JP2018500909A - プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ変異体を用いた植物及び／又は藻類の除草剤抵抗性付与又は増進方法 - Google Patents

プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ変異体を用いた植物及び／又は藻類の除草剤抵抗性付与又は増進方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2018500909A
JP2018500909A JP2017533480A JP2017533480A JP2018500909A JP 2018500909 A JP2018500909 A JP 2018500909A JP 2017533480 A JP2017533480 A JP 2017533480A JP 2017533480 A JP2017533480 A JP 2017533480A JP 2018500909 A JP2018500909 A JP 2018500909A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
herbicide
gene
resistant
amino acid
plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2017533480A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6499292B2 (ja
Inventor
ソン・スンギ
ユン・チュンソン
ハン・ユンチョン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
FarmHannong Co Ltd
Original Assignee
FarmHannong Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by FarmHannong Co Ltd filed Critical FarmHannong Co Ltd
Publication of JP2018500909A publication Critical patent/JP2018500909A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6499292B2 publication Critical patent/JP6499292B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/54—1,3-Diazines; Hydrogenated 1,3-diazines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/03—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with oxygen as acceptor (1.3.3)
    • C12Y103/03004—Protoporphyrinogen oxidase (1.3.3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Cultivation Of Plants (AREA)

Abstract

原核生物から由来したプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（Protoporphyrinogen oxidase）変異体を用いて植物又は藻類の除草剤抵抗性付与及び／又は増進させる方法が提供される。【選択図】図１８

Description

原核生物から由来したプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（protoporphyrinogen oxidase）変異体を導入することによって農作物を含む植物及び／又は藻類に対して除草剤抵抗性を付与及び／又は増進させる発明が提供される。
ポルフィリン生合成経路は、植物の代謝過程で重要な役割を果たす葉緑素とヘム（Heme）を合成する過程で葉緑体で行われる。この経路で、プロトポルフィリノーゲンＩＸオキシダーゼ（protoporphyrinogen IX oxidase、以下、‘ＰＰＯ’という；ＥＣ：１．３．３．４）は、プロトポルフィリノーゲンＩＸ（Protoporphyrinogen IX）からプロトポルフィリンＩＸ（protoporphyrin IX）への酸化過程を触媒する。プロトポルフィリノーゲンＩＸがプロトポルフィリンＩＸに酸化された後、プロトポルフィリンＩＸは、Ｍｇ−キラターゼによってマグネシウムと結合すれば、葉緑素が合成され、Ｆｅ−キラターゼによって鉄と結合すればヘム（Heme）が合成される。
従って、ＰＰＯの活性が阻害されれば、葉緑素とヘムの合成が抑制され、基質であるプロトポルフィリノーゲンＩＸが正常なポルフィリン合成経路から離脱し、葉緑体より細胞質へ移動して、速やかにプロトポルフィリンＩＸに酸化され、細胞膜に蓄積される。このように蓄積されたプロトポルフィリンＩＸは、光と酸素分子の存在下で活性の高い一重項酸素（singlet oxygen、１Ｏ２）を発生させ、植物の細胞膜を破壊することで、植物細胞死滅を引き起こす。このような原理を利用して、ＰＰＯ活性を抑制する除草剤が開発されており、現在まで、化学構造によって、ピリミジンジオン系（Pyrimidinediones）、ジフェニルエーテル系（diphenyl−ethers）、フェニルピラゾール系（Phenylpyrazoles）、Ｎ−フェニルフタルイミド系（N-phenylphthalimides）、チアジアゾール系（Thiadiazoles）、オキサジアゾール系（oxadiazoles）、トリアゾリノン系（triazolinones）、オキサゾリジンジオン系（Oxazolidinediones）及びその他の９個の系統の除草剤が使用されている。
また、前記除草剤を使用しながらも栽培対象作物の生長には影響を及ぼさないようにするためには、栽培対象作物に前記除草剤に対する抵抗性を付与する必要性が台頭してきた。
一方、藻類（algae）は、光合成有機体として光エネルギーを、多様な有用な化合物を合成し得るエネルギーに転換することができる。例えば、藻類は、光合成によって炭素を固定させ、二酸化炭素を糖、デンプン、脂質、脂肪又は他の生体分子に転換することによって、大気中の温室ガスを除去することができる。また、藻類の大規模培養を通じて産業的酵素、治療化合物及びタンパク質、栄養物質、商業的物質、燃料物質等の多様な物質を生産することができる。
生物反応器（bioreactor）又は、公開若しくは閉鎖された池で藻類の大量培養の際に主な問題点は、これらが異なる、非常に競争的であるが望ましくない種である藻類かび及びバクテリア、その他の培養物で好ましい種を貪り食うワムシ類（rotifers）やその他の動物性プランクトン（zooplankton）により汚染され得るという点である。
従って、所望の藻類に除草剤抵抗性を付与した後、除草剤抵抗性のない競争生物の成長を阻害し得る濃度で除草剤を処理し、所望の藻類を大規模で培養することができる技術が必要とされる。
原核生物から由来したｈｅｍ ＹタイプのＰＰＯ遺伝子が9個系統のＰＰＯ活性阻害除草剤に対して、広範囲な除草剤抵抗性を付与することが検証された。また、この遺伝子が植物又は藻類に発現すれば、除草剤抵抗性形質を付与することができることが確証された。
従って、一実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；配列番号３のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；配列番号５のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び配列番号7のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選ばれる１種以上のポリペプチドを含む、植物又は藻類の除草剤に対する抵抗性付与及び／又は増進用組成物を提供する。
別の実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子；配列番号３のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子；配列番号５のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子；及び配列番号７のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子を含む、植物又は藻類の除草剤に対する抵抗性付与及び／又は増進用組成物を提供する。
一具体例で、前記遺伝子は、配列番号２の塩基配列又はこれと９５％以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子；配列番号４の塩基配列又はこれと９５％以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子；配列番号６の塩基配列又はこれと９５％以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子；又は配列番号８の塩基配列又はこれと９５％以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子を含んでもよい。
別の具体例で、前記遺伝子は、植物発現用組換え遺伝子カセットベクターの形態又は藻類発現用組換え遺伝子カセットベクターに含まれてもよい。
さらに別の具体例で、前記除草剤は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤であってもよい。
具体例で、前記除草剤は、ピリミジンジオン系（Pyrimidinediones）、ジフェニルエーテル系（diphenyl-ethers）、フェニルピラゾール系（Phenylpyrazoles）、Ｎ−フェニルフタルイミド系（N-phenylphthalimides）、チアジアゾール系（Thiadiazoles）、オキサジアゾール系（oxadiazoles）、トリアゾリノン系（triazolinones）及びオキサゾリジンジオン系（Oxazolidinediones）からなる群から選ばれる１種以上であってもよい。
具体例で、前記除草剤は、ブタフェナシル（Butafenacil）、サフルフェナシル（Saflufenacil）、ベンズフェンジゾン（Benzfendizone）、チアフェナシル（Tiafenacil）、ホメサフェン（Fomesafen）、オキシフルオルフェン（Oxyfluorfen）、アクロニフェン（Aclonifen）、アシフルオルフェン（Acifluorfen）、ビフェノックス（Bifenox）、エトキシフェン（Ethoxyfen）、ラクトフェン（Lactofen）、クロメトキシフェン（Chlomethoxyfen）、クロルニトロフェン（Chlorintrofen）、フルオログリコフェン−エチル（Fluoroglycofen-ethyl）、ハロサフェン（Halosafen）、ピラフルフェン−エチル（Pyraflufen-ethyl）、フルアゾレート（Fluazolate）、フルミオキサジン（Flumioxazin）、シニドン−エチル（Cinidon-ethyl）、フルミクロラック−ペンチル（Flumiclorac-pentyl）、フルチアセット（Fluthiacet）、チジアジミン（Thidiazimin）、オキサジアルギル（Oxadiargyl）、オキサジアゾン（oxadiazon）、カルフェントラゾン（Carfentrazone）、スルフェントラゾン（Sulfentrazone）、アザフェニジン（Azafenidin）、ペントキサゾン（Pentoxazone）、ピラクロニル（Pyraclonil）、プルルペンピル-エチル（Flufenpyr-ethyl）及びプロフルアゾール（profluazol）からなる群から選ばれる１種以上であってもよい。
別の具体例で、前記植物は、単子葉植物、双子葉植物、草本及び／又は木本植物であってもよい。
別の具体例で、前記植物又は藻類は第２除草剤抵抗性ポリペプチド又はこれをコードする遺伝子をさらに含むように遺伝子的に操作され、第２除草剤に対する抵抗性が拡大されたものであってもよい。
別の具体例で、前記第２除草剤は、細胞分裂阻害性除草剤、光合成阻害性除草剤、アミノ酸合成阻害性除草剤、色素体阻害性除草剤及び細胞膜阻害性除草剤を含むが、これらに制限されるものではない。
別の具体例で、前記第２除草剤はグリホサート（glyphosate）、グルホシネート（glufosinate）、ジカンバ（dicamba）、２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）、イソキサフルトール（Isoxaflutole）、ＡＬＳ（アセト乳酸シンターゼ）阻害性除草剤、光化学系II（photosystem II）阻害性除草剤、フェニルウレア（phenylure）系除草剤、ブロモキシニル（bromoxynil）系除草剤又はこれらの組み合わせを例示することができるが、これらに制限されるものではない。
別の具体例で、植物又は藻類に対する第２除草剤抵抗性ポリペプチドは、グリホサート除草剤抵抗性ＥＰＳＰＳ（グリホサート抵抗性5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸シンターゼ）、ＧＯＸ（グリホサートオキシダーゼ）、ＧＡＴ（グリホサート-N-アセチルトランスフェラーゼ）又はグリホサートデカルボキシラーゼ（glyphosate decarboxylase）；グルホシネート除草剤抵抗性ＰＡＴ（ホスフィノスリシン-N-アセチルトランスフェラーゼ）；ジカンバ除草剤抵抗性ＤＭＯ（モノオキシゲナーゼ）；２，４−Ｄ除草剤抵抗性２，４−Ｄモノオキシゲナーゼ又はＡＡＤ（アリルオキシアルカノエート・ジオキシゲナーゼ）；ＡＬＳ阻害性スルホニルウレア（sulfonylurea）系除草剤抵抗性ＡＬＳ（アセト乳酸シンターゼ）、ＡＨＡＳ（アセトヒドロキシ酸シンターゼ）、又はＡｔｈａｈａｓｌ（アセトヒドロキシ酸シンターゼ大型サブユニット）；光化学系II阻害性除草剤抵抗性光化学系ＩＩ（photosystem II）タンパク質Ｄ１；フェニルウレア系除草剤抵抗性チトクロームＰ４５０（Cytochrome P450）；色素体阻害性除草剤抵抗性ＨＰＰＤ（ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ）；ブロモキシニル除草剤抵抗性ニトリラーゼ（Nitrilase）；及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種以上のペプチドを例示することができるが、これらに制限されるものではない。
また、前記第２除草剤抵抗性ポリペプチドをコードする遺伝子は、グリホサート除草剤抵抗性ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ、ＥＰＳＰＳ（ＡＧ）、ＭＥＰＳＰＳ、２ＭＥＰＳＰＳ、ＧＯＸＶ２４７、ＧＡＴ４６０１又はＧＡＴ４６２１遺伝子；グルホシネート除草剤抵抗性ＢＡＲ、ＰＡＴ又はＰＡＴ（ＳＹＮ）遺伝子；ジカンバ除草剤抵抗性ＤＭＯ遺伝子；２，４−Ｄ除草剤抵抗性ＡＡＤ−１、ＡＡＤ−１２遺伝子；ＡＬＳ阻害性スルホニルウレア系除草剤抵抗性ＡＬＳ、ＧＭ−ＨＲＡ、Ｓ４−ＨＲＡ、ＺＭ−ＨＲＡ、ＣＳＲ１、ＣＳＲ１−１、ＣＳＲ１−２、ＳＵＲＡまたはＳＵＲＢ；光化学系II（photosystem II）阻害性除草剤抵抗性ＰＳＢＡ遺伝子；フェニルウレア除草剤抵抗性ＣＹＰ７６Ｂ１遺伝子；イソキサフルトール除草剤抵抗性ＨＰＰＤＰＦ Ｗ３３６遺伝子；ブロモキシニル除草剤抵抗性ＢＸＮ遺伝子；及びこれらの組み合わせからなるヌクレオチド群から選ばれる１種以上を例示することができるが、これらに制限されるものではない。
別の例は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はこれをコードする遺伝子、配列番号３のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はこれをコードする遺伝子、配列番号５のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；配列番号７のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種以上を発現される新しいか、新規及び／又は除草剤抵抗性が増進された遺伝子組換え有機体、これのクローン又は子孫、形質転換体、これのクローン又は子孫を提供する。
具体例で、遺伝子組換えのためのターゲット（target）は、藻類、植物細胞、プロトプラスト（protoplast）、カルス（callus）、胚軸（hypocotyl）、種子（seed）、子葉（cotyledon）、新梢（shoot）又は植物であってもよい。
別の例は、新しいか、新規及び／又は除草剤抵抗性が増進された遺伝子組換え植物又は藻類を製造する方法を提供しており、この方法は、藻類、植物細胞、プロトプラスト、カルス、胚軸、種子、子葉、新梢又は植物が配列番号１のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；配列番号３のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；配列番号５のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；配列番号７のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種以上を発現されるように形質転換する工程を含む。
別の例は植物又は藻類に除草剤に対する抵抗性を付与及び／又は増進させる方法を提供する。この方法は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、配列番号３のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、配列番号５のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、及び配列番号７のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子を藻類、植物細胞、プロトプラスト、カルス、胚軸、種子、子葉、新梢又は植物に形質転換する工程を含む。
別の例は、栽培地で雑草を防除する方法を提供する。この方法は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれをコードする遺伝子、配列番号３のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれをコードする遺伝子、配列番号５のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれをコードする遺伝子、及び配列番号７のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれをコードする遺伝子、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる遺伝子組換え植物を栽培地に提供する工程、及び前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する工程、を含む。
具体例で、前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する工程は、２種以上のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を順次又は同時に適用してもよい。
別の例で、前記植物は、第２除草剤抵抗性ポリペプチド又はこれをコードする遺伝子を発現されるように遺伝子変形され得る。２つの除草剤、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤及び第２除草剤は、有効量を順次又は同時に栽培地に適用してもよい。
別の実施形態は培養培地（cultivation medium）に所望しない水生生物（aquatic species）を防除する方法を提供する。前記方法は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；配列番号３のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；配列番号５のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；配列番号７のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれるポリペプチド又は遺伝子を含む遺伝子組換え藻類を培養培地に提供する工程、及び前記培養培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する工程を含む。
一実施形態は、植物又は藻類に除草剤抵抗性付与用及び／又は増進用組成物を提供する。この組成物は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチド；配列番号３のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチド；配列番号５のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチド；及び配列番号７のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチド；及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種以上のポリペプチドを含んでもよい。
別の実施形態は、植物又は藻類に除草剤抵抗性付与用及び／又は増進用組成物を提供する。この組成物は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含くむか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子；配列番号３のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子；配列番号５のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子；配列番号７のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子；及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種以上の遺伝子を含んでもよい。
さらに別の実施形態は、植物又は藻類に除草剤抵抗性付与及び／又は増進用で用いるためのポリペプチドを提供しており、このポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチド；配列番号３のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチド；配列番号５のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチド；及び配列番号７のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチド；及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種以上である。
さらに別の実施形態は、植物又は藻類に除草剤抵抗性付与及び／又は増進用で用いるための遺伝子を提供しており、この遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子；配列番号３のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子；配列番号５のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子；配列番号７のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子；及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種以上である。
さらに別の実施形態は、前記遺伝子で形質転換された除草剤抵抗性を有する形質転換体を提供する。
さらに別の実施形態は、前記遺伝子を藻類、植物細胞、プロトプラスト、カルス、胚軸、種子、子葉、新梢又は植物に形質転換する工程を含む、除草剤抵抗性を有する植物又は藻類を製造する方法を提供する。
さらに別の実施形態は、前記遺伝子を藻類、植物細胞、プロトプラスト、カルス、胚軸、種子、子葉、新梢又は植物に形質転換する工程を含む、植物又は藻類に除草剤抵抗性を付与及び／又は増進させる方法を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本願では、オスキラトリアニグロ−ビリディス（Oscillatoria nigro-viridis）ＰＣＣ７１１２から由来したＰＰＯを提供しており、これをＣｙＰＰＯ２と命名し、このアミノ酸配列を配列番号１で表し、これをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２で表す。
また、リングビア属（Lyngbya sp.）ＰＣＣ８１０６菌株から由来したＰＰＯを提供しており、これをＣｙＰＰＯ４と命名し、これのアミノ酸配列を配列番号３として、これをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号４として提供する。
また、ハロテース属（Halothece sp.）ＰＣＣ７４１８菌株から由来したＰＰＯを提供しており、これをＣｙＰＰＯ８と命名し、これのアミノ酸配列を配列番号５で、これをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号６として提供する。
また、ミクロコレウスヴァギナツ（Microcoleusvaginatus）菌株から由来したＰＰＯを提供して、これをＣｙＰＰＯ１２で命名して、これのアミノ酸配列を配列番号７で表し、これをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号８で表す。ｙＰＰＯ１２のアミノ酸配列は、ＣｙＰＰＯ２のアミノ酸配列と９４％の配列相同性を示す。
本願で提供する除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質は、分子の活性を全体的に変更させない範囲内で追加的な変移を含んでいてもよい。このような変移は、アミノ酸の置換、結実、付加及び／又は挿入を含む。例えば、分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸置換は当該分野に公知されている。例えば、通常的に起こる置換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の両方向置換が挙げられるが、これらに制限されるものではない。場合に応じて、前記タンパク質は、リン酸化（phosphorylation）、硫化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、糖化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）等によって修飾（modification）され得る。また、アミノ酸配列上の変移又は修飾によってタンパク質の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性が増加するか、タンパク質活性が増加したタンパク質変異体含んでもよい。
また、前記除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質は、前記配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号７のアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチドと生物学的均等の活性を示す変異体を含む。前記変異体は、野生型（wild type）又はベンチマーク基準タンパク質と比較して、アミノ酸の置換、結実、付加及び／又は挿入を含んでもよく、野生型又はベンチマーク基準タンパク質と類似又は同等な生物学的活性を示す。これと関連して、用語「配列相同性」とは、野生型又は基準になるアミノ酸配列又は塩基配列との類似程度を示すためのものである。本発明の除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上同一性のアミノ酸残基を含みながら、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号７のアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチドと生物学的に均等の活性を保有するものであれば、いずれのタンパク質も本発明の範囲に含まれる。このようなタンパク質相当物は、目的タンパク質と同じ活性部位を含むことができる。このような相同性の比較は肉眼、又は購入が容易な比較プログラムを利用して行える。市販されるコンピュータプログラムは、２個以上の配列間の相同性を百分率（％）で計算することができ、相同性（％）は、隣接した配列に対して計算される。比較のための配列整列方法は当業界に知らされた方法を使用してもよく、例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含む。
また、本発明で利用される除草剤抵抗性ＰＰＯ遺伝子は、前記配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号７のアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列と機能的に均等なコドン又は（コドンの縮退性により）同じアミノ酸をコードするコドン、又は生物学的に均等のアミノ酸をコードするコドンを含む核酸分子を含む。又は、本発明の除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列と任意の他の塩基配列を最大限対応するように配列し、当業界で通常的に利用されるアルゴリズムを利用して配列された配列を分析した場合に、少なくとも６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上同一性塩基を含みながら、前記除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質と生物学的に均等の活性を保有するタンパク質をコードするものであれば、本発明の範囲に含まれる。
一実施形態で、本願で提供する除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと９５％又は９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチド；配列番号３のアミノ酸配列又はこれと９５％又は９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチド；配列番号５のアミノ酸配列又はこれと９５％又は９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチド；配列番号７のアミノ酸配列又はこれと９５％又は９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチド；及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種以上のポリペプチドを含む。
また、除草剤抵抗性ＰＰＯ遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと９５％又は９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子；配列番号３のアミノ酸配列又はこれと９５％又は９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子；配列番号５のアミノ酸配列又はこれと９５％以上又は９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子；配列番号７のアミノ酸配列又はこれと９５％又は９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子；及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種以上の遺伝子を含む。
前記遺伝子は、例えば、配列番号２の塩基配列又はこれと９５％又は９８％以上の相同性を有する塩基配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなる遺伝子；配列番号４の塩基配列又はこれと９５％又は９８％以上の相同性を有する塩基配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなる遺伝子；配列番号６の塩基配列又はこれと９５％又は９８％以上の相同性を有する塩基配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなる遺伝子；配列番号８の塩基配列又はこれと９５％又は９８％以上の相同性を有する塩基配列を含むか、必須的にこれら配列からなるか、これら配列からなる遺伝子；及び／又はこれらの組み合わせであってもよいが、これらに制限されるものではない。
前記除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質は、当分野に広く公知された方法を用いて天然から抽出及び精製して得ることができる。又は、化学的に合成された合成タンパク質又は遺伝子組換え技術を利用した組換えタンパク質として得ることができる。化学的に合成して製造する場合、当分野に広く公知されたポリペプチド合成法を利用して得ることができる。遺伝子組換え技術を利用する場合、除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質をコードする核酸を適切な発現ベクターに挿入し、ベクターで宿主細胞を形質転換し、目的タンパク質が発現されるように宿主細胞を培養した後、宿主細胞から除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質を回収する過程で得ることができる。タンパク質は、選ばれた宿主細胞で発現された後、分離及び精製のために通常の生化学分離技術、例えば、タンパク質沈殿剤による処理（塩析）、遠心分離、超音波破砕、限外ろ過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和度クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどを利用することができ、通常的に純度の高いタンパク質を分離するためにこれらを組み合わせて利用する。
前記除草剤抵抗性ＰＰＯ核酸分子は、標準分子生物学技術、例えば、化学的合成方法又は組換え方法を利用して分離又は製造するか、市販されるものを使用することができる。
具体的な実施形態で、前記ＰＰＯは、ＰＰＯが欠乏された大腸菌ＢＴ３（ΔＰＰＯ）を用いた除草剤抵抗性検証システムを通じて、化学構造に応じて９個の系統に属する代表的なＰＰＯ活性阻害除草剤に対して、広範囲な除草剤抵抗性を示すことが検証された。また、アグロバクテリウム形質転換によってタバコ葉で発現可能であることが確認されており、輸送ペプチド（transit peptide；ＴＰ）を使用すれば、植物の葉緑体で発現され得ることが確認された。また、前記ＰＰＯは、植物発現用ベクターによってシロイヌナズナ（ecotype Columbia）で発現が可能であり、このように形質転換された植物にＰＰＯ活性阻害除草剤を処理しても植物が発芽して生長することが確認された。しかも、遺伝研究を通じて上のような除草剤抵抗性形質が後代に継承されることが確認された。
従って、本願で提供するＰＰＯを植物又は藻類に導入することによって、植物又は藻類の除草剤抵抗性を増進させるために使用され得る。
本願の用語「除草剤」とは、植物又は藻類を死滅又は防除するか、又は植物又は藻類の生長を不利に調整する活性成分を意味する。また、本願において、「除草剤耐性」又は「除草剤抵抗性」とは、正常又は野生型の植物又は藻類を正常に死滅させるか、その生長を正常に抑制させる除草剤を処理しても、正常又は野生型の植物又は、藻類に比べて植物又は藻類生長の阻害程度が弱くなるか、除去され、植物又は藻類生長が持続的に続けられることを意味する。前記除草剤は、植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）を抑制する除草剤を含む。このようなＰＰＯ阻害除草剤は、化学構造に応じて、ピリミジンジオン系（Pyrimidinediones）、ジフェニルエーテル系（diphenyl-ethers）、フェニルピラゾール系（フェニルピラゾール）、Ｎ−フェニルフタルイミド系（N-phenylphthalimides）、チアジアゾール系（Thiadiazoles）、オキサジアゾール系（oxadiazoles）、トリアゾリノン系（triazolinones）、オキサゾリジンジオン系（Oxazolidinediones）及びその他の除草剤が挙げられる。
一実施形態で、ピリミジンジオン系除草剤は、ブタフェナシル（Butafenacil）、サフルフェナシル（Saflufenacil）、ベンズフェンジゾン（Benzfendizone）及びチアフェナシル（Tiafenacil）を含むが、これらに制限されない。
ジフェニルエーテル系除草剤は、ホメサフェン（Fomesafen）、オキシフルオルフェン（oxyfluorfen）、アクロニフェン（aclonifen）、アシフルオルフェン（acifluorfen）、ビフェノックス（bifenox）、エトキシフェン（Ethoxyfen）、ラクトフェン（Lactofen）、クロメトキシフェン（chlomethoxyfen）、クロルニトロフェン（chlorintrofen）、フルオログリコフェン−エチル（fluoroglycofen-ethyl）及びハロサフェン（halosafen）を含むが、これらに制限されない。
フェニルピラゾール系除草剤は、ピラフルフェン−エチル（Pyraflufen-ethyl）及びフルアゾレート（fluazolate）を含むが、これらに制限されない。
フェニルフタルイミド系除草剤は、フルミオキサジン（flumioxazin）、シニドン−エチル（Cinidon-ethyl）及びフルミクロラック−ペンチル（flumiclorac-pentyl）を含むが、これらに制限されない。
チアジアゾール系除草剤は、フルチアセット（Fluthiacet）及びチジアジミン（thidiazimin）を含むが、これらに制限されない。
オキサジアゾール系除草剤は、オキサジアルギル（Oxadiargyl）及びオキサジアゾン（oxadiazon）を含むが、これらに制限されない。
トリアゾリノン系除草剤は、カルフェントラゾン（carfentrazone）、スルフェントラゾン（sulfentrazone）及びアザフェニジン（azafenidin）を含むが、これらに制限されない。
オキサゾリジンジオン系除草剤は、ペントキサゾン（Pentoxazone）を含むが、これらに制限されない。
その他の除草剤は、ピラクロニル（Pyraclonil）、フルフェンピル−エチル（flufenpyr-ethyl）及びプロフルアゾール（profluazol）を含むが、これらに制限されない。
本願で提供される除草剤抵抗性ＰＰＯ遺伝子は、当業界に公知された多様な方法によって植物又は藻類内に導入されてもよく、好ましくは、植物又は藻類形質転換用発現ベクターが利用され得る。
ベクターに含まれる適切なプロモーターは、植物又は藻類への遺伝子導入のために当業界で通常的に利用される任意のものであってもよい。例えば、ＳＰ６プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＰＭプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーター（maize ubiquitin promoter）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモーター、フィッグウォートモザイクウイルス（figwort mosaic virus）３５Ｓプロモーター、サトウキビバチルス状ウイルスプロモーター（sugarcane bacilliform virus promoter）、ツユクサ黄斑パイロロスプロモーター（commelina yellow mottle virus promoter）、リブロース−１，５−ビス−リン酸塩カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）の光誘導性プロモーター、稲サイトソルトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、アラビドプシスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）プロモーター、オクトピンシンターゼプロモーター（octopine synthase promoter）及びＢＣＢ（blue copper binding protein）プロモーターを含むが、これらに制限されるものではない。
また、前記ベクターは、３’−末端のポリアデニル化を引き起こすポリＡシグナル配列を含んでいてもよく、例えば、アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノパリンシンターゼ遺伝子から由来したもの（ＮＯＳ ３’−末端）、アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオクトピンシンターゼ遺伝子から由来したターミネータ（octopine synthase terminator）、トマト又はジャガイモのプロテアーゼ抑制因子Ｉ又はＩＩ遺伝子の３’−末端の部分、ＣａＭＶ ３５Ｓ ターミネータ、稲α−アミラーゼＲＡｍｙ１ Ａ ターミネータ及びファセオリン（phaseoline）ターミネータを含むが、これらに制限されるものではない。
また、藻類形質転換用プロモーターは、葉緑体特異的プロモーター、核プロモーター、構成（constitutive）プロモーター又は誘導（inducible）プロモーターであってもよい。除草剤−抵抗性ＰＰＯ遺伝子をコードする遺伝子は、藻類の核内で機能する５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲに作動可能に連結されてもよい。また、藻類形質転換用ベクターは、藻類の核内で遺伝子を発現されるための転写調節配列を含んでもよい。除草剤抵抗性を付与する組換え遺伝子は、宿主藻類の核ゲノム又は葉緑体ゲノム内に統合されてもよい。
また、前記ベクターは、除草剤抵抗性ＰＰＯ遺伝子を葉緑体に発現させるために、葉緑体でのターゲッティングに必要な輸送ペプチドをＰＰＯ遺伝子の５'−末端に連結してもよい。
また、前記ベクターは、選択的に、リポーター分子として選択標識をコードする遺伝子をさらに含んでもよく、選択標識の例として、抗生剤（例：ネオマイシン、カルベニシリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、クロラムフェニコールなど）又は除草剤（グリホサート、グルホシネート、ホスフィノトリシンなど）耐性遺伝子などを含むが、これらに制限されるものではない。
また、植物発現用組換えベクターは、アグロバクテリウム（Agrobacterium）二値ベクター、共和分ベクター（cointegration vector）又はＴ−ＤＮＡ部位を含まないが、植物で発現するようにデザインされた一般ベクターが使用されてもよい。この中で、二値ベクターは、Ｔｉ（tumor inducible）プラスミドで移動に必要な部分であるＬＢ（left border）とＲＢ（right border）を有するプラスミドと標的ヌクレオチドを移すのに必要な他のプラスミドを有する二つの分離されたベクターシステムを含むベクターを意味しており、このベクターは、植物で発現させるためのプロモーター部位とポリアデニル化信号配列を含む。
前記で二値ベクター又は共和分ベクターを使用する場合、植物体に前記組換えベクターを導入するための形質転換用菌株としてはアグロバクテリウムを使用することが好ましい（Agrobacterium-mediated transformation）。このとき、アグロバクテリウムツメファシエンス又はアグロバクテリウムリゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を使用することができる。その他に、Ｔ−ＤＮＡ部位を含まないベクターを利用する場合には、電気穿孔法（electroporation）、パーティクル・ガン法（microparticle bombardment）、ポリエチレングリコール沈殿法（polyethylene glycol-mediated uptake）等が組換えプラスミドの植物への導入に利用することができる。
前記のような方法で遺伝子が導入された形質転換植物は、当業界に公知された標準技術を用いてカルス誘導、発根及び土壌純化のような過程を通じて植物に再分化させることができる。
本願で形質転換の対象となる植物は、成熟した植物だけでなく、植物細胞（懸濁培養細胞含む）、プロトプラスト、カルス、胚軸、種子、子葉、新梢などを全部含む意味として理解される。
また、本願の形質転換体の範疇には、前記遺伝子が導入された形質転換体だけでなく、これのクローン又は子孫（Ｔ１世代、Ｔ２世代又はそれ以上）を含む。例えば、本願の遺伝子で形質転換された植物の無性又は有性子孫として除草剤抵抗性形質が遺伝された植物も本発明の形質転換植物の範疇に含まれる。また、本願の遺伝子が形質転換された植物のすべての交配及び融合産物と共に、初期形質転換された植物の特性を示すすべての突然変異体及び変異体が本発明の範疇に含まれる。しかも、本発明の方法で予め形質転換させた形質転換された植物、又はこれらの子孫から由来し、形質転換された細胞の少なくとも一部からなる種子、花、幹、果実、葉、根元、塊茎（tuber）、塊根（tuberous root）のような植物の一部も本発明の範疇に含まれる。
本発明が適用される植物は、特に制限されなく、単子葉又は双子葉植物を含む。また、草本又は木本植物を含む。前記単子葉植物は、オモダカ科（Alismataceae）、トチカガミ科（Hydrocharitaceae）、シバナ科（Juncaginaceae）、ホロムイソウ科（Scheuchzeriaceae）、ヒルムシロ科（Potamogetonaceae）、イバラモ科（Najadaceae）、アマモ科（Zosteraceae）、ユリ科（Liliaceae）、ハエモドルム科（Haemodoraceae）、リュウゼツラン科（Agavaceae）、ヒガンバナ科（Amaryllidaceae）、ヤマノイモ科（Dioscoreaceae）、ミズアオイ科（Pontederiaceae）、アヤメ科（Iridaceae）、ヒナノシャクジョウ科（Burmanniaceae）、イグサ科（Juncaceae）、ツユクサ科（Commelinaceae）、ホシクサ科（Eriocaulaceae）、イネ科（Gramineae,Poaceae）、サトイモ科（Araceae）、ウキクサ亜科（Lemnaceae）、ミクリ科（Sparganiaceae）、ガマ科（Typhaceae）、カヤツリグサ科（Cyperaceae）、バショウ科（Musaceae）、ショウガ科（Zingiberaceae）、カンナ科（Cannaceae）、ラン科（Orchidaceae）の植物を含むが、これらに制限されるものではない。
前記双子葉植物は、イワウメ科（Diapensiaceae）、リョウブ科（Clethraceae）、イチヤクソウ科（Pyrolaceae）、ツツジ科（Ericaceae）、ヤブコウジ科（Myrsinaceae）、サクラソウ科（Primulaceae）、イソマツ科（Plumbaginaceae）、カキノキ科（Ebenaceae）、エゴノキ科（Styracaceae）、ハイノキ科、ハイノキ科（Symplocaceae）、モクセイ科（Oleaceae）、マチン科（Loganiaceae）、リンドウ科（Gentianaceae）、ミツガシワ科（Menyanthaceae）、キョウチクトウ科（Apocynaceae）、ガガイモ科（Asclepiadaceae）、アカネ科（Rubiaceae）、ハナシノブ科（Polemoniaceae）、ヒルガオ科（Convolvulaceae）、ムラサキ科（Boraginaceae）、クマツヅラ科（Verbenaceae）、シソ科（Labiatae）、ナス科（Solanaceae）、ゴマノハグサ科（Scrophulariaceae）、ノウゼンカズラ科（Bignoniaceae）、キツネノマゴ科（Acanthaceae）、ゴマ科（Pedaliaceae）、ハマウツボ科（Orobanchaceae）、イワタバコ科（Gesneriaceae）、タヌキモ科（Lentibulariaceae）、ハエドクソウ科（Phrymaceae）、オオバコ科（Plantaginaceae）、スイカズラ科（Caprifoliaceae）、レンプクソウ科（Adoxaceae）、オミナエシ科（Valerianaceae）、マツムシソウ科（Dipsacaceae）、キキョウ科（Campanulaceae）、キク科（Compositae）、ヤマモモ科（Myricaceae）、クルミ科（Juglandaceae）、ヤナギ科（Salicaceae）、カバノキ科（Betulaceae）、ブナ科（Fagaceae）、ニレ科（Ulmaceae）、クワ科（Moraceae）、イラクサ科（Urticaceae）、ビャクダン科（Santalaceae）、オオバヤドリギ科（Loranthaceae）、タデ科（Polygonaceae）、ヤマゴボウ科（Phytolaccaceae）、オシロイバナ科（Nyctaginaceae）、ハマミズナ科（Aizoaceae）、スベリヒユ科（Portulacaceae）、ナデシコ科（Caryophyllaceae）、アカザ科（Chenopodiaceae）、ヒユ科（Amaranthaceae）、サボテン科（Cactaceae）、モクレン科（Magnoliaceae）、マツブサ科（Illiciaceae）、クスノキ科（Lauraceae）、カツラ科（Cercidiphyllaceae）、キンポウゲ科（Ranunculaceae）、メギ科（Berberidaceae）、アケビ科（Lardizabalaceae）、ツヅラフジ科（Menispermaceae）、スイレン科（Nymphaeaceae）、マツモ科（Ceratophyllaceae）、ハゴロモモ科（Cabombaceae）、ドクダミ科（Saururaceae）、コショウ科（Piperaceae）、センリョウ科（Chloranthaceae）、ラット鈴ツルと（Aristolochiaceae）、サルナシ課（Actinidiaceae）、ツバキ科（Theaceae）、フクギ科（Guttiferae）、モウセンゴケ科（Droseraceae）、ケシ科（Papaveraceae）、フウチョウソウ科（Capparidaceae）、アブラナ科（Cruciferae）、スズカケノキ科（スズカケノキ科、Platanaceae）、マンサク科（Hamamelidaceae）、ベンケイソウ科（Crassulaceae）、ユキノシタ科（Saxifragaceae）、トチュウ科（Eucommiaceae）、トベラ科（Pittosporaceae）、バラ科（Rosaceae）、マメ科（Leguminosae）、カタバミ科（Oxalidaceae）、フウロソウ科（Geraniaceae）、ノウゼンハレン科（Tropaeolaceae）、ハマビシ科（Zygophyllaceae）、アマ科（Linaceae）、トウダイグサ科（Euphorbiaceae）、オオバコ科（Callitrichaceae）、ミカン科（Rutaceae）、ニガキ科（Simaroubaceae）、センダン科（Meliaceae）、ヒメハギ科（Polygalaceae）、ウルシ科（Anacardiaceae）、カエデ科（カエデ科、Aceraceae）、ムクロジ科（Sapindaceae）、トチノキ科（Hippocastanaceae）、アワブキ科（Sabiaceae）、ツリフネソウ科（Balsaminaceae）、モチノキ科（Aquifoliaceae）、ニシキギ科（ニシキギ科、Celastraceae）、ミツバウツギ科（Staphyleaceae）、ツゲ科（Buxaceae）、ガンコウラン科（Empetraceae）、クロウメモドキ科（Rhamnaceae）、ブドウ科（Vitaceae）、ホルトノキ科（Elaeocarpaceae）、シナノキ科（Tiliaceae）、アオイ科（Malvaceae）、アオギリ科（Sterculiaceae）、ジンチョウゲ科（Thymelaeaceae）、グミ科（Elaeagnaceae）、イイギリ科（Flacourtiaceae）、スミレ科（Violaceae）、トケイソウ科（Passifloraceae）、ギョリュウ科（Tamaricaceae）、ミゾハコベ科（Elatinaceae）、シュウカイドウ科（Begoniaceae）、ウリ科（Cucurbitaceae）、ミソハギ科（Lythraceae）、ザクロ科（Punicaceae）、アカバナ科（Onagraceae）、アリノトウグサ科（Haloragaceae）、ウリノキ科（Alangiaceae）、ミズキ科（Cornaceae）、ウコギ科（Araliaceae）、セリ科（Umbelliferae, Apiaceae）の植物を含むが、これに対し限定されるのではない。
具体例で、稲、小麦、麦、トウモロコシ、大豆、ジャガイモ、小麦、小豆、燕麦及びモロコシを含む食用作物類；シロイヌナズナ、ハクサイ、ダイコン、唐辛子、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、パー（ネギ）、タマネギ及びニンジンを含む野菜作物類；人参、タバコ、綿、馬草、牧草、ゴマ、サトウキビ、テンサイ、エゴマ、ピーナッツ、アブラナ、芝及びトウゴマを含む特用作物類；リンゴの木、梨の木、ナツメ、桃、キーウィフルーツ、ブドウ、ミカン、柿、スモモ、アンズ及びバナナを含む果樹類；松、ヤシ油及びユーカリプタスを含む木本類；バラ、グラジオラス、ガーベラ、カーネーション、菊、ユリ及びチューリップを含む花卉類；及びライグラス、レッドクローバー、オーチャードグラス、アルファルファ、トールフェスク及びペレニアルライグラスを含む飼料作物類を含むが、これらに制限されない。具体例で、前記植物は、シロイヌナズナ、ジャガイモ、ナス、タバコ、唐辛子、トマト、ゴボウ、春菊、チシャ、桔梗、ホウレンソウ、フダンソウ、サツマイモ、セロリ、ニンジン、セリ、パセリ、白菜、キャベツ、カラシナダイコン、スイカ、マクワウリ、キュウリ、カボチャ、瓢、イチゴ、大豆、緑豆、インゲン豆、又はエンドウなどの双子葉植物が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
本発明が適用される藻類は原核藻類又は真核藻類を含むが、特にこれらに制限されない。一部実施形態で、前記藻類はシアノバクテリア類、緑藻類、紅藻類、褐藻類、大型藻類又は微細藻類であってもよい。
シアノバクテリア類としては、ｐｈｙｌａ Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓ（Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ、Ａｐｈａｎｏｔｅｃｅ、Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ、Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｒｏｏｇｌｏｅｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｃｙａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓ、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ、Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ、Ｈａｌｏｔｈｅｃｅ、Ｊｏｈａｎｎｅｓｂａｐｔｉｓｔｉａ、Ｍｅｒｉｓｍｏｐｅｄｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｒａｄｉｏｃｙｓｔｉｓ、Ｒｈａｂｄｏｄｅｒｍａ、Ｓｎｏｗｅｌｌａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｗｏｒｏｎｉｃｈｉｎｉａを含む）、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ（Ｍｉｃｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ、Ｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ、Ｒｉｖｕｌａｒｉａｃｅａｅ、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａｔａｃｅａｅを含む）、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ（Ａｒｔｈｒｏｎｅｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ、Ｂｌｅｎｎｏｔｈｒｉｘ、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ、Ｇｅｉｔｌｅｒｉｎｅｍａ、Ｈａｌｏｍｉｃｒｏｎｅｍａ、Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｈｙｄｒｏｃｏｌｅｕｍ、Ｊａａｇｉｎｅｍａ、Ｋａｔａｇｎｙｍｅｎｅ、Ｋｏｍｖｏｐｈｏｒｏｎ、Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａ、Ｌｉｍｎｏｔｈｒｉｘ、Ｌｙｎｇｂｙａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ、Ｐｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｔｈｒｉｘ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ,Ｓｔａｒｒｉａ、Ｓｙｍｐｌｏｃａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ、Ｔｙｃｈｏｎｅｍａを含む）、 Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａｌｅｓ（Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐａ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐｅｌｌａ、Ｍｙｘｏｓａｒｃｉｎａ、Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ、Ｓｏｌｅｎｔｉａ、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ、Ｘｅｎｏｃｏｃｃｕｓを含む）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒａｌｅｓ、又はＳｔｉｇｏｎｅｍａｔａｌｅｓ（Ｃａｐｓｏｓｉｒａ、Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ、Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ、Ｈａｐａｌｏｓｉｐｈｏｎ、Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｏｐｓｉｓ、Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ、Ｎｏｓｔｏｃｈｏｐｓｉｓ、Ｓｔｉｇｏｎｅｍａ、Ｓｙｍｐｈｙｏｎｅｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｎｅｍｏｐｓｉｓ、Ｕｍｅｚａｋｉａ、Ｗｅｓｔｉｅｌｌｏｐｓｉｓを含む)であってもよい。
前記藻類は、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｖｏｌｖａｃａｌｅｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、又はＨｅｍａｔｏｃｏｃｃｍ種をさらに含んでもよい。
前記藻類は、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ ｈｙａｌｉｎｅ、Ａｍｐｈｏｒａ ｓｐｐ．、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ｃｏｍｍｕｎｉｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｏｂ ｌｉｑｕｕｓ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｕｅｃｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｕｌａｔａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓａｌｉｎａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ、 Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ｐａｌｅａ、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ ｃａｒｔｅｒａｅ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｃｈｕｉｉ、Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐｐ．、Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ ｓｐｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．、 Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ ｓｐｐ．をさらに含んでもよい。しかし、前記目録は排他的なものではなく、他の多様な種及び属の藻類も同様に使用可能であることは、当業者に明らかであろう。
本願で提供する除草剤抵抗性ＰＰＯが導入された植物又は藻類は、２種以上のＰＰＯ阻害除草剤に対して、抵抗性を示してもよい。
従って、本発明の一実施形態で、２種以上のＰＰＯ阻害除草剤を順次、又は同時に用いることによって、雑草及び／又は望ましくない水生生物を防除するのに使用され得る。
一例で、本発明は、前述した除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質又はこれをコードする遺伝子を含む植物を栽培地に提供する工程、及び前記栽培地に２種以上のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を順次又は同時に適用する工程、を含む栽培地で雑草を防除する方法を提供する。
また、本発明は、前述した除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質又はこれをコードする遺伝子を含む藻類を培養培地に提供する工程、及び前記培養培地に２種以上のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を順次又は同時に適用する工程、を含む培養培地で所望しない水生生物を防除する方法を提供する。
また、本発明で提供する除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質又は遺伝子は、第２除草剤抵抗性ポリペプチド又はこれをコードする遺伝子と組み合わせて使用することができる。
従って、本願で提供する除草剤抵抗性ＰＰＯが導入された植物又は藻類は、作用機序が異なる２種以上の除草剤に対して抵抗性を示すことができる。従って、本発明は、作用機序がＰＰＯ阻害除草剤を含む異なる２種以上の除草剤を順次、又は同時に用いることによって、雑草及び／又は所望しない水生生物を除去するのに使用することができる。以下、ＰＰＯ阻害除草剤と作用機序が異なる除草剤を「第２除草剤」と称する。
一例で、本発明は、前述した除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質又はこれをコードする遺伝子；及び第２除草剤抵抗性ポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；を含む、植物又は藻類の除草剤に対する抵抗性付与及び／又は増進用ペプチド又はヌクレオチド組成物を提供する。
また、本発明は前述した除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質又はこれをコードする遺伝子；及び第２除草剤抵抗性ポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；を含む、新規又は増進された除草剤抵抗性を有する形質転換体、これのクローン又は子孫を提供する。
また、本発明は前述した除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質又はこれをコードする遺伝子；及び第２除草剤抵抗性ポリペプチド又はこれをコードする遺伝子で、藻類、植物細胞、プロトプラスト、カルス、胚軸、種子、子葉、新梢又は植物を形質転換する工程を含む、新規又は増進された除草剤抵抗性を有する植物又は藻類を製造する方法を提供する。
また、本発明は、前述した除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質又はこれをコードする遺伝子；及び第２除草剤抵抗性ポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；を含む植物を栽培地に提供する工程、及び前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤及び第２除草剤の有効量を順次又は同時に適用する工程、を含む栽培地で雑草を防除する方法を提供する。
また、本発明は前述した除草剤抵抗性ＰＰＯタンパク質又はこれをコードする遺伝子；及び第２除草剤抵抗性ポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；を含む藻類を培養培地に提供する工程、及び前記培養培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤及び第２除草剤の有効量を順次又は同時に適用する工程、を含む培養培地で所望しない水生生物を防除する方法を提供する。
具体的な実施形態で、前記植物又は藻類は、第２除草剤抵抗性ポリペプチド又はこれをコードする遺伝子をさらに含むことによって、前記第２除草剤に対する新規又は増進された抵抗性を有することができる。
他の具体的な実施形態で、前記第２除草剤は、細胞分裂阻害性除草剤、光合成阻害性除草剤、アミノ酸合成阻害性除草剤、色素体阻害性除草剤及び細胞膜阻害性除草剤及び／又はこれらの組み合わせを含むが、これらに制限されるものではない。具体例で、前記第２除草剤は、グリホサート（glyphosate）、グルホシネート（glyphosate）、ジカンバ（dicamba）、２，４−Ｄ（2,4-ジクロロフェノキシ酢酸）、ＡＬＳ（アセト乳酸シンターゼ）阻害性除草剤（例えば、イミダゾリジノン、スルホニルウレア、トリアゾールピリミジン、スルホアニリド、ピリミジンチオベンゾエートなど）、光化学系II（photosystem II）阻害性除草剤、フェニルウレア（phenylure）系除草剤、色素体阻害性除草剤、ブロモキシニル（bromoxynil）系除草剤及び／又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに制限されるものではない。
別の具体的な実施形態で、第２除草剤抵抗性ポリペプチドはグリホサート除草剤抵抗性ＥＰＳＰＳ（グリホサート抵抗性5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸シンターゼ）、ＧＯＸ（グリホサートオキシダーゼ）、ＧＡＴ（グリホサート-N-アセチルトランスフェラーゼ）又はグリホサートデカルボキシラーゼ（glyphosate decarboxylase）；グルホシネート除草剤抵抗性ＰＡＴ（ホスフィノスリシン-N-アセチルトランスフェラーゼ）；ジカンバ除草剤抵抗性ＤＭＯ（モノオキシゲナーゼ）；２，４−Ｄ除草剤抵抗性２,４−Ｄモノオキシゲナーゼ又はＡＡＤ（アリルオキシアルカノエート・ジオキシゲナーゼ）；ＡＬＳ阻害性スルホニルウレア（sulfonylurea）系除草剤抵抗性ＡＬＳ（アセト乳酸シンターゼ）、ＡＨＡＳ（アセトヒドロキシ酸シンターゼ）、又はＡｔｈａｈａｓｌ（アセトヒドロキシ酸シンターゼ大型サブユニット）；光化学系II阻害性除草剤抵抗性光化学系ＩＩ（photosystem II）タンパク質Ｄ１；フェニルウレア系除草剤抵抗性チトクロームＰ４５０（Cytochrome P450）；色素体阻害性除草剤抵抗性ＨＰＰＤ（Hydorxylphenylpyruvated ioxygenase）；ブロモキシニル除草剤抵抗性ニトリラーゼ（Nitrilase）；及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれてもよいが、これらに制限されるものではない。
また、前記第２除草剤抵抗性ポリペプチドをコードする遺伝子はグリホサート除草剤抵抗性ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ、ＥＰＳＰＳ（ＡＧ）、ＭＥＰＳＰＳ、２ＭＥＰＳＰＳ、ＧＯＸＶ２４７、ＧＡＴ４６０１又はＧＡＴ４６２１遺伝子；グルホシネート除草剤抵抗性ＢＡＲ、ＰＡＴ又はＰＡＴ（ＳＹＮ）遺伝子；ジカンバ除草剤抵抗性DMO遺伝子；２，４−Ｄ除草剤抵抗性ＡＡＤ−１、ＡＡＤ−１２遺伝子；ＡＬＳ阻害性スルホニルウレア系除草剤抵抗性ＡＬＳ、ＧＭ−ＨＲＡ、Ｓ４−ＨＲＡ、ＺＭ−ＨＲＡ、ＣＳＲ１、ＣＳＲ１−１、ＣＳＲ１−２、ＳＵＲＡ又はＳＵＲＢ；光化学系II（photosystem II）阻害性除草剤抵抗性ＰＳＢＡ遺伝子；フェニルウレア除草剤抵抗性ＣＹＰ７６Ｂ１遺伝子；イソキサフルトール除草剤抵抗性ＨＰＰＤＰＦ Ｗ３３６遺伝子、ブロモキシニル除草剤抵抗性ＢＸＮ遺伝子；及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれるものが挙げられるが、これらに制限されるものではない。
本発明は多くの異なる形態で実施することができ、本明細書に開示された実施形態に制限されない。これら実施形態は本開示を全体的、且つ完全にするために提供されたものであり、当業者は本発明の範囲を十分に知ることができる。同じ参照番号は本明細書全般に亘って同じ要素を指す。
「第１」、「第２」、「第３」などの用語は多様な要素や成分を記述するために使用され、これらの要素や成分はこれら用語によって制限されない。このような用語は単に、ある要素や成分を他の要素や成分から区別するために使用される。
本明細書で使用された用語は、特定実施形態を記述するために使用されたものであり、制限するために使用されたものではない。本明細書で単数形態、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に明確に表示しない限り、複数形態を含む。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び／又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」又は「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び／又は「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は、本明細書で言及された特徴、要素及び／又は成分の存在を特定するためのものであり、一つ以上の他の特徴、要素又は成分及び／又はこれら群の存在又は追加を排除しない。ここで、用語「及び／又は」は、関連した記載事項の一つ以上の全て、そして任意の組み合わせを含む。
本発明は、多様な実施形態と関連して詳細に記述されるが、これら開示された実施形態に制限されない。本発明は、記載されていないが、本発明の範囲に符合する多様な変動、代替、置換又は均等の再配列を含むように変形され得る。
本発明で提供する除草剤抵抗性ＰＰＯを植物又は藻類に適用することによって、除草剤抵抗性形質と除草剤を用いた選別的防除を通じて経済的に雑草を防除することができる。
チアフェナシルを添加しないか、２μＭ又は１０μＭを添加したＣＲＢＩＰ培地（Institut Pasteur, France）でハロテース属ＰＣＣ ７４１８菌株を培養し、８日後の菌株の生長を観察した写真である。
本発明の大腸菌ＢＴ３（ΔＰＰＯ）に用いたｐＡＣＢＢベクターの構造を示す。各ＰＰＯ遺伝子をベクターにクローニングするとき、ｅＧＦＰは除去して用いた。
野生型ＡｔＰＰＯ１（ＷＴで示される）及び変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）遺伝子が、それぞれ形質転換されたＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株を０〜２５μＭ濃度のチアフェナシルを含む寒天培地にスポットした後、明条件（Light）及び暗条件（Dark）で生長阻害程度を確認した写真である。
野生型ＡｔＰＰＯ１（ＷＴで示される）、変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）、ＣｙＰＰＯ２（２で示される）、ＣｙＰＰＯ４（４で示される）及びＣｙＰＰＯ８（８で示される）遺伝子が、それぞれ形質転換されたＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株を０〜２５μＭ濃度のピリミジンジオン系ＰＰＯ除草剤であるチアフェナシル、サフルフェナシル及びブタフェナシル、及びＮ−フェニルフタルイミド系ＰＰＯ除草剤であるフルミオキサジンをそれぞれ含む寒天培地で生長阻害程度を確認した写真である。ＶはＰＰＯが挿入されていないｐＡＣＢＢベクターをＢＴ３（ΔＰＰＯ）に形質転換した菌株である。
野生型ＡｔＰＰＯ１（ＷＴで示される）、変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）、ＣｙＰＰＯ２（２で示される）、ＣｙＰＰＯ４（４で示される）及びＣｙＰＰＯ８（８で示される）遺伝子が、それぞれ形質転換されたＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株を０〜４００μＭ濃度のジフェニルエーテル系ＰＰＯ除草剤であるホメサフェン、アシフルオルフェン及びオキシフルオルフェンをそれぞれ含む寒天培地で生長阻害程度を確認した写真である。ＶはＰＰＯが挿入されていないｐＡＣＢＢベクターをＢＴ３（ΔＰＰＯ）に形質転換した菌株である。
野生型ＡｔＰＰＯ１（ＷＴで示される）、変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）、ＣｙＰＰＯ２（２で示される）、ＣｙＰＰＯ４（４で示される）及びＣｙＰＰＯ８（８で示される）遺伝子が、それぞれ形質転換されたＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株を０〜４００μＭ濃度のトリアゾリノン系ＰＰＯ除草剤であるスルフェントラゾン、オキサゾリジンジオン系ＰＰＯ除草剤であるペントキサゾン、フェニルピラゾール系ＰＰＯ除草剤であるピラフルフェンエチル、オキサジアゾール系ＰＰＯ除草剤であるオキサジアゾン、チアジアゾール系ＰＰＯ除草剤であるフルチアセットメチル、及びその他ＰＰＯ除草剤であるピラクロニルをそれぞれ含む寒天培地で生長阻害程度を確認した写真である。ＶはＰＰＯが挿入されていないｐＡＣＢＢベクターをＢＴ３（ΔＰＰＯ）に形質転換した菌株である。
野生型ＡｔＰＰＯ１（ＷＴで示される）、変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）及びＣｙＰＰＯ１２遺伝子が、それぞれ形質転換されたＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株を０〜４００μＭ濃度のチアフェナシル、サフルフェナシル、フルミオキサジン、ホメサフェン及びオキシフルオルフェンをそれぞれ含む寒天培地で生長阻害程度を確認した写真である。
野生型ＡｔＰＰＯ１（ＷＴで示される）、変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）及びＣｙＰＰＯ１２遺伝子が、それぞれ形質転換されたＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株を０〜４００μＭ濃度のピラフルフェンエチル、オキサジアゾン、スルフェントラゾン、ペントキサゾン及びピラクロニルをそれぞれ含む寒天培地で生長阻害程度を確認した写真である。
野生型ＡｔＰＰＯ１（ＷＴで示される）、変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）、ＣｙＰＰＯ２及びＣｙＰＰＯ４遺伝子が、それぞれ形質転換されたＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株を０〜１００μＭ濃度のチアフェナシルを含有した液体ＬＢ培地で培養時間による生長阻害程度を確認したグラフである。
野生型ＡｔＰＰＯ１（ＷＴで示される）、変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８遺伝子が、それぞれ形質転換されたＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株を０〜１００μＭ濃度のサフルフェナシルを含有した液体ＬＢ培地で培養時間による生長阻害程度を確認したグラフである。
野生型ＡｔＰＰＯ１（ＷＴで示される）、変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８遺伝子が、それぞれ形質転換されたＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株を０〜１００μＭ濃度のホメサフェンを含有する液体ＬＢ培地で培養時間による生長阻害程度を確認したグラフである。
タバコ葉の葉緑体にＰＰＯ遺伝子の発現を確認するために用いた植物発現ベクター構造の模式図を示す。
図１２のベクターにＹＦＰ、野生型ＡｔＰＰＯ１（ＷＴで示される）、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８遺伝子を、それぞれサブクローニングし、植物に導入した後、植物葉緑体に発現を確認した結果を示す。
シロイヌナズナにＰＰＯ遺伝子を形質転換するために用いた植物形質転換用ベクター構造の模式図を示す。
変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）、ＣｙＰＰＯ２及びＣｙＰＰＯ８遺伝子が、それぞれ形質転換されたシロイヌナズナのＴ２種子を１／２ＭＳ培地と７０ｎＭチアフェナシルが含まれた１／２ＭＳ培地にそれぞれ播種し、発芽の有無を確認した結果を示す。対照区として使用した変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）は、アミノ酸置換によってＰＰＯ系除草剤に抵抗性が確認された遺伝子を形質転換した種子（Ｔ２）を用いた。
後代でＣｙＰＰＯ２タンパク質の発現が維持されるかどうかを判断するために、ＣｙＰＰＯ２遺伝子が形質転換されたシロイヌナズナのＴ２世代でライン毎にウエスタンブロットを行った結果を示す。ＣｙＰＰＯ２（Ｒ）は、除草剤抵抗性を示す形質転換体ラインを表し、ＣｙＰＰＯ２（Ｓ）は、除草剤感受性を示表す形質転換体ラインを示す。図１６の下部パネルは二値ベクターに挿入されたＢＡＲ遺伝子の挿入をＰＣＲで確認したものを示す。
後代でＣｙＰＰＯ８タンパク質の発現が維持されるかどうかを判断するために、ＣｙＰＰＯ８遺伝子が形質転換されたシロイヌナズナのＴ２世代で形質転換体をライン毎にウエスタンブロットを行った結果を示す。ＣｙＰＰＯ８（Ｒ）は、除草剤抵抗性を示す形質転換体ラインを表し、ＣｙＰＰＯ８（Ｓ）は、除草剤感受性を表す形質転換体ラインを示す。図１７の下部パネルは、二値ベクターに挿入されたＢＡＲ遺伝子の挿入をＰＣＲで確認したものを示す。
ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８遺伝子と対照区である変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）遺伝子が、それぞれ形質転換されたシロイヌナズナのＴ２世代で形質転換体に１μＭチアフェナシルを散布した後、７日目に生長を確認した結果を示す。ＷＴは野生型シロイヌナズナでの結果を示す。
ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８遺伝子と対照区である変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）遺伝子が、それぞれ形質転換されたシロイヌナズナのＴ２世代で形質転換体にチアフェナシル０．５μＭ、サフルフェナシル１μＭ、ホメサフェン３μＭを処理した後、７日目に生長を確認した結果を示す。ＷＴは野生型シロイヌナズナでの結果を示す。
ＣｙＰＰＯ２及びＢＡＲ遺伝子が挿入されたシロイヌナズナ形質転換体、及びＣｙＰＰＯ８及びＢＡＲ遺伝子が挿入されたシロイヌナズナ形質転換体の種子を、それぞれグルホシネート添加培地、チアフェナシル添加培地、又はグルホシネート及びチアフェナシル添加培地で培養させた結果を示す。
ＣｙＰＰＯ２又はＣｙＰＰＯ８遺伝子が挿入されたシロイヌナズナ形質転換体の種子を、それぞれチアフェナシル添加培地、サフルフェナシル添加培地、又はチアフェナシル及びサフルフェナシル添加培地で培養させた結果を示す。
ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４、ＣｙＰＰＯ８タンパク質のアミノ酸相同性と除草剤抵抗性関係を実験した結果である。ＣｙＰＰＯ２アミノ酸配列変移（２Ｍで示される）、ＣｙＰＰＯ４アミノ酸配列変移（４Ｍで示される）及びＣｙＰＰＯ８アミノ酸配列変移（８Ｍで示される）遺伝子が、それぞれ形質転換されたＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株を含む寒天培地にチアフェナシル、サフルフェナシル及びブタフェナシルをそれぞれ濃度別に処理した後、生長阻害程度を確認した写真である。生長阻害判別の対照区としては、野生型ＡｔＰＰＯ１（ＷＴで示される）、変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）を用いた。
ＣｙＰＰＯ２アミノ酸配列変移（２Ｍで示される）、ＣｙＰＰＯ４アミノ酸配列変移（４Ｍで示される）及びＣｙＰＰＯ８アミノ酸配列変移（８Ｍで示される）遺伝子が、それぞれ形質転換されたＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株を含む寒天培地にアシフルオルフェン、オキシフルオルフェン及びホメサフェンをそれぞれ濃度別に処理した後、生長阻害程度を確認した写真である。生長阻害判別の対照区としては、野生型ＡｔＰＰＯ１（ＷＴで示される）、変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）を用いた。
ＣｙＰＰＯ２アミノ酸配列変移（２Ｍで示される）、ＣｙＰＰＯ４アミノ酸配列変移（４Ｍで示される）及びＣｙＰＰＯ８アミノ酸配列変移（８Ｍで示される）遺伝子が、それぞれ形質転換されたＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株を含む寒天培地にスルフェントラゾン、オキサジアゾン、ペントキサゾン及びピラクロニルをそれぞれ濃度別に処理した後、生長阻害程度を確認した写真である。生長阻害判別の対照区としては、野生型ＡｔＰＰＯ１（ＷＴで示される）、変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）を用いた。
ＣｙＰＰＯ２アミノ酸配列変移（２Ｍで示される）、ＣｙＰＰＯ４アミノ酸配列変移（４Ｍで示される）及びＣｙＰＰＯ８アミノ酸配列変移（８Ｍで示される）遺伝子が、それぞれ形質転換されたＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株を含む寒天培地にフルチアセットメチル、ピラフルフェンエチル及びフルミオキサジンをそれぞれ濃度別に処理した後、生長阻害程度を確認した写真である。生長阻害判別の対照区としては、野生型ＡｔＰＰＯ１（ＷＴで示される）、変異ＡｔＰＰＯ１（ＭＴで示される）を用いた。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、下記の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明が下記の実施例によって限定されない。
実施例１．原核生物からＰＰＯ遺伝子の分離
オスキラトリアニグロ−ビリディス（Oscillatorianigro-viridis）ＰＣＣ ７１１２、リングビア属（Lyngbya sp.）ＰＣＣ ８１０６菌株、ハロテース属（Halothece sp.）ＰＣＣ ７４１８菌株をパストゥール研究所（フランス）から分譲し、表１のプライマーを用いてＰＣＲでＰＰＯ遺伝子を分離した。各菌株よりゲノムＤＮＡを分離し、表１のプライマーを用いてＰＰＯ遺伝子を分離及び増幅させた。ミクロコレウスヴァギナツのＰＰＯ遺伝子の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース情報を活用して、シロイヌナズナのコドンで最適化（codon usage optimization）して合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、表１のプライマーを用いて増幅させた。ＰＣＲ反応液は、テンプレート（各菌株のゲノムＤＮＡ）１μＬ、１０×バッファー５μＬ、ｄＮＴＰ混合液（各１０ｍＭ）２μＬ、フォワードプライマー（１０μＭ）３μＬ、リバースプライマー（１０μＭ）３μＬ、ＤＤＷ３５．５μＬ、及びＰｆｕ−Ｘ（Solgent社、２．５ｕｎｉｔ／μＬ）又はＥＦ−ｔａｑ（Solgent社、２．５u／μＬ）０．５μＬを含む反応液５０μＬで構成し、９４℃で４分間反応した後、３０サイクル（９４℃で３０秒、５６℃で３０秒及び７２℃で１．５分）繰り返し、７２℃で５分及び４℃で５分反応して、増幅した。オスキラトリアニグロ−ビリディスＰＣＣ ７１１２から分離したＰＰＯをＣｙＰＰＯ２と命名し、リングビア属（Lyngbya sp.）ＰＣＣ ８１０６菌株から分離したＰＰＯをＣｙＰＰＯ４と命名し、ハロテース属ＰＣＣ ７４１８から分離したＰＰＯをＣｙＰＰＯ８と命名し、ミクロコレウスヴァギナツのＰＰＯをＣｙＰＰＯ１２と命名した。
また、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４、ＣｙＰＰＯ８及びＣｙＰＰＯ１２の各アミノ酸配列及び塩基配列を確認し、配列番号１〜８に示した。特に、ＣｙＰＰＯ２のアミノ酸配列は、ＣｙＰＰＯ１２のアミノ酸配列と９４％の配列相同性を示すことを確認した。
実施例２．ハロテース属ＰＣＣ７４１８菌株の除草剤抵抗性確認
ハロテース属ＰＣＣ ７４１８菌株をＣＲＢＩＰ Ｍｅｄｉｕｍ １５３８（パストゥール研究所、フランス）で培養した。ＣＲＢＩ ＰＭｅｄｉｕｍ １５３８は、ＡＳＮＩＩＩ及びＴｕｒｋｓ Ｉｓｌａｎｄ Ｓａｌｔｓ ４Ｘが１：１（ｖ／ｖ）で混合された培地であり、ＡＳＮＩＩＩ ｍｅｄｉｕｍは、ＮａＣｌ ２５．０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ３．５ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２．０ｇ、ＫＣｌ ０．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＮａＮＯ３ ０．７５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＮａＣＯ３ ０．０４ｇ、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム２．５ｍＬ［クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム３００ｍｇ、クエン酸一水和物３００ｍｇ及び蒸溜水２５０ｍＬ混合］、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ２．５ｍＬ［ＭｇＥＤＴＡ０．１ｇ及び蒸溜水５００ｍＬ混合］、微量金属Ａ５＋Ｃｏ１ｍＬ［Ｈ３ＢＯ３ ２．８６ｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ １．８１ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２２２ｇ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．３９ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０７９ｇ、Ｃｏ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ ０．０４９ｇ及び蒸溜水１０００ｍＬ混合］、及び蒸溜水１０００ｍＬに構成されている。Ｔｕｒｋｓ Ｉｓｌａｎｄ Ｓａｌｔｓ ４Ｘは、ＮａＣｌ １１２ｇ、ＫＣｌ ２．６８ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２２ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２７．７ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ５．８ｇ、及び蒸溜水１０００ｍＬに構成されている。ＡＳＮＩＩＩ ｍｅｄｉｕｍとＴｕｒｓｋ Ｉｓｌａｎｄ Ｓａｌｔｓ４Ｘをそれぞれ１２０℃で２０分間滅菌（autoclave）した後、１：１（ｖ／ｖ）混合して用いた。
各ガラス管（test tube）に前記培養培地５ｍＬを添加し、そこにチアフェナシルを添加しないか、それぞれ２又は１０μＭを添加した。種培養（seed culture）したハロテース属ＰＣＣ ７４１８菌株を等体積で各ガラス管に入れた後、８日間菌株の生長を確認した。その結果、チアフェナシル１０μＭまで処理しても、培養８日後、ハロテース属ＰＣＣ ７４１８菌株の生長が維持されたので、前記菌株が除草剤に抵抗性があることを確認することができた（図１）。
実施例３．ＰＰＯ欠乏大腸菌を用いたＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４、ＣｙＰＰＯ８及びＣｙＰＰＯ１２の除草剤抵抗性検証（寒天培地）
実施例１から分離したＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４、ＣｙＰＰＯ８及びＣｙＰＰＯ１２の除草剤抵抗性を検証するために、ＰＰＯが欠乏したＢＴ３大腸菌［以下、ＢＴ３（ΔＰＰＯ）］に、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４、ＣｙＰＰＯ８及びＣｙＰＰＯ１２遺伝子をそれぞれ形質転換した後、除草剤を処理した環境で培養し、形質転換大腸菌の生長阻害有無を確認した。陰性対照群としてはシロイヌナズナ由来の野生型ＰＰＯ（野生型ＡｔＰＰＯ１）を用いており、前記野生型ＡｔＰＰＯ１は、ＰＰＯ系除草剤感受性があり、ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＸ０８４７３２に配列情報が登録されている（遺伝子の塩基配列を配列番号１０、アミノ酸配列を配列番号９に示す）。陽性対照群としては、前記野生型ＡｔＰＰＯ１のアミノ酸配列でＹ４２６Ｍ（第４２６番目のアミノ酸であるタイロシンがメチオニンに置換）及びＳ３０５Ｌ（第３０５番目のアミノ酸であるセリンがロイシンに置換）のアミノ酸置換が発生した変異ＡｔＰＰＯ１を用いた（アミノ酸配列を配列番号１１に示す）（Li X, Volrath SL., N D B.G., Chilcott CE, Johnson MA, Ward ER, Law MD (2003) Development of protoporphyrinogen oxidase as an efficient selection marker for agrobacterium tumefaciens- mediated transformation of maize. Plant physiology 133:736-747）。
ＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株は、Ｈｏｋｋａｉｄｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（日本）から提供され、ｈｅｍＧ ｔｙｐｅ ＰＰＯが欠如した大腸菌であり、カナマイシン（Kanamycine）に抵抗性を有する菌株である（Watanabe et al., (2001) Dual targeting of spinach protoporphyrinogen oxidase II to mitochondria and chloroplasts by alternative use of two in-frame inhibition codons. JBC 20474-20481）。
３−１．実験材料及び機器の準備
オートクレーブは、Ｈｉｒａｙａｍａ社のＨＶＥ−５０、電子秤は、Ｈａｎｓｕｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社のＨＳ２１００Ａ、無菌実験台は、Ｊｅｉｏ Ｔｅｃｈ社のＣＢ−３０Ｖ、培養器は、ＪＳＲ社のＪＳＩ−２００ＣＬ、紫外可視分光光度計は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社の１２１０タイプ、光度計は、Ａｐｏｇｅｅ社のＭＱ−２００、ＰＣＲ装備は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭｙＣｙｃｌｅｒを使用した。オートクレーブは、１２１℃で１５分、培養器は３７℃、光条件１６０〜２００μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１及び培養時間１４〜２０時間の条件で用いた。ＬＢ培地（Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ１５ｇ／Ｌ）及び抗生剤クロラムフェニコール（Ｄｕｃｈｅｆａ）を用いた。実験に用いられた除草剤は下記表に記載した。
３−２．実験方法
実施例１から分離増幅したＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４、ＣｙＰＰＯ８及びＣｙＰＰＯ１２遺伝子をそれぞれｐＡＣＢＢ（ベクターの構造は図２参照）にクローニングするために、それぞれのＰＰＯ遺伝子４μＬ、ｐＡＣＢＢベクター３．５μＬ、１０Ｘ バッファーＡ １μＬ、１０Ｘ バッファーＢ １μＬ、リガーゼ１μＬ（ＲＢＣ、３ｕｎｉｔ／μＬ）を含む溶液１０μＬで製造し、２２℃で３０分反応した。反応溶液をＤＨ５ ａｌｐｈａ コンピテント細胞１００μＬに入れ、２０分間氷で反応した後、４２℃で４０秒間静置した。その後、氷で２分間静置した後、ＬＢブロス１ｍＬを添加し、３７℃で１時間の間振盪培養した。各挿入遺伝子の種類別に、培養液で生育した菌を収穫し、クロラムフェニコールが含まれたＬＢ ａｇａｒ培地で培養した。
各遺伝子で形質転換された大腸菌の種培養のために、各単一コロニー（single colony）を、クロラムフェニコールを含む３ｍＬのＬＢブロスで一晩培養した後、１００μＬを新しい３ｍＬのＬＢブロスに継代し、吸光度（ＯＤ６００）が０．５〜１がなるまで培養し、吸光度（ＯＤ６００）を０．５に合わせるためにＬＢブロスで希釈した。この希釈液をＬＢブロスで１０倍ずつ５回希釈した。次に、クロラムフェニコールと多様な除草剤ストックが濃度別に（０〜４００μＭ）混合されたＬＢ寒天培地（ペトリ皿）に、前記準備した形質転換大腸菌培養希釈液を１０μＬずつ滴下した。ＬＢ寒天培地を３７℃条件で培養し、培養１６〜２０時間後に生長阻害程度を肉眼で確認した。また、チアフェナシルが混合された培地の場合、明条件（光条件１６９μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１）と暗条件で、それぞれ菌株の生長阻害程度を確認した。
３−３．実験の結果
図４〜図６は、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８の除草剤抵抗性を確認した結果を、図７及び図８は、ＣｙＰＰＯ１２の除草剤抵抗性を確認した結果を示した。
図３に示されるように、チアフェナシルが混合された培地で、野生型ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株の場合、明条件及び暗条件で全部生長が阻害されたが、明条件で培養時、暗条件で培養した場合に比べてより強い生長阻害を示した。例えば、１μＭチアフェナシル濃度で明条件培養時、野生型ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株の生長が略完全に阻害されたが、暗条件培養時には、ある程度生長が維持されていた。しかし、５μＭチアフェナシル濃度からは明条件と暗条件の両方ともに完全な生長阻害を示した。このように、野生型ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株の場合、チアフェナシルの処理濃度に依存的に生長阻害を示して、除草剤感受性を確認することができ、変異ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株の場合、チアフェナシル２５μＭまでも生長阻害が観察されなく、除草剤抵抗性を確認することができた。
従って、除草剤感受性ＰＰＯの基準を野生型ＡｔＰＰＯ１に、除草剤抵抗性ＰＰＯの基準を変異ＡｔＰＰＯ１に設定し、代表的な化学族毎に代表的なＰＰＯ除草剤に対して、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８の除草剤抵抗性を検証した。
図４は、代表的なピリミジンジオン系ＰＰＯ除草剤であるチアフェナシル、サフルフェナシル及びブタフェナシル、及び代表的なＮ−フェニルフタルイミド系ＰＰＯ除草剤であるフルミオキサジンを、それぞれ濃度別に処理した結果を示す。チアフェナシル及びサフルフェナシル処理時変異ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株、ＣｙＰＰＯ２形質転換菌株、ＣｙＰＰＯ４形質転換菌株及びＣｙＰＰＯ８形質転換菌株の場合、チアフェナシル又はサフルフェナシル処理濃度２５μＭでも生長阻害がほとんど観察されなかった。ブタフェナシル処理時、変異ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株、ＣｙＰＰＯ２形質転換菌株及びＣｙＰＰＯ８形質転換菌株の場合、ブタフェナシル処理濃度２５μＭでも生長阻害がほとんど観察されなかった。フルミオキサジン処理時、ＣｙＰＰＯ２形質転換菌株、ＣｙＰＰＯ４形質転換菌株及びＣｙＰＰＯ８形質転換菌株でフルミオキサジン処理濃度２５μＭでも生長阻害がほとんど観察されなかった。前記４種類の除草剤の全てにおいて、野生型ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株は０．５μＭで阻害が開始され、５μＭからほとんど生長しないことを確認することができた。
図５は、代表的なジフェニルエーテル系ＰＰＯ除草剤であるホメサフェン、アシフルオルフェン及びオキシフルオルフェンをそれぞれ濃度別に処理した結果を示す。ホメサフェン処理時、変異ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株は２５μＭまで生長阻害が観察されなく、ＣｙＰＰＯ２形質転換菌株、ＣｙＰＰＯ４形質転換菌株及びＣｙＰＰＯ８形質転換菌株の場合、ホメサフェン処理濃度４００μＭでも生長阻害がほとんど観察されなかった。アシフルオルフェン処理時、ＣｙＰＰＯ２形質転換菌株、ＣｙＰＰＯ４形質転換菌株及びＣｙＰＰＯ８形質転換菌株の場合、アシフルオルフェン処理濃度４００μＭでも生長阻害がほとんど観察されなかった。オキシフルオルフェン処理時、ＣｙＰＰＯ２形質転換菌株、ＣｙＰＰＯ４形質転換菌株及びＣｙＰＰＯ８形質転換菌株の場合、オキシフルオルフェン処理濃度４００μＭでも生長阻害がほとんど観察されなかった。前記３種類の除草剤の全てにおいて、野生型ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株は、５μＭからほとんど生長しないことを確認することができた。
図６は、代表的なトリアゾリノン系ＰＰＯ除草剤であるスルフェントラゾン、代表的なオキサゾリジンジオン系ＰＰＯ除草剤であるペントキサゾン、代表的なフェニルピラゾール系ＰＰＯ除草剤であるピラフルフェンエチル、代表的なオキサジアゾール系ＰＰＯ除草剤であるオキサジアゾン、代表的なチアジアゾール系ＰＰＯ除草剤であるフルチアセットメチル、及びその他ＰＰＯ除草剤であるピラクロニルをそれぞれ濃度別に処理した結果を示す。スルフェントラゾン処理時、ＣｙＰＰＯ２形質転換菌株、ＣｙＰＰＯ４形質転換菌株及びＣｙＰＰＯ８形質転換菌株の場合、スルフェントラゾン処理濃度４００μＭでも生長阻害がほとんど観察されなかった。ペントキサゾン、ピラフルフェンエチル、オキサジアゾン、フルチアセットメチル及びピラクロニル処理時、ＣｙＰＰＯ２形質転換菌株及びＣｙＰＰＯ８形質転換菌株の場合、オキシフルオルフェン処理濃度４００μＭでも生長阻害がほとんど観察されなかった。７種類の除草剤の全てにおいて、野生型ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株は５μＭからほとんど生長しないことを確認することができた。
図７は、チアフェナシル、サフルフェナシル、フルミオキサジン、ホメサフェン及びオキシフルオルフェン処理時、ＣｙＰＰＯ１２の除草剤抵抗性を確認した結果だ。ＣｙＰＰＯ１２の形質転換菌株はチアフェナシル、サフルフェナシル、フルミオキサジン、ホメサフェン及びオキシフルオルフェンの各処理濃度２５μＭでも生長阻害がほとんど観察されなく、ホメサフェン又はオキシフルオルフェン処理の場合、処理濃度４００μＭでも生長阻害がほとんど観察されなかった。変異ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株は、オキシフルオルフェン処理時、５μＭから生長阻害が観察されており、その他の除草剤では２５μＭでも生長阻害がほとんど観察されなかった。反面、野生型ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株は、ホメサフェンを除いた４種類の除草剤の全てにおいて、処理濃度０．５μＭで阻害が開始され、５μＭからほとんど生長しないことを観察することができた。ホメサフェン処理時、野生型ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株は５μＭで生長阻害が観察された。
図８は、ピラフルフェンエチル、オキサジアゾン、スルフェントラゾン、ペントキサゾン及びピラクロニル処理時、ＣｙＰＰＯ１２の除草剤抵抗性を確認した結果だ。変異ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株とＣｙＰＰＯ１２の形質転換菌株は、処理濃度２５μＭでも生長阻害が観察されなく、スルフェントラゾンを除いた４種類の除草剤処理時は、処理濃度４００μＭでも生長阻害が観察されなかった。反面、野生型ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株の場合、ピラフルフェンエチル、オキサジアゾン、スルフェントラゾン、ピラクロニル処理時、処理濃度０．５μＭから生長阻害が観察され、ピラクロニル処理時には処理濃度５μＭから生長阻害が観察され、２５μＭでほとんど成長しないことを観察することができた。
実施例４．ＰＰＯ欠乏大腸菌を用いたＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８の除草剤抵抗性検証（ＬＢブロス培地）
前記実施例３において、野生型ＡｔＰＰＯ１、変異ＡｔＰＰＯ１、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８遺伝子がそれぞれ形質転換されたＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株に対して、多様な除草剤が混合された寒天培地上で除草剤抵抗性を検証したところ、今回は前記菌株に対して、多様な除草剤が混合されたＬＢ液体培地上で除草剤抵抗性を再確認した。
４−１．実験材料及び機器の準備
オートクレーブは、Ｈｉｒａｙａｍａ社のＨＶ−５０、電子秤は、Ｈａｎｓｕｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社のＨＳ２１００Ａ、無菌実験台は、Ｊｅｉｏ Ｔｅｃｈ社のＣＢ−３０Ｖ、培養器は、ＪＳＲ社のＪＳＩ−２００ＣＬ、光度計は、Ａｐｏｇｅｅ社のＭＱ−２００、紫外可視分光光度計は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社の１２１０タイプを使用した。オートクレーブは、１２１℃で１５分、培養器は３７℃、光条件１６０〜２００μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１及び培養時間１３．５時間の条件で、紫外可視分光光度計は６００ｎｍで用いた。
実験に用いられたチアフェナシル（Ｍ．Ｗ．５１１．８７ｇ／ｍｏｌ）は、Ｄｏｎｇｂｕ Ｆａｒｍ Ｈａｎｎｏｎｇ社から、サフルフェナシル（Ｍ．Ｗ．５００．８５ｇ／ｍｏｌ）はＳｉｇｍａ社から、ホメサフェン（Ｍ．Ｗ．４３８．７６ｇ／ｍｏｌ）はＳｉｇｍａ社から入手した。各薬剤は１００％アセトンに２００ｍＭ濃度に調製した後、−２０℃で保管した。そして、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）及び抗生剤クロラムフェニコール（Duchefa社）を用いた。
４−２．実験方法
各遺伝子で形質転換された大腸菌の種培養のために、各単一コロニーを、クロラムフェニコールを含む３ｍＬ液体培地で１２時間培養した後、吸光度（ＯＤ６００）が１．５になるまでＬＢ培地で希釈した。次に、２５０ｍＬのＬＢ液体培地にクロラムフェニコールと、前記準備した種培養された形質転換大腸菌５００μＬを添加し、前記培養液を５０ｍＬずつ２５０ｍＬフラスコに分注した。各フラスコに多様な除草剤（チアフェナシル、サフルフェナシル、ホメサフェン）ストックを濃度別に（０、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ）処理した後、処理した培養液を３７℃及び２００ｒｐｍ条件で培養し、１．５時間毎に分光光度計で吸光度（ＯＤ６００）を測定した。実験結果は、３回ずつ繰り返し、その平均値をグラフで示した。３回繰り返しの標準誤差をエラーバーで表した。
４−３．実験の結果
除草剤感受性ＰＰＯの基準を除草剤野生型ＡｔＰＰＯ１に、抵抗性ＰＰＯの基準を変異ＡｔＰＰＯ１に設定した。
チアフェナシルを処理した結果を図９に示した。
野生型ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株の場合、チアフェナシル１０μＭからほとんど生長しない様相を示した反面、変異ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株の場合、チアフェナシル１０μＭでは生長に影響を受けなかったが、５０μＭから生長阻害が観察された。また、ＣｙＰＰＯ２形質転換菌株及びＣｙＰＰＯ４形質転換菌株は１００μＭまで正常な生長を示した。
サフルフェナシルを処理した結果を図１０に示した。
形質転換菌株別の抵抗性の有無は、チアフェナシルを処理した結果と似ていたが、抵抗性の程度はチアフェナシルに比べて、サフルフェナシルで高く示された。野生型ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株の場合、サフルフェナシル１０μＭからほとんど生長しない様相を示した反面、変異ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株、ＣｙＰＰＯ２形質転換菌株、ＣｙＰＰＯ４形質転換菌株及びＣｙＰＰＯ８形質転換菌株の場合、１００μＭまで正常な生長を示した。
ホメサフェンを処理した結果を図１１に示した。
野生型ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株の場合、ホメサフェン５０μＭから生長阻害が観察されたが、変異ＡｔＰＰＯ１形質転換菌株、ＣｙＰＰＯ２形質転換菌株、ＣｙＰＰＯ４形質転換菌株及びＣｙＰＰＯ８形質転換菌株の場合、１００μＭまで正常な生長を示した。
実施例５．ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８の植物内発現
実施例３及び実施例４を通して多様なＰＰＯ除草剤に対する抵抗性が検証されたＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８を植物で発現させるための実験を行った。蛍光蛋白質（yellow fluorescent protein；ＹＦＰ）を用いて、前記ＰＰＯタンパク質の発現を確認した。
５−１．実験方法
アグロバクテリウムコンピテント細胞を製造するために、アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＧＶ３１０１菌株（韓国生命工学研究院）を５ｍＬのＬＢ培地に３０℃及び２００ｒｐｍ条件で１２時間培養した。この培養液を２００ｍＬのＬＢ培地に注いだ後、３０℃及び２００ｒｐｍ条件で３〜４時間培養し、３０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。滅菌蒸留水でペレットを洗浄した後、２０ｍＬのＬＢ培地で再懸濁（resuspension）した。２００μＬずつ分量し、液体窒素に瞬間凍結した後、超低温冷凍庫に保管した。
野生型ＡｔＰＰＯ１、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８遺伝子がそれぞれクローニングされたベクターを製造するために、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、ＹＦＰ及びＮＯＳターミネータを含むベクターにＸｂａＩ及びＸｈｏＩ制限酵素を処理し、ＰＣＲで増幅した輸送ペプチド遺伝子（配列番号２６）にＸｂａＩ及びＸｈｏＩ制限酵素を処理して切断した後、前記ベクターと輸送ペプチド遺伝子とを連結し、ベクター内に葉緑体移動に関与する輸送ペプチドを挿入した。また、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素を用いて各ＰＰＯ遺伝子（野生型ＡｔＰＰＯ１,ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８遺伝子）とベクターを切断した後、ライゲーションし、ベクター内ＰＰＯ遺伝子を挿入した。その結果、ＰＰＯ遺伝子の５’に輸送ペプチドが結合され、３’にＹＦＰ遺伝子が結合された。最終ベクター構造模式図は図１２に示した。
次に、アグロバクテリウムを用いた形質転換のために、前記で製造したアグロバクテリウムコンピテント細胞を氷上で溶解し、各ＰＰＯ遺伝子が挿入されたベクターを３〜５μＬを細胞と混合した後、液体窒素で２〜３分間瞬間凍結した後、３７℃で５分間溶解した。１ｍＬのＬＢ培地添加した後、３０℃で２時間培養し、ＬＢ／スペクチノマイシン培地に塗抹し、３０℃に２日間培養した。
アグロバクテリウムをタバコ葉に接種するために、各ＰＰＯ遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたアグロバクテリウム単一コロニーをＬＢ／スペクチノマイシン媒体に３０℃、２００ｒｐｍで１２時間培養し、７０００ｒｐｍで２分間遠心分離した後、ペレットを１０ｍＭのＭｇＣｌ２に再懸濁した。吸光度（ＯＤ６００）を０．５に調整した後、２００μＭのアセトシリンゴンを添加し、室温で２時間保管した。アグロバクテリウムは１ｍＬ注射器を利用して正常な生育状態のタバコ葉に浸潤した後、２−５日間栽培した。
次に、タバコ葉のプロトプラストを分離するために、表３又は表５の組成で酵素溶液を製造した。
前記溶液をｐＨ５．８に調整した後、０．２２μｍ 細孔径で滅菌ろ過した。
タバコ葉をカミソリの刃で細かく切断し、葉片を前記製造した酵素溶液に懸濁した後、アルミ箔で覆い、室温で、４０〜５０ｒｐｍで３〜５時間撹拌した。顕微鏡（Carl Zeiss Observer Z1）及び生体物質結合分析システム（Zeiss LSM710）を利用して、ＤＩＣ、ＹＦＰ及びローダミン観察フィルター３種を利用してプロトプラスト細胞を観察した。イメージツールでキャプチャーした後、ＺＥＮ ｌｉｔｅ ２０１２（Carl Zeiss）プログラムを利用してデータ化した。
ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４又はＣｙＰＰＯ８タンパク質と共に発現された蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をウエスタンブロットで確認した。そのために、サンプルを液体窒素に凍らせて保管し、Ｍｉｃｒｏｐｅｓｔｌｅを利用して磨砕した。ＩＰバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、７５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｘ プロテアーゼインヒビター］（大型ウェルに対して４０μＬ）を添加し、ボルテックスし、氷で１０分以上静置した。４℃で１０分間遠心分離した後、上清を新しい１．５ｍＬチューブに移した。タンパク質充填色素（protein loading dye）を添加した後、１００℃で５分間沸騰し、氷に静置した後、遠心分離し、上清を用いた。電気泳動は７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌタンパク質抽出液をローディングし、濃縮ゲルは１００Ｖで、分離ゲル１５０Ｖでタンパク質を分離した。電気泳動したタンパク質は、ＰＶＤＦ（polyvinylidene fluoride）膜に移転し、ブロッキングバッファー（４％脱脂粉乳、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）に１時間ブロッキングした後、ａｎｔｉ−ＧＦＰ抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）（Santa Cruz社）を１／２０００添加し、２時間室温で反応させた。抗体反応後、膜をＰＢＳ−Ｔ（リン酸緩衝食塩水−Ｔｗｅｅｎ）バッファーで１０分間、３回洗浄し、ＥＣＬ（電気化学発光）溶液５００μL（バッファー組成又は入手先：Bio-Rad社）をスプレーした後、１分間静置した後ＯＨＰフィルムなどで覆った後、Ｘ−ｒａｙフィルムに露出し、フィルムを焼いた。
５−２．実験の結果
野生型ＡｔＰＰＯ１、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８遺伝子をそれぞれ植物に導入した後、各遺伝子の発現を確認した結果を図１３に示した。各ＰＰＯ遺伝子が形質転換された植物内で、アグロバクテリウムコロニーが形成されることを確認することができた。陰性対照群として使用したＹＦＰタンパク質の場合、葉緑体でターゲッティングされず、細胞質及び核内に発現されることが確認された。ＰＰＯタンパク質の場合、葉緑素の自己蛍光（autofluorescence）イメージとマージした結果、蛍光シグナルが互いに重なることから、葉緑体ターゲッティングを目的としてＮ−末端にリンクされたｃＴＰ（葉緑体輸送ペプチド）の影響により葉緑体でターゲッティングされることを確認することができた。
実施例６．植物形質転換ベクター及び形質転換体の作製
植物形質転換選択は、ＢＡＲ遺伝子（グルホシネート抵抗性遺伝子）のＯＲＦとそれぞれのＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４又はＣｙＰＰＯ８遺伝子ＯＲＦを有した二値ベクターを作製して使用した。ＰＰＯ系除草剤と作用機序が異なる除草剤を交差使用する場合、その効果を確認するために、ＢＡＲ遺伝子を用い、前記遺伝子は後代遺伝が安定的に進むかどうかを検証するために用いられた。ＢＡＲ遺伝子の発現のためにＮＯＳプロモーターを使用したし、転写終結のためにＥ９ターミネータを使用した。一方、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８の植物発現誘導のためにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを使用し、葉緑体でのタンパク質移動を誘導するために、ＡｔＰＰＯ１遺伝子の輸送ペプチド（ＴＰ）部位をＸｂａＩ、ＸｈｏＩ制限酵素を利用して挿入した。また、発現されたタンパク質の確認のために、ヘムアグルチニン（ＨＡ）ｔａｇを３’末端部位にＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ制限酵素を利用して挿入した。ベクター内挿入された輸送ペプチド部位を配列番号２７で示し、挿入されたＨＡｔａｇ配列を配列番号２８で示した。ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ８遺伝子は、輸送ペプチドとＨＡ ｔａｇと間にＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ制限酵素を利用して挿入され、ＨＡ ｔａｇ後に、ＮＯＳターミネータが挿入され、ＰＰＯ遺伝子の転写終結を誘導した。本願で使用した植物形質転換二値ベクターの構造模式図を図１４に示した。
一方、植物形質転換体は以下のように作製した。まず、形質転換されたアグロバクテリウムを抗生剤培地で選別した後、コロニーを液体培養した。アグロバクテリウムを細胞収穫した後、５％スクロース、０．０５％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７溶液に懸濁した。吸光度（ＯＤ６００）を０．８に調整した後、約５〜６週生育したシロイヌナズナの花器をアグロバクテリウム溶液に浸漬した。湿度を維持するために、ポットはビニール袋で覆った後、暗状態で１日間静置した。アグロバクテリウムを接種したシロイヌナズナは、さらに１〜2カ月間栽培し、種子を成熟させて収穫した。形質転換された植物から収穫された種子は、形質転換された種子と非形質転換された種子とが混在されているので、収穫された種子から形質転換された種子を選択する作業が必要とされる。
従って、ベクター作製時に形質転換体を選択するために挿入されたＢＡＲ遺伝子を用いて、形質転換体（グルホシネートを用いて形質転換体を選択した）を土壌に移植し、成長させてＴ１植物を得た。
移植されたＴ１植物のＰＰＯ系除草剤に対する抵抗性を判断するために、約３−４週間育てた後、花茎が上がってくる前に、除草剤を処理した。シロイヌナズナの生態型Ｃｏｌ−０は、１植物当たり１μＭのチアフェナシル（＋０．０５％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７）を２〜３ｍＬ処理した場合に死滅することが確認された。従って、１μＭのチアフェナシルは、植物の個体数に適した量で均一に適用された。７日後、ＰＰＯ系除草剤に対する形質転換体の抵抗性有無を調べた。抵抗性を示し、生き残っている植物を持続的に生育し、種子（Ｔ２種子）を収穫し、前記Ｔ２種子を１／２ＭＳ培地で１週間培養した後、土壌に移植してＴ２植物を得た。
実施例７．発芽実験
ＣｙＰＰＯ２及びＣｙＰＰＯ８形質転換体の中で、１μＭのチアフェナシルの処理下で生存したＴ２世代の種子のチアフェナシル抵抗性を調べるために、７０ｎＭのチアフェナシルが含まれた１／２ＭＳ培地（１．１２５ｇ／Ｌ ＭＳ塩、１０ｇ／ショ糖e、７ｇ／Ｌ寒天）にシロイヌナズナ種子を播種した。５０ｎＭのチアフェナシルが含まれた１／２ＭＳ培地で野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０；Ｃｏｌｕｍｂｉａ−０生態型）は、発芽障害が観察され、７０ｎＭ含まれた１／２ＭＳ培地でＣｏｌ−０は、正常発芽しなく、死滅した。従って、７０ｎＭのチアフェナシル下での生存は、植物がチアフェナシルに対して、抵抗性を有することを意味する。
試験結果、図１５に示されるように、ＣｙＰＰＯ２形質転換体のＴ２世代ラインのうち、第１番と第４９番が発芽を示し、ＣｙＰＰＯ８形質転換体のＴ２世代ラインのうち、第６番、第１６番及び第４０番が７０ｎＭのチアフェナシルが含まれた１／２ＭＳ培地で発芽することを確認することができた。また、陰性対照群として使用された野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０）種子は、７０ｎＭのチアフェナシルが含まれた１／２ＭＳ培地で発芽を示さなかった。陽性対照群として使用された変異ＡｔＰＰＯ１形質転換体は、７０ｎＭのチアフェナシルが含まれた１／２ＭＳ培地でも発芽することを確認することができた。
実施例８．後代遺伝性試験
８−１．Ｔ２世代種子の分離比（segregation ratio）の確認
形質転換されたシロイヌナズナで除草剤抵抗性形質が後代への遺伝形質を判断するために、Ｔ２種子を対象にＢＡＲ遺伝子抵抗性と感受性個体の分離比（segregation ratio）をライン別に判断した。
ＣｙＰＰＯ２形質転換体の場合、１０個のラインのうち、第１０番、第２０番、第３８番、第４０番ラインが３：１に近い分離比を示し、ゲノム内トランス遺伝子（transgene）が単一コピー（single copy）に挿入され、メンデルの法則に従って分離及び発現されたことを確認することができた。残りの６個のラインの場合は、３：１の分離比を示さず、２重コピー（double copy）以上と予測された。
ＣｙＰＰＯ８形質転換体の場合、５個のラインのうち、第６番、第１６番、第４０番ラインが３：１に近い分離比を示し、ゲノム内トランス遺伝子が単一コピー挿入され、メンデルの法則に従って、分離及び発現されたことを確認することができた。残りの２個のラインの場合、３：１より低い分離比を示した。
８−２．除草剤抵抗性Ｔ２世代種子でＣｙＰＰＯ２及びＣｙＰＰＯ８タンパク質の発現確認
後代でＣｙＰＰＯ２及びＣｙＰＰＯ８タンパク質の発現が維持されるかどうかを判断するために、形質転換体のＴ２世代ライン別にタンパク質を抽出し、ウエスタンブロットを行った。ＨＡ ｔａｇ ＰＰＯタンパク質量を検出するために、シロイヌナズナの葉約１００ｍｇからタンパク質を抽出し、電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に移転した後、ａｎｔｉ−ＨＡ抗体を用いてウエスタンブロットを行った。Ｔ１世代植物に１μＭのチアフェナシルをスプレー処理したとき、生長する植物を抵抗性ライン、死ぬ植物を感受性ラインに分類した。
その結果、ＣｙＰＰＯ２形質転換体の場合、除草剤散布で抵抗性を有する第８番、第２３番、第３０番、第３８番、第４０番及び４９番ラインは、ＰＰＯタンパク質が検出されたが、感受性のラインではタンパク質が検出されなかった（図１６）。ＣｙＰＰＯ８形質転換体でも除草剤に抵抗性を有する第６番、第２３番、第３８番、第４０番ラインは、ＰＰＯタンパク質が検出されたが、感受性のラインではタンパク質が検出されなかった（図１７）。これは抵抗性ラインが後代でもＣｙＰＰＯ２及びＣｙＰＰＯ８タンパク質発現を維持し、抵抗性を付与することを示す。
８−３．ＢＡＲ遺伝子を用いたトランス遺伝子の安定的遺伝性の検証
形質転換された遺伝子のＢＡＲ遺伝子のゲノム内挿入の有無を検証することによって、後代へのトランス遺伝子の安定的遺伝性を確認した。ＣｙＰＰＯ２及びＣｙＰＰＯ８形質転換体の葉１００ｍｇを用いて、ゲノムＤＮＡを分離した後、ＢＡＲ遺伝子の挿入を、ＰＣＲを通じて検証した。その結果、ＣｙＰＰＯ２形質転換体及びＣｙＰＰＯ８形質転換体においてチアフェナシル抵抗性及び感受性ラインが、いずれもＢＡＲ遺伝子がゲノム内挿入されたことが分かった。これは、形質転換された遺伝子が後代に安定的に継承されていることが示された。
実施例９．形質転換シロイヌナズナの除草剤抵抗性の検証
除草剤抵抗性形質が植物の世代が進展するにつれて維持されるかを判断するために、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８遺伝子がそれぞれ形質転換されたシロイヌナズナのＴ２世代植物に対して、除草剤抵抗性をテストした。約４週生育したシロイヌナズナ植物当たり０．５μＭのチアフェナシル、１μＭのサフルフェナシル、又は３μＭのホメサフェン２〜３ｍＬをそれぞれスプレーした。スプレー後、７日目に観察した結果、野生型Ｃｏｌ−０植物は全部死滅した反面、陽性対照群である変異ＡｔＰＰＯ１形質転換体と実験群であるＣｙＰＰＯ２形質転換体、ＣｙＰＰＯ４形質転換体及びＣｙＰＰＯ８形質転換体が略損傷なしに持続生長した（図１８及び図１９）。これは、Ｔ１植物が有していた除草剤抵抗性形質がＴ２世代によく継承され、除草剤抵抗性を付与することが示された。
実施例１０．作用機序の異なる複数の除草剤との交差使用試験
前記実施例６で製造した植物形質転換ベクターを用いて形質転換して収得された、ＣｙＰＰＯ２又はＣｙＰＰＯ８遺伝子を含むシロイヌナズナ形質転換体は、ＰＰＯ活性を抑制する除草剤に対する抵抗性遺伝子及びグルホシネート（glyphosate）抵抗性遺伝子を同時に発現される。従って、前記シロイヌナズナ形質転換体に対して、２種類の除草剤、即ち、ＰＰＯ活性を抑制する除草剤及びグルホシネートを交差使用したと、雑草の防除に効果的であるかどうかをテストした。それのために、ＣｙＰＰＯ２及びＢＡＲ遺伝子が挿入されたシロイヌナズナ形質転換体、又はＣｙＰＰＯ８及びＢＡＲ遺伝子が挿入されたシロイヌナズナ形質転換体の種子を消毒し、４℃で２日間低温処理した。種子をそれぞれ１／２ＭＳ培地（Duchefa社）、７０ｎＭのチアフェナシルを添加した１／２ＭＳ培地、５０μＭのグルホシネートを添加した１／２ＭＳ培地、又は７０ｎＭのチアフェナシル及び５０μＭのグルホシネートを添加した１／２ＭＳ培地に播種し、２３℃、１６時間の明及び８時間の暗の条件で７〜１４日間生長させた。除草剤培地上のシロイヌナズナは、それぞれＣｙＰＰＯ２又はＣｙＰＰＯ８を形質転換した種子と対照区である野生型Ｃｏｌ０であった。形質転換体と対照区を除草剤培地に培養し、培養２週後観察した結果、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ８はグルホシネート添加培地、チアフェナシル添加培地、又はグルホシネート及びチアフェナシル添加培地で正常に生長したが、対照区であるＣｏｌ０は発芽しなかった（図２０参照）。
これらの結果から、本発明のＰＰＯ除草剤抵抗性遺伝子とＢＡＲ遺伝子を二価ベクターに組換えることによって形質転換植物を確保し、これらＧＭ植物を利用してそれぞれ異なる機序を有する除草剤を交差又は二重処理する場合、所望しない植物を制御することができることを確認した。
本実施例では、組換え遺伝子としてＣｙＰＰＯ遺伝子とともに導入されたＢＡＲ遺伝子は、抵抗性遺伝子の例示であるのみで、本実施例に用いられる遺伝子の種類に制限されない。この目的に適した抵抗性遺伝子をＣｙＰＰＯ２、４、８又は１２と共に二値ベクターに組換える一方、各遺伝子が抵抗性を示す除草剤を交差処理する場合、所望の抵抗性が得られることは当業者に自明である。
実施例１１．複数のＰＰＯ除草剤の交差使用試験
実施例９では、本願で作製されたシロイヌナズナ形質転換体がＰＰＯ系除草剤であるチアフェナシルとサフルフェナシルに同時に抵抗性を有するかを確認しており、前記シロイヌナズナヒョンジン転換体に対して、チアフェナシルとサフルフェナシルを交差使用したとき、雑草の防除に効果的であるかどうかをテストした。このために、ＣｙＰＰＯ２又はＣｙＰＰＯ８遺伝子が挿入されたシロイヌナズナ形質転換体種子を消毒し、４℃で、２日間低温処理した。種子をそれぞれ１／２ＭＳ培地、７０ｎＭのチアフェナシルを添加した１／２ＭＳ培地、７０ｎＭのサフルフェナシルを添加した１／２ＭＳ培地、又は３５ｎＭのチアフェナシル及び３５ｎＭのサフルフェナシルを添加した１／２ＭＳ培地に播種し、２３℃、１６時間の明及び８時間の暗条件で７〜１４日間生長させた。除草剤培地上のシロイヌナズナは、それぞれＣｙＰＰＯ２又はＣｙＰＰＯ８を形質転換した種子と対照区である野生型Ｃｏｌ０であった。形質転換体と対照区を除草剤培地に培養し、培養２週後観察した結果、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ８は、チアフェナシル添加培地、サフルフェナシル添加培地、又はチアフェナシル及びサフルフェナシル添加培地で正常に生長したが、対照区であるＣｏｌ０は発芽しなかった（図２１参照）。
こられの結果から、本発明のＰＰＯ除草剤抵抗性遺伝子を用いて、ＧＭ植物を作製する場合、ＰＰＯ系列に該当する単一除草剤の処理だけでなく、複数の除草剤を交差又は二重処理する場合にも、所望しない植物を制御することができることを確認した。
実施例１２．ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８アミノ酸配列相同性による除草剤抵抗性検証
除草剤抵抗性が維持されるＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８アミノ酸配列相同性範囲を確認するために、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８タンパク質の一部アミノ酸配列をＮｔＰＰＯ（タバコ由来ＰＰＯ遺伝子）の一部アミノ酸配列に置換した。その結果、生成されたＣｙＰＰＯ２アミノ酸配列変異体は、配列番号１２、その塩基配列を配列番号１３に示した。前記ＣｙＰＰＯ２配列変異体は、ＣｙＰＰＯ２のアミノ酸及び塩基配列とそれぞれ９８％の配列相同性を有することを確認した。また、生成されたＣｙＰＰＯ４アミノ酸配列変異体は、配列番号１４、その塩基配列を配列番号１５に示し。前記ＣｙＰＰＯ４配列変異体のアミノ酸及び塩基配列は、ＣｙＰＰＯ４のアミノ酸及び塩基配列とそれぞれ９８％の配列相同性を有することを確認した。生成されたＣｙＰＰＯ８アミノ酸配列変異体は配列番号１６、その塩基配列を配列番号１７に示した。前記ＣｙＰＰＯ８配列変異体は、ＣｙＰＰＯ８のアミノ酸及び塩基配列とそれぞれ９８％の配列相同性を有することを確認した。
ＣｙＰＰＯ２アミノ酸配列変異体、ＣｙＰＰＯ４アミノ酸配列変異体及びＣｙＰＰＯ８アミノ酸配列変異体の除草剤抵抗性をＰＰＯが欠乏したＢＴ３大腸菌［ＢＴ３（ΔＰＰＯ）］を用いて検証した。具体的な実験方法は、実施例３と同様である。実施例３と同様に、陰性対照群としてはシロイヌナズナの野生型ＰＰＯ（野生型ＡｔＰＰＯ１）を用いて、除草剤感受性の基準に設定し、陽性対照群では前記野生型のアミノ酸配列でＹ４２６Ｍ及びＳ３０５Ｌのアミノ酸置換が発生した変異ＡｔＰＰＯ１を用いて、除草剤抵抗性の基準に設定した。
１２−１．実験材料及び機器の準備
オートクレーブは１２１℃で、１５分、培養器は３７℃、光条件１６９μｍｏｌ ｍ−２ ｓ−１及び培養時間１４〜１６時間の条件で用いた。紫外可視分光光度計は６００ｎｍで測定し、９４℃で、４分間反応した後、２５サイクル（９４℃で、３０秒、５６〜６０℃で、３０秒及び７２℃で、３分）繰り返して、７２℃で、５分及び４℃で、５分の間ＰＣＲ反応した。実験に用いられた除草剤は下記表８に記載した。各除草剤はＤＭＳＯに２００ｍＭ濃度で調製し、−２０℃保管した後、希釈して、ＬＢブロス培地（クロラムフェニコール３４ｍｇ／ｍＬ含む）に添加して使用した。
１２−２．実験方法
クロラムフェニコールを含む３ｍＬのＬＢブロス液体培地に、飽和細胞を接種した後、３７℃、２００ｒｐｍ条件で５時間培養した。６００ｎｍで培養した細胞濃度を測定し、形質転換体１ｍＬ当たり吸光度（ＯＤ６００）が一定になるようにＬＢ液体培地で希釈した（ＯＤ６００＝０．５）。ＬＢブロス液体培地に寒天を１％で添加し、オートクレーブで滅菌した。クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍＬ）と濃度に応じて除草剤を添加し、混合した。同じ濃度で希釈した細胞を１００、１０−１、１０−２、１０−３、１０−４、１０−５に希釈した。細胞を１％寒天、ＬＢブロス固体培地に１０μＬずつ滴下した。３７℃の培養器で１４〜１６時間培養した（光条件：１６９μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１）。
ｐＡＣＢＢ−ＣｙＰＰＯ２、ｐＡＣＢＢ−ＣｙＰＰＯ４及びｐＡＣＢＢ−ＣｙＰＰＯ８のそれぞれを鋳型として、置換部位のプライマー（表９）を作製し、ＰＣＲを行い、ｐＡＣＢＢ−ＣｙＰＰＯ２変異体、ｐＡＣＢＢ−ＣｙＰＰＯ４変異体及びｐＡＣＢＢ−ＣｙＰＰＯ８変異体ベクターを作製した。ＰＣＲ反応液は、テンプレート（ｐＡＣＢＢ−ＣｙＰＰＯ２、ｐＡＣＢＢ−ＣｙＰＰＯ４及びｐＡＣＢＢ−ＣｙＰＰＯ８オリジナル）１μＬ、１０Ｘ バッファー５μＬ、ｄＮＴＰ混合物（各１０ｍＭ）１μＬ、フォワードプライマー（１０μＭ）１μＬ、リバースプライマー（１０μＭ）１μＬ、ＤＤＷ３５μＬ、及びＰｆｕ−Ｘ（Solgent社；２．５ｕｎｉｔ/μＬ）１μＬを含む反応液５０μＬで構成し、９４℃で、４分間反応した後、２５サイクル（９４℃で３０秒、５６℃で３０秒及び７２℃で３分）繰り返して、７２℃で５分及び４℃で５分反応して増幅した。
ＢＴ３（ΔＰＰＯ）コンピテント細胞を作製するために、ＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株を５ｍＬのＬＢブロスに、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び２０μｇ／ｍＬのヘマチンを添加し、３７℃震とう培養器で１２時間、暗培養した。その後、５ｍＬ培養液を２０μｇ／ｍＬヘマチン添加された１００ｍＬのＬＢブロスに入れた後、ＯＤ６００＝０．５程度になるまで３７℃震とう培養器で暗培養した。培養された大腸菌を、ＣａＣｌ２を用いてコンピテント細胞作製プロトコルに従って、ＢＴ３（ΔＰＰＯ）コンピテント細胞を作製した。次に、ＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株に、ＣｙＰＰＯ２変異体、ＣｙＰＰＯ４変異体及びＣｙＰＰＯ８変異体を含有するベクターを形質転換するために、ＢＴ３（ΔＰＰＯ）コンピテント細胞１００μＬにベクター５μＬを添加し、混合した後、２０分間、氷で反応した後、４２℃で４０秒間静置した。その後、氷で２分間安定化させ、ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＬＢブロス１ｍＬを添加し、３７℃で１時間撹拌培養した。各挿入遺伝子の種類別に、培養液で生育した菌を回収し、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍＬ）が添加されたＬＢ固体培地に塗抹した後、３７℃で１２時間以上培養した。その後、各単一コロニーを液体ＬＢ培地で培養した。以後、光状態で除草剤処理による生長阻害を測定し、除草剤が未添加されたＬＢ固体培地で生育したＢＴ３形質転換菌株の生育状態と比較し、除草剤が濃度別に添加されたＬＢ固体培地でＢＴ３形質転換菌株が育つ状態を観察した。
１２−３．実験の結果
図２２〜図２５は、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８のオリジナル配列とそれぞれ９８％の配列相同性を有するＣｙＰＰＯ２変異体、ＣｙＰＰＯ４変異体及びＣｙＰＰＯ８変異体遺伝子の除草剤抵抗性を確認した結果を示す。陰性対照群では野生型ＡｔＰＰＯ１を除草剤感受性の基準に設定し、陽性対照群では変異ＡｔＰＰＯ１を除草剤抵抗性の基準に設定したので、変異ＡｔＰＰＯ１で形質転換された菌株と同等以上の抵抗性別を示した場合、除草剤抵抗性があると判断した。
結果的に、９個の系統の１３種の除草剤（チアフェナシル、サフルフェナシル、ブタフェナシル、ホメサフェン、アシフルオルフェン、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、スルフェントラゾン、ペントキサゾン、ピラフルフェンエチル、ピラクロニル、オキサジアゾン、フルチアセットメチル）において、ＣｙＰＰＯ２変異体、ＣｙＰＰＯ４変異体及びＣｙＰＰＯ８変異体で形質転換されたＢＴ３菌株全部明条件でよく生長し、陽性対照群である変異ＡｔＰＰＯ１と同等以上の除草剤抵抗性を示した（２５μＭでも生長阻害をほとんど示さしていない）。
したがって、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８だけでなく、これらと９８％配列相同性を有する変異体も、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８の抵抗性水準と同等又はそれ以上の抵抗性を示し、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４及びＣｙＰＰＯ８の一部配列が改変されてもＰＰＯの機能を示し、除草剤抵抗性に関する生物学的活性が維持されることを確認することができた。

Claims (19)

  1. 配列番号１のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；
    配列番号３のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；
    配列番号５のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；及び
    配列番号７のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれをコードする遺伝子；
    からなる群から選ばれる１種以上のポリペプチド又は遺伝子を含む、植物又は藻類の除草剤抵抗性付与又は増進用組成物。
  2. 前記遺伝子は、
    配列番号２の塩基配列又はこれと９５％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子；
    配列番号４の塩基配列又はこれと９５％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子；
    配列番号６の塩基配列又はこれと９５％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子；又は
    配列番号８の塩基配列又はこれと９５％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子；
    である請求項１に記載の組成物。
  3. 前記遺伝子は、植物発現用組換えベクター又は藻類発現用組換えベクターの形態で含まれたものである請求項１に記載の組成物。
  4. 前記除草剤は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤である請求項１に記載の組成物。
  5. 前記除草剤は、ピリミジンジオン系（Pyrimidinediones）、ジフェニルエーテル系（Diphenyl-ethers）、フェニルピラゾール系（Phenylpyrazoles）、Ｎ−フェニルフタルイミド系（N-Phenylphthalimides）、チアジアゾール系（Thiadiazoles）、オキサジアゾール系（Oxadiazoles）、トリアゾリノン系（Triazolinones）、オキサゾリジンジオン系（Oxazolidinediones）及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種以上である請求項４に記載の組成物。
  6. 前記除草剤は、ブタフェナシル（Butafenacil）、サフルフェナシル（Saflufenacil）、ベンズフェンジゾン（Benzfendizone）、チアフェナシル（Tiafenacil）、ホメサフェン（Fomesafen）、オキシフルオルフェン（Oxyfluorfen）、アクロニフェン（Aclonifen）、アシフルオルフェン（Acifluorfen）、ビフェノックス（Bifenox）、エトキシフェン（Ethoxyfen）、ラクトフェン（Lactofen）、クロメトキシフェン（Chlomethoxyfen）、クロルニトロフェン（Chlorintrofen）、フルオログリコフェン−エチル（Fluoroglycofen-ethyl）、ハロサフェン（Halosafen）、ピラフルフェン−エチル（Pyraflufen-ethyl）、フルアゾレート（Fluazolate）、フルミオキサジン（Flumioxazin）、シニドン−エチル（Cinidon-ethyl）、フルミクロラック−ペンチル（Flumiclorac-pentyl）、フルチアセット（Fluthiacet）、チジアジミン（Thidiazimin）、オキサジアルギル（Oxadiargyl）、オキサジアゾン（Oxadiazon）、カルフェントラゾン（Carfentrazone）、スルフェントラゾン（Sulfentrazone）、アザフェニジン（Azafenidin）、ペントキサゾン（Pentoxazone）、ピラクロニル（Pyraclonil）、プルルペンピル−エチル（Flufenpyr-ethyl）、プロフルアゾール（Profluazol）及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種以上である請求項４に記載の組成物。
  7. 前記植物が、単子葉植物、双子葉植物、草本又は木本植物である請求項１に記載の組成物。
  8. 前記植物と藻類は、第２除草剤抵抗性ポリペプチド又はこれをコードする遺伝子を更に含むことによって、第２除草剤に対して、新規又は増進された抵抗性を有するものである請求項１に記載の組成物。
  9. 第２除草剤は、グリホサート（glyphosate）、グルホシネート（glyphosate）、ジカンバ（dicamba）、２，４−Ｄ（2,4-ジクロロフェノキシ酢酸）、イソキサフルトール（Isoxaflutole）、ＡＬＳ（アセト乳酸シンターゼ）阻害性除草剤、光化学系II（photosystem II）阻害性除草剤、フェニルウレア（phenylure）系除草剤、ブロモキシニル（bromoxynil）系除草剤及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種以上である請求項８に記載の組成物。
  10. 前記第２除草剤抵抗性ポリペプチドは、
    グリホサート（glyphosate）除草剤抵抗性ＥＰＳＰＳ（グリホサート抵抗性5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸シンターゼ）、ＧＯＸ（グリホサートオキシダーゼ）、ＧＡＴ（グリホサート-N-アセチルトランスフェラーゼ）又はグリホサートデカルボキシラーゼ（glyphosate decarboxylase）；
    グルホシネート（glyphosate）除草剤抵抗性ＰＡＴ（ホスフィノスリシン-N-アセチルトランスフェラーゼ）；
    ジカンバ（dicamba）除草剤抵抗性ＤＭＯ（モノオキシゲナーゼ）；
    ２、４−Ｄ（2,4-ジクロロフェノキシ酢酸）除草剤抵抗性２,４−Ｄモノオキシゲナーゼ又はＡＡＤ（アリルオキシアルカノエート・ジオキシゲナーゼ）；
    ＡＬＳ（アセト乳酸シンターゼ）阻害性スルホニルウレア系除草剤抵抗性ＡＨＡＳ（アセトヒドロキシ酸シンターゼ）、ＡＨＡＳ（アセトヒドロキシ酸シンターゼ）又はＡｔａｈａｓｌ（アセトヒドロキシ酸シンターゼ大型サブユニット）；
    光化学系II（photosystem II）阻害性除草剤抵抗性光化学系ＩＩ（photosystem II）タンパク質Ｄ１；
    フェニルウレア（phenylurea）除草剤抵抗性チトクロームＰ４５０（Cytochrome P450）；
    色素体阻害性除草剤抵抗性ＨＰＰＤ（ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ）；
    ブロモキシニル（bromoxynil）除草剤抵抗性ニトリラーゼ（Nitrilase）；及び
    これらの組み合わせからなる群から選ばれる１種以上である、請求項８に記載の組成物。
  11. 前記第２除草剤抵抗性ポリペプチドをコードする遺伝子は、
    グリホサート（glyphosate）除草剤抵抗性ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ、ＭＥＰＳＰＳ、２ＭＥＰＳＰＳ、ＧＯＸＶ２４７、ＧＡＴ４６０１又はＧＡＴ４６２１遺伝子；
    グルホシネート（glyphosate）除草剤抵抗性ＢＡＲ又はＰＡＴ遺伝子；
    ジカンバ（dicamba）除草剤抵抗性ＤＭＯ遺伝子；
    ２，４−Ｄ（2,4-ジクロロフェノキシ酢酸）除草剤抵抗性ＡＡＤ−１又はＡＡＤ−１２遺伝子；
    イソキサフルトール除草剤抵抗性ＨＰＰＤＰＦ Ｗ３３６遺伝子；
    スルホニル尿素除草剤抵抗性ＡＬＳ、ＣＳＲ１、ＣＳＲ１−１、ＣＳＲ１−２、ＧＭ−ＨＲＡ、Ｓ４−ＨＲＡ、ＺＭ−ＨＲＡ,ＳＵＲＡ又はＳＵＲＢ；
    光化学系II（photosystem II）阻害性除草剤抵抗性ＰＳＢＡ遺伝子；
    フェニルウレア（phenylure）除草剤抵抗性ＣＹＰ７６Ｂ１遺伝子；
    ブロモキシニル（bromoxynil）除草剤抵抗性ＢＸＮ遺伝子；及び
    これらの組み合わせからなる群から選ばれる１種以上である、請求項８に記載の組成物。
  12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド又は遺伝子を含む、除草剤抵抗性を有する形質転換体、これのクローン又は子孫。
  13. 前記形質転換体は、植物細胞、プロトプラスト、カルス、胚軸、種子、子葉、新梢又は植物である請求項１２に記載の形質転換体、これのクローン又は子孫。
  14. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド又は遺伝子で藻類、植物細胞、プロトプラスト、カルス、胚軸、種子、子葉、新梢又は商業作物を含む植物を形質転換する工程を含む、除草剤抵抗性を有する植物又は藻類を製造する方法。
  15. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド又は遺伝子で藻類、植物細胞、プロトプラスト、カルス、胚軸、種子、子葉、新梢又は商業作物を含む植物を形質転換する工程を含む、植物藻類の除草剤抵抗性を付与又は増進させる方法。
  16. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド又は遺伝子を含む植物を栽培地に提供する工程、及び
    前記栽培地に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する工程、
    を含む栽培地で雑草を防除する方法。
  17. 前記栽培地に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する工程は、２種以上のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を順次又は同時に適用する請求項１６に記載の方法。
  18. 前記植物は、第２除草剤抵抗性ポリペプチド又はこれをコードする遺伝子をさらに含むものであり、
    前記栽培地に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤及び第２除草剤の有効量を順次又は同時に適用する請求項１６に記載の方法。
  19. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド又は遺伝子を含む藻類を培養培地に提供する工程、及び
    前記培養培地に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する工程、
    を含む培養培地で所望しない水生生物を防除する方法。
JP2017533480A 2014-12-16 2015-12-16 プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ変異体を用いた植物及び／又は藻類の除草剤抵抗性付与又は増進方法 Active JP6499292B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20140181791 2014-12-16
KR10-2014-0181791 2014-12-16
PCT/KR2015/013812 WO2016099153A1 (en) 2014-12-16 2015-12-16 Methods for conferring or enhancing herbicide resistance on plants and/or alga with protoporphyrinogen oxidase variants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2018500909A true JP2018500909A (ja) 2018-01-18
JP6499292B2 JP6499292B2 (ja) 2019-04-10

Family

ID=56126950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017533480A Active JP6499292B2 (ja) 2014-12-16 2015-12-16 プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ変異体を用いた植物及び／又は藻類の除草剤抵抗性付与又は増進方法

Country Status (15)

Country Link
US (2) US10717985B2 (ja)
EP (2) EP3234129B1 (ja)
JP (1) JP6499292B2 (ja)
KR (2) KR101827545B1 (ja)
CN (1) CN107466321B (ja)
AR (1) AR103056A1 (ja)
AU (2) AU2015363925B2 (ja)
BR (1) BR112017012666A2 (ja)
CA (1) CA2967935C (ja)
CL (1) CL2017001564A1 (ja)
ES (2) ES2894871T3 (ja)
IL (1) IL252586A0 (ja)
MX (1) MX2017007888A (ja)
PH (2) PH12017501047A1 (ja)
WO (1) WO2016099153A1 (ja)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017217794A1 (en) * 2016-06-16 2017-12-21 Farmhannong Co., Ltd. Protoporphyrinogen oxidase variants and methods and compositions for conferring and/or enhancing herbicide tolerance using the same
US10745712B2 (en) * 2016-07-29 2020-08-18 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for gene expression in plants
US11219221B2 (en) 2017-12-15 2022-01-11 Farmhannong Co., Ltd. Composition and method for conferring and/or enhancing herbicide tolerance using variants of protoporphyrinogen IX oxidase from cyanobacteria
AU2018385129A1 (en) * 2017-12-15 2020-07-02 Farmhannong Co., Ltd. Composition and method for conferring and/or enhancing tolerance against herbicides by using variants of PPO
KR102057445B1 (ko) * 2018-03-06 2020-01-14 주식회사 팜한농 피리미딘다이온계 화합물을 포함하는 제초제 조성물
KR102015925B1 (ko) * 2018-05-03 2019-08-29 한국해양과학기술원 남극개미자리 원형질체 분리용 효소액 및 이를 이용하여 남극개미자리로부터 원형질체를 분리하는 방법
CN109964743A (zh) * 2019-04-10 2019-07-05 达州市农业科学研究院 一种适用于黄花菜栽培的除草方法
BR122024000155A2 (pt) * 2019-06-14 2024-02-27 Farmhannong Co., Ltd. Métodos e composições para conferir e/ou aumentar a tolerância a herbicidas com o uso de protoporfirinogênio ix oxidase de várias cianobacterias ou variantes das mesmas
MX2023006053A (es) 2020-11-24 2023-06-06 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos herbicidas.
EP4320122A1 (en) 2021-04-07 2024-02-14 Syngenta Crop Protection AG Herbicidal compounds
KR102616008B1 (ko) * 2021-09-01 2023-12-21 대한민국 유전자변형생물체 스크리닝용 양성대조군 핵산 구조물 및 이의 용도
AU2023231748A1 (en) 2022-03-11 2024-09-05 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2023222589A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2024012968A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal pyrimidinone derivatives
WO2024020316A2 (en) * 2022-07-22 2024-01-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for ppo herbicide tolerance
WO2024160989A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Syngenta Crop Protection Ag Herbicide resistant plants
WO2024175476A1 (en) 2023-02-24 2024-08-29 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2024175475A1 (en) 2023-02-24 2024-08-29 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2024194063A1 (en) 2023-03-17 2024-09-26 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal triazine derivatives

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010526535A (ja) * 2007-05-09 2010-08-05 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 新規な除草剤抵抗性遺伝子

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6808904B2 (en) 1994-06-16 2004-10-26 Syngenta Participations Ag Herbicide-tolerant protox genes produced by DNA shuffling
US6084155A (en) 1995-06-06 2000-07-04 Novartis Ag Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
US5859348A (en) * 1996-07-17 1999-01-12 Board Of Trustees Operating Michigan State University Imidazolinone and sulfonyl urea herbicide resistant sugar beet plants
KR100559155B1 (ko) * 2004-04-12 2006-03-13 전남대학교산학협력단 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자 및 이를이용한 식물의 제초제 저항성 증대방법
JP4720223B2 (ja) 2004-05-18 2011-07-13 住友化学株式会社 除草活性化合物耐性植物
EP1930434B1 (en) * 2005-09-26 2012-02-22 Nippon Soda Co., Ltd. Protoporphyrinogen oxidase having activity of imparting resistance against acifluorfen and gene thereof
AR073279A1 (es) * 2008-09-05 2010-10-28 TransAlgae Ltd Resistencia a herbicida para mantener cultivos axenicos de algas por manipulacion genetica
EP2521441A4 (en) 2010-01-07 2013-10-23 Basf Agro B V Arnhem Nl Zuerich Branch HERBICID TOLERANT PLANTS
CN102438285B (zh) * 2010-09-29 2017-04-05 中兴通讯股份有限公司 在终端切换过程中对终端进行接入控制的方法及系统
KR102085133B1 (ko) 2010-12-16 2020-03-05 바스프 아그로 비.브이. 제초제에 대한 내성이 증가된 식물
CN102321640B (zh) * 2011-08-18 2013-08-07 杭州瑞丰生物科技有限公司 抗除草剂基因及其在转基因农作物中的应用
AR091489A1 (es) * 2012-06-19 2015-02-11 Basf Se Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo)
CN103740664B (zh) * 2013-12-24 2016-05-18 北京大北农科技集团股份有限公司 除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途
CN103740663B (zh) * 2013-12-24 2016-04-20 北京大北农科技集团股份有限公司 除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010526535A (ja) * 2007-05-09 2010-08-05 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 新規な除草剤抵抗性遺伝子

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
UNIPROT[ONLINE], JPN6018015658, 2013, ISSN: 0003790321 *
UNIPROT[ONLINE], JPN6018015660, 2007, ISSN: 0003790322 *
UNIPROT[ONLINE], JPN6018015662, 2013, ISSN: 0003790323 *
UNIPROT[ONLINE], JPN6018015664, 2011, ISSN: 0003790324 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101862795B1 (ko) 2018-07-04
KR101827545B1 (ko) 2018-02-08
MX2017007888A (es) 2017-09-05
AU2019204916A1 (en) 2019-07-25
US10717985B2 (en) 2020-07-21
EP3234129B1 (en) 2021-09-15
ES2900515T3 (es) 2022-03-17
ES2894871T3 (es) 2022-02-16
PH12017501047A1 (en) 2017-11-27
BR112017012666A2 (pt) 2018-05-15
AU2015363925A1 (en) 2017-05-25
PH12020552021A1 (en) 2022-02-14
AU2019204916B2 (en) 2021-04-01
US11130960B2 (en) 2021-09-28
EP3234129A4 (en) 2018-10-17
EP3540058B1 (en) 2021-11-24
EP3234129A1 (en) 2017-10-25
JP6499292B2 (ja) 2019-04-10
CN107466321B (zh) 2021-07-20
US20200277619A1 (en) 2020-09-03
AR103056A1 (es) 2017-04-12
CA2967935A1 (en) 2016-06-23
US20170327837A1 (en) 2017-11-16
WO2016099153A1 (en) 2016-06-23
EP3540058A1 (en) 2019-09-18
CA2967935C (en) 2022-03-22
KR20160073340A (ko) 2016-06-24
IL252586A0 (en) 2017-07-31
CN107466321A (zh) 2017-12-12
AU2015363925B2 (en) 2019-05-02
KR20160146629A (ko) 2016-12-21
CL2017001564A1 (es) 2018-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6499292B2 (ja) プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ変異体を用いた植物及び／又は藻類の除草剤抵抗性付与又は増進方法
KR102305484B1 (ko) 남세균 유래 프로토포르피리노겐 ix 옥시다아제의 변이체를 이용하는 제초제 내성 부여 및/또는 증진을 위한 조성물 및 방법
KR102250017B1 (ko) 프로토포르피리노겐 옥시다아제 또는 이의 변이체를 이용하는 제초제 내성 부여 및/또는 증진을 위한 조성물 및 방법
CA3085594C (en) Composition and method for conferring and/or enhancing tolerance against herbicides by using variants of ppo
KR102011925B1 (ko) 프로토포르피리노겐 옥시다아제 변이체 및 이를 이용하는 제초제 내성 부여 및/또는 증진을 위한 조성물 및 방법
BR122024000155A2 (pt) Métodos e composições para conferir e/ou aumentar a tolerância a herbicidas com o uso de protoporfirinogênio ix oxidase de várias cianobacterias ou variantes das mesmas

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180508

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20180806

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20181005

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181026

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20190305

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20190314

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6499292

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250