPPDPF W336 resistente al herbicida isoxaflutol; gen BXN resistente al herbicida bromoxinil; y cualquier combinación de los mismos, pero no se limita a estos.

Se entenderá que, aunque los términos "primero", "segundo", "tercero", etc. pueden usarse en este documento para describir diversos elementos o componentes, estos elementos o componentes no deberían estar limitados por estos términos. Estos términos solo se utilizan para distinguir un elemento o componente de otro elemento o componente.

La terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitante. Como se utiliza en el presente documento, las formas singulares “un”, “una” y “el” pretenden incluir las formas plurales también, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se entenderá adicionalmente que los términos “comprende” y/o “que comprende” o “incluye” y/o “que incluye” cuando se utilizan en esta especificación, especifican la presencia de características, elementos y/o componentes declarados, pero que no excluye la presencia o adición de una o más características, elementos o componentes y/o grupos de los mismos. Como se usa en este documento, el término "y/o" incluye todas y cada una de las combinaciones de uno o más de los elementos enumerados asociados.

[Efecto de la invención]

Se aplica un PPO resistente a herbicidas del método, transformante o progenie de la presente invención a plantas o algas que incluyen cultivos comerciales, y luego se realiza un control selectivo utilizando rasgos de resistencia a herbicidas y herbicidas, controlando de esta manera económicamente las malezas.

[Breve descripción de los dibujos]

La FIG. 1 es una fotografía que muestra el crecimiento de Halothece sp. Cepa PCC 7418 que se cultivó durante 8 días en un medio CRBIP (Institut Pasteur, Francia) agregado sin Tiafenacilo o con Tiafenacilo 2 pM o 10 pM.

La FIG. 2 muestra una estructura del vector pACBB utilizado en E. coli BT3(APPO) de la presente invención. La eGFP se eliminó antes de uso, cuando se clonó cada gen de PPO en el vector.

La FIG. 3 es una fotografía que muestra la inhibición del crecimiento de las respectivas cepas de BT3(APPO) transformadas con los genes AtPPOI de tipo silvestre (indicado por WT) y AtPPOI mutante (indicado por MT) después de colocarlos en medio de agar que contenía Tiafenacilo 0~25 pM, y cultivarlos bajo condiciones de luz y oscuridad. La FIG. 4 es una fotografía que muestra la inhibición del crecimiento de las respectivas cepas de BT3(APPO) transformadas con los genes AtPPOI de tipo silvestre (indicado por WT), AtPPOI mutante (indicado por MT), CyPPO2 (indicado por 2), CyPP04 (indicado por 4) y CyPP08 (indicado por 8) en medio de agar que contenía 0~25 pM de un herbicida a base de pirimidinadiona, Tiafenacilo, Saflufenacilo o butafenacilo, o un herbicida de PPO a base de N-fenilftalimida, Flumioxazina. V indica una cepa preparada al transformar BT3(APPO) con el vector pACBB vacío. La FIG. 5 es una fotografía que muestra la inhibición del crecimiento de las respectivas cepas de BT3(APPO) transformadas con los genes AtPPOI de tipo silvestre (indicado por WT), AtPPOI mutante (indicado por MT), CyPPO2 (indicado por 2), CyPP04 (indicado por 4) y CyPP08 (indicado por 8) sobre medio de agar que contenía 0~400 pM de un herbicida de p Po a base de difenil éter, Fomesafeno, Acifluorfen u Oxifluorfeno. V indica una cepa preparada al transformar BT3(APPO) con el vector pACBB vacío.

La FIG. 6 es una fotografía que muestra la inhibición del crecimiento de las respectivas cepas de BT3(APPO) transformadas con los genes AtPPOI de tipo silvestre (indicado por WT), AtPPOI mutante (indicado por MT), CyPPO2 (indicado por 2), CyPP04 (indicado por 4) y CyPPO8 (indicado por 8) sobre medio de agar que contenía 0~400 pM de un herbicida de PPO a base de triazolinona, Sulfentrazona, un herbicida de PPO a base de oxizolidinadiona, Pentoxazona, un herbicida de PPO a base de fenilpirazol, Piraflufen-etilo, un herbicida de PPO a base de oxadiazol, Oxadiazon, un herbicida de PPO a base detiadiazol, Flutiacet-metilo, u otro herbicida de PPO, Piraclonil. V indica una cepa preparada al transformar BT3(APPO) con el vector pACBB vacío.

La FIG. 7 es una fotografía que muestra la inhibición del crecimiento de las respectivas cepas de BT3(APPO) transformadas con el gen AtPPOI de tipo silvestre (indicado por WT), AtPPOI mutante (indicado por MT) y CyPP012 sobre medio de agar que contenía 0~40o pM de Tiafenacilo, Saflufenacilo, Flumioxazin, Fomesafeno u Oxifluorfeno.

La FIG. 8 es una fotografía que muestra la inhibición del crecimiento de las respectivas cepas de BT3(APPO) transformadas con el gen AtPPO1 de tipo silvestre (indicado por WT), AtPPO1 mutante (indicado por MT) y CyPP012 sobre medio de agar que contenía 0~40o pM de Piraflufen-etilo, Oxadiazon, Sulfentrazona, Pentoxazona o Piraclonil. La FIG. 9 es un gráfico que muestra la inhibición del crecimiento de las respectivas cepas de BT3(APPO) transformadas con los genes AtPPOI de tipo silvestre (indicado por WT), AtPPOI mutante (indicado por MT), CyPPO2 y CyPPO4 en medio líquido LB que contenía 0~100 pM de Tiafenacilo durante el tiempo de cultivo.

La FIG. 10 es un gráfico que muestra la inhibición del crecimiento de las respectivas cepas de BT3(APPO) transformadas con los genes AtPPOI de tipo silvestre (indicado porWT), AtPPOI mutante (indicado por MT), CyPPO2, CyPPO4 y CyPPO8 en medio líquido LB que contenía 0~100 pM de Saflufenacilo durante el tiempo de cultivo. La FIG. 11 es un gráfico que muestra la inhibición del crecimiento de las respectivas cepas de BT3(APPO) transformadas con los genes AtPPOI de tipo silvestre (indicado porWT), AtPPOI mutante (indicado por MT), CyPP02, CyPPO4 y CyPPO8 en medio líquido LB que contenía 0~100 pM de Fomesafeno durante el tiempo de cultivo.

La FIG. 12 es un diagrama esquemático que muestra una estructura de un vector de expresión vegetal que se utilizó para examinar la expresión del gen PPO en cloroplastos de hojas de tabaco.

La FIG. 13 muestra el resultado de examinar las expresiones de los genes YFP, AtPPO1 de tipo silvestre (indicado porWT), CyPPO2, CyPPO4 y CyPPO8 en cloroplastos de planta, después de que cada uno de ellos se subclonó en el vector de la FIG. 12, y luego se introduce en la planta.

La FIG. 14 es un diagrama esquemático que muestra una estructura de un vector para la transformación de plantas, que se utilizó para la transformación de Arabidopsis thaliana con el gen PPO.

La FIG. 15 es el resultado de examinar la germinación de semillas de las respectivas semillas T2 de Arabidopsis thaliana transformadas con los genes AtPPO1 mutantes (indicados por MT), CyPPO2 y CyPPO8 en medio 1/2 MS o 1/2 MS que contiene 70 nM de tiafenacilo. El AtPPO1 mutante (indicado por Mt ) como control fue una semilla (T2) que se transformó con el gen que tenía resistencia contra un herbicida a base de PPO mediante reemplazo de aminoácidos.

La FIG. 16 muestra el resultado de la transferencia Western de cada estirpe de la generación T2 de Arabidopsis thaliana transformada con el gen CyPPO2 para examinar si la expresión de la proteína CyPPO2 se mantiene en la siguiente generación. CyPPO2 (R) indica la estirpe transformante resistente a herbicidas y CyPP02 (S) indica la estirpe transformante sensible a herbicidas. El panel inferior de la FIG. 16 muestra el resultado de la PCR para examinar la inserción del gen BAR en un vector binario.

La FIG. 17 muestra el resultado de la transferencia Western de cada estirpe de la generación T2 de Arabidopsis thaliana transformada con el gen CyPPO8 para examinar si la expresión de la proteína CyPPO8 se mantiene en la siguiente generación. CyPPO8 (R) indica la estirpe transformante resistente a herbicidas y CyPPO8 (S) indica la estirpe transformante sensible a herbicidas. El panel inferior de la FIG. 17 muestra el resultado de la PCR para examinar la inserción del gen BAR en un vector binario.

La FIG. 18 muestra el resultado de examinar el crecimiento de las respectivas generaciones T2 de Arabidopsis thaliana transformadas con genes CyPPO2, CyPPO4 y CyPPO8 y un gen AtPPO1 mutante de control (indicado por MT) 7 días después de pulverizar Tiafenacilo 1 pM al mismo. WT indica el resultado de Arabidopsis thaliana de tipo silvestre. La FIG. 19 muestra el resultado de examinar el crecimiento de las respectivas generaciones T2 de Arabidopsis thaliana transformadas con los genes CyPP02, CyPP04 y CyPPO8 y el gen AtPPO1 mutante de control (indicado por MT) 7 días después de la pulverización de Tiafenacilo 0.5 pM, Saflufenacilo 1 pM o Fomesafeno 3 pM al mismo. WT indica el resultado de Arabidopsis thaliana de tipo silvestre.

La FIG. 20 muestra el resultado de cultivar semillas respectivas de transformante de Arabidopsis thaliana insertado en el gen CyPPO2 y BAR y transformante de Arabidopsis thaliana insertado en el gen CyPPO8 y BAR en un medio con adición de glufosinato, medio con adición de tiafenacilo o medio con adición de glufosinato y Tiafenacilo.

La FIG. 21 muestra el resultado de cultivar la semilla del transformante de Arabidopsis thaliana insertado en el gen CyPPO2 o CyPPO8 en un medio con adición de Tiafenacilo, medio con adición de Saflufenacilo o medio con adición de Tiafenacilo y Saflufenacilo.

La FIG. 22 muestra el resultado de examinar una relación entre la homología de aminoácidos de la proteína CyPP02, CyPPO4 o CyPPO8 y la resistencia a herbicidas, y es una fotografía que muestra la inhibición del crecimiento de las respectivas cepas de BT3(APPO) transformadas con los genes de la variante de secuencia de aminoácidos de CyPPO2 (indicada por 2M), variante de secuencia de aminoácidos de CyPPO4 (indicada por 4M) y variante de secuencia de aminoácidos de CyPPO8 (indicada por 8M) en medio de agar con concentraciones variables de Tiafenacilo, Saflufenacilo y Butafenacilo. Como grupo de control para determinar la inhibición del crecimiento, se utilizaron AtPPO1 de tipo silvestre (indicado por WT) y AtPPO1 mutante (indicado por MT).

La FIG. 23 es una fotografía que muestra la inhibición del crecimiento de las respectivas cepas de BT3(APPO) transformadas con los genes de la variante de secuencia de aminoácidos de CyPPO2 (indicada por2M), variante de secuencia de aminoácidos de CyPPO4 (indicada por 4M) y variante de secuencia de aminoácidos de CyPPO8 (indicada por 8M) en medio de agar con concentraciones variables de Acifluorfen, Oxifluorfeno y Fomesafeno. Como grupo de control para determinar la inhibición del crecimiento, se utilizaron AtPPO1 de tipo silvestre (indicado porWT) y AtPPO1 mutante (indicado por MT).

La FIG. 24 es una fotografía que muestra la inhibición del crecimiento de las respectivas cepas de BT3(APPO) transformadas con los genes de la variante de secuencia de aminoácidos CyPPO2 (indicada por 2M), variante de secuencia de aminoácidos CyPPO4 (indicada por 4M) y variante de secuencia de aminoácidos CyPPO8 (indicada por 8M) en medios de agar con concentraciones variables de Sulfentrazona, Oxadiazon, Pentoxazona y Piraclonil. Como grupo de control para determinar la inhibición del crecimiento, se utilizaron AtPPO1 de tipo silvestre (indicado porWT) y AtPPO1 mutante (indicado por MT).

La FIG. 25 es una fotografía que muestra la inhibición del crecimiento de las respectivas cepas de BT3(APPO) transformadas con los genes de la variante de secuencia de aminoácidos CyPPO2 (indicada por 2M), variante de secuencia de aminoácidos de CyPPO4 (indicada por 4M) y variante de secuencia de aminoácidos de CyPPO8 (indicada por 8M) en medios de agar con concentraciones variables de Flutiacet-metilO, Piraflufen-etilo y Flumioxazin. Como grupo de control para determinar la inhibición del crecimiento, se utilizaron AtPPO1 de tipo silvestre (indicado por WT) y AtPPO1 mutante (indicado por MT).

[Descripción detallada de las realizaciones]

A continuación, la presente invención se describirá en detalle con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos tienen solo fines ilustrativos y no se pretende que la invención quede limitada por estos ejemplos.

Ejemplo 1. Aislamiento del gen PPO de procariotas

Se proporcionaron la cepa de Oscillatoria nigro-viridis PCC 7112, Lyngbya sp. PCC 8106 y la cepa Halothece sp. PCC 7418 por el Institut Pasteur, (Francia), y los genes PPO se aislaron de la misma mediante PCR utilizando los cebadores de la Tabla 1. Se aisló ADN genómico de cada cepa, y el gen PPO se aisló y amplificó utilizando los cebadores de la Tabla 1. La secuencia del gen PPO de Microcoleus vaginatus (GenScript) se sintetizó mediante la optimización del uso de codones de Arabidopsis thaliana utilizando la información de la base de datos de Genbank y se amplificó utilizando los cebadores de la Tabla 1. Se prepararon 50 pl de mezcla de reacción de PCR al mezclar 1 pl de cada plantilla (ADN genómico de cada cepa), 5 pl detampón 10X, 2 pl de mezcla de dNTP (cada 10 mM), 3 pl de un cebador directo (10 pM), 3 pl de un cebador inverso (10 pM), 35.5 pl de DDW, y 0.5 pl de Pfu-X (Solgent, 2.5 unidades/pl) o EF-taq (Solgent, 2.5 u/pl), y la amplificación se realizó bajo condiciones de a 94 °C durante 4 minutos y 30 ciclos (a 94 °C durante 30 segundos, a 56 °C durante 30 segundos y a 72 °C durante 1.5 minutos), a 72 °C durante 5 minutos y a 4 °C durante 5 minutos. La PPO aislada de Oscillatoria nigro-viridis PCC 7112 se denominó CyPPO2, PPO aislada de la cepa Lyngbya sp. PCC 8106 se designó como CyPPO4, PPO aislado de la cepa Halothece sp. PCC 7418 se denominó CyPPO8 y la PPO aislada de Microcoleus vaginatus se designó CyPPO12.

Adicionalmente, se examinaron las respectivas secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos de CyPPO2, CyPPO4, CyPPO8 y CyPPO12, y se representaron mediante las SEQ ID NO:1 a 8, y en particular, la secuencia de aminoácidos de CyPPO2 mostró un 94% de homología de secuencia con aquella de CyPPO12.

T l 1

Ejemplo 2. Prueba de resistencia a herbicidas de la cepa Halothece sp. PCC 7418

La cepa Halothece sp. PCC 7418 se cultivó en Medio CRBIP 1538 (Institut Pasteur, Francia). El medio CRBIP 1538 es un medio mixto de ASNIII y Sales de Turks Island 4X en una relación de 1:1 (v/v), y el medio ASNIII estaba compuesto por 25.0 g de NaCl, 3.5 g de MgSO4-7H2O, 2.0 g de M g C h ^^O , 0.5 g de KCl, 0.5 g de C a C h ^^O , 0.75 g de NaNOa, 0.02 g de K² HPO^{4 3} H²O, 0.04 g de NaCO³ , 2.5 ml de solución de citrato de amonio y hierro (III)/monohidrato de ácido cítrico [una mezcla de 300 mg de citrato de amonio hierro (III), 300 mg de monohidrato de ácido cítrico y 250 ml de agua destilada], 2.5 ml de solución de dihidrato de magnesio titriplex [una mezcla de 0.1 g de Mg EDTA y 500 ml de agua destilada], 1 ml de metales traza A5 Co [una mezcla de 2.86 g de H³ BO³ , 1.81 g de MnCl2-4H2O, 0.222 g de ZnSO4'7H2O, 0.39 g de NaMoO4-2H2O, 0.079 g de CuSO4-5H2O, 0.049 g de C o ^ O s ^ ^ O y 1000 ml de agua destilada] y 1000 ml de agua destilada. Las sales de Turks 4X estaban compuestas por 112 g de NaCl, 2.68 g de KCl, 22 g de M g C h ^^O , 27.7 g de MgSO4-7H2O, 5.8 g de CaCh-2 H²O, y 1000 ml de agua destilada. El medio ASNIII y las sales de Tursk Island 4X se esterilizaron en autoclave a 120°C durante 20 minutos, respectivamente, y luego se mezclaron en una relación de 1:1 (v/v).

Se agregaron 5 ml del medio de cultivo anterior a un tubo de ensayo, y se agregaron o no al mismo 2 o 10 pM de Tiafenacilo. Se agregó la cepa de Halothece sp. PCC 7418 cultivada en semillas a cada tubo de ensayo aun volumen igual y se examinó el crecimiento de la cepa durante 8 días. Como resultado, el crecimiento de la cepa Halothece sp.PCC 7418 se mantuvo incluso 8 días después del tratamiento con Tiafenacilo 10 pM, lo que indica que esta cepa tiene resistencia a herbicidas (FIG. 1).

Ejemplo 3. Prueba de resistencia a herbicidas de CyPPO2, CyPPO4, CyPPO8 y CyPPO12 en E. coli deficiente en PPO (medio Agar)

Para probar la resistencia a herbicidas de CyPP02, CyPPO4, CyPPO8 y CyPP012 aislados en el Ejemplo 1, E. coli BT3 deficiente en PPO [en lo sucesivo, denominado BT3(APpO)] se transformó con el gen CyPPO2, CyPPO4, CyPPO8 o CyPPO12, respectivamente, y luego se cultivó en presencia de herbicidas para examinar la inhibición del crecimiento de la E. coli transformada. Como control negativo, se utilizó PPO de tipo silvestre derivada de Arabidopsis thaliana (AtPPO1 de tipo silvestre), y la AtPPO1 de tipo silvestre tiene sensibilidad a los herbicidas a base de PPO y su información de secuencia está disponible en el número de acceso de GeneBank. AX084732 (una secuencia de nucleótidos del gen se representa por la SEQ ID NO:10, y una secuencia de aminoácidos de la misma se representa por la SEQ ID NO: 9). Como control positivo, se utilizó AtPPO1 mutante, en el que los reemplazos de aminoácidos de Y426M (reemplazo de tirosina por metionina en la posición 426) y S305L (reemplazo de serina por leucina en la posición 305) ocurren en la secuencia de aminoácidos de la AtPPO1 tipo silvestre (una secuencia de aminoácidos se representa por la SEQ ID NO:11) (Li X, Volrath SL., N D B.G., Chilcott CE, Johnson MA, Ward ER, Law MD (2003) Development of protoporphyrinogen oxidase as an efficient selection marker for agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize. Plant physiology 133:736-747).

La cepa de BT3(APPO) se proporcionó por la Universidad de Hokkaido (Japón) y es una cepa de E. coli que es deficiente en PPO de tipo hemG y tiene resistencia a la kanamicina (Watanabe et al., (2001) Dual targeting of spinach protoporphyrinogen oxidase II to mitochondria and chloroplasts by alternative use of two in-frame inhibition codons. JBC 20474-20481).

3-1. Preparación de materiales e instrumentos experimentales.

Se utilizaron autoclave HVE-50 de Hirayama, balanza electrónica HS2100Ade Hansung Instrument, banco limpio CB-30V de Jeio Tech, incubadora JSI-200CL de JSR, espectrofotómetro UV-visible tipo 1210 de Thermo Fisher Scientific, fotómetro MQ-200 de Apogee y Bio-Rad MyCycler como máquina de PCR. El autoclave se utilizó bajo condiciones de 121 °C y 15 minutos, y la incubadora se utilizó a 37 °C con iluminación de 160~200 pmol m'2 s_1 para un tiempo de cultivo de 14~20 horas. Se utilizaron medio LB (10 g/L de Bacto-Triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de cloruro de sodio, 15 g/L de agar Bacto) y un antibiótico Cloranfenicol (Duchefa). Los herbicidas utilizados en el experimento se dan en la siguiente Tabla.

3-2. Método experimental

Para clonar cada uno de los genes CyPPO2, CyPPO4, CyPPO8 y CyPP012 aislados y amplificados en el Ejemplo 1 en pACBB (su estructura se muestra en la FIG. 2), se preparó 10 pl de una solución que contiene 4 pl de cada gen PPO, 3.5 pl de vector pACBB, 1 pl de tampón A 10X, 1 pl de tampón B 10X, 1 pl de ligasa (RBC, 3 unidades/pl) y se dejó reaccionar a 22°C durante 30 minutos. La solución de reacción se agregó a 100 pl de células competentes DH5 alfa y se dejó reaccionar en hielo durante 20 minutos y luego se dejó a 42°C durante 40 segundos. Después de eso, las células se dejaron en hielo durante 2 minutos, y luego se agregó a las mismas 1 ml de caldo LB, seguido por incubación con agitación a 37°C durante 1 hora. Las cepas que tenían cada gen inserto en el medio de cultivo se recolectaron y luego se cultivaron sobre medio de agar LB que contenía cloranfenicol.

Para el cultivo de semillas de E. coli transformado con los genes respectivos, se cultivaron colonias individuales de las mismas en 3 ml de caldo LB que contenía cloranfenicol durante la noche, y cada 100 pl del mismo se subcultivó en 3 ml de caldo LB fresco hasta que la absorbancia (OD⁶⁰⁰) alcanzó 0.5~1. Se diluyeron con caldo LB hasta una absorbancia (OD⁶⁰⁰) de 0.5. Se realizó una dilución de 10 veces de esta solución diluida con caldo LB cinco veces. A continuación, se vertieron 10 pl de la solución diluida del cultivo de E. coli transformado sobre medio de agar LB (placa de Petri) que contenía cloranfenicol y una variedad de reservas de herbicidas a diferentes concentraciones (0~400 pM). Las placas de agar LB se incubaron a 37 °C. A los 16~20 horas después del cultivo, la inhibición del crecimiento se examinó a simple vista. Además, se examinó la inhibición del crecimiento de las cepas cultivadas en un medio que contenía Tiafenacilo bajo condiciones de luz (iluminación de 169 pmol m-2s-1) y oscuridad.

3-3. Resultado experimental

Las FIGS. 4 a 6 muestran los resultados de examinar la resistencia a herbicidas de CyPPO2, CyPPO4 y CyPPO8, y las FIGS. 7 y 8 muestran los resultados de examinar la resistencia a herbicidas de CyPPO12.

Como se muestra en la FIG. 3, el crecimiento de la cepa transformada con AtPPO1 de tipo silvestre se inhibió en el medio que contenía Tiafenacilo bajo condiciones de luz y oscuridad, y se observó una inhibición del crecimiento más fuerte bajo condiciones de luz que bajo condiciones de oscuridad. Por ejemplo, el crecimiento de la cepa transformada con AtPpO1 de tipo silvestre se inhibió casi completamente a 1 pM de Tiafenacilo bajo condiciones de luz, pero su crecimiento se mantuvo más bien bajo condiciones de oscuridad. Sin embargo, el crecimiento se inhibió completamente a 5 pM o más de Tiafenacilo tanto bajo condiciones de luz como de oscuridad. Como tal, el crecimiento de la cepa transformada con AtPPO1 de tipo silvestre se inhibió de una manera dependiente de la concentración de Tiafenacilo, lo que indica sensibilidad a herbicidas. No se observó inhibición del crecimiento de la cepa transformada con el AtPPO1 mutante incluso a 25 pM de Tiafenacilo, lo que indica resistencia a herbicidas.

Por lo tanto, el AtPPO1 de tipo silvestre se empleó como referencia para PPO sensible a herbicidas, y el AtPPO1 mutante se empleó como referencia para PPO resistente a herbicidas y se examinó la resistencia a herbicidas de CyPPO2, CyPPO4 o CyPPO8 contra las familias de PPO representativas.

La FIG. 4 muestra los resultados después del tratamiento con concentraciones variables de herbicidas de PPO a base de pirimidindiona representativos, Tiafenacilo, Saflufenacilo y Butafenacilo, y un herbicida de PPO representativo a base de N-fenilftalimida, flumioxazin. Tras el tratamiento de Tiafenacilo y Saflufenacilo, las inhibiciones del crecimiento de la cepa transformada con el AtPPO1 mutante, la cepa transformada con CyPPO2, la cepa transformada con CyPPO4 y la cepa transformada con CyPP08 apenas se observaron incluso a 25 pM de Tiafenacilo o Saflufenacilo. Tras el tratamiento de Butafenacilo, las inhibiciones del crecimiento de la cepa transformada con el AtPPO1 mutante, la cepa transformada con CyPPO2 y la cepa transformada con CyPPO8 apenas se observaron incluso a 25 pM de Butafenacilo. Tras el tratamiento de Flumioxazin, las inhibiciones del crecimiento de la cepa transformada con CyPPO2, la cepa transformada con CyPPO4 y la cepa transformada con CyPPO8 apenas se observaron incluso a 25 pM de Flumioxazin. Tras el tratamiento de cada uno de los cuatro herbicidas, la inhibición del crecimiento de la cepa transformada con AtPPO1 de tipo silvestre comenzó a 0.5 pM y apenas creció a 5 pM o más.

La FIG. 5 muestra los resultados después del tratamiento con concentraciones variables de herbicidas representativos de PPO a base de difenil éter, Fomesafeno, Acifluorfen y Oxifluorfeno. Tras el tratamiento con Fomesafeno, no se observó inhibición del crecimiento de la cepa transformada con el AtPPO1 mutante por 25 pM, y apenas se observaron inhibiciones del crecimiento de la cepa transformada con CyPPO2, la cepa transformada con CyPPO4 y la cepa transformada con CyPPO8 incluso a 400 pM de Fomesafeno. Tras el tratamiento con Acifluorfen, las inhibiciones del crecimiento de la cepa transformada con CyPPO2, la cepa transformada con CyPPO4 y la cepa transformada con CyPP08 apenas se observaron incluso a 400 pM de Acifluorfen. Tras el tratamiento con oxifluorfeno, apenas se observaron inhibiciones del crecimiento de la cepa transformada con CyPPO2, la cepa transformada con CyPPO4 y la cepa transformada con CyPPO8 incluso a 400 pM de Oxifluorfeno. Tras el tratamiento de cada uno de los tres herbicidas, la cepa transformada con AtPPO1 de tipo silvestre apenas creció a 5 pM o más.

La FIG. 6 muestra los resultados después del tratamiento con concentraciones variables de un herbicida de PPO representativo a base de triazolinona Sulfentrazona, un herbicida de PPO representativo a base de oxazolidindiona Pentoxazona, un herbicida de PPO representativo a base de fenilpirazol Piraflufen-etilo, un herbicida de PPO representativo a base de oxadiazol Oxadiazon, un herbicida de PPO a base de tiadiazol representativo Flutiacet-metilo, y otro herbicida de PPO Piraclonil. Tras el tratamiento con sulfentrazona, apenas se observaron inhibiciones del crecimiento de la cepa transformada con CyPPO2, la cepa transformada con CyPPO4 y la cepa transformada con CyPPO8 incluso a 400 pM de sulfentrazona. Tras el tratamiento de Pentoxazona, Piraflufen-etilo, Oxadiazon, Flutiacetmetilo y Piraclonil, las inhibiciones del crecimiento de la cepa transformada con CyPP02 y la cepa transformada con CyPP08 apenas se observaron incluso a 400 pM de Oxifluorfeno. Tras el tratamiento de cada uno de los siete herbicidas, la cepa transformada con AtPPO1 de tipo silvestre apenas creció a 5 pM o más.

La FIG. 7 muestra los resultados de examinar la resistencia a herbicidas de CyPPO12 tras el tratamiento de Tiafenacilo, Saflufenacilo, Flumioxazin, Fomesafeno y Oxifluorfeno. La inhibición del crecimiento de la cepa transformada con CyPPO12 apenas se observó incluso a cada 25 pM de Tiafenacilo, Saflufenacilo, Flumioxazin, Fomesafeno y Oxifluorfeno, y la inhibición del crecimiento de los mismos apenas se observó incluso a 400 pM de Fomesafeno u Oxifluorfeno. Tras el tratamiento con oxifluorfeno, la inhibición del crecimiento de la cepa transformada con el AtPPOI mutante comenzó a 5 pM. La inhibición del crecimiento del mismo apenas se observó incluso a 25 pM de otros herbicidas. Por el contrario, la inhibición del crecimiento de la cepa transformada con AtPPOI de tipo silvestre comenzó en cada 0.5 pM de los cuatro herbicidas excluyendo Fomesafeno, y apenas creció a 5 pM o más. Tras el tratamiento de Fomesafeno, se observó inhibición del crecimiento de la cepa transformada con AtPPOI de tipo silvestre a 5 pM.

La FIG. 8 muestra los resultados de examinar la resistencia a herbicidas de CyPPO12 tras el tratamiento de Piraflufenetilo, Oxadiazon, Sulfentrazona, Pentoxazona y Piraclonil. No se observaron inhibiciones del crecimiento de la cepa transformada con el AtPPOI mutante y la cepa transformada con CyPPO12 incluso a 25 pM, y tampoco se observaron inhibiciones del crecimiento de las mismas incluso a cada 400 pM de los cuatro herbicidas excluyendo la sulfentrazona. Por el contrario, tras el tratamiento de Piraflufen-etilo, Oxadiazon, Sulfentrazona o Piraclonil, la inhibición del crecimiento de la cepa transformada con AtPPOI de tipo silvestre comenzó a 0.5 pM. Tras el tratamiento de Piraclonil, la inhibición del crecimiento del mismo comenzó a 5 pM y apenas creció a 25 pM.

Ejemplo 4. Ensayo de resistencia a herbicidas de CyPPO2, CyPPO4 y CyPPO8 en E. coli deficiente en PPO (medio de caldo LB)

En el Ejemplo 3, se investigó la resistencia a herbicidas de las respectivas cepas de BT3(APPO) transformadas con el gen AtPPOI de tipo silvestre, AtPPOI mutante, CyPPO2, CyPP04 o CyPPO8 sobre medios de agar que contenían diferentes herbicidas, y en este Ejemplo, la resistencia a herbicidas de las cepas se investigaron en medios líquidos LB que contenían diferentes herbicidas.

4-1. Preparación de materiales e instrumentos experimentales.

Se utilizaron autoclave HV-50 de Hirayama, balanza electrónica HS2100A de Hansung Instrument, banco limpio CB-30V de Jeio Tech, incubadora JSI-200CL de JSR, fotómetro MQ-200 de Apogee y espectrofotómetro UV-visible tipo 1210 de Thermo Fisher Scientific. El autoclave se utilizó bajo condiciones de 121 °C y 15 minutos, y la incubadora se utilizó a 37 °C con luz de 160~200 pmol i r r V durante un tiempo de cultivo de 13.5 horas. El espectrofotómetro UV-visible se utilizó a 600 nm.

El Tiafenacilo (P.M. 511.87 g/mol), el Saflufenacilo (P.M. 500,85 g/mol) y Fomesafeno (P.M. 438.76 g/mol) utilizados en el experimento se adquirieron de Dongbu Farm Hannong Co., Ltd, Sigma y Sigma, respectivamente. Estos fármacos se prepararon a una concentración de 200 mM en acetona al 100% y se almacenaron a -20 °C, respectivamente. Se utilizaron medio Luria-Bertani (LB) (10 g/L de Bacto-Triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de cloruro de sodio) y un antibiótico Cloranfenicol (Duchefa).

4-2. Método experimental

Para el cultivo de siembra de E. coli transformado con los genes respectivos, se cultivaron colonias individuales de las mismas en 3 ml de caldo LB que contenía cloranfenicol durante 12 horas, y se diluyeron con caldo LB hasta una absorbancia (OD⁶⁰⁰) de 1.5. A continuación, se agregaron cloranfenicol y 500 pl del cultivo de siembra de la E. coli transformada a 250 ml de medio líquido LB, y se agregaron 50 ml del cultivo a cada matraz de 250 ml. Cada matraz se trató con concentraciones variables (0, 10 pM, 50 pM, 100 pM) de reservas de herbicidas (Tiafenacilo, Saflufenacilo, Fomesafeno) y luego se incubó a 37 °C y 200 rpm. La absorbancia (OD⁶⁰⁰) se midió utilizando un espectrofotómetro cada 1.5 horas. El experimento se repitió tres veces y los valores medios del mismo se dieron en un gráfico. Las barras de error representan el error estándar de tres repeticiones.

4-3. Resultado experimental

El AtPPO1 de tipo silvestre se empleó como referencia para la PPO sensible a herbicidas, y la AtPPO1 mutante se empleó como referencia para la p Po resistente a herbicidas.

El resultado del tratamiento con Tiafenacilo se muestra en la FIG. 9.

La cepa transformada con AtPPO1 de tipo silvestre apenas creció a 10 pM de Tiafenacilo o más, mientras que la cepa transformada con el AtPPO1 mutante creció a 10 pM de Tiafenacilo, pero se observó inhibición del crecimiento de la misma a 50 pM de Tiafenacilo o más. Adicionalmente, la cepa transformada con CyPPO2 y la cepa transformada con CyPP04 crecieron normalmente en 100 pM de Tiafenacilo.

El resultado del tratamiento con Saflufenacilo se muestra en la FIG. 10.

En todas las cepas transformadas, la presencia o ausencia de resistencia fue similar al resultado del tratamiento con Tiafenacilo, pero se observó una alta resistencia en las cepas tratadas con Saflufenacilo, en comparación con las tratadas con Tiafenacilo. La cepa transformada con la AtPPO1 de tipo silvestre apenas creció a 10 pM de Saflufenacilo o más, mientras que la cepa transformada con la AtPPOI mutante, la cepa transformada con CyPPO2, la cepa transformada con CyPPO4 y la cepa transformada con CyPPO8 normalmente creció en 100 pM.

El resultado del tratamiento con Fomesafeno se muestra en la FIG. 11.

La inhibición del crecimiento de la cepa transformada con la AtPPO1 de tipo silvestre comenzó a 50 pM, mientras que la cepa transformada con la AtPPO1 mutante, la cepa transformada con CyPPO2, la cepa transformada con CyPP04 y la cepa transformada con CyPPO8 normalmente crecieron por 100 pM.

Ejemplo 5. Expresión de CyPPO2, CyPPO4 y CyPPO8 en planta

Se realizaron experimentos para expresar CyPP02, CyPPO4 y CyPPO8 en plantas, de las cuales se había demostrado resistencia contra varios herbicidas de PPO en los Ejemplos 3 y 4, y se utilizó proteína fluorescente (proteína amarilla fluorescente, YFP) para confirmar las expresiones de proteínas de PPO.

5-1. Método experimental

Para preparar células competentes de Agrobacterium, se cultivó la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens (Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology) en 5 ml de medio LB a 30°C y 200 rpm durante 12 horas. Este caldo de cultivo se agregó a 200 ml de medio LB y luego se cultivó a 30 °C y 200 rpm durante 3~4 horas, seguido de centrifugación a 3000 g, 4 °C durante 20 minutos. El sedimento se lavó con agua destilada estéril y luego se resuspendió en 20 ml de medio LB. Se congelaron instantáneamente 200 pl de una alícuota del mismo en nitrógeno líquido y luego se almacenaron en un congelador.

Para preparar los vectores respectivos que se clonaron con los genes AtPPO1, CyPPO2, CyPPO4 y CyPPO8 de tipo silvestre, se trató un vector que contenía un promotor CaMV 35S, un terminador YFP y NOS con las enzimas de restricción Xbal y Xhol y un gen de péptido de tránsito. (SEQ ID NO: 26) amplificado por PCR se trató con enzimas de restricción Xbal y Xhol, y luego el vector y el gen del péptido de tránsito se ligaron entre sí para insertar el péptido de tránsito que está implicado en la transición del cloroplasto al vector. Adicionalmente, las enzimas de restricción Xhol y BamHI se utilizaron para digerir los genes PPO respectivos (genes AtPPO1, CyPP02, CyPPO4 y CyPPO8 de tipo silvestre) y el vector, y luego se ligaron entre sí para insertar los genes PPO respectivos en el vector. Como resultado, el péptido de tránsito se ligó al extremo 5' del gen PPO y el gen YFP se unió al extremo 3' del mismo. Un diagrama esquemático del vector final se muestra en la FIG. 12.

A continuación, para la transformación mediada por Agrobacterium, las células competentes de Agrobacterium preparadas anteriormente se descongelaron en hielo y luego se mezclaron con 3~5 pl de los vectores que albergan los genes de PPO respectivos, seguido de congelación rápida en nitrógeno líquido durante 2~3 minutos. Después de eso, las células se descongelaron a 37°C durante 5 minutos, se agregó a las mismas 1 ml de medio LB y se incubaron a 30°C durante 2 horas. Cada cultivo resultante se sembró en medio LB/espectinomicina y se incubó a 30°C durante 2 días.

Para inocular hojas de tabaco con Agrobacterium, se cultivaron colonias individuales de Agrobacterium transformadas con los respectivos vectores insertados en PPO en medio LB/espectinomicina a 30°C, 200 rpm durante 12 horas y se centrifugaron a 7000 rpm durante 2 minutos. Los sedimentos resultantes se resuspendieron en MgCh 10 mM, respectivamente. Después de ajustar su absorbancia (OD⁶⁰⁰) a 0.5, se agregó acetosiringona 200 pM y se almacenó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se infiltró Agrobacterium en hojas de tabaco cultivadas normalmente utilizando una jeringa de 1 ml y se cultivó durante 2-5 días.

A continuación, para aislar protoplastos de hojas de tabaco, se preparó una solución de enzima como en la composición de la Tabla 3 o 5.

T l 1

El pH de la solución anterior se ajustó a 5,8 y se esterilizó utilizando un filtro que tenía un tamaño de poro de 0.22 |jm.

______________ ___________

Las hojas de tabaco se cortaron en tiras con una cuchilla de afeitar y las tiras de hojas se suspendieron en la solución de enzima preparada, se cubrieron con papel de aluminio y se agitaron a temperatura ambiente a 40-50 rpm durante 3-5 horas. Se utilizaron un microscopio (Carl Zeiss Observer Z1) y un sistema de análisis de correlación de biomateriales (Zeiss LSM710) para examinar las células de protoplasto con tres tipos de filtros, DIC, YFP y rodamina. Las imágenes se capturaron utilizando una herramienta de formación de imágenes y luego se procesaron con un programa ZEN lite 2012 (Carl Zeiss).

La proteína fluorescente (YFP) expresada con la proteína CyPPO2, CyPP04 o CyPPO8 se examinó mediante transferencia Western. Con este fin, las muestras se congelaron y almacenaron en nitrógeno líquido, y luego se rompieron con un micropistilo. Se agregó tampón IP [Tris-Cl 50 mM (pH 7.5), NaCl 75 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 al 1%, DTT 1 mM, inhibidor de proteasa 1x] (40 j l para pocillo grande) y se agitó con vórtex, y luego se deja sobre hielo durante 10 minutos o más. Después de centrifugar a 4 °C durante 10 minutos, el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de 1.5 ml. Se le agregó un colorante de carga de proteínas, se hirvió a 100°C durante 5 minutos y luego se dejó en hielo. Después de la centrifugación, se utilizó el sobrenadante. Para la electroforesis, se cargó una solución de extracto de proteína sobre un gel de SDS-PAGE al 7.5% y las proteínas se separaron a 100 V para un gel de apilamiento y a 150 V para un gel de separación. Las proteínas sometidas a electroforesis se transfirieron a una membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno) y se bloquearon con un tampón de bloqueo (leche desnatada en polvo al 4%, fosfato de sodio 10 mM, NaCl 0,15 M, Tween-20 al 0,05%, pH 7.5) durante 1 hora. Luego, se agregó anticuerpo anti-GFP (conjugado con HRP) (SantaCruz) a una dilución 1/2000 y se hizo reaccionara temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la reacción del anticuerpo, la membrana se lavó con tampón PBS-T (solución salina tamponada con fosfato-Tween) durante 10 minutos tres veces, y se pulverizaron 500 j l de solución de ECL (electroquimioluminiscencia) (composición de tampón o proveedor: Bio-Rad) y se dejaron durante 1 minuto. La membrana se cubrió con una película OHP, se expuso a una película de rayos X y luego se reveló la película.

5-2. Resultado experimental

Los resultados de examinar las expresiones de los genes AtPPO1, CyPPO2, CyPPO4 y CyPPO8 de tipo silvestre respectivos después de la introducción en plantas se muestran en la FlG. 13. Se observó la formación de colonias de Agrobacterium en las respectivas plantas transformadas con los genes PPO. No se observó la orientación de la proteína YFP de control negativo a los cloroplastos y se observó su expresión en el citoplasma y el núcleo. La imagen fusionada de la proteína de PPO y la autofluorescencia de clorofila mostró que las señales de fluorescencia se superpusieron entre sí, lo que indica que el cTP (péptido de tránsito del cloroplasto) se dirige a los cloroplastos, que se ligan al terminal N con el fin de dirigirse al cloroplasto.

Ejemplo 6. Preparación del vector de transformación de planta y transformante

Para la selección de transformación de plantas, se preparó y usó un vector binario que albergaba el ORF del gen BAR (gen de resistencia al glufosinato) y el ORF del gen CyPPO2, CyPPO4 o CyPPO8 respectivo. El gen BAR se utilizó para examinar los efectos del tratamiento cruzado de otros herbicidas que tienen un mecanismo de acción diferente al de los herbicidas basados en PPO. Este gen también se utilizó para examinar si se producía una herencia estable en la siguiente generación. Para expresar el gen BAR, se utilizó un promotor NOS y se utilizó un terminador E9 para terminar la transcripción. Mientras tanto, para la inducción de la expresión de CyPPO2, CyPPO4 y CyPPO8 en plantas, se utilizó un promotor CaMV35S, y para dirigir las proteínas a los cloroplastos, se insertó una región de péptido de tránsito (TP) del gen AtPPO1 utilizando las enzimas de restricción XbaI y XhoI. Adicionalmente, para confirmar las proteínas expresadas, se insertó una etiqueta de hemaglutinina (HA) en el extremo 3' utilizando enzimas de restricción BamHI y SacI. La región del péptido de tránsito insertada en el vector se representa por la SEQ ID NO: 27 y la secuencia de etiqueta HA insertada se representa por la SEQ ID NO: 28. Los genes CyPP02 y CyPP08 se insertaron entre el péptido de tránsito y la etiqueta Ha utilizando enzimas de restricción XhoI y BamHI, y el terminador NOS se insertó detrás de la etiqueta HA para inducir la terminación de la transcripción del gen PPO. En la FIG. 14 se muestra un diagrama esquemático que muestra la estructura del vector binario de transformación de plantas.

Mientras tanto, el transformante de planta se preparó como sigue. Primero, se seleccionó Agrobacterium transformado en un medio antibiótico y luego se cultivaron las colonias en un medio líquido. Se recolectaron células de Agrobacterium y se suspendieron en una solución que contenía sacarosa al 5% y Silwet L-77 al 0.05%. La absorbancia (OD⁶⁰⁰) se ajustó a 0.8, y luego se puso un órgano floral de Arabidopsis thaliana cultivado durante aproximadamente 5-6 semanas en la solución de Agrobacterium. Para mantener la humedad, la maceta se cubrió con una bolsa de plástico y se dejó durante un día en la oscuridad. La Arabidopsis thaliana inoculada con Agrobacterium se cultivó adicionalmente durante 1-2 meses, y las semillas se maduraron y luego se recogieron. Debido a que las semillas recolectadas de la planta transformada eran una mezcla de semillas transformadas y no transformadas, se requiere un proceso de selección de semillas transformadas de las semillas recolectadas.

De acuerdo con lo anterior, se utilizó el gen BAR que se insertó para la selección de individuos transformados durante la preparación del vector para seleccionar transformantes (los transformantes se seleccionaron utilizando glufosinato), que se trasplantaron al suelo y se cultivaron para obtener una planta T1.

Para examinar la resistencia de las plantas T1 trasplantadas contra herbicidas a base de PPO, las plantas se cultivaron durante aproximadamente 3-4 semanas y luego se trataron con herbicidas antes del alargamiento del tallo de la flor. Se encontró que el ecotipo Col-0 de Arabidopsis thaliana se destruye cuando se trata con 2-3 ml de tiafenacilo 1 pM (+ Silwet L-77 al 0.05%) por planta. Por lo tanto, se aplicó tiafenacilo 1 pM uniformemente en una cantidad adecuada para el número de plantas individuales. Después de 7 días, se examinó la resistencia de los transformantes frente a herbicidas a base de PPO. Las plantas que mostraron resistencia y por lo tanto sobrevivieron se cultivaron continuamente y sus semillas (semilla T2) se cosecharon y las semillas t 2 se cultivaron en medio 1/2 MS durante una semana y luego se trasplantaron al suelo para obtener una planta T2.

Ejemplo 7. Prueba de germinación

Para examinar la resistencia al tiafenacilo de las semillas de la generación T2 que sobrevivieron bajo el tratamiento de tiafenacilo 1 pM, entre los transformantes CyPPO2 y CyPPO8, se sembraron semillas de Arabidopsis thaliana en medio 1/2 MS (1.125 g/L de sal MS, 10 g/L de sacarosa, 7 g/Lde agar) que contenías tiafenacilo 70 nM. La Arabidopsis thaliana de tipo silvestre (Col-0; ecotipo Columbia-0) mostró una germinación reducida de la semilla en medio 1/2 MS que contenía tiafenacilo 50 nM, y Col-0 no mostró una germinación normal de la semilla y se destruyó ató en medio 1/2 MS que contenía tiafenacilo70 nM. Por lo tanto, la supervivencia por debajo de tiafenacilo 70 nM significa que una planta tiene resistencia contra tiafenacilo.

Como resultado, como se muestra en la FIG. 5, no. 1 y 49 entre las estirpes de generación T2 de los transformantes CyPPO2 mostraron germinación, y no. 6, 16 y 40 entre las estirpes de generación T2 de los transformantes CyPPO8 mostraron germinación en medio 1/2 MS que contenía tiafenacilo 70 nM. Adicionalmente, la semilla de Arabidopsis thaliana (Col-0) de tipo silvestre utilizada como control negativo no mostró germinación en medio 1/2 MS que contenía tiafenacilo 70 nM. El transformante AtPPO1 mutante utilizado como control positivo mostró germinación incluso en medio 1/2 MS que contenía tiafenacilo 70 nM.

Ejemplo 8. Prueba de herencia

8-1. Examen de la relación de segregación de la semilla de la generación T2

El rasgo de resistencia a herbicidas se observó en la siguiente generación de Arabidopsis thaliana transformada y, por lo tanto, para determinar la herencia, se determinaron las relaciones de segregación de semillas T2 sensibles y resistentes al gen BAR en cada estirpe.

En el caso del transformante CyPP02, se obtuvo una relación de segregación cercana a 3:1 en la estirpe no. 10, 20, 38 y 40 entre 10 estirpes, lo que indica que una sola copia del transgén se integró en el genoma y se segregó y expresó de acuerdo con el mendeliano. Las 6 estirpes restantes no mostraron una relación de segregación de 3:1, lo que implica una copia doble o más.

En el caso del transformante CyPPO8, se obtuvo una relación de segregación cercana a 3:1 en la estirpe no. 6, 16 y 40 entre 5 estirpes, lo que indica que una sola copia del transgén se integró en el genoma, y se segregó y expresó de acuerdo con el mendeliano. Las 2 estirpes restantes mostraron una relación de segregación inferior a 3:1.

8-2. Examen de las expresiones de las proteínas CyPPO2 y CyPPO8 en semillas de generación T2 resistentes a herbicidas

Para examinar si las expresiones de las proteínas CyPPO2 y CyPPO8 se mantienen en la siguiente generación, se extrajeron proteínas de cada estirpe de transformantes de generación T2, seguido de transferencia Western. Para detectar las cantidades de proteínas de PPO etiquetadas con HA, se extrajeron proteínas de aproximadamente 100 mg de hoja de Arabidopsis thaliana, seguido de electroforesis. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF y luego se realizó una transferencia de Western utilizando anticuerpo anti-HA. Se pulverizó tiafenacilo 1 pM sobre plantas de generación T1. Las plantas que sobrevivieron se clasificaron como resistentes y las plantas que se destruyeron se clasificaron como sensibles.

En el caso del transformante CyPPO2, las proteínas de PPO se detectaron en la estirpe no. 8, 23, 30, 38, 40 y 49 que mostraron resistencia luego de rociar herbicidas a las mismas y no se detectaron en estirpes sensibles (FIG. 16). En el caso del transformante CyPPO8, las proteínas de PPO se detectaron en la estirpe no. 6, 23, 38 y 40 que tienen resistencia a herbicidas y no se detectan en estirpes sensibles (FIG. 17). Estos resultados sugieren que las expresiones de las proteínas CyPPO2 y CyPP08 se mantuvieron en las próximas generaciones de estirpes resistentes, proporcionando resistencia.

8-3. Examen de la herencia estable de transgén utilizando el gen BAR

Se investigó la herencia estable del transgén a la siguiente generación al examinar la integración del gen transformado, BAR en el genoma. Los ADN genómicos se aislaron de 100 mg de las hojas de los transformantes CyPPO2 y CyPPO8, y luego se examinó la integración del gen BAR mediante PCR. Como resultado, se observó la integración del genoma del gen BAR en las estirpes tanto sensibles como resistentes al tiafenacilo del transformante CyPPO2 y del transformante CyPPO8, lo que indica una herencia estable de los genes transformados a la siguiente generación.

Ejemplo 9. Examen de la resistencia a herbicidas de Arabidopsis thaliana transformada

Para examinar si los rasgos de resistencia a herbicidas se mantienen en las próximas generaciones de plantas, las respectivas plantas de la generación T2 de Arabidopsis thaliana que se transformaron con genes CyPPO2, CyPPO4 y CyPPO8 se sometieron a una prueba de resistencia a herbicidas. Se pulverizaron 2~3 ml de Tiafenacilo 0.5 pM, Saflufenacilo 1 pM, o Fomesafeno 3 pM en cada planta de Arabidopsis thaliana cultivada durante aproximadamente 4 semanas. A los 7 días después de la pulverización, se destruyeron las plantas Col-0 de tipo silvestre, mientras que el control positivo, el transformante AtPPO1 mutante y los grupos experimentales, el transformante CyPPO2, el transformante CyPP04 y el transformante CyPPO8 continuaron creciendo sin daño (FIGS. 18 y 19), lo que indica que los rasgos de resistencia a herbicidas de las plantas T1 se mantuvieron bien para proporcionar a las generaciones T2 resistencia a herbicidas.

• Ejemplo 10. Experimento de uso cruzado de herbicidas plurales con diferentes mecanismos de acción

En el transformante de Arabidopsis thaliana que incluye el gen CyPPO2 o CyPPO8, que se obtuvo mediante transformación utilizando el vector de transformación de planta preparado en el Ejemplo 6, el gen resistente a herbicidas que inhiben la actividad PPO y el gen resistente al glufosinato se expresan al mismo tiempo. Por lo tanto, se examinó si el tratamiento cruzado del transformante de Arabidopsis thaliana con dos herbicidas, a saber, el herbicida que inhibe la actividad de PPO y el glufosinato, es eficaz para el control de malezas. Con este fin, las semillas del transformante de Arabidopsis thaliana insertado en el gen CyPP02 y BAR, o del transformante de Arabidopsis thaliana insertado en el gen CyPPO8 y BAR se esterilizaron y trataron a baja temperatura de 4°C durante 2 días. Las semillas se sembraron en un medio 1/2 MS (Duchefa), un medio 1/2 MS que contenía Tiafenacilo 70 nM, un medio 1/2 MS que contenía glufosinato 50 uM o un medio 1/2 MS que contenía Tiafenacilo 70 nM y glufosinato 50 uM, y se cultivaron a 23 °C bajo condiciones de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad durante 7~14 días. La Arabidopsis thaliana sobre el medio herbicida fue semilla transformada con CyPPO2 o CyPPO8 y la ColO de tipo silvestre como control, respectivamente. El transformante y el control se cultivaron en medio herbicida. Después de 2 semanas, fueron examinados. Como resultado, CyPPO2 y CyPP08 crecieron normalmente en un medio con adición de glufosinato, un medio con adición de Tiafenacilo o un medio con adición de glufosinato y Tiafenacilo, mientras que el ColO de control no germinó (ver FIG. 20).

Estos resultados muestran que cuando se preparan plantas transformadas mediante la recombinación del gen PPO resistente al herbicida de la presente invención y el gen BAR en un vector binario, y se realiza el tratamiento cruzado o doble de estas plantas GM con herbicidas que tienen diferentes mecanismos de una acción, se pueden controlar las plantas no deseadas.

En este ejemplo, el gen BAR introducido como un gen recombinante, junto con el gen CyPPO, es ilustrativo solo para un gen resistente, y no hay limitación en el tipo de gen que se va a utilizar en la presente invención. Es evidente para aquellos expertos en la técnica que cuando un gen resistente adecuado para el propósito y CyPPO 2, 4, 8 o 12 se recombinan con el vector binario, y los herbicidas a los que los genes respectivos son resistentes se tratan de forma cruzada, se puede obtener la resistencia deseada.

Ejemplo 11. Experimento de uso cruzado de herbicidas de PPO plurales

En el Ejemplo 9, se confirmó que el transformante de Arabidopsis thaliana preparado en la presente invención tiene resistencia contra los dos herbicidas a base de PPO, Tiafenacilo y Saflufenacilo al mismo tiempo, y por lo tanto, se probó si el tratamiento cruzado del transformante de Arabidopsis thaliana con Tiafenacilo y Saflufenacilo es eficaz para el control de malezas. Con este fin, se esterilizaron semillas de transformante de Arabidopsis thaliana insertado en el gen CyPPO2 o CyPPO8 y se trataron a baja temperatura de 4°C durante 2 días. Las semillas se sembraron en un medio 1/2 MS, un medio 1/2 MS que contenía Tiafenacilo 70 nM, un medio 1/2 MS que contenía Saflufenacilo 70 nM o un medio 1/2 MS que contenía Tiafenacilo 35 nM y Saflufenacilo 35 nM, y se cultivaron a 23 °C bajo condiciones de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad durante 7~14 días. La Arabidopsis thaliana sobre el medio herbicida fue semilla transformada con CyPPO2 o CyPPO8 y la ColO de tipo silvestre como control, respectivamente. El transformante y el control se cultivaron en medio herbicida. Después de 2 semanas, fueron examinados. Como resultado, CyPP02 y CyPPO8 crecieron normalmente sobre un medio con Tiafenacilo agregado, un medio con Saflufenacilo agregado o un medio con Tiafenacilo y Saflufenacilo agregado, mientras que el ColO de control no germinó (véase FIG. 21).

Estos resultados muestran que cuando se preparan plantas GM utilizando genes resistentes a herbicidas de PPO de la presente invención, y se realiza un tratamiento cruzado o doble de varios herbicidas basados en PPO, así como un tratamiento único de herbicidas basados en PPO, se pueden controlar las plantas no deseadas.

Ejemplo 12. Examen de la resistencia a herbicidas de acuerdo con la homología de secuencia de aminoácidos de CyPPO2, CyPPO4 y CyPPO8

Para investigar el rango de homología de secuencias de aminoácidos de CyPPO2, CyPPO4 y CyPPO8 que mantienen la resistencia a herbicidas, una parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína CyPP02, CyPP04 o CyPPO8 se reemplazó por una parte de la secuencia de aminoácidos de NtPPO (gen p Po derivado de tabaco). Como resultado, la secuencia de aminoácidos de la variante CyPPO2 resultante se representa por la SEQ ID NO:12, y su secuencia de nucleótidos de la misma se representa por la SEQ ID NO:13. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de la variante CyPPO2 mostraron 98 % de homología de secuencia con las de CyPPO2, respectivamente. Adicionalmente, la secuencia de aminoácidos de la variante CyPPO4 se representa por la SEQ ID NO:14, y su secuencia de nucleótidos se representa por la SEQ ID NO:15. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de la variante CyPPO4 mostraron 98% de homología de secuencia con aquella de CyPPO4, respectivamente. Adicionalmente, la secuencia de aminoácidos de la variante CyPP08 se representa por la SEQ ID NO:16, y su secuencia de nucleótidos se representa por la SEQ ID NO:17. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de la variante CyPP08 mostraron 98% de homología de secuencia con aquellas de CyPPO8, respectivamente.

Se investigó la resistencia a herbicidas de la variante de secuencia de aminoácidos de CyPPO2, la variante de secuencia de aminoácidos de CyPPO4 y la variante de secuencia de aminoácidos de CyPPO8 en E. coli BT3 deficiente en PPO. [BT3(APPO)], y un método experimental específico es similar al del Ejemplo 3. De la misma manera que en el Ejemplo 3, como control negativo, se empleó la PPO de tipo silvestre (AtPPOl de tipo silvestre) de Arabidopsis thaliana como referencia para la sensibilidad a los herbicidas. Como control positivo, el AtPPOl mutante que se preparó mediante la sustitución de aminoácidos de Y426M y S305L en la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre se empleó como referencia para la resistencia a herbicidas.

12-1. Preparación de materiales e instrumentos experimentales.

Se utilizó un autoclave bajo condiciones de 121°C y 15 minutos, y se utilizó una incubadora a 37°C con iluminación de 169 |jmol m-2 s-1 durante un tiempo de cultivo de 14~16 horas.

Se utilizó un espectrofotómetro UV-visible a 600 nm. La PCR se realizó bajo condiciones de a 94 °C durante 4 minutos y 25 ciclos (a 94 °C durante 30 segundos, a 56~60 °C durante 30 segundos y a 72 °C durante 3 minutos), a 72 °C durante 5 minutos ya 4 °C durante 5 minutos. Los herbicidas utilizados en el experimento se dan en la siguiente Tabla 8. Los herbicidas respectivos se prepararon a una concentración de 200 mM en DMSO y se almacenaron a -20 °C. Antes de uso, los herbicidas se diluyeron y se agregaron al medio de caldo LB (que contenía 34 mg/ml de cloranfenicol).

12-2. Método experimental

Se inocularon células saturadas en 3 ml de medio líquido LB que contenía cloranfenicol y luego se cultivaron a 37°C, 200 rpm durante 5 horas. La densidad de las células cultivadas se midió a 600 nm y los transformantes se diluyeron con medio líquido LB para tener la misma absorbancia (OD⁶⁰⁰) por 1 ml de las mismas (OD⁶⁰⁰ = 0.5). Se agregó agar al medio líquido LB a una concentración del 1% y luego se esterilizó en autoclave. Se agregaron y mezclaron cloranfenicol (34 jg/m l) y herbicida. Las células diluidas por igual se diluyeron a una densidad de 10°, 10-1, 10'2, 10'3, 10'4 y 10'5. Cada 10 j l de las células se vertieron en agar al 1%, medio sólido LB, y se cultivaron en una incubadora a 37 °C durante 14~16 horas (condición de luz: 169 jm ol itt2 s_1).

Se utilizaron pACBB-CyPP02, pACBB-CyPPO4 y pACBB-CyPPO8 como plantillas para preparar cebadores para la región que se va a reemplazar (Tabla 9), y se realizó la PCR para preparar los vectores de la variante pACBB-CyPPO2, la variante pACBB-CyPPO4 y la variante de pACBB-CyPPO8. Se prepararon 50 j l de mezcla de reacción de PCR al mezclar 1 j l de cada plantilla (pACBB-CyPPO2, pACBB-CyPPO4 y pACBB-CyPPo8 original), 5 j l de tampón 10X, 1 j l de mezcla de dNTP (cada 10 mM), 1 j l de un cebador directo (10 jM), 1 j l de un cebador inverso (10 jM), 35 j l de DDW y 1 j l de Pfu-X (Solgent, 2.5 unidades/jl), y la amplificación se realizó bajo condiciones de 94 °C durante 4 minutos y 25 ciclos (a 94 °C durante 30 segundos, a 56 °C durante 30 segundos y a 72 °C durante 3 minutos), a 72 °C durante 5 minutos y a 4 °C durante 5 minutos.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un método para conferir o mejorar la resistencia a los herbicidas sobre una planta o alga, el método incluye transformar una planta, alga, célula vegetal, protoplasto, callo, hipocótilo, semilla, cotiledón, o brote con un gen que codifica que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, en el que el herbicida es un herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el gen es un gen que consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de nucleótidos que tiene 95% o más de homología con la misma.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el gen se compone en forma de un vector de expresión vegetal recombinante o un vector de expresión de algas recombinantes.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el herbicida es uno o más seleccionado del grupo que consiste en pirimidinadionas, difenil-éteres, fenilpirazoles, N-fenilftalimidas, tiadiazoles, oxadiazoles, triazolinonas, oxazolidinadionas, y cualquier combinación de los mismos, preferiblemente, en el que el herbicida es uno o más seleccionado del grupo que consiste en butafenacilo, saflufenacilo, benzfendizona, tiafenacilo, fomesafeno, oxifluorfeno, aclonifen, acifluorfen, bifenox, etoxifeno, lactofeno, clometoxifeno, clorintrofeno, fluoroglicofeno-etilo, halosafeno, piraflufeno-etilo, fluazolato, flumioxazin, cinidon-etilo, flumiclorac-pentilo, flutiacet, tidiazimin, oxadiargilo, oxadiazon, carfentrazona, sulfentrazona, azafenidin, pentoxazona, piraclonil, flufenpir-etilo, profluazol, y cualquier combinación de los mismos.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la planta es una de las plantas monocotiledóneas, plantas dicotiledóneas, plantas herbáceas, o plantas leñosas.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la planta o alga comprende adicionalmente un segundo polipéptido resistente a herbicida o un gen que codifica los correspondientes péptidos, que por lo tanto tiene resistencia novedosa o mejorada contra el segundo herbicida, en el que el segundo herbicida es preferiblemente uno o más seleccionados del grupo que consiste en glifosato, glufosinato, dicamba, 2,4-D(ácido 2,4-Diclorofenoxiacético), isoxaflutol, herbicida que inhibe la ALS (acetolactato sintasa), un herbicida que inhibe el fotosistema II, un herbicida a base de fenilurea, un herbicida a base de bromoxinil, y cualquier combinación de los mismos, o

en el que el segundo polipéptido resistente a herbicida es preferiblemente uno o más seleccionado del grupo que consiste en EPSPS (5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa resistente a glifosato) resistente a herbicidas de glifosato, GOX (glifosato oxidasa), GAT (glifosato-N-acetiltransferasa), o glifosato descarboxilasa;

PAT (fosfinotricina-N-acetiltransferasa) resistente herbicida a glufosinato;

DMO (monooxigenasa) resistente a herbicida dicamba;

2,4-D(ácido 2,4-Diclorofenoxiacético) 2,4-D monooxigenasa o AAD resistente a herbicida (ariloxialcanoato dioxigenasa);

AHAS (acetohidroxiácido sintasa) en base a sulfonilurea que inhibe ALS (acetolactato sintasa), o AtAHASL (Subunidad Grande de Acetohidroxiácido sintasa);

proteína D1 del fotosistema II resistente a herbicida que inhibe el fotosistema II;

citocromo P450 resistente a herbicida a base de fenilurea;

HPPD (Hidroxilfenilpiruvato dioxigenasa) resistente a herbicida que inhibe plastidios; nitrilasa resistente al herbicida bromoxinil; y cualquier combinación de los mismos.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el gen que codifica el segundo polipéptido resistente a herbicida es uno o más seleccionados del grupo que consiste en gen CP4 EPSPS, MEPs Ps , ² MEPSPS, GOXV247, GAT4601, o GAT4621 resistente al herbicida glifosato; gen BAR o PAT resistente al herbicida glufosinato; gen DMO resistente a herbicida dicamba ; gen AAD-1 o AAD-12 resistente al herbicida 2,4-D(ácido 2,4-Diclorofenoxiacético);

gen HPPDPF W336 resistente al herbicida isoxaflutol;

ALS, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, GM-HRA, S4-HRA, Zm-HRA, SurA o SurB resistentes a herbicida a base de sulfonilurea; gen PSBA resistente a herbicida que inhibe el fotosistema II;

gen CYP76B1 resistente al herbicida fenilurea; gen BXN resistente al herbicida bromoxinil; y cualquier combinación de los mismos.

8. Un transformante que tiene resistencia a un herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa, en el que el transformante comprende un gen que codifica un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, y en el que el transformante es una planta, célula vegetal, protoplasto, callo, hipocótilo, semilla, cotiledón, brote, o, alga.

9. Una progenie de la planta de la reivindicación 8, en la que dicha progenie comprende un gen que codifica un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, y en la que dicha progenie muestra resistencia a un herbicida que inhibe la protoporfirinógeno oxidasa.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el método comprende adicionalmente transformar la planta, alga, célula vegetal, protoplasto, callo, hipocótilo, semilla, cotiledón, o brote con un gen que codifica:

i) un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, o

ii) un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma.

11. El transformante de la reivindicación 8 o la progenie de la reivindicación 9, en el que el transformante o progenie comprende adicionalmente un gen que codifica:

i) un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma, o

ii) un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más de homología con la misma.