KR20160146629A - 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 이용한 식물 및/또는 조류의 제초제 저항성 부여 또는 증진 방법 - Google Patents

프로토포르피리노겐 옥시다아제를 이용한 식물 및/또는 조류의 제초제 저항성 부여 또는 증진 방법 Download PDF

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Abstract

원핵생물에서 유래한 프로토포르피리노겐 옥시다아제(Protoporphyrinogen oxidase)를 이용하여 식물 및/또는 조류(algae)의 제초제에 대한 저항성을 부여 및/또는 증진시키는 발명이 제공된다.

Description

프로토포르피리노겐 옥시다아제를 이용한 식물 및/또는 조류의 제초제 저항성 부여 또는 증진 방법{Methods for conferring or enhancing herbicide resistance on plants and/or alga with protoporphyrinogen oxidase variants}
원핵생물에서 유래한 프로토포르피리노겐 옥시다아제(protoporphyrinogen oxidase)를 이용하여 식물 및/또는 조류(algae)의 제초제에 대한 저항성을 부여 및/또는 증진시키는 발명이 제공된다.
포르피린 합성 경로는 식물의 대사 과정에서 중요한 엽록소와 헴(Heme)을 합성하는 과정으로 엽록체에서 이루어진다. 이 경로에서, 프로토포르피리노겐 옥시다아제(protoporphyrinogen IX oxidase, 이하 PPO; EC:1.3.3.4)는 프로토포르피리노겐 IX(Protoporphyrinogen IX)로부터 프로토포르피린 IX(protoporphyrin IX)로의 산화과정을 촉매한다. 프로토포르피리노겐 IX이 프로토포르피린 IX로 산화된 후 Mg-chelatase에 의해 마그네슘과 결합하면 엽록소가 합성 되고, Fe-chelatase에 의해 철과 결합하면 헴(Heme)이 합성된다.
따라서, PPO의 활성이 저해되면 엽록소와 헴의 합성이 억제되고, 기질인 프로토포르피리노겐 IX이 정상적인 포르피린 합성 경로에서 이탈하여 엽록체에서 세포질로 이동하여 빠르게 프로토포르피린 IX으로 산화되고 세포막에 축적된다. 이렇게 축적된 프로토포르피린 IX은 광과 산소 분자의 존재 하에서 활성이 높은 단일항산소(singlet oxygen, 1O2)를 발생시켜 식물의 세포막을 파괴함으로써 급속한 식물 세포 사멸을 일으킨다. 이러한 원리를 이용하여, PPO 활성을 억제하는 제초제가 개발되었으며, 현재까지 화학 구조에 따라 피리미딘디온계(Pyrimidinediones), 디페닐에테르계(diphenyl-ethers), 페닐피라졸계(Phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계(N-phenylphthalimides), 티아디아졸계(Thiadiazoles), 옥사디아졸계(oxadiazoles), 트리아졸리논계(triazolinones), 옥사졸리딘디온계(Oxazolidinediones) 및 기타의 9개 계통의 제초제가 사용되고 있다.
또한, 상기 제초제들을 사용하면서도 재배 대상 작물의 생장에는 영향을 미치지 않게 하기 위해서는 재배 대상 작물에 상기 제초제들에 대한 저항성을 부여할 필요성이 대두되어 왔다.
한편, 조류(algae)는 광합성 생물로서, 빛에너지를 다양한 유용한 화합물을 합성할 수 있는 에너지로 전환할 수 있다. 예를 들어, 조류는 광합성에 의하여 탄소를 고정시키며, 이산화탄소를 당, 전분, 지질, 지방 또는 다른 생체분자들로 전환함으로써, 대기 중의 온실가스를 제거할 수 있다. 또한, 조류의 대류모 배양을 통하여 산업적 효소, 치료 화합물 및 단백질, 영양 물질, 상업적 물질, 연료 물질과 같은 다양한 물질들을 생산할 수 있다.
그러나, 생물반응기(bioreactor) 또는 공개된 또는 폐쇄된 연못에서 조류를 대규모로 배양하는 경우, 원하지 않는 경쟁 생물들, 예를 들어 원치 않는 조류, 곰팡이, 윤충류(rotifer) 또는 동물성 플라크톤들에 의하여 오염이 발생할 수 있다.
따라서, 원하는 조류에 제초제 저항성을 부여한 후, 제초제 저항성이 없는 경쟁 생물들의 성장을 저해할 수 있는 농도로 제초제를 처리하여, 원하는 조류들을 대규모로 배양할 수 있는 기술이 필요하다.
미국특허출원 등록공보 US 6,308,458 (2001.10.30) 미국특허출원 등록공보 US 6,808,904 (2004.10.26) 미국특허출원 등록공보 US 7,563,950 (2009.07.21) 국제특허출원 공개공보 WO2011/085221 (2011.07.14)
Li X, Volrath SL., N D B.G., Chilcott CE, Johnson MA, Ward ER, Law MD, Development of protoporphyrinogen oxidase as an efficient selection marker for agrobacterium tumefaciens- mediated transformation of maize. Plant physiology 133:736-747, 2003
이에, 본 발명자들은 원핵생물로부터 hemY 타입의 PPO 유전자를 분리하여 이 유전자가 9개 계통의 PPO 활성 저해 제초제들에 대하여 광범위한 제초제 저항성을 나타낸다는 것을 검증하였고, 이를 식물 또는 조류에 발현시키면 제초제 저항성 형질을 부여할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 일예는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드; 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드; 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드; 및 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 폴리펩티드를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 저항성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
다른 예는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자; 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자; 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자; 및 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 저항성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
구체 예로, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 이루어지는 유전자; 서열번호 4의 염기서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 이루어지는 유전자; 서열번호 6의 염기서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 이루어지는 유전자; 또는 서열번호 8의 염기서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 이루어지는 유전자를 포함할 수 있다.
구체 예로, 상기 유전자는 식물 또는 조류 발현용 재조합 벡터 형태로 포함될 수 있다.
구체 예로, 상기 제초제는 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제일 수 있다.
구체 예로, 상기 제초제는 피리미딘디온계(Pyrimidinediones), 디페닐에테르계(diphenyl-ethers), 페닐피라졸계(Phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계(N-phenylphthalimides), 티아디아졸계(Thiadiazoles), 옥사디아졸계(oxadiazoles), 트리아졸리논계(triazolinones), 옥사졸리딘디온계(Oxazolidinediones) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
구체 예로, 상기 제초제는 부타페나실(Butafenacil), 사플루페나실(Saflufenacil), 벤즈펜디존(Benzfendizone), 티아페나실(Tiafenacil), 포메사펜(Fomesafen), 옥시플루오르펜(Oxyfluorfen), 아클로니펜(Aclonifen), 아시플루오르펜 (Acifluorfen), 비페녹스(Bifenox), 에톡시펜(Ethoxyfen), 락토펜(Lactofen), 클로메톡시펜(Chlomethoxyfen), 클로인트로펜(Chlorintrofen), 플루오로글리코펜-에틸(Fluoroglycofen-ethyl), 할로사펜(Halosafen), 피라플루펜-에틸(Pyraflufen-ethyl), 플루아졸레이트(Fluazolate), 플루미옥사진 (Flumioxazin), 시니돈-에틸(Cinidon-ethyl), 플루미클로락-펜틸(Flumiclorac-pentyl), 플루티아셋(Fluthiacet), 티디아지민(Thidiazimin), 옥사디아길(Oxadiargyl), 옥사디아존(oxadiazon), 카펜트라존(Carfentrazone), 설펜트라존(Sulfentrazone), 아자페니딘(Azafenidin), 펜톡사존(Pentoxazone), 피라클로닐(Pyraclonil), 플루펜피르-에틸(Flufenpyr-ethyl), 프로플루아졸(profluazol) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
구체 예로, 상기 식물은 단자엽 식물, 쌍자엽 식물, 초본 또는 목본 식물일 수 있다.
구체 예로, 상기 식물 또는 조류는 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 더욱 포함하도록 유전적으로 조작되며 상기 제2의 제초제에 대한 더 넓은 범위의 제초제 저항성이 부여되거나 및/또는 증진된 것일 수 있다.
구체 예로, 상기 제2의 제초제는 세포분열 저해성 제초제, 광합성 저해성 제초제, 아미노산합성 저해성 제초제, 색소체 저해성 제초제 및 세포막 저해성 제초제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체 예로, 상기 제2의 제초제는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트(glufosinate), 디캄바(dicamba), 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), 이속사플루톨(Isoxaflutole), ALS(acetolactate synthase) 저해성 제초제, 제2광계(photosystem II) 저해성 제초제, 페닐우레아(phenylure)계 제초제 또는 브로모시닐(bromoxynil)계 제초제 또는 이들의 조합을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체 예로, 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드는 글리포세이트 제초제 저항성 EPSPS(glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), GOX(glyphosate oxidase), GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈(glyphosate decarboxylase); 글루포시네이트 제초제 저항성 PAT(phosphinothricin-N-acetyltransferase); 디캄바 제초제 저항성 DMO(monooxygenase); 2,4-D 제초제 저항성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD(aryloxyalkanoate Dioxygenase); ALS 저해성 설포닐우레아(sulfonylurea)계 제초제 저항성 ALS(Acetolactate Synthase), AHAS(acetohydroxyacid synthase), 또는 Athahasl(Acetohydroxyacid synthase Large Subunit); 제2광계 저해성 제초제 저항성 광계 II(photosystem II) 단백질 D1; 페닐우레아계 제초제 저항성 시토크롬 P450(Cytochrome P450); 색소체 저해성 제초제 저항성 HPPD(Hydorxylphenylpyruvate dioxygenase); 브로모시닐 제초제 저항성 니트릴레이즈( Nitrilase); 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 글리포세이트 제초제 저항성 cp4 epsps,epsps(AG), mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자; 글루포시네이트 제초제 저항성 bar, pat 또는 pat(SYN) 유전자; 디캄바 제초제 저항성 dmo 유전자; 2,4-D 제초제 저항성 AAD-1, AAD-12 유전자; ALS 저해성 설포닐우레아계 제초제 저항성 ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, SurA 또는 SurB; 제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 저항성 psbA 유전자; 페닐우레아 제초제 저항성 CYP76B1 유전자; 이속사플루톨 제초제 저항성 HPPDPF W336 유전자 및 브로모시닐 제초제 저항성 bxn 유전자; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자, 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자, 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자; 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 제초제에 대한 저항성이 부여 및/또는 증진된 형질전환체, 이의 클론 또는 자손을 제공한다.
구체 예로, 상기 형질전환체는 조류, 식물세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물일 수 있다.
다른 예는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자, 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자, 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자, 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상으로 조류, 식물세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 저항성이 부여 및/또는 증진된 식물 또는 조류를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 예는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 식물, 식물세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물에 형질전환하는 단계를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 저항성을 부여 및/또는 증진시키는 방법을 제공한다.
다른 예는, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자, 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자, 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자, 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
구체 예로, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계는, 2종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것일 수 있다.
다른 예로, 상기 식물은 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 더욱 포함하도록 유전적으로 조작된 것이고, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것일 수 있다.
다른 예는, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자, 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자, 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자, 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 원하지 않는 수생 생물들을 제거하는 방법을 제공한다.
본 발명은 식물 또는 조류에 제초제에 대한 저항성을 부여 및/또는 증진하는 기술에 관한 것이다. 본원에서, '식물 또는 조류의 제초제에 대한 저항성 부여 및/또는 증진' 또는 '식물 또는 조류의 제초제에 대한 저항성 증진' 이란 제초제에 저항성이 없는 식물 또는 조류에 대하여 저항성을 부여하는 것, 또는 제초제에 저항성을 지닌 식물 또는 조류에 대하여 그 저항성을 보다 향상시키는 것을 모두 포괄하는 광의의 의미로 해석된다.
일 구체예는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드; 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드; 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드; 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 폴리펩티드를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 저항성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
다른 구체예는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자; 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자; 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자; 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자; 및 이들의 조합을 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 저항성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
다른 구체예는 상기 유전자로 형질전환된, 제초제에 대한 저항성을 가진 형질전환체를 제공한다.
다른 구체예는 상기 유전자를 조류, 식물세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 저항성을 가지는 식물 또는 조류를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 구체예는 상기 유전자를 조류, 식물세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물에 형질전환하는 단계를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 저항성을 부여 및/또는 증진시키는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본원에서는 오실라토리아 니그로-비리디스(Oscillatoria nigro-viridis) PCC 7112 에서 유래한 PPO 를 제공하며, 이를 CyPPO2로 명명하고, 이의 아미노산 서열을 서열번호 1로, 이를 코딩하는 유전자의 염기서열을 서열번호 2로 제공한다.
또한, 링비아 속(Lyngbya sp.) PCC 8106 균주에서 유래한 PPO 를 제공하며, 이를 CyPPO4로 명명하고, 이의 아미노산 서열을 서열번호 3으로, 이를 코딩하는 유전자의 염기서열을 서열번호 4로 제공한다.
또한, 할로테세 속(Halothece sp.) PCC 7418 균주에서 유래한 PPO 를 제공하며, 이를 CyPPO8로 명명하고, 이의 아미노산 서열을 서열번호 5로, 이를 코딩하는 유전자의 염기서열을 서열번호 6으로 제공한다.
또한, 마이크로콜레우스 바기나투스(Microcoleus vaginatus) 균주에서 유래한 PPO 를 제공하며, 이를 CyPPO12로 명명하고, 이의 아미노산 서열을 서열번호 7로, 이를 코딩하는 유전자의 염기서열을 서열번호 8로 제공한다. CyPPO12 의 아미노산 서열은 CyPPO2 의 아미노산 서열과 94%의 서열 상동성을 나타낸다.
본원에서 제공하는 제초제 저항성 PPO 단백질은 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 범위 내에서 추가적인 변이를 포함할 수 있다. 이러한 변이는 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 예를 들어, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 치환은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 통상적으로 일어나는 치환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 치환을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 경우에 따라서, 상기 단백질은, 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification) 될 수도 있다. 또한, 아미노산 서열 상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질 변이체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 제초제 저항성 PPO 단백질은 상기 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 생물학적 균등한 활성을 나타내는 변이체를 포함한다. 상기 변이체는 변형되지 않은 기준 단백질과 비교하여 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 포함할 수 있으며, 그 변형되지 않은 기준 단백질, 예컨대 야생형 단백질과 유사한 또는 동등한 생물학적 활성을 나타내는 것을 포함한다. 이와 관련하여, 용어 "서열 상동성"이란 야생형(wild type) 또는 기준이 되는 아미노산 서열 또는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 제초제 저항성 PPO 단백질의 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 잔기를 포함하면서 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 생물학적으로 균등한 활성을 보유한다면 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 이러한 단백질 상동물은 목적 단백질과 동일한 활성 부위를 포함할 수 있다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA를 포함한다.
또한, 본 발명에서 이용되는 제초제 저항성 PPO 유전자는, 상기 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 염기서열과 기능적으로 균등한 코돈 또는 (코돈의 축퇴성에 의해) 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다. 또는, 본 발명의 제초제 저항성 PPO 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 서열과 임의의 다른 염기 서열을 최대한 대응되도록 배열하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 배열된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 염기를 포함하면서 상기 제초제 저항성 PPO 단백질과 생물학적으로 균등한 활성을 보유하는 단백질을 코딩한다면 본 발명의 범위에 포함된다.
바람직한 일예로, 본원에서 제공하는 제초제 저항성 PPO 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 95% 또는 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 95% 또는 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 95% 또는 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 95% 또는 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 폴리펩티드를 포함한다.
또한, 제초제 저항성 PPO 유전자는, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 95% 또는 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 95% 또는 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상 또는 98%의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 95% 또는 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함한다.
상기 유전자는, 예를 들어, 서열번호 2의 염기서열 또는 이와 95% 또는 98% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 이루어지는 유전자, 서열번호 4의 염기서열 또는 이와 95% 또는 98% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 이루어지는 유전자, 서열번호 6의 염기서열 또는 이와 95% 또는 98% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 이루어지는 유전자, 서열번호 8의 염기서열 또는 이와 95% 또는 98% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 이루어지는 유전자 및/또는 이들의 조합을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제초제 저항성 PPO 단백질은 당 분야에 널리 공지된 방법으로 천연에서 추출 및 정제하여 얻을 수 있다. 또는, 화학적으로 합성된 합성 단백질 또는 유전자 재조합 기술을 이용한 재조합 단백질로 수득할 수 있다. 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당 분야에 널리 공지된 폴리펩티드 합성법을 이용하여 얻을 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, 제초제 저항성 PPO 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 목적 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 제초제 저항성 PPO 단백질을 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.
상기 제초제 저항성 PPO 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.
구체적인 실시예에서, 상기 PPO 들은 PPO가 결핍된 대장균 BT3(ΔPPO)을 이용한 제초제 저항성 검증 시스템을 통하여, 화학 구조에 따라 9개 계통에 속하는 대표적인 PPO 활성 저해 제초제들에 대하여 광범위한 제초제 저항성을 나타낸다는 것이 검증되었다. 또한, 아그로박테리움 형질전환에 의하여 담배 잎에서 발현 가능하다는 것이 확인되었고, 트랜지트 펩타이드(transit peptide, TP)를 사용하면 식물의 엽록체에서 발현될 수 있다는 것이 확인되었다. 또한, 상기 PPO 들은 식물 발현용 벡터에 의하여 애기장대 (Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)에서 발현이 가능하며, 이와 같이 형질전환된 식물체에 PPO 활성 저해 제초제를 처리하더라도 식물이 발아 및 생장하는 것이 확인되었다. 아울러, 후대 유전성 시험을 통하여 위와 같은 제초제 저항성 형질이 다음 세대로 전달되는 것이 확인되었다.
따라서, 본원에서 제공하는 PPO 들을 식물 또는 조류에 도입함으로써 식물 또는 조류의 제초제 저항성을 부여 및/또는 증진시키는 데 사용될 수 있다.
본원에서 제초제란, 식물 또는 조류를 사멸시키거나 방제하거나, 또는 식물또는 조류의 생장을 불리하게 조정하는 활성 성분을 말한다. 또한, 본원에서 제초제 내성 또는 제초제 저항성이란, 정상 또는 야생형 식물 또는 조류를 정상적으로 사멸시키거나 그의 생장을 정상적으로 억제시키는 제초제를 처리하더라도, 정상 또는 야생형의 식물 또는 조류에 비하여 식물 또는 조류 생장의 저해 정도가 약화되거나 제거되어, 식물 또는 조류의 생장이 지속적으로 이루어지는 것을 말한다. 상기 제초제는 식물 또는 조류의 프로토포르피리노겐 옥시다아제(PPO) 를 억제하는 제초제를 포함한다. 이러한 PPO 저해 제초제는 화학 구조에 따라 피리미딘디온계(Pyrimidinediones), 디페닐에테르계(diphenyl-ethers), 페닐피라졸계(Phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계(N-phenylphthalimides), 티아디아졸계(Thiadiazoles), 옥사디아졸계(oxadiazoles), 트리아졸리논계(triazolinones), 옥사졸리딘디온계(Oxazolidinediones) 및 기타의 제초제를 예시할 수 있다.
구체예로, 피리미딘디온계 제초제는 부타페나실(Butafenacil), 사플루페나실(Saflufenacil), 벤즈펜디존(Benzfendizone) 및 티아페나실(Tiafenacil)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
디페닐에테르계 제초제는 포메사펜(Fomesafen), 옥시플루오르펜(oxyfluorfen), 아클로니펜(aclonifen), 아시플루오르펜 (acifluorfen), 비페녹스(bifenox), 에톡시펜(Ethoxyfen), 락토펜(Lactofen), 클로메톡시펜(chlomethoxyfen), 클로인트로펜(chlorintrofen), 플루오로글리코펜-에틸(fluoroglycofen-ethyl) 및 할로사펜(halosafen) 을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
페닐피라졸계 제초제는 피라플루펜-에틸(Pyraflufen-ethyl) 및 플루아졸레이트(fluazolate)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
페닐프탈이미드계 제초제는 플루미옥사진 (flumioxazin), 시니돈-에틸(Cinidon-ethyl) 및 플루미클로락-펜틸(flumiclorac-pentyl)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
티아디아졸계 제초제는 플루티아셋(Fluthiacet) 및 티디아지민(thidiazimin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
옥사디아졸계 제초제는 옥사디아길(Oxadiargyl) 및 옥사디아존(oxadiazon)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
트리아졸리논계 제초제는 카펜트라존(carfentrazone), 설펜트라존(sulfentrazone) 및 아자페니딘(azafenidin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
옥사졸리딘디온계 제초제는 펜톡사존(Pentoxazone)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
기타의 제초제는 피라클로닐(Pyraclonil), 플루펜피르-에틸(flufenpyr-ethyl) 및 프로플루아졸(profluazol)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 제공하는 제초제 저항성 PPO 유전자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 식물체 또는 조류 내에 도입될 수 있으며, 바람직하게는 식물 또는 조류 형질전환용 발현벡터가 이용될 수 있다.
식물체 형질전환의 경우, 벡터에 포함되는 적합한 프로모터로는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제(nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트(ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터, 옥토파인 신타아제 프로모터 및 BCB(blue copper binding protein) 프로모터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 벡터는 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것(NOS 3' end), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 터미네이터(octopine synthase terminator), 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터, 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터 및 파세올린 (phaseoline) 터미네이터 을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 조류 혈질전환의 경우, 프로모터로서 엽록체 특이적 프로모터, 핵 프로모터, 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 본원에서 제공하는 제초제 저항성 PPO 유전자는 5'UTR 또는 3'UTR 에 작동적으로 연결되어 조류의 핵 안에서 기능을 발휘하도록 설계될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 조류 형질전환에 적합한 전사 조절 서열을 더욱 포함할 수 있다. 제조제 저항성을 부여하는 재조합 유전자는 숙주 조류에서 핵의 게놈 또는 엽록체의 게놈에 통합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 벡터는 제초제 저항성 PPO 유전자를 엽록체에 발현시키기 위하여, 엽록체로의 타겟팅에 필요한 트랜지트 펩타이드를 PPO 유전자의 5'-위치에 연결시킬 수 있다.
또한, 상기 벡터는 선택적으로, 리포터 분자로서 선택 표지를 코딩하는 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으며, 선택 표지의 예로서 항생제(예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신, 블레마이신, 클로람페니콜 등) 또는 제초제(글리포세이트, 글루포시네이트, 포스피노트리신 등) 내성 유전자 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 식물 발현용 재조합 벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터, 코인테그레이션 벡터(cointegration vector) 또는 T-DNA 부위를 포함하지는 않지만 식물에서 발현될 수 있도록 디자인된 일반 벡터가 사용될 수 있다. 이 중, 바이너리 벡터는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말하며, 그 내부에 식물체에서 발현시키기 위한 프로모터 부위와 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 벡터를 사용할 수 있다.
상기에서 바이너리 벡터 또는 코인테그레이션 벡터를 사용하는 경우, 식물체에 상기 재조합 벡터를 도입하기 위한 형질전환용 균주로는 아그로박테리움을 사용하는 것이 바람직하며(Agrobacterium - mediated transformation), 이때 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스 (Agrobacterium rhizogenes)를 사용할 수 있다. 그 밖에 T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는, 전기천공법(electroporation), 입자 총법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake) 등이 재조합 플라스미드를 식물체로 도입하는데 이용될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 유전자가 도입된 형질전환 식물들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 캘러스 유도, 발근 및 토양 순화와 같은 과정을 거쳐 식물체로 재분화시킬 수 있다.
본원에서 형질전환의 대상이 되는 식물은, 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물세포(현탁배양 세포 포함), 원형질체(protoplast), 캘러스(callus), 배축 (hypocotyl), 종자(seed), 자엽(cotyledon), 신초(shoot) 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.
또한, 본원의 형질전환체의 범주에는 상기 유전자가 도입된 형질전환체 뿐만 아니라 이의 클론 또는 자손(T1 세대, T2 세대 또는 그 이상)을 포함하며, 예를 들어, 본원의 유전자가 형질전환된 식물의 무성 또는 유성 자손으로서 제초제 저항성 형질이 유전된 식물들도 본 발명의 형질전환 식물의 범주에 포함된다. 또한, 본원의 유전자가 형질전환된 식물의 모든 교배 및 융합 생성물과 함께, 초기 형질전환된 식물의 특성을 나타내는 모든 돌연변이체 및 변이체가 본 발명의 범주에 포함된다. 아울러, 본 발명의 방법으로 미리 형질전환시킨 형질전환된 식물, 또는 이들의 자손으로부터 기원하며 형질전환된 세포의 적어도 일부로 이루어진 종자, 꽃, 줄기, 과실, 잎, 뿌리, 괴경, 괴근, 주와 같은 식물의 일부도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명이 적용될 수 있는 식물은 특별히 제한되지 않으며, 단자엽 또는 쌍자엽 식물을 포함한다. 또한 초본 또는 목본 식물을 포함한다. 상기 단자엽 식물은 택사과(Alismataceae), 자라풀과(Hydrocharitaceae), 지채과(Juncaginaceae), 장지채과(Scheuchzeriaceae), 가래과(Potamogetonaceae), 나자스말과(Najadaceae), 거머리말과(Zosteraceae), 백합과(Liliaceae), 지모과(Haemodoraceae), 용설란과(Agavaceae), 수선화과(Amaryllidaceae), 마과(Dioscoreaceae), 물옥잠과 (Pontederiaceae), 붓꽃과(Iridaceae), 버먼초과(Burmanniaceae), 골풀과 (Juncaceae), 닭의장풀과(Commelinaceae), 곡정초과(Eriocaulaceae), 화본과(벼과, Gramineae, Poaceae), 천남성과(Araceae), 개구리밥과(Lemnaceae), 흑삼릉과 (Sparganiaceae), 부들과(Typhaceae), 사초과(방동사니과, Cyperaceae), 파초과 (Musaceae), 생강과(Zingiberaceae), 홍초과(Cannaceae), 난초과(Orchidaceae)의 식물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도 과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과 (Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과 (Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), 연복초과(Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과 (Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과 (Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과 (Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과 (Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과 (Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과 (Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과 (Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도 과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae), 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))의 식물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체예로, 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 마초, 목초, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 잔디 및 피마자를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 소나무, 팜오일 및 유칼립투스를 포함하는 목본류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 구체 예로, 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명이 적용될 수 있는 조류는 특별히 제한되지 않으며, 원핵(prokaryotic) 조류 또는 진핵(eukaryotic) 조류일 수 있다. 예를 들어, 조류는 시아노박테리아, 녹조류, 홍조류, 갈조류, 대형조류(macroalgae) 또는 미세조류(microalgae)일 수 있다.
시아노박테리아류로는, Chroococcales 문(예, Aphanocapsa, Aphanotece, Chamaesiphon, Chondrocystis, Chroococcus, Chroogloeocystis, Crocosphaera, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanodictyon, Cyanosarcina, Cyanothece, Dactylococcopsis, Gloeocapsa, Gloeothece, Halothece, Johannesbaptistia, Merismopedia, Microcystis, Radiocystis, Rhabdoderma, Snowella, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Woronichinia), Gloeobacteria 문, Nostocales 문 (예, Microchaetaceae, Nostocaceae, Rivulariaceae, Scytonemataceae), Oscillatoriales 문 (예, Arthronema, Arthrospira, Blennothrix, Crinalium, Geitlerinema, Halomicronema, Halospirulina, Hydrocoleum, Jaaginema, Katagnymene, Komvophoron, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus,Oscillatoria, Phormidium, Planktothricoides, Planktothrix, Plectonema, Pseudanabaena, Pseudophormidium, Schizothrix, Spirulina, Starria, Symploca, Trichodesmium, Tychonema), Pleurocapsales 문 (예, Chroococcidiopsis, Dermocarpa, Dermocarpella, Myxosarcina, Pleurocapsa, Solentia, Stanieria, Xenococcus), Prochlorales 문, 또는 Stigonematales 문 (예, Capsosira, Chlorogloeopsis, Fischerella, Hapalosiphon, Mastigocladopsis, Mastigocladus, Nostochopsis, Stigonema, Symphyonema, Symphonemopsis, Umezakia, Westiellopsis) 등을 예시할 수 있다.
조류의 다른 예로, Chlorophyta, Chlamydomonas, Volvacales, Dunaliella, Scenedesmus, Chlorella, 또는 Hematococcm 를 예시할 수 있다.
조류의 다른 예로, Phaeodactylum tricornutum, Amphiprora hyaline, Amphora spp., Chaetoceros muelleri, Navicula saprophila, Nitzschia communis, Scenedesmus dimorphus, Scenedesmus obliquus, Tetraselmis suecica, Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris, Haematococcus pluvialis, Neochloris oleoabundans, Synechococcus elongatus, Botryococcus braunii, Gloeobacter violaceus, Synechocystis, Thermosynechococcus elongatus, Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis salina, Nannochloropsis gaditana, Isochrysis galbana, Botryococcus sudeticus, Euglena gracilis, Neochloris oleoabundans, Nitzschia palea, Pleurochrysis carterae, Tetraselmis chuii, Pavlova spp., Aphanocapsa spp., Synechosystis spp. Nannochloris spp. 등을 예시할 수 있다. 그러나, 상기 열거한 종류들에 제한 되는 것은 아니며, 그 외 다양한 속 및 종에 속하는 조류들이 본원에 포함될 수 있다.
본원에서 제공하는 제초제 저항성 PPO 가 도입된 식물 또는 조류는 2 종 이상의 PPO 저해 제초제에 대하여 저항성을 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명은 2 종 이상의 PPO 저해 제초제를 순차적으로, 또는 동시에 사용함으로써 잡초를 방제하거나 원하지 않는 수생 생물을 제거하는 데 사용될 수 있다.
일 예로, 본 발명은 상술한 제초제 저항성 PPO 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 2종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
다른 예로, 본 발명은 상술한 제초제 저항성 PPO 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 2종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 단계를 포함하는, 배양 배지에서 원하지 않는 수생 생물들을 제거하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에서 제공하는 제초제 저항성 PPO 단백질 또는 유전자는, 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자와 조합하여 사용될 수 있다.
이에 따라, 본원에서 제공하는 제초제 저항성 PPO 가 도입된 식물 또는 조류는 작용기전이 상이한 2 종 이상의 제초제에 대하여 저항성을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명은 작용기전이 PPO 저해 제초제를 포함한 상이한 2 종 이상의 제초제를 순차적으로, 또는 동시에 사용함으로써 잡초를 방제하거나 및/또는 원치 않는 수생 생물을 제거하는 데 사용될 수 있다. 이하, PPO 저해 제초제와 작용기전이 상이한 제초제를 "제2의 제초제"라고 지칭한다.
일 예로, 본 발명은 상술한 제초제 저항성 PPO 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 저항성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술한 제초제 저항성 PPO 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 제초제에 대한 저항성을 가지는 형질전환체, 이의 클론 또는 자손을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술한 제초제 저항성 PPO 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 조류, 식물세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 저항성을 가지는 식물 또는 조류를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술한 제초제 저항성 PPO 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술한 제초제 저항성 PPO 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 조류의 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 단계를 포함하는, 배양 배지에서 원하지 않는 수생 생물을 제거하는 방법을 제공한다.
구체 예로, 상기 식물 또는 조류는 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 더욱 포함하며 상기 제2의 제초제에 대한 저항성이 부여 및/또는 증진된 것일 수 있다.
구체 예로, 상기 제2의 제초제는 세포분열 저해성 제초제, 광합성 저해성 제초제, 아미노산합성 저해성 제초제, 색소체 저해성 제초제, 세포막 저해성 제초제및/또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체 예로, 상기 제2의 제초제는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트(glufosinate), 디캄바(dicamba), 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), ALS(acetolactate synthase) 저해성 제초제(예를 들어, 이미다졸리디논, 설포닐우레아, 트리아졸피리미딘, 설포아닐라이드, 피리미딘 티오벤조에이트 등), 제2광계(photosystem II) 저해성 제초제, 페닐우레아(phenylure)계 제초제, 색소체 저해성 제초제, 브로모시닐(bromoxynil)계 제초제 및/또는 이들의 조합을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체 예로, 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드는 글리포세이트 제초제 저항성 EPSPS(glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), GOX(glyphosate oxidase), GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈(glyphosate decarboxylase); 글루포시네이트 제초제 저항성 PAT(phosphinothricin-N-acetyltransferase); 디캄바 제초제 저항성 DMO(monooxygenase); 2,4-D 제초제 저항성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD(aryloxyalkanoate Dioxygenase); ALS 저해성 설포닐우레아(sulfonylurea)계 제초제 저항성 ALS(Acetolactate Synthase), AHAS(acetohydroxyacid synthase), 또는 Athahasl(Acetohydroxyacid synthase Large Subunit); 제2광계 저해성 제초제 저항성 광계 II(photosystem II) 단백질 D1; 페닐우레아계 제초제 저항성 시토크롬 P450(Cytochrome P450); 색소체 저해성 제초제 저항성 HPPD(Hydorxylphenylpyruvate dioxygenase); 브로모시닐 제초제 저항성 니트릴레이즈( Nitrilase); 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 글리포세이트 제초제 저항성 cp4 epsps,epsps(AG), mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자; 글루포시네이트 제초제 저항성 bar, pat 또는 pat(SYN) 유전자; 디캄바 제초제 저항성 dmo 유전자; 2,4-D 제초제 저항성 AAD-1, AAD-12 유전자; ALS 저해성 설포닐우레아계 제초제 저항성 ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, SurA 또는 SurB; 제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 저항성 psbA 유전자; 페닐우레아 제초제 저항성 CYP76B1 유전자; 이속사플루톨 제초제 저항성 HPPDPF W336 유전자; 브로모시닐 제초제 저항성 bxn 유전자; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 제초제 저항성 PPO 를 식물 또는 조류에 적용함으로써 제초제 저항성 형질과 제초제를 이용한 선별적 방제를 통해 경제적으로 잡초를 방제하거나 원하지 않는 수생 생물을 제거할 수 있다.
도 1은 Tiafenacil 을 첨가하지 않거나 2 μM 또는 10μM 첨가한 CRBIP 배지(파스퇴르 연구소, 프랑스)에서 할로테세 속 PCC 7418 균주를 배양시키고 8일 후 균주의 생장을 관찰한 사진이다.
도 2는 본 발명의 대장균 BT3(ΔPPO)에 사용한 pACBB 벡터의 구조를 나타낸다. 각 PPO 유전자를 벡터에 클로닝 할 때 eGFP는 제거하여 사용하였다.
도 3은 Wild type AtPPO1 (WT로 나타냄) 및 Mutant AtPPO1 (MT로 나타냄) 유전자가 각각 형질전환된 BT3(ΔPPO) 균주를 0~25 μM Tiafenacil를 포함하는 Agar 배지에 spot한 후 명조건(Light) 및 암조건(Dark)에서 생장 저해 정도를 확인한 사진이다.
도 4는 Wild type AtPPO1(WT로 나타냄), Mutant AtPPO1(MT로 나타냄), CyPPO2(2로 나타냄), CyPPO4(4로 나타냄) 및 CyPPO8(8로 나타냄) 유전자가 각각 형질전환된 BT3(ΔPPO) 균주를 0~25 μM 농도의 Pyrimidinedione계 PPO 제초제인 Tiafenacil, Saflufenacil 및 Butafenacil, 및 N-phenylphthalimides계 PPO 제초제인 Flumioxazin 을 각각 포함하는 Agar 배지에서 생장 저해 정도를 확인한 사진이다. V 는 PPO가 삽입되지 않은 pACBB 벡터를 BT3(ΔPPO)에 형질전환한 균주이다.
도 5는 Wild type AtPPO1(WT로 나타냄), Mutant AtPPO1(MT로 나타냄), CyPPO2(2로 나타냄), CyPPO4(4로 나타냄) 및 CyPPO8(8로 나타냄) 유전자가 각각 형질전환된 BT3(ΔPPO) 균주를 0~400 μM 농도의 Diphenyl ether계 PPO 제초제인 Fomesafen, Acifluorfen 및 Oxyfluorfen을 각각 포함하는 Agar 배지에서 생장 저해 정도를 확인한 사진이다. V 는 PPO가 삽입되지 않은 pACBB 벡터를 BT3(ΔPPO)에 형질전환한 균주이다.
도 6은 Wild type AtPPO1(WT로 나타냄), Mutant AtPPO1(MT로 나타냄), CyPPO2(2로 나타냄), CyPPO4(4로 나타냄) 및 CyPPO8(8로 나타냄) 유전자가 각각 형질전환된 BT3(ΔPPO) 균주를 0~400 μM 농도의 Triazolinones계 PPO 제초제인 Sulfentrazone, Oxizolidinediones계 PPO 제초제인 Pentoxazone, Phenylpyrazoles계 PPO 제초제인 Pyraflufen-ethyl, Oxadiazoles계 PPO 제초제인 Oxadiazon, Thiadiazoles 계 PPO 제초제인 Fluthiacet-methyl, 및 기타 PPO 제초제인 Pyraclonil을 각각 포함하는 Agar 배지에서 생장 저해 정도를 확인한 사진이다. V 는 PPO가 삽입되지 않은 pACBB 벡터를 BT3(ΔPPO)에 형질전환한 균주이다.
도 7은 Wild type AtPPO1(WT로 나타냄), Mutant AtPPO1(MT로 나타냄) 및 CyPPO12 유전자가 각각 형질전환된 BT3(ΔPPO) 균주를 0~400 μM 농도의 Tiafenacil, Saflufenacil, Flumioxazin, Fomesafen 및 Oxyfluorfen을 각각 포함하는 Agar 배지에서 생장 저해 정도를 확인한 사진이다.
도 8은 Wild type AtPPO1(WT로 나타냄), Mutant AtPPO1(MT로 나타냄) 및 CyPPO12 유전자가 각각 형질전환된 BT3(ΔPPO) 균주를 0~400 μM 농도의 Pyraflufen-ethyl, Oxadiazon, Sulfentrazone, Pentoxazone 및 Pyraclonil 을 각각 포함하는 Agar 배지에서 생장 저해 정도를 확인한 사진이다.
도 9는 Wild type AtPPO1(WT로 나타냄), Mutant AtPPO1(MT로 나타냄), CyPPO2 및 CyPPO4 유전자가 각각 형질전환된 BT3(ΔPPO) 균주를 0~100 μM 농도의 Tiafenacil을 함유한 액체 LB 배지에서 배양 시간에 따른 생장 저해 정도를 확인한 그래프이다.
도 10은 Wild type AtPPO1(WT로 나타냄), Mutant AtPPO1(MT로 나타냄), CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 유전자가 각각 형질전환된 BT3(ΔPPO) 균주를 0~100 μM 농도의 Saflufenacil을 함유한 액체 LB배지에서 배양시간에 따른 생장 저해 정도를 확인한 그래프이다.
도 11은 Wild type AtPPO1(WT로 나타냄), Mutant AtPPO1(MT로 나타냄), CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 유전자가 각각 형질전환된 BT3(ΔPPO) 균주를 0~100 μM 농도의 Fomesafen 을 함유하는 액체 LB 배지에서 배양시간에 따른 생장 저해 정도를 확인한 그래프이다.
도 12는 담배 잎의 엽록체에 PPO 유전자의 발현을 확인하기 위하여 사용한 식물 발현 벡터 구조의 모식도를 나타낸다.
도 13은 도 12의 벡터에 YFP, Wild type AtPPO1(WT로 나타냄), CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 유전자를 각각 subcloning 하여 식물에 도입한 후 식물 엽록체에 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 14는 애기장대에 PPO 유전자를 형질전환하기 위하여 사용한 식물 형질전환용 벡터 구조의 모식도를 나타낸다.
도 15는 Mutant AtPPO1(MT로 나타냄), CyPPO2 및 CyPPO8 유전자가 각각 형질전환된 애기장대의 T2 종자를 1/2 MS 배지와 70nM tiafenacil이 함유된 1/2 MS 배지에 각각 파종하여 발아 여부를 확인한 결과를 나타낸다. 대조구로 사용한 Mutant AtPPO1(MT로 나타냄)는 아미노산 치환에 의해 PPO 계 제초제에 저항성이 확인된 유전자를 형질전환한 종자(T2)을 사용하였다.
도 16은 후대에서 CyPPO2 단백질의 발현이 유지되는지를 판단하고자 CyPPO2 유전자가 형질전환된 애기장대의 T2 세대에서 라인별로 웨스턴 블랏을 수행한 결과를 나타낸다. CyPPO2(R)은 제초제 저항성을 나타내는 형질전환체 라인을 나타내고, CyPPO2(S)는 제초제 감수성을 나타내는 형질전환체 라인을 나타낸다. 도 16 하단은 이원벡터에 삽입된 BAR 유전자의 삽입을 PCR로 확인한 것을 나타낸다.
도 17은 후대에서 CyPPO8 단백질의 발현이 유지되는지를 판단하고자 CyPPO8 유전자가 형질전환된 애기장대의 T2 세대에서 형질전환체를 라인별로 웨스턴 블랏을 수행한 결과를 나타낸다. CyPPO8(R)은 제초제 저항성을 나타내는 형질전환체 라인을 나타내고, CyPPO8(S)는 제초제 감수성을 나타내는 형질전환체 라인을 나타낸다. 도 17 하단은 이원벡터에 삽입된 BAR 유전자의 삽입을 PCR로 확인한 것을 나타낸다.
도 18은 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 유전자와 대조구인 Mutant AtPPO1(MT로 나타냄) 유전자가 각각 형질전환된 애기장대의 T2 세대에서 형질전환체에 1 μM Tiafenacil를 살포한 후 7일째에 생장을 확인한 결과를 나타낸다. WT 는 야생형 애기장대에서의 결과를 나타낸다.
도 19는 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 유전자와 대조구인 Mutant AtPPO1 (MT로 나타냄) 유전자가 각각 형질전환된 애기장대의 T2 세대에서 형질전환체에 Tiafenacil 0.5 μM, Saflufenacil 1 μM, Fomesafen 3 μM 을 처리한 후 7일째에 생장을 확인한 결과를 나타낸다. WT 는 야생형 애기장대에서의 결과를 나타낸다.
도 20은 CyPPO2 및 BAR 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체, 및 CyPPO8 및 BAR 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체의 종자를 각각 glufosinate 첨가 배지, Tiafenacil 첨가 배지, 또는 glufosinate 및 Tiafenacil 첨가 배지에서 배양시킨 결과를 나타낸다.
도 21은 CyPPO2 또는 CyPPO8 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체의 종자를 각각 Tiafenacil 첨가 배지, Saflufenacil 첨가 배지, 또는 Tiafenacil 및Saflufenacil 첨가 배지에서 배양시킨 결과를 나타낸다.
도 22는 CyPPO2, CyPPO4, CyPPO8 단백질의 아미노산 상동성과 제초제 저항성 관계를 실험한 결과이다. CyPPO2 아미노산 서열 변이(2M 으로 나타냄), CyPPO4 아미노산 서열 변이(4M 으로 나타냄) 및 CyPPO8 아미노산 서열 변이 (8M으로 나타냄) 유전자가 각각 형질전환된 BT3(ΔPPO) 균주를 포함하는 Agar 배지에 Tiafenacil, Saflufenacil 및 Butafenacil 을 각각 농도별로 처리한 후 생장 저해 정도를 확인한 사진이다. 생장저해 판별의 대조구로는 Wild type AtPPO1(WT로 나타냄), Mutant AtPPO1(MT로 나타냄)를 사용하였다.
도 23은 CyPPO2 아미노산 서열 변이(2M 으로 나타냄), CyPPO4 아미노산 서열 변이(4M 으로 나타냄) 및 CyPPO8 아미노산 서열 변이 (8M으로 나타냄) 유전자가 각각 형질전환된 BT3(ΔPPO) 균주를 포함하는 Agar 배지에 Acifluorfen, Oxyfluorfen 및 Fomesafen을 각각 농도별로 처리한 후 생장 저해 정도를 확인한 사진이다. 생장저해 판별의 대조구로는 Wild type AtPPO1(WT로 나타냄), Mutant AtPPO1(MT로 나타냄)를 사용하였다.
도 24는 CyPPO2 아미노산 서열 변이(2M 으로 나타냄), CyPPO4 아미노산 서열 변이(4M 으로 나타냄) 및 CyPPO8 아미노산 서열 변이 (8M으로 나타냄) 유전자가 각각 형질전환된 BT3(ΔPPO) 균주를 포함하는 Agar 배지에 Sulfentrazone, Oxadiazon, Pentoxazone 및 Pyraclonil 을 각각 농도별로 처리한 후 생장 저해 정도를 확인한 사진이다. 생장저해 판별의 대조구로는 Wild type AtPPO1(WT로 나타냄), Mutant AtPPO1(MT로 나타냄)를 사용하였다.
도 25는 CyPPO2 아미노산 서열 변이(2M 으로 나타냄), CyPPO4 아미노산 서열 변이(4M 으로 나타냄) 및 CyPPO8 아미노산 서열 변이(8M으로 나타냄) 유전자가 각각 형질전환된 BT3(ΔPPO) 균주를 포함하는 Agar 배지에 Fluthiacet-methyl, Pyraflufen-ethyl 및 Flumioxazin 을 각각 농도별로 처리한 후 생장 저해 정도를 확인한 사진이다. 생장저해 판별의 대조구로는 Wild type AtPPO1(WT로 나타냄), Mutant AtPPO1(MT로 나타냄)를 사용하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 원핵생물로부터 PPO 유전자의 분리
오실라토리아 니그로-비리디스(Oscillatoria nigro-viridis) PCC 7112, 링비아 속(Lyngbya sp.) PCC 8106 균주, 할로테세 속(Halothece sp.) PCC 7418 균주 를 파스퇴르 연구소(프랑스)에서 분양받았으며, 표 1의 프라이머를 사용하여 PCR 을 통해 PPO 유전자를 분리하였다. 각 균주에서 게놈 DNA를 분리하여 표 1의 프라이머를 이용하여 PPO 유전자를 분리 및 증폭시켰다. 마이크로콜레우스 바기나투스의 PPO 유전자의 서열은 Genbank database 정보를 활용하여 애기장대의 코돈으로 최적화(codon usage optimization)하여 합성하고(GenScript) 표 1의 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. PCR 반응액은 Template (각 균주의 게놈 DNA) 1μl, 10X buffer 5μl, dNTP mixture (각 10mM) 2μl, forward primer (10μM) 3μl, reverse primer (10μM) 3μl, DDW 35.5μl, 및 Pfu-X (Solgent, 2.5unit/μl) 또는 EF-taq(Solgent, 2.5 u/μl) 0.5μl을 포함하는 반응액 50μl 으로 구성하였고, 94℃에서 4분간 반응한 후, 30 cycles (94℃ 에서 30초, 56℃ 에서 30초 및 72℃에서 1.5분) 반복하고, 72℃에서 5분 및 4℃ 에서 5분 반응하여 증폭하였다. 오실라토리아 니그로-비리디스 PCC 7112에서 분리한 PPO를 CyPPO2 로 명명하고, 링비아 속(Lyngbya sp.) PCC 8106 균주에서 분리한 PPO를 CyPPO4 로 명명하고, 할로테세 속 PCC 7418에서 분리한 PPO를 CyPPO8 로 명명하였고, 마이크로콜레우스 바기나투스의 PPO 를 CyPPO12 로 명명하였다.
또한, CyPPO2, CyPPO4, CyPPO8 및 CyPPO12 의 각 아미노산 서열 및 염기 서열을 확인하여 서열번호 1 내지 8에 나타내었으며, 특히, CyPPO2 의 아미노산 서열은 CyPPO12 의 아미노산 서열과 94%의 서열 상동성을 나타냄을 확인하였다.
균주 프라이머 서열 서열번호
Oscillatoria nigro-viridis PCC 7112 PCC7112_BmHIF ccccggatccATGGAACTATTAGATACCTTGATTGTGGG 18
PCC7112_StuIR cccaggcctGATCGATCGAGTATCTGATTG 19
Halothece sp. PCC 7418 PCC7418_BmHIF ccccggatccATGATAGATACTTTAATTGTGGG 20
PCC7418_XhoIR ccccctcgagACCCAAATAATCTAACACGG 21
Lyngbya sp. PCC 8106 PCC8106_BglIIF ccccagatctATGACTCACGTACTCGATAG 22
PCC8106_XhoIR ccccctcgagTTGACCCAAAAAACTGAGAATTTC 23
Microcoleus vaginatus CyPPO12_BamHIF CCCCGGATCCATGGAACTCTTGGATACTCT 24
CyPPO12_XhoIR CCCCCTCGAGGATTGACCTGGTATCAGATT 25
실시예 2. 할로테세 속 PCC 7418 균주의 제초제 저항성 확인
할로테세 속 PCC 7418 균주를 CRBIP Medium 1538 (파스퇴르 연구소, 프랑스)에서 배양하였다. CRBIP Medium 1538은 ASNIII 및 Turks Island Salts 4X 가 1:1(v/v)로 혼합된 배지이며, ASNIII medium 은 NaCl 25.0g, MgSO4·H2O 3.5g, MgCl2·H2O 2.0g, KCl 0.5g, CaCl2·H2O 0.5 g, NaNO3 0.75g, K2HPO4·H2O 0.02 g, NaCO3 0.04 g, Ammonium iron(III) citrate/Citric acid monohydrate solution 2.5ml[Ammonium iron(III) citrate 300 mg, Citric acid monohydrate 300 mg 및 증류수 250 ml 혼합], Magnesium titriplex dihydrate solution 2.5ml [Mg EDTA 0.1 g 및 증류수 500 ml 혼합], Trace metal A5 + Co 1ml [H3BO3 2.86 g, MnCl2·4H2O 1.81 g, ZnSO4·7H2O 0.222 g, NaMoO4·2H2O 0.39 g, CuSO4·5H2O 0.079 g, Co(NO3)2·6H2O 0.049 g 및 증류수 1000 ml 혼합], 및 증류수 1000 ml까지로 구성되어 있다. Turks Island Salts 4X 는 NaCl 112 g, KCl 2.68 g, MgCl2·6 H2O 22 g, MgSO4·7 H2O 27.7 g, CaCl2·2 H2O 5.8 g, 및 증류수 1000 ml 까지로 구성되어 있다. ASNIII medium 과 Tursk Island Salts 4X를 각각 120℃ 에서 20분간 멸균(autoclave)한 후 1:1(v/v) 혼합하여 사용하였다.
각 유리관(test tube)에 위 배양배지 5ml 를 넣고 여기에 Tiafenacil 을 첨가하지 않거나 각각 2 또는 10μM 첨가하였다. 종배양(seed culture)한 할로테세 속 PCC 7418 균주를 동일 부피로 각 유리관에 넣은 후 8일 동안 균주의 생장을 확인하였다. 그 결과, Tiafenacil 10μM 까지 처리에도 배양 8일 후 할로테세 속 PCC 7418 균주의 생장이 유지되었으므로, 위 균주가 제초제에 저항성이 있음을 확인할 수 있었다 (도 1).
실시예 3. PPO 결핍 대장균을 이용한 CyPPO2 , CyPPO4 , CyPPO8 및 CyPPO12의 제초제 저항성 검증 (Agar 배지)
실시예 1에서 분리한 CyPPO2, CyPPO4, CyPPO8 및 CyPPO12 의 제초제 저항성을 검증하기 위하여, PPO가 결핍된 BT3 대장균[이하, BT3(ΔPPO)]에 CyPPO2, CyPPO4, CyPPO8 및 CyPPO12 유전자를 각각 형질전환한 후 제초제를 처리한 환경에서 배양하여, 형질전환 대장균의 생장 저해 여부를 확인하였다. 음성 대조군으로는 애기장대 유래의 야생형 PPO (Wild type AtPPO1)를 사용하였는데 상기 Wild type AtPPO1 은 PPO계 제초제 감수성이 있으며 GeneBank accession no. AX084732 에 서열정보가 등록되어 있다 (유전자의 염기서열을 서열번호 10, 아미노산 서열을 서열번호 9에 나타냄). 양성 대조군으로는 상기 Wild type AtPPO1 의 아미노산 서열에서 Y426M (426번째 아미노산인 타이로신이 메티오닌으로 치환) 및 S305L (305번째 아미노산인 세린이 류신으로 치환)의 아미노산 치환이 발생한 Mutant AtPPO1 를 사용하였다 (아미노산 서열을 서열번호 11에 나타냄) (Li X, Volrath SL., N D B.G., Chilcott CE, Johnson MA, Ward ER, Law MD (2003) Development of protoporphyrinogen oxidase as an efficient selection marker for agrobacterium tumefaciens- mediated transformation of maize. Plant physiology 133:736-747).
BT3(ΔPPO) 균주는 Hokkaido University (일본)에서 제공받았으며, hemG type PPO가 결여된 대장균이며 카나마이신(Kanamycine)에 저항성을 가지는 균주이다(Watanabe et al., (2001) Dual targeting of spinach protoporphyrinogen oxidase II to mitochondria and chloroplasts by alternative use of two in-frame inhibition codons. JBC 20474~20481)
3-1. 실험재료 및 기기의 준비
Autoclave 는 Hirayama 사의 HV-50, 전자저울은 한성계기의 HS2100A, Clean bench는 Jeio Tech 사의 CB-30V, Incubator 는 JSR 사의 JSI-200CL, UV-visible spectrophotometer는 Thermo Fisher Scientific 사의 1210 type, 광도계는 Apogee 사의 MQ-200, PCR 장비는 Bio-Rad MyCycler 를 사용하였다. Autoclave는 121℃에서 15분, Incubator 는 37℃, 광조건 160~200 μmol m-2 s-1 및 배양 시간 14~20시간의 조건으로 사용하였다. LB배지(Bacto-Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium chloride 10g/L, Bacto agar 15g/L) 및 항생제 클로람페니콜(Duchefa)을 사용하였다. 실험에 사용된 제초제는 다음 표에 기재하였다.
Chemical family 제초제(원제)명 제조사/입수처
Pyrimidinedione Tiafenacil 동부팜한농㈜/ 동부팜한농㈜
Saflufenacil BASF/ Sigma
Butafenacil Syngenta/ Sigma
Diphenyl ether Fomesafen Syngenta/ Sigma
Acifluorfen United Phosphorus/ Supelco
Oxyfluorfen Dow/ Sigma
N-phenylphthalimides Flumioxazin Sumitomo/ Sigma
Triazolinones Sulfentrazone FMC/ Waka
Oxazolidinediones Pentoxazone Kaken/Sigma
Phenylpyrazoles Pyraflufen-ethyl Nihon Nohyaky /Sigma
Others Pyraclonil Kyoyu Agri/Sigma
Oxadiazoles Oxadiazon Bayer/Sigma
Thiadiazoles Fluthiacet-methyl FMC/Sigma
3-2. 실험방법
실시예 1 에서 분리 증폭한 CyPPO2, CyPPO4, CyPPO8 및 CyPPO12 유전자를 각각 pACBB(벡터의 구조는 도 2 참조) 에 클로닝하고자, 각각의 PPO 유전자 4 μl, pACBB 벡터 3.5μl, 10X buffer A 1μl, 10X buffer B 1μl, ligase 1μl(RBC, 3unit/μl)을 포함하는 용액 10μl로 제조하여 22℃에서 30분 반응하였다. 반응 용액을 DH5 alpha competent cell 100μl에 넣어 20분간 얼음에서 반응한 후 42℃에서 40초간 두었다. 그 후 얼음에서 2분간 둔 다음 LB broth 1ml 을 넣어 37℃에서 1시간 동안 진탕배양 하였다. 각 삽입 유전자 종류별로, 배양액에서 자란 균들을 수확하여 클로람페니콜이 포함된 LB agar 배지에서 배양하였다.
각 유전자로 형질전환된 대장균의 종배양을 위해, 각 단일 콜로니(single colony)를 클로람페니콜을 포함한 3ml LB broth에서 밤새 배양한 후 100μl를 새로운 3ml LB broth에 계대하여 흡광도(OD600)가 0.5~1 이 될 때까지 배양하고 흡광도(OD600)를 0.5에 맞추기 위해 LB broth 에서 희석하였다. 이 희석액을 LB broth 로 10배씩 5번 희석하였다. 다음으로, 클로람페니콜과 다양한 제초제 stock 이 농도별로 (0~ 400μM) 혼합된 LB Agar 배지(패트리디쉬)에 위에서 준비한 형질전환 대장균 배양 희석액을 10μl 씩 떨어뜨렸다. LB Agar 배지를 37℃ 조건에서 배양하였고, 배양 16~20시간 후 생장 저해 정도를 육안으로 확인하였다. 또한, Tiafenacil 이 혼합된 배지의 경우 명조건(광조건 169 μmol m-2 s-1)과 암조건에서 각각 균주의 생장 저해 정도를 확인하였다.
3-3. 실험결과
도 4 내지 도 6은 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8의 제초제 저항성을 확인한 결과를 나타내고, 도 7 및 도 8은 CyPPO12의 제초제 저항성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3에 나타난 바와 같이, Tiafenacil 이 혼합된 배지에서, Wild type AtPPO1 형질전환 균주의 경우 명조건 및 암조건에서 모두 생장이 저해되었으나, 명조건에서 배양시 암조건에서 배양한 경우보다 더 강한 생장 저해를 보였다. 예를 들어, 1μM Tiafenacil 농도에서 명조건 배양시 Wild type AtPPO1 형질전환 균주의 생장이 거의 완전하게 저해되었으나, 암조건 배양시에는 어느 정도 생장이 유지되어 있었다. 그러나, 5μM Tiafenacil 농도부터는 명조건과 암조건 모두에서 완전한 생장 저해를 나타내었다. 이와 같이, Wild type AtPPO1 형질전환 균주의 경우 Tiafenacil 의처리 농도에 의존적으로 생장 저해를 나타내어 제초제 감수성을 확인할 수 있었고, Mutant AtPPO1 형질전환 균주의 경우 Tiafenacil 25μM 까지도 생장 저해가 관찰되지 않아 제초제 저항성을 확인할 수 있었다.
따라서, 제초제 감수성 PPO의 기준을 Wild type AtPPO1에, 제초제 저항성 PPO의 기준을 Mutant AtPPO1에 설정하고, 대표적인 chemical family 별로 대표적인 PPO 제초제들에 대하여 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 의 제초제 저항성을 검증해보았다.
도 4는 대표적인 Pyrimidinedione계 PPO 제초제인 Tiafenacil, Saflufenacil 및 Butafenacil, 및 대표적인 N-phenylphthalimides계 PPO 제초제인 Flumioxazin 을 각각 농도별로 처리한 결과를 나타낸다. Tiafenacil 및 Saflufenacil 처리시 Mutant AtPPO1 형질전환 균주, CyPPO2 형질전환 균주, CyPPO4 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 Tiafenacil 또는 Saflufenacil 처리 농도 25μM 에도 생장 저해가 거의 관찰되지 않았다. Butafenacil 처리시 Mutant AtPPO1 형질전환 균주, CyPPO2 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 Butafenacil 처리 농도 25μM 에도 생장 저해가 거의 관찰되지 않았다. Flumioxazin 처리시, CyPPO2 형질전환 균주, CyPPO4 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주에서 Flumioxazin 처리 농도 25μM 에도 생장 저해가 거의 관찰되지 않았다. 위 네 가지 제초제 모두에서 Wild type AtPPO1 형질전환 균주는 0.5μM에서 저해가 시작되어 5μM부터 거의 생장하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
도 5는 대표적인 Diphenyl ether계 PPO 제초제인 Fomesafen, Acifluorfen 및 Oxyfluorfen 을 각각 농도별로 처리한 결과를 나타낸다. Fomesafen 처리시 Mutant AtPPO1 형질전환 균주는 25μM까지 생장 저해가 관찰되지 않았고, CyPPO2 형질전환 균주, CyPPO4 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 Fomesafen 처리 농도 400μM에도 생장 저해가 거의 관찰되지 않았다. Acifluorfen 처리시 CyPPO2 형질전환 균주, CyPPO4 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 Acifluorfen 처리 농도 400μM에도 생장 저해가 거의 관찰되지 않았다. Oxyfluorfen 처리시 CyPPO2 형질전환 균주, CyPPO4 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 Oxyfluorfen 처리 농도 400μM에도 생장 저해가 거의 관찰되지 않았다. 세 가지 제초제 모두에서 Wild type AtPPO1 형질전환 균주는 5μM 부터 거의 생장하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
도 6은 대표적인 Triazolinones계 PPO 제초제인 Sulfentrazone, 대표적인 Oxazolidinediones계 PPO 제초제인 Pentoxazone, 대표적인 Phenylpyrazoles계 PPO 제초제인 Pyraflufen-ethyl, 대표적인 Oxadiazoles계 PPO 제초제인 Oxadiazon, 대표적인 Thiadiazoles 계 PPO 제초제인 Fluthiacet-methyl, 및 기타 PPO 제초제인 Pyraclonil을 각각 농도별로 처리한 결과를 나타낸다. Sulfentrazone 처리시 CyPPO2 형질전환 균주, CyPPO4 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 Sulfentrazone 처리 농도 400μM에도 생장저해가 거의 관찰되지 않았다. Pentoxazone, Pyraflufen-ethyl, Oxadiazon, Fluthiacet-methyl 및 Pyraclonil 처리시 CyPPO2 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 Oxyfluorfen 처리 농도 400μM에도 생장 저해가 거의 관찰되지 않았다. 일곱 가지 제초제 모두에서 Wild type AtPPO1 형질전환 균주는 5μM 부터 거의 생장하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
도 7은 Tiafenacil, Saflufenacil, Flumioxazin, Fomesafen 및 Oxyfluorfen 처리 시 CyPPO12의 제초제 저항성을 확인한 결과이다. CyPPO12의 형질전환 균주는 Tiafenacil, Saflufenacil, Flumioxazin, Fomesafen 및 Oxyfluorfen 의 각 처리 농도 25μM 에도 생장저해가 거의 관찰되지 않았고, Fomesafen 또는 Oxyfluorfen 처리의 경우 처리농도 400μM에도 생장저해가 거의 관찰되지 않았다. Mutant AtPPO1 형질전환 균주는 Oxyfluorfen 처리시 5μM부터 생장저해가 관찰되었고, 그 외의 제초제에서는 25μM 에도 생장저해가 거의 관찰되지 않았다. 반면, Wild type AtPPO1 형질전환 균주는 Fomesafen을 제외한 네 가지 제초제 모두에서 처리농도 0.5μM에서 저해가 시작되어 5μM부터 거의 생장하지 않는 것을 관찰할 수 있었다. Fomesafen 처리시 Wild type AtPPO1 형질전환 균주는 5μM에서 생장 저해가 관찰되었다.
도 8은 Pyraflufen-ethyl, Oxadiazon, Sulfentrazone, Pentoxazone 및 Pyraclonil 처리시 CyPPO12의 제초제 저항성을 확인한 결과이다. Mutant AtPPO1 형질전환 균주와 CyPPO12의 형질전환 균주는 처리 농도 25μM에도 생장저해가 관찰되지 않았고, Sulfentrazone을 제외한 네 가지 제초제 처리시는 처리 농도 400μM에도 생장 저해가 관찰되지 않았다. 반면, Wild type AtPPO1 형질전환 균주의 경우 Pyraflufen-ethyl, Oxadiazon, Sulfentrazone, Pyraclonil 처리시 처리농도 0.5μM부터 생장저해가 관찰되었고, Pyraclonil 처리시에는 처리농도 5μM부터 생장저해가 관찰되어 25μM에서 거의 자라지 않는 것을 관찰할 수 있다.
실시예 4. PPO 결핍 대장균을 이용한 CyPPO2 , CyPPO4 및 CyPPO8의 제초제 저항성 검증 (LB broth 배지)
위 실시예 3에서 Wild type AtPPO1, Mutant AtPPO1, CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 유전자가 각각 형질전환된 BT3(ΔPPO) 균주에 대하여 다양한 제초제가 혼합된 Agar 배지 상에서 제초제 저항성을 검증하였는바, 이번에는 위 균주들에 대하여 다양한 제초제가 혼합된 LB 액체배지 상에서 제초제 저항성을 재확인해보았다.
4-1. 실험재료 및 기기의 준비
Autoclave 는 Hirayama 사의 HV-50, 전자저울은 한성계기의 HS2100A, Clean bench는 Jeio Tech 사의 CB-30V, Incubator 는 JSR 사의 JSI-200CL, 광도계는 Apogee 사의 MQ-200, UV-visible spectrophotometer는 Thermo Fisher Scientific 사의 1210 type 를 사용하였다. Autoclave는 121℃에서 15분, Incubator 는 37℃, 광조건 160~200μmol m-2 s-1 및 배양 시간 13.5시간의 조건으로, UV-visible spectrophotometer 는 600nm에서 사용하였다.
실험에 사용된 Tiafenacil (M.W. 511.87 g/mol)은 동부팜한농㈜에서, Saflufenacil(M.W. 500.85 g/mol)은 Sigma 에서, Fomesafen(M.W. 438.76 g/mol)은 Sigma 에서 입수하였다. 각 약제는 100% 아세톤에 200mM 농도로 조제한 후 -20℃ 에서 보관하였다. 그리고 Luria-Bertani(LB) 배지(Bacto-Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium chloride 10g/L) 및 항생제 클로람페니콜 (Duchefa)을 사용하였다.
4-2. 실험방법
각 유전자로 형질전환된 대장균의 종배양을 위해, 각 단일 콜로니(single colony)를 클로람페니콜을 포함한 3ml 액체 배지에서 12시간 배양한 후 흡광도(OD600)가 1.5가 될 때까지 LB 배지에서 희석하였다. 다음으로, 250ml LB 액체 배지에 클로람페니콜과 위에서 준비한 종배양된 형질전환 대장균 500μl를 첨가하고, 위 배양액을 50ml 씩 250ml 플라스크에 분주하였다. 각 플라스크에 다양한 제초제 (Tiafenacil, Saflufenacil, Fomesafen) stock 를 농도별로 (0, 10μM, 50μM, 100μM) 처리한 후, 처리한 배양액을 37℃ 및 200rpm 조건에서 배양하였고, 매 1.5 시간마다 spectrophotometer를 이용하여 흡광도(OD600)를 측정하였다. 실험 결과는 3회씩 반복하여 그 평균값을 그래프로 나타내었으며 3회 반복의 표준오차를 error bar로 표현하였다.
4-3. 실험결과
제초제 감수성 PPO의 기준을 제초제 Wild type AtPPO1에, 저항성 PPO의 기준을 Mutant AtPPO1에 설정하였다.
Tiafenacil을 처리한 결과를 도 9에 나타내었다.
Wild type AtPPO1 형질전환 균주의 경우 Tiafenacil 10μM 부터 거의 생장하지 않는 양상을 나타낸 반면, Mutant AtPPO1 형질전환 균주의 경우 Tiafenacil 10μM 에서는 생장에 영향을 받지 않았다가 50μM부터 생장 저해가 관찰되었다. 또한, CyPPO2 형질전환 균주 및 CyPPO4 형질전환 균주는 100μM까지 정상적인 생장을 보였다.
Saflufenacil을 처리한 결과를 도 10에 나타내었다.
형질전환 균주 별 저항성의 유무는 Tiafenacil을 처리한 결과와 유사하였으나, 저항성의 정도는 Tiafenacil에 비해 Saflufenacil 에서 높은 편으로 나타났다. Wild type AtPPO1 형질전환 균주의 경우 Saflufenacil 10μM 부터 거의 생장하지 않는 양상을 나타낸 반면, Mutant AtPPO1 형질전환 균주, CyPPO2 형질전환 균주, CyPPO4 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 100μM까지 정상적인 생장 을 보였다.
Fomesafen 을 처리한 결과를 도 11에 나타내었다.
Wild type AtPPO1 형질전환 균주의 경우 Fomesafen 50μM 부터 생장저해가 관찰되었으나, Mutant AtPPO1 형질전환 균주, CyPPO2 형질전환 균주, CyPPO4 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 100μM까지 정상적인 생장을 보였다.
실시예 5. CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8의 식물 내 발현
실시예 3 및 실시예 4를 통해 다양한 PPO 제초제에 대한 저항성이 검증된 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8을 식물에서 발현시키기 위한 실험을 수행하였고, 형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP)을 이용하여 위 PPO 단백질들의 발현을 확인하였다.
5-1. 실험방법
Agrobacterium competent cell 을 제조하기 위하여, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101 균주(한국생명공학연구원) 를 5ml LB media 에 30℃ 및 200rpm 조건에서 12시간 배양하였다. 이 배양액을 200ml LB media 에 부은 뒤, 30℃ 및 200rpm 조건에서 3~4시간 배양하고, 3000g, 4 에서 20분간 원심분리하였다. 멸균 증류수로 pellet을 씻어 준 뒤 20ml LB media 로 재현탁(resuspension)하였다. 200μL씩 aliquot 하여 액체 질소에 snap freezing 한 뒤, 초저온 냉동고에 보관하였다.
Wild type AtPPO1, CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 유전자가 각각 클로닝된 벡터를 제조하기 위하여, CaMV 35S 프로모터, YFP 및 NOS terminator를 포함하는 벡터에 XbaI 및 XhoI 제한효소를 처리하고, PCR로 증폭한 transit peptide 유전자(서열번호 26) 에 XbaI 및 XhoI 제한효소를 처리하여 절단한 뒤, 위 벡터와 transit peptide 유전자를 연결하여 벡터 내에 엽록체 이동에 관여하는 트랜지트 펩타이드를 삽입하였다. 또한, XhoI 및 BamHI 제한효소를 이용해 각 PPO 유전자(Wild type AtPPO1, CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 유전자)와 vector 를 절단한 뒤 ligation 하여 벡터 내 PPO 유전자를 삽입하였다. 그 결과, PPO 유전자의 5'에 트랜지트 펩타이드가 결합되고, 3'에 YFP 유전자가 결합되었으며, 최종 벡터 구조 모식도는 도 12에 나타내었다.
다음으로, Agrobacterium 을 이용한 형질전환을 위하여, 위에서 제조한 Agrobacterium competent cell 을 얼음 위에서 녹이고, 각 PPO 유전자가 삽입된 벡터를 3~5 μL를 cell 과 섞어준 뒤, 액체질소에 2~3분간 snap freezing 한 후, 37에서 5분간 녹였다. 1ml LB media 넣어준 뒤 30 에 2시간 배양하고, LB/spectinomycin 배지에 도말하여 30 에 2일간 배양하였다.
Agrobacterium 을 담배 잎에 접종하기 위하여, 각 PPO 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 Agrobacteirum 단일 콜로니를 LB/spectinomycin media 에 30, 200rpm 으로 12시간 배양하고, 7000 rpm 에서 2분간 원심분리한 뒤 pellet 을 10mM MgCl2 에 재현탁하였다. 흡광도(OD600)를 0.5 로 맞춘 뒤, 200μM acetosyringone 을 첨가하고 상온에서 2시간 동안 보관하였다. Agrobacterium은 1ml syringe 를 이용하여 정상적인 생육 상태의 담배 잎에 infiltration 한 뒤 2-5일간 재배하였다.
다음으로, 담배 잎의 protoplast를 분리하기 위하여, 표 3 또는 표 5의 조성으로 효소 용액을 제조하였다.
조성 함량
CPW stock A (100x) 5 ml
CPW stock B (10x) 50 ml
mannitol 45 g
MES 533 mg
Viscozyme (Novozymes; KWN00019;
700 EGU/g Cellulase)		 5 ml
Celluclast (Novozymes; CCN03123;
100FBG/g Beta-glucanase)		 2.5 ml
pectinEX (Novozymes; KJN01013) 2.5 ml
DDW up to 500ml
위 용액을 pH 5.8 로 맞춘 뒤, 0.22μm pore size 로 멸균 여과하였다.
CPW stock A (100x) CaCl2.2H2O 1460 mg/L
CPW stock B (10x) KH2PO4 27.2 mg/L
KNO3 101 mg/L
MgSO4 .7H2O 246 mg/L
KI 0.16 mg/L
CuSO4.5H2O 0.025 mg/L
pH 5.8
조성 함량
mannitol 1g
200mM MES (pH 5.7) 150μL
viscozyme 100μL
celluclast 50μL
pectinEX 50μL
1M CaCl2 70μL
DDW up to 10ml
담배 잎을 면도날을 이용하여 잘게 일렬로 자르고, 자른 잎을 위에서 제조한 효소 용액에 띄운 뒤 알루미늄 호일로 싸고 상온에서 40-50rpm 으로 3-5 시간 동안 교반하였다. 현미경(Carl Zeiss Observer Z1) 및 생체물질 결합분석 시스템(Zeiss LSM710)을 이용하여, DIC, YFP 및 rhodamine 관찰 필터 3종을 이용하여 원형질체 세포를 관찰하였고, imaging tool 로 캡처한 뒤, ZEN lite 2012 (Carl Zeiss)프로그램을 이용하여 데이터화하였다.
CyPPO2, CyPPO4 또는 CyPPO8 단백질과 함께 발현된 형광 단백질(YFP)을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 이를 위하여, 샘플을 액체 질소에 얼려 보관하였다가 Micropestle 이용하여 마쇄하였다. IP buffer[50mM Tris-Cl(pH7.5), 75mM NaCl, 5mM EDTA, 1% Triton X-100, 1mM DTT, 1x protease inhibitor] (40μL for large well) 넣고 볼텍싱하고 얼음에서 10분 이상 상치하였다. 4℃에서 10분간 원심분리한 뒤 상층액을 새로운 1.5ml 튜브로 옮겼다. Protein loading dye 넣은 뒤 100℃ 에서 5분간 끓이고 얼음에 상치한 후 원심분리하고 상등액을 사용하였다. 전기영동은 7.5% SDS-PAGE gel 단백질 추출액을 로딩하고, Stacking gel은 100V 로, separating gel 150 V 로 단백질을 분리하였다. 전기영동한 단백질은 PVDF (polyvinylidene fluoride) 막으로 전이하고, Blocking buffer (4% skim milk powder, 10mM sodium phosphate, 0.15M NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.5)에 1시간 blocking 한 후, anti-GFP antibody (HRP-conjugated) (SantaCruz사)을 1/2000 넣고 2시간 동안 상온에서 반응 시겼다. 항체반응 후 막을 PBS-T(phosphate buffered saline-Tween) buffer 로 10분간 3회 세척하고, ECL(electrochemiluminescence) solution 500μL (버퍼 조성 또는 입수처: Bio-Rad 사) 을 뿌린 뒤 1분간 정치한 후 OHP film 등으로 덮은 뒤 X-ray film 에 노출하고 필름을 인화하였다.
5-2. 실험결과
Wild type AtPPO1, CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 유전자를 각각 식물에 도입한 후 각 유전자들의 발현을 확인한 결과를 도 13에 나타내었다. 각 PPO 유전자가 형질전환된 식물체 내에서 아그로박테리움 콜로니가 형성됨을 확인할 수 있었다. 음성 대조군으로 사용한 YFP 단백질의 경우 엽록체로 타겟팅되지 않고 세포질 및 핵 내에 발현하는 것이 확인되었고, PPO 단백질의 경우, 엽록소의 자가형광(autofluorescence) 이미지와 merge 한 결과 형광 시그널이 서로 겹쳐지는 것을 보아, 엽록체 타겟팅을 목적으로 N-말단에 붙인 cTP(chloroplast transit peptide) 의 영향으로 엽록체로 타겟팅됨을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 식물 형질전환 벡터 및 형질전환체 제작
식물 형질전환 선발은 BAR 유전자(glufosinate 저항성 유전자)의 ORF와 각각의 CyPPO2, CyPPO4 또는 CyPPO8 유전자 ORF를 지닌 이원벡터(binary vector)을 제작하여 사용하였다. PPO 계 제초제와 작용 기전이 다른 제초제를 교차 사용하는 경우 그 효과를 확인하기 위하여 BAR 유전자를 사용하였으며, 상기 유전자는 후대 유전이 안정적으로 진행되고 있는지 여부를 검증하는데에도 사용하였다. BAR 유전자의 발현을 위해 NOS 프로모터를 사용하였으며, 전사 종결을 위해 E9 터미네이터를 사용하였다. 한편, CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 의 식물체 발현 유도를 위해 CaMV35S 프로모터를 사용하였으며, 엽록체로의 단백질 이동을 유도하기 위해 AtPPO1 유전자의 transit peptide(TP) 부위를 XbaI, XhoI 제한효소를 이용하여 삽입하였다. 또한, 발현된 단백질의 확인을 위해 헤마글루티닌(hemaglutinin, HA) tag를 3' 말단 부위에 BamHI, SacI 제한효소를 이용하여 삽입하였다. 벡터 내 삽입된 transit peptide 부위를 서열번호 27로, 삽입된 HA tag 서열을 서열번호 28 로 나타내었다. CyPPO2, CyPPO8 유전자는 transit peptide 와 HA tag 의 사이에 XhoI, BamHI 제한효소를 이용하여 삽입되었고, HA tag 뒤에 NOS terminator 가 삽입되어 PPO 유전자의 전사 종결을 유도하였다. 본원에서 사용한 식물 형질전환 이원벡터의 구조 모식도를 도 14에 나타내었다.
한편 식물 형질전환체는 다음과 같이 제작하였다. 우선, 형질전환된 Agrobacterium 을 항생제 배지에서 선별한 뒤 콜로니를 액체 배양하였다. Agrobacterium 을 cell harvest 한 뒤 5% sucrose, 0.05% Silwet L-77 용액에 현탁하였다. 흡광도(OD600)를 0.8 로 맞춘 뒤 약 5-6주 자란 애기장대의 화기를 Agrobacterium 용액에 담가 주었다. 습도 유지를 위하여 비닐 백으로 화분을 덮어 준 뒤 암상태에서 하루 동안 두었다. Agrobacterium 으로 접종한 애기장대는 1-2달 정도 더 키운 후 종자를 후숙시킨 다음 수확하였다. 형질전환한 식물체에서 수확한 종자는 형질전환된 것과 되지 않은 것이 혼재되어 있으므로 수확된 종자에서 형질전환된 개체를 선발하는 작업이 요구 된다.
이에, 벡터 제작 시 형질전환된 개체 선발을 위해 삽입한 BAR 유전자(glufosinate을 이용하여 형질전환체를 선발)를 이용하여 형질전환된 개체를 선별하였으며, 이를 흙으로 이식하여 키움으로써 T1 식물체를 수득하였다.
이식한 T1 식물체들의 PPO 계 제초제에 대한 저항성을 판단하기 위해 약 3-4 주 키운 뒤 꽃대가 올라오기 전 제초제를 처리하였다. 애기장대 Col-0 ecotype 의 경우 식물체당 1μM tiafenacil (+0.05% Silwet L-77)을 2-3ml 처리에서 사멸되는 것을 확인하였다. 따라서, 식물체의 개체수에 적합하게 1μM tiafenacil 을 골고루 처리하고 7일 경과 뒤 형질전환체들의 PPO 계 제초제 저항성 여부를 판별하였다. 저항성을 나타내어 살아남는 식물체는 지속적으로 키워 종자를 수확하였고(T2 종자), 상기 T2 종자를 1/2 MS 배지에 일주일간 키운 뒤 흙으로 이식하여 키워 T2 식물체를 수득하였다.
실시예 7. 발아 실험
CyPPO2 및 CyPPO8 형질전환체 중 1μM tiafenacil 처리 하에도 생존한 개체의 T2 세대 종자를 이용하여 tiafenacil 저항성을 확인하고자, 70nM tiafenacil이 함유된 1/2 MS 배지 (1.125g/L MS salt, 10g/L sucrose, 7g/L Agar)에 애기장대 종자를 파종하였다. 50nM tiafenacil 이 함유된 1/2 MS 배지에서 야생형 애기장대(Col-0; Columbia-0 생태형)는 발아 장애가 관찰되고 70nM 함유된 1/2 MS 배지에서 Col-0는 정상 발아 하지 못하고 사멸되었다. 따라서, 70nM 에서 생존한다면 tiafenacil 에 대한 저항성을 갖는 것으로 판단할 수 있었다.
시험 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, CyPPO2 형질전환체의 T2 세대 라인 중 1번과 49번이 발아하는 것을 알 수 있었고, CyPPO8 형질전환체의 T2 세대 라인 중 6번, 16번 및 40번이 70nM tiafenacil이 함유된 1/2 MS 배지에서도 발아하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 음성 대조군으로 사용된 야생형 애기장대(Col-0) 종자는 70nM tiafenacil이 함유된 1/2 MS 배지에서 발아하지 않았으며, 양성 대조군으로 사용된 Mutant AtPPO1 형질전환체는 70nM tiafenacil이 함유된 1/2 MS 배지에서도 발아하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 후대 유전성 시험
8-1. T2 세대 종자에서 분리비(segregation ratio)의 확인
형질전환 애기장대에서 제초제 저항성 형질이 세대가 진전됨에 따른 유전 양식을 판단하기 위해 T2 종자를 대상으로 BAR 유전자 저항성과 감수성 개체의 분리비(segregation ratio)를 라인 별로 판단하였다.
CyPPO2 형질전환체의 경우 10개 라인 중 10, 20, 38, 40번 라인이 3:1에 가까운 분리비를 보여 게놈 내 트랜스유전자(transgene)가 1 카피(single copy)로 삽입되어 멘델의 법칙에 따라서 분리 및 발현되었다는 것을 확인할 수 있었다. 나머지 6개 라인의 경우는 3:1 의 분리비를 보이지 않아 2 카피(double copy) 이상으로 예측되었다.
CyPPO8 형질전환체의 경우 5개 라인 중 6, 16, 40번 라인이 3:1에 가까운 분리비를 보여 게놈 내 트랜스유전자가 1 카피 삽입되어 멘델의 법칙에 따라서 분리 및 발현되었다는 것을 확인할 수 있었다. 나머지 2개 라인의 경우 3:1 보다 낮은 분리비를 보였다.
CyPPO2-HA 형질전환체 (T2)
line no. 분리비
1 4.56:1
8 1.56:1
10 2.85:1
20 2.70:1
23 1.5:1
30 1.7:1
35 2.03:1
38 2.57:1
40 3.17:1
49 2.41:1
CyPPO8-HA 형질전환체 (T2)
line no. 분리비
6 2.57:1
16 2.85:1
23 2.23:1
38 2.03:1
40 2.85:1
8-2. 제초제 저항성 T2 세대 종자에서 CyPPO2 및 CyPPO8 단백질의 발현 확인
후대에서 CyPPO2 및 CyPPO8 단백질의 발현이 유지되는지를 판단하고자 형질전환체의 T2 세대 라인별로 단백질을 추출하고 웨스턴 블랏을 수행하였다. HA tag PPO 단백질량을 검출하고자 애기장대 잎 약 100mg 에서 단백질을 추출하여 전기영동하여 PVDF membrane 에 전이한 뒤 anti-HA antibody 를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. T1 세대 식물체에 1μM tiafenacil 을 스프레이 처리하였을 때 생장하는 식물체를 저항성 라인, 죽는 식물체를 감수성 라인으로 분류하였다.
그 결과, CyPPO2 형질전환체의 경우 제초제 살포에서 저항성을 지니는 8번, 23번, 30번, 38번, 40번 및 49번 라인은 PPO 단백질이 검출되었으나, 감수성인 라인들은 단백질이 검출되지 않았다(도 16). CyPPO8 형질전환체에서도 제초제에 저항성을 지니는 6번, 23번, 38번, 40번 라인은 PPO 단백질이 검출되었으나, 감수성인 라인들은 단백질이 검출되지 않았다(도 17). 이는 저항성 라인들이 후대에서도 CyPPO2 및 CyPPO8 단백질 발현을 유지하며 저항성을 부여함을 나타낸다.
8-3. BAR 유전자를 이용한 트랜스유전자의 안정적 유전성 검증
형질전환된 유전자인 BAR 유전자의 게놈 내 삽입 여부를 검증함으로써, 세대 진전에 따른 트랜스유전자의 안정적 유전성을 확인하였다. CyPPO2 및 CyPPO8 형질전환체의 잎 100mg 을 이용하여 genomic DNA를 분리한 뒤 BAR 유전자의 삽입 여부을 PCR 을 통해 검증하였다. 그 결과, CyPPO2 형질전환체 및 CyPPO8 형질전환체 모두에 있어서 tiafenacil 저항성 및 감수성 라인이 모두 BAR 유전자가 게놈 내 삽입된 것을 알 수 있었다. 이는 형질전환된 유전자가 세대가 진전함에 따라 안정적으로 유지되고 있음을 보여준다.
실시예 9. 형질전환 애기장대의 제초제 저항성 검증
제초제 저항성 형질이 식물의 세대가 진전됨에 따라 유지되는지를 판단하고자 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 유전자가 각각 형질전환된 애기장대의 T2 세대 식물체에 대하여 제초제 저항성을 테스트하였다. 약 4주 자란 애기장대 식물체 당 0.5μM Tiafenacil, 1μM Saflufenacil, 또는 3μM Fomesafen 2~3ml을 각각 스프레이하였다. 스프레이 뒤 7일차 관찰 결과, Wild Type Col-0 식물체는 모두 사멸한 반면, 양성 대조군인 Mutant AtPPO1 형질전환체과 실험군인 CyPPO2 형질전환체, CyPPO4 형질전환체 및 CyPPO8 형질전환체 모두 거의 손상없이 지속 생장하였다 (도 18 및 도 19). 이는 T1 식물체가 가졌던 제초제 저항성 형질이 T2 세대에 잘 유지되어 제초제 저항성을 부여함을 보여준다.
실시예 10. 작용 기전이 다른 복수의 제초제와의 교차 사용 시험
상기 실시예 6에서 제조한 식물 형질전환 벡터로 형질전환하여 수득된, CyPPO2 또는 CyPPO8 유전자를 포함하는 애기장대 형질전환체는, PPO 활성을 억제하는 제초제에 대한 저항성 유전자 및 글루포시네이트(glufosinate) 저항성 유전자를 동시에 발현한다. 따라서, 상기 애기장대 형질전환체에 대하여 두 가지 제초제, 즉 PPO 활성을 억제하는 제초제 및 글루포시네이트를 교차 사용하였을 때, 잡초를 방제하는 데 효과적인지 여부를 시험해보았다. 이를 위하여, CyPPO2 및 BAR 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체, 또는 CyPPO8 및 BAR 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체의 종자를 소독하여 4℃에서 2일간 저온 처리하였다. 종자를 각각 1/2MS 배지(Duchefa), 70nM Tiafenacil 를 첨가한 1/2MS 배지, 50uM glufosinate 를 첨가한 1/2MS 배지, 또는 70nM Tiafenacil 및 50uM glufosinate 를 첨가한 1/2MS 배지에 파종하여 23℃, 16시간 광 및8시간 암의 일장 조건에서 7~14 일간 생장 시켰다. 제초제 배지에 치상한 애기장대는 각각 CyPPO2 또는 CyPPO8를 형질전환한 종자와 대조구인 wild type Col0 이였다. 형질전환체와 대조구를 제초제 배지에 배양하여 배양 2주 후 관찰한 결과, CyPPO2, CyPPO8는 glufosinate 첨가 배지, Tiafenacil 첨가 배지, 또는 glufosinate 및 Tiafenacil 첨가 배지에서 정상적으로 생장하였으나, 대조구인 Col0는 발아하지 못하였다(도 20 참조).
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 PPO 제초제 저항성 유전자와 BAR 유전자를 이원 벡터에 재조합함으로써 형질전환 식물체를 확보하고, 이들 GM 식물을 이용하여 서로 다른 기작을 가진 제초제를 교차 또는 이중 처리하는 경우, 원하지 않은 식물을 제어 할 수 있음을 확인하였다.
본 실시예에서 CyPPO 유전자와 함께 재조합 유전자로 도입한 BAR 유전자는 저항성 유전자의 예시일 뿐, 본 실시예에 의해 사용될 수 있는 유전자의 종류가 제한되는 것은 아니다. 목적에 적합한 저항성 유전자를 CyPPO 2, 4, 8 또는 12와 함께 이원 벡터에 재조합하는 한편, 각 유전자가 저항성을 나타내는 제초제를 교차 처리하는 경우, 목적하는 저항성을 얻을 수 있음은 당업자에게 자명하다.
실시예 11. 복수의 PPO 제초제의 교차 사용 시험
실시예 9 를 통하여, 본원에서 제작된 애기장대 형질전환체가 PPO 계 제초제인 Tiafenacil과 Saflufenacil 에 동시에 저항성을 가지는지를 확인하였으므로, 상기 애기장대 형진전환체에 대하여 Tiafenacil 과 Saflufenacil 를 교차 사용하였을 때, 잡초를 방제하는 데 효과적인지 여부를 시험해보았다. 이를 위하여, CyPPO2 또는 CyPPO8 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체 종자를 소독하여 4℃에서 2일간 저온 처리하였다. 종자를 각각 1/2MS 배지, 70nM Tiafenacil 를 첨가한 1/2MS 배지, 70nM Saflufenacil 를 첨가한 1/2MS 배지, 또는 35nM Tiafenacil 및 35nM Saflufenacil 를 첨가한 1/2MS 배지에 파종하여 23℃, 16시간 광 및 8시간 암의 일정 조건에서 7~14 일간 생장 시켰다. 제초제 배지에 치상한 애기장대는 각각 CyPPO2 또는 CyPPO8를 형질전환한 종자와 대조구인 wild type Col0 이였다. 형질전환체와 대조구를 제초제 배지에 배양하여 배양 2주 후 관찰한 결과, CyPPO2, CyPPO8는 Tiafenacil 첨가 배지, Saflufenacil 첨가 배지, 또는 Tiafenacil 및Saflufenacil 첨가 배지에서 정상적으로 생장하였으나 대조구인 Col0는 발아하지 못하였다(도 21 참조).
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 PPO 제초제 저항성 유전자들을 이용하여 GM 식물을 제작하는 경우, PPO 계열에 해당하는 단일 제초제의 처리뿐만 아니라 복수의 제초제를 교차 또는 이중 처리하는 경우에도 원치 않는 식물을 제어할 수 있음을 확인하였다.
실시예 12. CyPPO2 , CyPPO4 및 CyPPO8 아미노산 서열 상동성에 따른 제초제 저항성 검증
제초제 저항성이 유지되는 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 아미노산 서열 상동성 범위를 확인하기 위해 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 단백질의 일부 아미노산 서열을 NtPPO (담배 유래 PPO 유전자)의 일부 아미노산 서열로 대체하였다. 그 결과 생성된 CyPPO2 아미노산 서열 변이체는 서열번호 12, 그 염기서열을 서열번호 13에 나타내었고, 상기 CyPPO2 서열 변이체는 CyPPO2 의 아미노산 및 염기 서열과 각각 98%의 서열 상동성을 가지는 것을 확인하였다. 또한, 생성된 CyPPO4 아미노산 서열 변이체는 서열번호 14, 그 염기서열을 서열번호 15에 나타내었고, 상기 CyPPO4 서열 변이체의 아미노산 및 염기 서열은 CyPPO4 의 아미노산 및 염기 서열과 각각 98%의 서열 상동성을 가지는 것을 확인하였다. 생성된 CyPPO8 아미노산 서열 변이체는 서열번호 16, 그 염기서열을 서열번호 17에 나타내었고, 상기 CyPPO8 서열 변이체는 CyPPO8 의 아미노산 및 염기 서열과 각각 98%의 서열 상동성을 가지는 것을 확인하였다.
CyPPO2 아미노산 서열 변이체, CyPPO4 아미노산 서열 변이체 및 CyPPO8 아미노산 서열 변이체의 제초제 저항성을 PPO가 결핍된 BT3 대장균[BT3(ΔPPO)]을 이용하여 검증하였으며, 구체적인 실험방법은 실시예 3과 유사하다. 실시예 3과 동일하게, 음성 대조군으로는 애기장대의 야생형 PPO (Wild type AtPPO1) 를 사용하여 제초제 감수성의 기준으로 설정하였고, 양성 대조군으로는 상기 야생형의 아미노산 서열에서 Y426M 및 S305L 의 아미노산 치환이 발생한 Mutant AtPPO1 를 사용하여 제초제 저항성의 기준으로 설정하였다.
12-1. 실험재료 및 기기의 준비
Autoclave는 121℃에서 15분, Incubator 는 37℃, 광조건 169 μmol m-2 s-1 및 배양 시간 14~16시간의 조건으로 사용하였다. UV-visible spectrophotometer 는 600nm 에서 측정하고, 94℃에서 4분간 반응한 후, 25 사이클 (94℃ 에서 30초, 56~60℃ 에서 30초 및 72℃에서 3분) 반복하고, 72℃에서 5분 및 4℃ 에서 5분 동안 PCR 반응하였다. 실험에 사용된 제초제는 다음 표 8에 기재하였다. 각 제초제는 DMSO에 200mM 농도로 조제하였고, -20℃ 보관한 후, 희석하여 LB broth 배지(클로람페니콜 34mg/ml 포함)에 첨가하여 사용하였다.
Chemical family 제초제(원제) 명 제조사/입수처
Pyrimidinedione Tiafenacil 동부팜한농㈜/ 동부팜한농㈜
Saflufenacil BASF/ Sigma
Butafenacil Syngenta/ Sigma
Diphenyl ether Fomesafen Syngenta/ Sigma
Acifluorfen United Phosphorus/ Supelco
Oxyfluorfen Dow/ Sigma
N-phenylphthalimides Flumioxazin Sumitomo/ Sigma
Triazolinones Sulfentrazone FMC/ Waka
Oxizolidinediones Pentoxazone Kaken/Sigma
Phenylpyrazoles Pyraflufen-ethyl Nihon Nohyaky/Sigma
Others Pyraclonil Kyoyu Agri/Sigma
Oxadiazoles Oxadiazon Bayer/Sigma
Thiadiazoles Fluthiacet-methyl FMC/Sigma
12-2. 실험방법
클로람페니콜을 포함한 3ml LB broth 액체 배지에 saturated cell을 접종한 후, 37, 200rpm 조건에서 5시간 배양하였다. 600nm에서 배양한 cell 농도를 측정하여 형질전환체 간 1ml 당 흡광도(OD600)가 일정하도록 LB 액체 배지로 희석하였다(OD600=0.5). LB broth 액체 배지에 agar를 1%로 넣고, Autoclave에서 멸균하였다. 클로람페니콜(34μg/ml)과 농도에 따라 제초제를 넣고 혼합하였다. 동일한 농도로 희석한 cell을 100, 10---1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5로 희석하였다. cell을 1% agar, LB broth 고체 배지에 10μl씩 떨어뜨렸다. 37 incubator 에서 14~16시간 배양하였다(광조건 : 169 μmol m-2 s-1).
pACBB-CyPPO2, pACBB-CyPPO4 및 pACBB-CyPPO8 각각을 주형으로 하여, 치환할 부위를 프라이머(표 9)를 제작하였고, PCR 을 이용하여 pACBB-CyPPO2 변이체, pACBB-CyPPO4 변이체 및 pACBB-CyPPO8 변이체 벡터를 제작하였다. PCR 반응액은 Template (pACBB-CyPPO2, pACBB-CyPPO4 및 pACBB-CyPPO8 오리지널) 1μl, 10X buffer 5μl, dNTP mixture (각 10mM) 1μl, forward primer (10μM) 1μl, reverse primer (10μM) 1μl, DDW 35μl, 및 Pfu-X (Solgent, 2.5unit/μl) 1μl을 포함하는 반응액 50μl 으로 구성하였고, 94℃에서 4분간 반응한 후, 25 cycles (94℃ 에서 30초, 56℃ 에서 30초 및 72℃에서 3분) 반복하고, 72℃에서 5분 및 4℃ 에서 5분 반응하여 증폭하였다.
균주 프라이머 서열(pACBB cloning 용) 서열번호
Oscillatoria nigro-viridis PCC 7112 CyPPO2Nt98%_F ATCTGATCAAAAGCAATTTTCTGAGTTTTCCGGGGAAAC 29
CyPPO2Nt98%_R CAATTGGATTTGAAGGTAA CGGTTGCAGCTTATTTTCC 30
Lyngbya sp. PCC 8106 CyPPO4-Nt-98%_F ATCTGATCAAAAGCAATTTTTTAAGTCCTGGAGGTAAACT 31
CyPPO4-Nt-98%_R CAATTGGATTTGAAGGTAA AGGCATGAGTTGACCATTC 32
Halothece sp. PCC 7418 CyPPO8_Nt98%-F ATCTGATCAAAAGCAATTTTCTGAGTCCAATCGGGAAAC 33
CyPPO8_Nt98%-R CAATTGGATTTGAAGGTAAAGGGCGCAGTTTCCCCTCCC 34
BT3(ΔPPO) competent cell 을 제작하기 위하여, BT3(ΔPPO) 균주를 5ml LB broth 에 50 μg/ml kanamycin 및 20 μg/ml hematin 첨가하여 37 shaking incubator 에서 12시간 동안 암배양하였다. 그 후 5ml culture 를 20μg/ml hematin 첨가된 100 ml LB broth에 넣어 준 뒤, OD600=0.5 정도 될 때까지 37 shaking incubator 에서 암배양하였다. 배양된 대장균을 CaCl2 이용하여 competent cell 제작 프로토콜을 따라 BT3(ΔPPO) competent cell 을 제작하였다. 다음으로, BT3(ΔPPO) 균주에 CyPPO2 변이체, CyPPO4 변이체 및 CyPPO8 변이체를 함유하는 벡터를 형질전환하기 위하여, BT3(ΔPPO) competent cell 100 μl 에 벡터 5 μl를 첨가하여 섞어준 뒤, 20분간 얼음에서 반응한 후 42℃에서 40초간 두었다. 그 후 얼음에서 2분간 안정화 시키고 BT3(ΔPPO) 에 LB broth 1ml 을 넣어 37℃ 에서 1시간 동안 교반 배양하였다. 각 삽입 유전자 종류별로, 배양액에서 자란 균들을 모아 클로람페니콜(34μg/ml)이 첨가된 LB 고체 배지에 도말한 후 37 에서 12시간 이상 배양하였다. 그 후 각 단일 콜로니(single colony)를 액체 LB 배지에서 배양하였다. 이후, 광 상태에서 제초제 처리에 따른 생장 저해를 측정하였고, 제초제가 미첨가된 LB 고체 배지에서 자란 BT3 형질전환 균주의 생육 상태와 비교하여, 제초제가 농도별로 첨가된 LB 고체 배지에서 BT3 형질전환 균주가 자라는 상태를 관찰하였다.
12-3. 실험결과
도 22 내지 도 25은 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 의 오리지널 서열과 각각 98%의 서열 상동성을 가지는 CyPPO2 변이체, CyPPO4 변이체 및 CyPPO8 변이체 유전자의 제초제 저항성을 확인한 결과를 나타낸다. 음성 대조군으로는 Wild type AtPPO1를 제초제 감수성의 기준으로 설정하였고, 양성 대조군으로는 Mutant AtPPO1 를 제초제 저항성의 기준으로 설정하였으므로, Mutant AtPPO1 로 형질전환된 균주과 유사하거나 더 높은 저항성을 나타낸 경우 제초제 저항성이 있는 것으로 판단하였다.
결과적으로, 9개 계통의 13종의 제초제(Tiafenacil, Saflufenacil, Butafenacil, Fomesafen, Acifluorfen, Oxyfluorfen, Flumioxazin, Sulfentrazone, Pentoxazone, Pyraflufen-ethyl, Pyraclonil, Oxadiazon, Fluthiacet-methyl) 모두에서, CyPPO2 변이체, CyPPO4 변이체 및 CyPPO8 변이체로 형질전환된 BT3 균주 모두 명조건에서 잘 생장하였으며, 양성 대조군인 Mutant AtPPO1과 유사하거나 더 높은 제초제 저항성을 나타내었다 (25μM 에도 생장 저해를 거의 나타내지 않음).
따라서, CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 뿐만 아니라, 이들과 98% 서열 상동성을 가지는 변이체들도 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 의 저항성 수준과 비슷한 양상으로 저항성을 보여, CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 의 일부 서열이 변경되더라도 여전히 PPO 의 기능을 나타내며 제초제 저항성에 관한 생물학적 활성이 유지됨을 확인할 수 있었다.
<110> Dongbu Farm Hannong Co., Ltd. <120> Method for conferring or enhancing herbicide resistance on plants and/or alga with protoporphyrinogen oxidase variants <130> DPP20165866KR <150> KR10-2014-0181791 <151> 2014-12-16 <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 486 <212> PRT <213> Oscillatoria nigroviridis PCC 7112 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(486) <223> CyPPO2 <400> 1 Met Glu Leu Leu Asp Thr Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ala His Ala Leu His Lys Glu Ala Thr Ser Ala Ser Pro Leu 20 25 30 Lys Ile Leu Val Ala Glu Ser Gln Gly Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr 35 40 45 Thr Val Thr Ala Glu Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe 50 55 60 Ser Pro Thr Pro Glu Leu Met Lys Leu Ala Val Asp Val Gly Leu Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ile Phe Ala Asp Arg Lys Leu Pro Arg Phe Val Tyr Trp 85 90 95 Glu Asn Lys Leu Gln Pro Val Pro Met Thr Pro Pro Ala Met Ile Gln 100 105 110 Ser Gln Leu Leu Ser Phe Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Phe Gly Ala 115 120 125 Leu Gly Phe Val Ala Pro Ala Met Gly Asp Arg Leu Ser Gln Gln Gly 130 135 140 Asn Glu Glu Thr Val Ser Gln Phe Phe Arg Arg His Leu Gly Thr Glu 145 150 155 160 Val Met Gln Arg Leu Val Glu Pro Phe Val Ser Gly Val Tyr Ala Gly 165 170 175 Asp Pro Gln Gln Leu Ser Ala Ala Ala Ala Phe Gly Arg Val Ala Lys 180 185 190 Met Ala Asp Val Gly Gly Gly Leu Val Ala Gly Ala Leu Leu Ser Ala 195 200 205 Lys Asn Arg Pro Lys Lys Met Pro Ala Asp Pro Asn Val Pro Lys Thr 210 215 220 Lys Pro Gly Glu Leu Gly Ser Phe Lys Gln Gly Leu Lys Ala Leu Pro 225 230 235 240 Glu Ala Ile Ala Ala Lys Leu Gly Asp Arg Val Lys Leu Asn Trp His 245 250 255 Leu Thr Arg Leu Gln Arg Thr Glu Arg Glu Thr Tyr Ile Ala Glu Phe 260 265 270 Ser Thr Pro Asp Gly Gln Gln Glu Val Glu Ala Arg Thr Val Val Leu 275 280 285 Thr Thr Pro Ala Tyr Val Thr Ala Asp Leu Leu Gln Pro Leu Glu Pro 290 295 300 Gln Val Ser Ser Ala Leu Gln Ala Phe Thr Tyr Pro Thr Val Ala Ser 305 310 315 320 Val Val Leu Ala Tyr Pro Gln Ser Asp Val Lys Gly Lys Leu Val Gly 325 330 335 Phe Gly Asn Leu Ile Pro Arg Gly Gln Gly Ile Arg Cys Leu Gly Thr 340 345 350 Ile Trp Thr Ser Ser Leu Phe Pro Asp Arg Ala Pro Ala Gly Trp Gln 355 360 365 Thr Leu Thr Ser Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asp Ser Glu Ile Gly Asn 370 375 380 Leu Asp Ser Glu Gln Ile Val Arg Glu Val His Arg Asp Leu Ser Arg 385 390 395 400 Ile Leu Leu Lys Pro Asp Val Pro Gln Pro Lys Val Leu Thr Val Lys 405 410 415 Leu Trp Lys Arg Ala Ile Pro Gln Tyr Asn Leu Gly His Phe Asp Arg 420 425 430 Leu Gln Gln Ile Asp Glu Gly Leu Lys Ser Leu Pro Gly Val Tyr Leu 435 440 445 Cys Ser Asn Tyr Val Gly Gly Val Ala Leu Gly Asp Cys Val Arg Arg 450 455 460 Gly Phe Asp Arg Ala Arg Glu Val Gly Glu Tyr Leu Gln Lys Lys Gln 465 470 475 480 Ser Asp Thr Arg Ser Ile 485 <210> 2 <211> 1461 <212> DNA <213> Oscillatoria nigroviridis PCC 7112 <220> <221> gene <222> (1)..(1461) <223> CyPPO2 <400> 2 atggaactat tagatacctt gattgtgggt gcgggtatta gcggtttgag tttggcgcac 60 gcacttcaca aggaagcaac gagtgcatcg ccgctgaaga ttttagtcgc tgagagtcag 120 ggacgtgtgg gcgggaacat cacgactgtg acagcagagg ggtttctctg ggaggagggc 180 ccgaacagtt tttcgccgac gccggaattg atgaagttgg ctgtggatgt gggattgaag 240 caggagttga tttttgccga tcgcaaattg cctcgttttg tgtattggga aaataagctg 300 caaccggtgc cgatgactcc accggcgatg attcagtctc agttgctgag ttttccgggg 360 aaactgcggg cgttgttcgg ggctttgggg tttgtcgcgc cggcaatggg cgatcgactt 420 tcgcagcagg gtaacgagga aacagtttct caatttttcc gccgtcatct cggtacggaa 480 gtgatgcagc ggttggtgga accttttgtt tctggggttt atgccggcga tccgcaacaa 540 cttagcgcgg cggcggcttt tggccgggta gccaagatgg ctgatgtggg tggcgggctg 600 gtggcggggg cgctgctttc tgctaaaaac agaccgaaga aaatgcctgc agacccgaat 660 gttcctaaaa ctaagccggg ggagttgggt tcgttcaagc aggggttgaa ggctttgcca 720 gaggcgatcg ctgctaagtt gggcgatcga gtgaaactca actggcactt gactcgcctc 780 cagcgcacag aacgcgaaac ttacattgct gaattctcga cgcccgacgg acagcaggaa 840 gttgaggcgc gcaccgtggt tttgacaacg cccgcttacg ttacagccga tttgttgcaa 900 cctctggaac cgcaagttag cagcgcttta caagctttta cttatcctac ggttgcctcc 960 gttgtcttag catacccgca gtcggatgtc aagggtaaat tagtgggttt tggaaattta 1020 attccgaggg ggcagggaat tcgctgtctc gggacgattt ggacatcgag tttatttccc 1080 gatcgcgcgc ctgcagggtg gcaaactctc accagttaca tcggcggggc aacagactcg 1140 gaaattggca atctcgactc agaacaaatc gttcgggagg tacaccgaga tttgtctcgg 1200 attttgctga aaccagatgt gccacagcca aaagttttaa cggtgaagct gtggaaacgg 1260 gcgattcctc agtacaattt ggggcatttc gatcgcctgc aacaaatcga tgagggctta 1320 aaatctttgc ctggagtgta tttgtgcagc aactacgttg gcggagtggc tttgggagat 1380 tgcgtgcgaa ggggtttcga tcgtgcgcga gaagtgggcg agtatttgca gaagaaacaa 1440 tcagatactc gatcgatctg a 1461 <210> 3 <211> 479 <212> PRT <213> Lyngbya sp. PCC 8106 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(479) <223> CyPPO4 <400> 3 Met Thr His Val Leu Asp Ser Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ala His Ala Leu His Gln Asn Gln Asp His Gln Leu Pro 20 25 30 Leu Asn Ile Leu Val Ser Glu His Gln Gly Arg Val Gly Gly Asn Ile 35 40 45 Thr Thr Val Ser Glu Gly Glu Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser 50 55 60 Phe Ser Pro Thr Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ala Val Glu Val Gly Leu 65 70 75 80 Lys Pro Glu Leu Val Phe Ala Asp Arg Lys Leu Pro Arg Tyr Val Tyr 85 90 95 Trp Asn Gly Gln Leu Met Pro Val Pro Met Ser Pro Pro Ala Leu Leu 100 105 110 Ser Thr Lys Leu Leu Ser Pro Gly Gly Lys Leu Arg Ala Leu Thr Gly 115 120 125 Ala Leu Gly Phe Val Gln Pro Ala Met Gly Glu Ser Leu Ser Gln Gln 130 135 140 Asn Gly Glu Glu Thr Ile Ser Gln Phe Phe Glu Arg His Leu Gly Ser 145 150 155 160 Glu Val Leu Lys Arg Leu Val Glu Pro Phe Val Ser Gly Val Tyr Ala 165 170 175 Gly Asp Pro Gln Gln Leu Glu Ile Ser Ser Ala Phe Ala Arg Val Ala 180 185 190 Arg Met Ala Tyr Ser Gly Gly Gly Leu Val Ala Gly Ala Val Leu Ser 195 200 205 Arg Arg Gln Asn Lys Ser Pro Arg Ser Pro Ala Asp Pro Ser Ile Pro 210 215 220 Gln Thr Lys Arg Gly Glu Leu Gly Ser Phe Arg Gln Gly Ile Gly Ala 225 230 235 240 Leu Pro Asn Ala Ile Ala Lys Gln Leu Gly Asp Gln Leu Lys Leu Asn 245 250 255 Trp Gln Leu Thr Arg Leu Glu Arg Thr Glu Asn Gln Thr Tyr Arg Ala 260 265 270 Glu Phe Ser Thr Pro Glu Gly Val Gln Gln Val Glu Thr Arg Thr Val 275 280 285 Val Leu Thr Thr Pro Ala Tyr Val Thr Ala Glu Ile Leu Lys Pro Leu 290 295 300 Gln Leu Gln Val Ser Gln Thr Leu Thr Glu Ile Pro Tyr Pro Pro Val 305 310 315 320 Ala Cys Val Val Leu Ala Tyr Pro Val Ser Ala Leu Lys Gln Lys Leu 325 330 335 Thr Gly Phe Gly Asn Leu Val Pro Arg Gly Gln Gly Ile Arg Thr Leu 340 345 350 Gly Thr Ile Trp Thr Ser Ser Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Gln Gly 355 360 365 Trp Gln Val Leu Thr Ser Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asp Pro Glu Ile 370 375 380 Gly Glu Leu Glu Asp Asp Gln Ile Val Glu Ala Val His Gln Asp Leu 385 390 395 400 Arg His Ile Leu Leu Lys Glu Asp Ile Ser Pro Lys Val Leu Ala Val 405 410 415 His Leu Trp Lys Arg Ala Ile Pro Gln Tyr Asn Leu Gly His Gln Gln 420 425 430 Arg Leu Gln His Val Asn Glu Gly Leu Glu Ala Met Pro Gly Leu Tyr 435 440 445 Leu Cys Ser Asn Tyr Ile Asp Gly Val Ala Leu Gly Asp Cys Val Arg 450 455 460 Arg Ser Ile Gly Gln Ala Asn Glu Ile Leu Ser Phe Leu Gly Gln 465 470 475 <210> 4 <211> 1440 <212> DNA <213> Lyngbya sp. PCC 8106 <220> <221> gene <222> (1)..(1440) <223> CyPPO4 <400> 4 atgactcacg tactcgatag tttaatcgtc ggtgcaggca ttagcggcct ggcgttagct 60 catgctctcc atcagaacca agatcatcaa ttgcctctca acattcttgt cagcgagcat 120 caaggacggg taggaggaaa tataaccaca gtatccgaag gagaatttct ttgggaagaa 180 ggccccaata gtttttctcc aacccctgag ttactgaagt tagcggtaga agtaggtctt 240 aagcctgagc tagtctttgc cgatcgcaag ttacctcggt acgtttactg gaatggtcaa 300 ctcatgcctg tgccgatgag tcctccggct ttgttgagta caaaactctt aagtcctgga 360 ggtaaacttc gagcattaac gggggcattg gggtttgtac aacccgcgat gggagaatcg 420 ttaagtcaac aaaatgggga agaaacgatc tcgcagtttt ttgagcgtca tttgggttca 480 gaagttctca agcgactggt tgaacccttt gtttctggtg tttatgcagg cgatccccag 540 caactcgaaa ttagctcggc ttttgcccga gtcgcacgta tggcttacag tggcggtgga 600 ttggttgctg gagcggtttt atcgcgtcgt cagaacaaat ctccgcgatc gcctgccgac 660 ccgtctattc cccaaactaa acggggagag ttggggtctt ttcgtcaggg gattggagcc 720 ttacccaatg cgatcgccaa acagttaggc gatcaactca aattaaactg gcaactcacc 780 cgtctcgaac ggactgaaaa ccaaacctat cgggctgaat tttcgactcc agaaggggtt 840 caacaggtag aaactcgaac ggtggtgttg acgactccgg cctatgtcac agcagaaatt 900 ctcaaaccgt tgcaactcca agtcagtcaa acgttaactg aaattcccta tcccccggtg 960 gcttgcgtcg ttttagccta tcccgtttca gctttaaagc agaaattaac cggatttggc 1020 aatttagttc cccgaggaca agggattcgg acgttaggca cgatttggac atcgagttta 1080 tttcctggtc gcgcccccca aggctggcaa gtcctcacca gttatattgg cggagcgacg 1140 gatccagaaa ttggagagtt agaagatgat caaattgttg aggcggttca tcaagatttg 1200 cgtcacattt tactcaaaga agatatctct cccaaagtgc tagccgtgca tctgtggaaa 1260 cgtgctatcc ctcaatacaa tctcggacac caacaacggt tacaacacgt taatgagggt 1320 ctagaggcaa tgccggggtt atatctgtgt agcaactata tcgacggtgt agcgttggga 1380 gattgtgtgc gtcgttctat cggacaagct aacgaaattc tcagtttttt gggtcaatag 1440 1440 <210> 5 <211> 466 <212> PRT <213> Halothece sp. PCC 7418 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(466) <223> CyPPO8 <400> 5 Met Ile Asp Thr Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Leu Ser Ala 1 5 10 15 Ala Tyr Arg Leu Asp Glu Lys Gln Arg Gln Val Leu Val Ala Glu Lys 20 25 30 Arg Asp Arg Ala Gly Gly Asn Ile Thr Ser Gln Gln Ser Gly Asp Phe 35 40 45 Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Ser Pro Thr Pro Glu Leu Leu 50 55 60 Lys Leu Ala Val Asp Ala Gly Leu Arg Asn Glu Leu Ile Phe Ala Asp 65 70 75 80 Arg Gly Leu Pro Arg Tyr Val Tyr Trp Glu Gly Lys Leu Arg Pro Val 85 90 95 Pro Met Ser Pro Pro Thr Ala Val Thr Ser Gln Leu Leu Ser Pro Ile 100 105 110 Gly Lys Leu Arg Ala Leu Thr Gly Ala Leu Gly Phe Ile Pro Pro Gln 115 120 125 Val Ser Ser Gln Glu Glu Thr Val Ala Asp Phe Phe Thr Arg His Leu 130 135 140 Gly Ser Glu Val Ala Gln Arg Leu Val Ser Pro Phe Val Ser Gly Val 145 150 155 160 Tyr Ala Gly Asp Val Asp Gln Leu Ser Ala Glu Ala Ala Phe Gly Arg 165 170 175 Val Thr Gln Leu Ala Asp Val Gly Gly Gly Leu Val Ala Gly Ala Ile 180 185 190 Leu Cys Arg Arg Gln Lys Pro Lys Ser Thr Pro Lys Thr Ala Lys Pro 195 200 205 Ser Asp Ile Pro Glu Thr Lys Ser Gly Gln Leu Gly Ser Phe Lys Glu 210 215 220 Gly Leu Gln Gln Leu Pro Ser Ala Ile Val Ser Gln Leu Gly Asp Lys 225 230 235 240 Val Lys Phe Gln Trp Glu Leu Lys Asn Ile Ser Pro His Pro Glu Ser 245 250 255 Gly Tyr Val Ala Thr Phe Ser Thr Pro Glu Gly Glu Gln Thr Val Glu 260 265 270 Ala Lys Thr Val Ile Leu Thr Thr Pro Ala Tyr Val Thr Ala Ser Leu 275 280 285 Val Lys Asp Leu Ser Pro Gln Ala Ser Gln Ala Leu Asn Glu Ile Ser 290 295 300 Tyr Pro Pro Val Ala Cys Val Val Leu Ala Tyr Pro Asp Glu Ala Leu 305 310 315 320 Arg Phe Pro Leu Lys Gly Phe Gly Asn Leu Asn Pro Arg Ser Gln Gly 325 330 335 Ile Arg Thr Leu Gly Thr Ile Trp Ser Ser Thr Leu Phe Pro Gly Arg 340 345 350 Thr Pro Lys Gly Trp His Leu Leu Thr Asn Phe Ile Gly Gly Ala Thr 355 360 365 Asp Pro Ala Ile Ala Glu Leu Ser Glu Asp Gln Ile Ile Glu Gln Val 370 375 380 His Gln Asp Leu Gln Gln Ala Val Ile Lys Ser Gly Ser Ile Pro Lys 385 390 395 400 Pro Leu Ala Val His Leu Trp Ser Lys Ala Ile Pro Gln Tyr Asn Leu 405 410 415 Gly His Leu Lys Arg Leu Glu Thr Ile Arg Asn His Leu Lys Pro Phe 420 425 430 Ser Gly Leu Phe Leu Ser Ser Asn Tyr Leu Asp Gly Val Ala Leu Gly 435 440 445 Asp Cys Val Arg Arg Gly Glu Glu Ser Ser Gln Ala Val Leu Asp Tyr 450 455 460 Leu Gly 465 <210> 6 <211> 1401 <212> DNA <213> Halothece sp. PCC 7418 <220> <221> gene <222> (1)..(1401) <223> CyPPO8 <400> 6 atgatagata ctttaattgt gggagcaggg attagtggtt taagtgctgc gtatcgactc 60 gatgagaagc agcgccaagt gctggttgca gaaaagcgcg atcgcgctgg gggaaatatc 120 accagccaac aaagtggcga tttcctctgg gaagaaggac cgaacagttt ttctcccaca 180 ccagaactcc taaaactagc ggttgatgcg ggcttaagaa atgagttaat ctttgctgat 240 cgcggacttc cccgttatgt ttattgggag gggaaactgc gccctgttcc tatgagtccc 300 cccacagccg tgacatccca gttgctgagt ccaatcggga aactacgggc gttaacgggt 360 gcattaggct ttattccccc gcaagtgtcg agtcaggaag aaacggttgc ggactttttt 420 acccgtcatc tcggttcaga agtagcccaa cggttagtga gtccgtttgt gtctggggtt 480 tatgcagggg atgtggatca actcagtgcg gaagctgcat ttggacgagt tacccaactg 540 gcggatgtgg gcggtggact ggtcgcaggt gcgattttat gtcgtcgtca aaagccaaag 600 tcaaccccaa aaacggctaa accgtctgat attccagaaa caaagtctgg acagttaggt 660 tcatttaagg aaggattaca acaattaccc agcgcgatcg tttctcaact gggagacaaa 720 gtaaagtttc aatgggaact gaaaaatatc tcccctcatc cagaatcggg ttacgtcgcg 780 acattttcca caccagaggg agaacaaaca gtcgaagcca aaaccgttat cctcaccact 840 cccgcctacg ttaccgcctc tctggtcaaa gatttatcac ctcaagccag tcaagcctta 900 aacgaaattt cctatccccc cgtagcttgt gtggtcttag cctatcccga tgaagccctc 960 cgttttcccc tcaaaggatt tggtaatctt aaccctcgca gtcaaggaat ccgcactctt 1020 ggtacaattt ggagttcaac actctttcca ggacgcacgc cgaaaggttg gcatctctta 1080 accaatttta ttggcggtgc aactgatccc gcaattgctg aactcagtga agatcaaatt 1140 attgaacaag tccatcaaga cttacaacaa gcggtgatta aatcgggaag tatcccgaaa 1200 cccttagccg ttcatttgtg gtcaaaagcg attccgcaat acaatctcgg acatctgaaa 1260 cggttagaaa ccatccgcaa tcacttaaaa cccttctctg gactcttttt atcgagtaac 1320 tatctcgatg gcgttgcgtt gggtgattgt gtgcgccgag gggaagagag tagtcaagcc 1380 gtgttagatt atttgggtta a 1401 <210> 7 <211> 486 <212> PRT <213> Microcoleus vaginatus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(486) <223> CyPPO12 <400> 7 Met Glu Leu Leu Asp Thr Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ala His Ala Leu His Lys Glu Ala Thr Ser Pro Ser Ser Leu 20 25 30 Lys Ile Leu Val Ala Glu Ser Gln Gly Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr 35 40 45 Thr Val Thr Ala Glu Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe 50 55 60 Ser Pro Thr Pro Glu Leu Met Lys Leu Ala Val Asp Val Gly Leu Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ile Phe Ala Asp Arg Lys Leu Pro Arg Phe Val Tyr Trp 85 90 95 Gln Asn Lys Leu Gln Pro Val Pro Met Thr Pro Pro Ala Met Ile Gln 100 105 110 Ser Gln Leu Leu Ser Phe Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Phe Gly Ala 115 120 125 Leu Gly Phe Val Ala Pro Ala Ile Gly Ser Gly Leu Ser Gln Gln Gly 130 135 140 Asp Glu Glu Thr Val Ser Gln Phe Phe Arg Arg His Leu Gly Thr Glu 145 150 155 160 Val Met Gln Arg Leu Val Glu Pro Phe Val Ser Gly Val Tyr Ala Gly 165 170 175 Asp Pro Gln Gln Leu Ser Ala Ala Ala Ala Phe Gly Arg Val Thr Lys 180 185 190 Met Ala Asp Val Gly Gly Gly Leu Met Ala Gly Ala Leu Leu Ser Ala 195 200 205 Arg Lys Arg Pro Lys Gln Met Pro Ala Asp Pro Asn Val Pro Ser Thr 210 215 220 Arg Pro Gly Glu Leu Gly Ser Phe Lys Gln Gly Leu Lys Ala Leu Pro 225 230 235 240 Glu Ala Ile Ala Ala Gln Leu Gly Asp 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taggaggaaa tataaccaca gtatccgaag gagaatttct ttgggaagaa 180 ggccccaata gtttttctcc aacccctgag ttactgaagt tagcggtaga agtaggtctt 240 aagcctgagc tagtctttgc cgatcgcaag ttacctcggt acgtttactg gaatggtcaa 300 ctcatgcctt taagtcctgg aggtaaactt cgagcattaa cgggggcatt ggggtttgta 360 caacccgcga tgggagaatc gttaagtcaa caaaatgggg aagaaacgat ctcgcagttt 420 tttgagcgtc atttgggttc agaagttctc aagcgactgg ttgaaccctt tgtttctggt 480 gtttatgcag gcgatcccca gcaactcgaa attagctcgg cttttgcccg agtcgcacgt 540 atggcttaca gtggcggtgg attggttgct ggagcggttt tatcgcgtcg tcagaacaaa 600 tctccgcgat cgcctgccga cccgtctatt ccccaaacta aacggggaga gttggggtct 660 tttcgtcagg ggattggagc cttacccaat gcgatcgcca aacagttagg cgatcaactc 720 aaattaaact ggcaactcac ccgtctcgaa cggactgaaa accaaaccta tcgggctgaa 780 ttttcgactc cagaaggggt tcaacaggta gaaactcgaa cggtggtgtt gacgactccg 840 gcctatgtca cagcagaaat tctcaaaccg ttgcaactcc aagtcagtca aacgttaact 900 gaaattccct atcccccggt ggcttgcgtc gttttagcct atcccgtttc agctttaaag 960 cagaaattaa ccggatttgg caatttagtt ccccgaggac aagggattcg gacgttaggc 1020 acgatttgga catcgagttt atttcctggt cgcgcccccc aaggctggca agtcctcacc 1080 agttatattg gcggagcgac ggatccagaa attggagagt tagaagatga tcaaattgtt 1140 gaggcggttc atcaagattt gcgtcacatt ttactcaaag aagatatctc tcccaaagtg 1200 ctagccgtgc atctgtggaa acgtgctatc cctcaataca atctcggaca ccaacaacgg 1260 ttacaacacg ttaatgaggg tctagaggca atgccggggt tatatctgtg tagcaactat 1320 atcgacggtg tagcgttggg agattgtgtg cgtcgttcta tcggacaagc taacgaaatt 1380 ctcagttttt tgggtcaata g 1401 <210> 16 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CyPPO8 mutant <400> 16 Met Ile Asp Thr Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Leu Ser Ala 1 5 10 15 Ala Tyr Arg Leu Asp Glu Lys Gln Arg Gln Val Leu Val Ala Glu Lys 20 25 30 Arg Asp Arg Ala Gly Gly Asn Ile Thr Ser Gln Gln Ser Gly Asp Phe 35 40 45 Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Ser Pro Thr Pro Glu Leu Leu 50 55 60 Lys Leu Ala Val Asp Ala Gly Leu Arg Asn Glu Leu Ile Phe Ala Asp 65 70 75 80 Arg Gly Leu Pro Arg Tyr Val Tyr Trp Glu Gly Lys Leu Arg Pro Leu 85 90 95 Ser Pro Ile Gly Lys Leu Arg Ala Leu Thr Gly Ala Leu Gly Phe Ile 100 105 110 Pro Pro Gln Val Ser Ser Gln Glu Glu Thr Val Ala Asp Phe Phe Thr 115 120 125 Arg His Leu Gly Ser Glu Val Ala Gln Arg Leu Val Ser Pro Phe Val 130 135 140 Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Val Asp Gln Leu Ser Ala Glu Ala Ala 145 150 155 160 Phe Gly Arg Val Thr Gln Leu Ala Asp Val Gly Gly Gly Leu Val Ala 165 170 175 Gly Ala Ile Leu Cys Arg Arg Gln Lys Pro Lys Ser Thr Pro Lys Thr 180 185 190 Ala Lys Pro Ser Asp Ile Pro Glu Thr Lys Ser Gly Gln Leu Gly Ser 195 200 205 Phe Lys Glu Gly Leu Gln Gln Leu Pro Ser Ala Ile Val Ser Gln Leu 210 215 220 Gly Asp Lys Val Lys Phe Gln Trp Glu Leu Lys Asn Ile Ser Pro His 225 230 235 240 Pro Glu Ser Gly Tyr Val Ala Thr Phe Ser Thr Pro Glu Gly Glu Gln 245 250 255 Thr Val Glu Ala Lys Thr Val Ile Leu Thr Thr Pro Ala Tyr Val Thr 260 265 270 Ala Ser Leu Val Lys Asp Leu Ser Pro Gln Ala Ser Gln Ala Leu Asn 275 280 285 Glu Ile Ser Tyr Pro Pro Val Ala Cys Val Val Leu Ala Tyr Pro Asp 290 295 300 Glu Ala Leu Arg Phe Pro Leu Lys Gly Phe Gly Asn Leu Asn Pro Arg 305 310 315 320 Ser Gln Gly Ile Arg Thr Leu Gly Thr Ile Trp Ser Ser Thr Leu Phe 325 330 335 Pro Gly Arg Thr Pro Lys Gly Trp His Leu Leu Thr Asn Phe Ile Gly 340 345 350 Gly Ala Thr Asp Pro Ala Ile Ala Glu Leu Ser Glu Asp Gln Ile Ile 355 360 365 Glu Gln Val His Gln Asp Leu Gln Gln Ala Val Ile Lys Ser Gly Ser 370 375 380 Ile Pro Lys Pro Leu Ala Val His Leu Trp Ser Lys Ala Ile Pro Gln 385 390 395 400 Tyr Asn Leu Gly His Leu Lys Arg Leu Glu Thr Ile Arg Asn His Leu 405 410 415 Lys Pro Phe Ser Gly Leu Phe Leu Ser Ser Asn Tyr Leu Asp Gly Val 420 425 430 Ala Leu Gly Asp Cys Val Arg Arg Gly Glu Glu Ser Ser Gln Ala Val 435 440 445 Leu Asp Tyr Leu Gly 450 <210> 17 <211> 1362 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CyPPO8 mutant <400> 17 atgatagata ctttaattgt gggagcaggg attagtggtt taagtgctgc gtatcgactc 60 gatgagaagc agcgccaagt gctggttgca gaaaagcgcg atcgcgctgg gggaaatatc 120 accagccaac aaagtggcga tttcctctgg gaagaaggac cgaacagttt ttctcccaca 180 ccagaactcc taaaactagc ggttgatgcg ggcttaagaa atgagttaat ctttgctgat 240 cgcggacttc cccgttatgt ttattgggag gggaaactgc gccctctgag tccaatcggg 300 aaactacggg cgttaacggg tgcattaggc tttattcccc cgcaagtgtc gagtcaggaa 360 gaaacggttg cggacttttt tacccgtcat ctcggttcag aagtagccca acggttagtg 420 agtccgtttg tgtctggggt ttatgcaggg gatgtggatc aactcagtgc ggaagctgca 480 tttggacgag ttacccaact ggcggatgtg ggcggtggac tggtcgcagg tgcgatttta 540 tgtcgtcgtc aaaagccaaa gtcaacccca aaaacggcta aaccgtctga tattccagaa 600 acaaagtctg gacagttagg ttcatttaag gaaggattac aacaattacc cagcgcgatc 660 gtttctcaac tgggagacaa agtaaagttt caatgggaac tgaaaaatat ctcccctcat 720 ccagaatcgg gttacgtcgc gacattttcc acaccagagg gagaacaaac agtcgaagcc 780 aaaaccgtta tcctcaccac tcccgcctac gttaccgcct ctctggtcaa agatttatca 840 cctcaagcca gtcaagcctt aaacgaaatt tcctatcccc ccgtagcttg tgtggtctta 900 gcctatcccg atgaagccct ccgttttccc ctcaaaggat ttggtaatct taaccctcgc 960 agtcaaggaa tccgcactct tggtacaatt tggagttcaa cactctttcc aggacgcacg 1020 ccgaaaggtt ggcatctctt aaccaatttt attggcggtg caactgatcc cgcaattgct 1080 gaactcagtg aagatcaaat tattgaacaa gtccatcaag acttacaaca agcggtgatt 1140 aaatcgggaa gtatcccgaa acccttagcc gttcatttgt ggtcaaaagc gattccgcaa 1200 tacaatctcg gacatctgaa acggttagaa accatccgca atcacttaaa acccttctct 1260 ggactctttt tatcgagtaa ctatctcgat ggcgttgcgt tgggtgattg tgtgcgccga 1320 ggggaagaga gtagtcaagc cgtgttagat tatttgggtt aa 1362 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCC7112_BmHIF primer <400> 18 ccccggatcc atggaactat tagatacctt gattgtggg 39 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCC7112_StuIR primer <400> 19 cccaggcctg atcgatcgag tatctgattg 30 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCC7418_BmHIF primer <400> 20 ccccggatcc atgatagata ctttaattgt ggg 33 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCC7418_XhoIR primer <400> 21 ccccctcgag acccaaataa tctaacacgg 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCC8106_BglIIF primer <400> 22 ccccagatct atgactcacg tactcgatag 30 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCC8106_XhoIR primer <400> 23 ccccctcgag ttgacccaaa aaactgagaa tttc 34 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CyPPO12_BamHIF primer <400> 24 ccccggatcc atggaactct tggatactct 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CyPPO12_XhoIR primer <400> 25 ccccctcgag gattgacctg gtatcagatt 30 <210> 26 <211> 212 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cTP (chloroplast transit peptide) PCR product <400> 26 tctagaatgg agttatctct tctccgtccg acgactcaat cgcttcttcc gtcgttttcg 60 aagcccaatc tccgattaaa tgtttataag cctcttagac tccgttgttc agtggccggt 120 ggaccaaccg tcggatcttc aaaaatcgaa ggcggaggag gcctcgaggc gcgccgggcc 180 caggcctacg cgtttaatta aacctaggat cc 212 <210> 27 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cTP(chloroplast transit peptide) <400> 27 atggagttat ctcttctccg tccgacgact caatcgcttc ttccgtcgtt ttcgaagccc 60 aatctccgat taaatgttta taagcctctt agactccgtt gttcagtggc cggtggacca 120 accgtcggat cttcaaaaat cgaaggcgga ggaggc 156 <210> 28 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA(hemaglutinin) tag <400> 28 atgtatcctt atgatgttcc agattatgct agtcttatgt acccatacga cgtgcctgac 60 tacgcatcat tg 72 <210> 29 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CyPPO2Nt98%_F primer <400> 29 atctgatcaa aagcaatttt ctgagttttc cggggaaac 39 <210> 30 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CyPPO2Nt98%_R primer <400> 30 caattggatt tgaaggtaac ggttgcagct tattttcc 38 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CyPPO4-Nt-98%_F primer <400> 31 atctgatcaa aagcaatttt ttaagtcctg gaggtaaact 40 <210> 32 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CyPPO4-Nt-98%_R primer <400> 32 caattggatt tgaaggtaaa ggcatgagtt gaccattc 38 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CyPPO8_Nt98%-F primer <400> 33 atctgatcaa aagcaatttt ctgagtccaa tcgggaaac 39 <210> 34 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CyPPO8_Nt98%-R primer <400> 34 caattggatt tgaaggtaaa gggcgcagtt tcccctccc 39

Claims (21)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는,
    식물 또는 조류(algae)의 제초제에 대한 저항성 부여 또는 증진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열 또는 이와 98% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 이루어지는 유전자인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 식물 또는 조류 발현용 재조합 벡터 형태로 포함된 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제초제는 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제초제는 피리미딘디온계(Pyrimidinediones), 디페닐에테르계(Diphenyl-ethers), 페닐피라졸계(Phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계(N-Phenylphthalimides), 티아디아졸계(Thiadiazoles), 옥사디아졸계(Oxadiazoles), 트리아졸리논계(Triazolinones), 옥사졸리딘디온계(Oxazolidinediones) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 제초제는 부타페나실(Butafenacil), 사플루페나실(Saflufenacil), 벤즈펜디존(Benzfendizone), 티아페나실(Tiafenacil), 포메사펜(Fomesafen), 옥시플루오르펜(Oxyfluorfen), 아클로니펜(Aclonifen), 아시플루오르펜 (Acifluorfen), 비페녹스(Bifenox), 에톡시펜(Ethoxyfen), 락토펜(Lactofen), 클로메톡시펜(Chlomethoxyfen), 클로인트로펜(Chlorintrofen), 플루오로글리코펜-에틸(Fluoroglycofen-ethyl), 할로사펜(Halosafen), 피라플루펜-에틸(Pyraflufen-ethyl), 플루아졸레이트(Fluazolate), 플루미옥사진 (Flumioxazin), 시니돈-에틸(Cinidon-ethyl), 플루미클로락-펜틸(Flumiclorac-pentyl), 플루티아셋(Fluthiacet), 티디아지민(Thidiazimin), 옥사디아길(Oxadiargyl), 옥사디아존(Oxadiazon), 카펜트라존(Carfentrazone), 설펜트라존(Sulfentrazone), 아자페니딘(Azafenidin), 펜톡사존(Pentoxazone), 피라클로닐(Pyraclonil), 플루펜피르-에틸(Flufenpyr-ethyl), 프로플루아졸(Profluazol) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 식물이 단자엽 식물, 쌍자엽 식물, 초본 또는 목본 식물인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 식물 또는 조류는 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 더욱 포함하며 상기 제2의 제초제에 대한 저항성이 부여 또는 증진된 것인, 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제2의 제초제는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트(glufosinate), 디캄바(dicamba), 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), 이속사플루톨(Isoxaflutole), ALS(acetolactate synthase) 저해성 제초제, 제2광계(photosystem II) 저해성 제초제, 페닐우레아(phenylure)계 제초제, 브로모시닐(bromoxynil)계 제초제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드는
    글리포세이트(glyphosate) 제초제 저항성 EPSPS(glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), GOX(glyphosate oxidase), GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈(glyphosate decarboxylase);
    글루포시네이트(glufosinate) 제초제 저항성 PAT(phosphinothricin-N-acetyltransferase);
    디캄바(dicamba) 제초제 저항성 DMO(monooxygenase);
    2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) 제초제 저항성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD(Aryloxyalkanoate Dioxygenase);
    ALS(acetolactate synthase) 저해성 설포닐우레아계 제초제 저항성 AHAS(acetohydroxyacid synthase), AHAS(Acetohydroxyacid synthase) 또는 Atahasl(Acetohydroxyacid synthase large subnit);
    제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 저항성 광계 II(photosystem II) 단백질 D1;
    페닐우레아(phenylurea) 제초제 저항성 시토크롬 P450(Cytochrome P450);
    색소체 저해성 제초제 저항성 HPPD(Hydorxylphenylpyruvate dioxygenase);
    브로모시닐(bromoxynil) 제초제 저항성 니트릴레이즈 (Nitrilase); 및
    이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는
    글리포세이트(glyphosate) 제초제 저항성 cp4 epsps, mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자;
    글루포시네이트(glufosinate) 제초제 저항성 BAR 또는 pat 유전자;
    디캄바(dicamba) 제초제 저항성 dmo 유전자;
    2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) 제초제 저항성 AAD-1 또는 AAD-12유전자;
    이속사플루톨 제초제 저항성 HPPDPF W336 유전자;
    설포닐 유레아 제초제 저항성 ALS, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, GM-HRA, S4-HRA, Zm-HRA, SurA 또는 SurB;
    제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 저항성 psbA 유전자;
    페닐우레아(phenylure) 제초제 저항성 CYP76B1 유전자;
    브로모시닐(bromoxynil) 제초제 저항성 bxn 유전자; 및
    이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 또는 유전자를 포함하는, 제초제에 대한 저항성을 가지는 형질전환체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 형질전환체는 조류, 식물세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물인, 형질전환체.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 또는 유전자를 조류,식물세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물에 형질전환하는 단계를 포함하는,
    제초제에 대한 저항성을 가지는 식물 또는 조류를 제조하는 방법.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 또는 유전자를 조류, 식물세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물에 형질전환하는 단계를 포함하는,
    식물 또는 조류의 제초제에 대한 저항성을 부여 또는 증진시키는 방법.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 또는 유전자를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및
    상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는,
    재배지에서 잡초를 방제하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계는, 2종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것인, 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 식물은 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 더욱 포함하는 것이고,
    상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것인, 방법.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 또는 유전자를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및
    상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는,
    배양 배지에서 원하지 않는 수생 생물을 제거하는 방법.
  20. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자; 및
    서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자
    로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 폴리펩티드 또는 유전자를 추가로 포함하는, 조성물.
  21. 제20항에 기재된 폴리펩티드 또는 유전자를 포함하는, 제초제에 대한 저항성을 가지는 형질전환체.
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