KR102015925B1 - 남극개미자리 원형질체 분리용 효소액 및 이를 이용하여 남극개미자리로부터 원형질체를 분리하는 방법 - Google Patents

남극개미자리 원형질체 분리용 효소액 및 이를 이용하여 남극개미자리로부터 원형질체를 분리하는 방법 Download PDF

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이호림
차옥경
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Abstract

본 발명은 남극개미자리(Colobanthus quitensis) 원형질체 분리용 효소액 및 이를 이용하여 남극개미자리로부터 원형질체를 분리하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 특정 구성성분 및 조성비로 이루어짐으로써 남극개미자리 식물로부터 원형질체를 분리하는데 효과적인 효소 용액과 이를 이용하여 남극개미자리로부터 원형질체를 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 남극개미자리 원형질체 분리용 효소액은 특정 구성성분의 조합, 이들의 조합비, 및 pH 조건을 최적화함으로써 남극지역이라는 극한의 환경 조건에서 서식하는 남극개미자리의 잎으로부터 엽육 원형질체를 효과적으로 분리할 수 있다. 또한, 상기 효소액을 사용하여 분리한 남극개미자리의 엽육 원형질체를 세포 시스템으로 이용하는 경우 세포 내 단백질 발현 양상, 환경 스트레스와 관련된 특정 단백질의 기능 연구와 더불어 단백질-단백질 간 상호작용 연구 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

남극개미자리 원형질체 분리용 효소액 및 이를 이용하여 남극개미자리로부터 원형질체를 분리하는 방법{An enzyme solution for the isolation of Colobanthus quitensis protoplasts and a method for isolation protoplasts from olobanthus quitensis using this solution}
본 발명은 남극개미자리(Colobanthus quitensis) 원형질체 분리용 효소액 및 이를 이용하여 남극개미자리로부터 원형질체를 분리하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 특정 구성성분 및 조성비로 이루어짐으로써 남극개미자리 식물로부터 원형질체를 분리하는데 효과적인 효소 용액과 이를 이용하여 남극개미자리로부터 원형질체를 분리하는 방법에 관한 것이다.
남극개미자리는 극도로 낮은 온도로 특징되는 남극지역 연안육상에서 서식해 온 두 가지 현화식물 중 하나로서 남극, 아남극 및 남아메리카에 걸쳐 넓은 범위에 서식한다. 이들은 극한의 조건에서 적응할 수 있도록 특별한 유전적, 생리학적 및 발달상의 특징이 유전되었을 것으로 추측된다. 따라서 유전 및 유전체 접근법의 다양한 측면을 통해 남극 환경에서 적응의 분자적, 생화학적 메카니즘에 관여하는 유전자의 생물학적 증거를 얻는 것은 매우 중요하다. 남극개미자리 식물의 경우 종자생산에 대한 번식분배는 자연적인 남극 지역에서는 매우 낮으며, 실험실 내에서 번식되어질 경우 거의 불임에 해당한다. 한편, 남극개미자리 유전자의 생물학적 기능 판독을 위한 신뢰할만한 유전적 접근법은 아직까지 개발되지 않은 상태이다.
식물조직으로부터 엽육 원형질체를 분리 후 DNA 형질전환을 통한 다목적의 세포 시스템은 개발되어져 왔으며, 이는 단백질의 세포내 위치, 단백질과 단백질 상호작용, 전사적 활성, 신호전달 및 유전자 사일런싱(흥미로운 유전자의 시스템 기능적 특성을 결정할 수 있는)을 포함하는 분자적 및 세포적 연구를 위해 사용되고 있다.
애기장대, 옥수수 및 담배를 포함하는 모델 식물로부터 분리된 엽육 원형질체를 사용한 이종 트랜지언트 발현 시스템은 남극개미자리와 같은 비-모델 식물에서 얻어진 신규 유전자의 생물학적 기능을 연구하는데 일반적으로 사용되어져 왔다. 그러나 이러한 이형 시스템은 종종 다른 유전적 배경에 기인하여 부정확한 정보를 제공하기 때문에, 이러한 식물을 위한 새로운 방법이 필요한 실정이다.
이를 위해 최근에는 Liriodendron, cassava 및 switchgrass와 같은 많은 비 모델 종에 대해 최적화된 원형질체 분리 방법이 확립되었으나, 관다발 남극 식물의 원형질체를 이용한 방법론적 연구는 없다. 본 연구에서는 남극개미자리 잎으로부터의 원형질체 신속하고 안정적으로 수득하는 방법을 최적화하였으며, 급속하게 확장되고 있는 극지 유전체 정보를 활용하기 위한 새로운 대안으로 남극개미자리 원형질체를 사용한 일시적인 유전자 발현 시스템을 개발하였다.
유럽공개특허 0 589 357 A2
따라서 본 발명의 목적은 남극개미자리 원형질체를 효과적으로 분리할 수 있는 효소액의 조성을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 남극개미자리로부터 원형질체를 효과적으로 분리하할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법으로 분리된 남극개미자리 원형질체를 제공하는 것이다.
본 발명의 도 다른 목적은, 남극개미자리 원형질체 세포 발현 시스템을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 셀룰레이스, 마세로자임, 비스코자임, 만니톨 및 MES 버퍼를 포함하는 남극개미자리 원형질체 분리용 효소액을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 셀룰레이스, 마세로자임 및 비스코자임은 3 : 1.2 : 1.5의 중량비로 포함될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 만니톨은 0.5M의 농도일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 MES 버퍼는 pH 4 ~ 4.5일 수 있다.
또한, 본 발명은 남극개마자리 잎을 잘라 절편체를 준비하는 단계; 및 남극개미자리 잎 절편체에 셀룰레이스, 마세로자임, 비스코자임, 만니톨 및 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 버퍼를 포함하는 효소액을 처리하는 단계를 포함하는, 남극개미자리로부터 원형질체를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 셀룰레이스, 마세로자임 및 비스코자임은 3 : 1.2 : 1.5의 중량비로 포함될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 만니톨은 0.5M 농도일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 MES 버퍼는 pH 4 ~ 4.5일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분리된 남극개미자리 원형질체를 제공한다.
또한, 본 발명은 남극개미자료 원형질체에 목적 유전자를 형질주입 후 발현시키는 단계를 포함하는, 남극개미자리 원형질체 세포 발현 시스템을 제공한다.
본 발명의 남극개미자리 원형질체 분리용 효소액은 특정 구성성분의 조합, 이들의 조합비, 및 pH 조건을 최적화함으로써 남극지역이라는 극한의 환경 조건에서 서식하는 남극개미자리의 잎으로부터 엽육 원형질체를 효과적으로 분리할 수 있다. 또한, 상기 효소액을 사용하여 분리한 남극개미자리의 엽육 원형질체를 세포 시스템으로 이용하는 경우 세포 내 단백질 발현 양상, 환경 스트레스와 관련된 특정 단백질의 기능 연구와 더불어 단백질-단백질 간 상호작용 연구 등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 남극개미자리 잎으로부터 분리된 원형질체를 나타낸 것이다(a: 본 연구에서 사용한 남극개미자리 식물, b: 남극개미자리 잎으로부터 분리된 원형질체, c-e: 분리된 원형질체의 생존율을 측정하기 위해 플루오레스세인 다이아세테이트(fluorescein diacetate) 염색한 결과).
도 2는 남극개미자리 원형질체에서 일시적인 발현 시스템을 확립한 결과로서, HA 에피토프-태그된 단백질의 발현을 항-HA 항체를 이용하여 검출하였다(레인 1: 공백터의 대조 발현, 레인 2-9: 남극개미자리 식물의 다양한 이종상동성 유전자의 발현). 화살표는 비특이적 발현을 가리킨다.
도 3은 본 발명의 남극개미자리 엽육 원형질체를 이용한 남극개미자리 GFP 융합 단백질의 세포 내 위치를 보여주는 사진이다(a: GFP 단독 유전자 주입, b: GFP-AtWRKY29 융합 유전자 주입). 녹색형광단백질(GFP: Green Fluorescence Protein).
본 발명은 남극개미자리 원형질체 분리용 효소액에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "남극개미자리 (Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl.)"란 남위 60도 이남에 분포하는 단자엽식물로서, 남국의 여름이면 해안가 주변에서 확인되며 주로 습기가 많고 북쪽을 향해 기울어진 곳에 지의류, 선태류와 함께 섞여 자란다. 다년초로 줄기는 모아나고 높이 5-25 cm이며, 잎은 좁은 선형으로 길이 5-15cm, 너비 1-3mm이며 관 모양으로 안쪽으로 말리고 엽설은 길이 3-7mm로 얇은 막질인 특징을 갖는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "원형질체(protoplast)"란 일반적으로 세포벽(細胞壁)이 제거된 상태의 세포를 말하며 정확한 용어로는 naked protoplast 또는 isolated protoplast라고 해야 하며 원 뜻은 세포벽의 유무를 떠나서 살아있는 세포내부의 구성물 전체를 가리킨다.
본 발명의 남극개미자리 원형질체 분리용 효소액은 유효 구성성분으로 셀룰레이스, 마세로자임, 비스코자임, 만니톨 및 MES 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예에서, 남극개미자리 원형질체 분리용 효소액에 포함되는 상기 셀룰레이스, 마세로자임 및 비스코자임의 조성은 3 : 1-2 : 1-2의 중량비를 가질 수 있으며, 바람직하게는 3 : 1.2 : 1.5의 중량비를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 남극개미자리 원형질체 분리용 효소액에 포함되는 만니톨은 0.5 내지 0.7M의 농도일 수 있으며, 바람직하게는 0.5M일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 남극개미자리 원형질체 분리용 효소액에 포함되는 MES 버퍼는 pH 4 ~ 4.5일 수 있으며, 바람직하게는 pH 4일 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 남극개마자리 잎을 잘라 절편체를 준비하는 단계; 및 (b) 남극개미자리 잎 절편체에 셀룰레이스, 마세로자임, 비스코자임, 만니톨 및 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 버퍼를 포함하는 효소액을 처리하는 단계를 포함하는 남극개미자리로부터 원형질체를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 (b) 단계에서 셀룰레이스, 마세로자임, 비스코자임은 3 : 1.2 : 1.5의 중량비를 가질 수 있으며; 만니톨은 0.5M일 수 있고; MES 버퍼는 pH 4일 수 있다.
본 발명의 남극개미자리로부터 원형질체를 분리하는 방법은 상기 (b) 단계 이후, (c) 남극개미자리 잎 절편체를 포함하는 효소액을 50 내지 60에서 10-30분 동안 가온시키고, 30-40분 동안 식힌 후 여과하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계를 거친 효소액을 데시케이터에 넣어 3시간 동안 효소분해를 진행하는 단계를 추가적으로 더 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 방법으로 분리된 남극개미자리 원형질체를 제공한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 원형질체에 목적 유전자를 형질주입 후 발현시키는 단계를 포함하는, 남극개미자리 원형질체 세포 발현 시스템을 제공한다.
본 발명은 방법으로 분리된 남극개미자리 원형질체를 세포 시스템으로 이용하는 경우 세포 내 단백질 발현 양상, 환경 스트레스와 관련된 특정 단백질의 기능 연구와 더불어 단백질-단백질 간 상호작용 연구 등에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
1. 재료 및 방법
남극개미자리 수집 및 성장조건
남극개미자리(Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl.) 식물은 호주 여름철 (주로 2014 년 1 월) 동안 킹조지 섬의 바톤반도 세종남극기지(62°14' 29'' S; 58°44' 18'' W) 부근에서 식물을 수집하였으며, 이후 실험실로 옮기고, 장일조건 하의 성장챔버에서 half-MS(Murashige & Skoog) 배지(0.5 × MS, 0.5 % 수크로오스, 0.05 % MES, pH 5.7 및 0.8 % 식물성 한천) 또는 16℃의 토양에서 무성번식시켰다.
엽육 원형질체 분리
건강하고 완전히 팽창된 남극개미자리 잎을 면도날로 잘게 썰어 다른 농도의 셀룰레이스 RA(1.5 %, 2.0 %, 3.0 %), Macerozyme R-10 (0.3 %, 0.6 %, 1.2 %) 및 1.5 % Viscozyme (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 포함하는 2 mL의 효소 용액 (0.5 M 만니톨, 20 mM MES, pH 4.0-5.7, 10 mM CaCl2, 20 mM KCl, 0.1 % BSA 및 5 mM b-mercaptoethanol)으로 옮겼다. 효소 용액을 55℃에서 10-30분 동안 가온시키고, 30분 동안 실온(25℃)으로 식힌 후, 0.45㎛ 주사기 필터를 통해 여과시켰다. 다음에, 다진 잎 조직을 데시케이터(desiccator)를 사용하여 어두운 곳에서 30분 동안 진공 침투시키고, 70 rpm 속도로 가볍게 흔들어 주면서 실온에서 3시간 동안 계속해서 효소 분해를 진행하였다. 이어서, 원형질체를 함유한 효소 용액을 습식 75μm 나일론 메쉬로 여과하고, 라운드 바텀 튜브에서 2분동안 1,400 rpm으로 원심 분리하였다. 원형질체 펠릿을 동일한 부피의 W5 용액 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl 및 2 mM MES, pH 5.7)으로 2회 세척하였다. 원심 분리 후, 원형질체 펠렛을 MMG 용액 (0.4M 만니톨, 15mM MgCl2 및 4mM MES, pH 5.7)에 재현탁키고 헤마사이토미터(haemocytometer)를 이용하여 현미경으로 수를 세었다. DNA 형질 주입을 위해 1-2×105 세포/1mL 밀도로 희석하였다.
원형질체로 플라스미드 DNA 트렌스펙션
일시적인 발현 시스템을 위하여 PEG-CaCl2 매개된 DNA 트렌스펙션은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다(Yoo et al., 2007). 모든 플라스미드 DNA는 높은 형질도입 효율을 위해 CsCl 구배 방법을 사용하여 준비되었다. 2 ML 둥근 바닥 튜브에 20μL DNA (10-20μg 플라스미드 DNA)와 200μL 세포 (2-4×104 원형질체)를 부드럽게 혼합하였다. 동일한 부피 (220 μL)의 40%(w/v) PEG 4000 용액 (0.2 M 만니톨 및 100 mM CaCl2)을 첨가하고, 혼합한 다음 실온에서 3-5분 동안 반응시켰다. 상기 혼합물을 0.8 mL의 W5 용액으로 희석하였다. 형질도입된 원형질체는 2분 동안 1,400 rpm에서 원심 분리를 진행하여 수득하였다. 이후 6시간 동안 6-웰 플레이트의 각 웰에서 부드럽게 재현탁하고 1 ML WI 솔루션 (0.5 M 만니톨, 20 mM KCl, 및 4mM MES, pH 5.7)에서 인큐베이션하였다.
플라스미드 DNA 구조물
일시적 발현을 위한 플라스미드 구조물은 식물 발현벡터에서 35S 프로모터 및 NOS 터미네이터 사이에 cDNA를 삽입시켜 제조하였다. 종결코돈을 생략한 cDNA를 NOS 터미네이션 전에 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA: human influenza hemagglutinin) 또는 녹색형광단백질(GFP: Green Fluorescence Protein) 태그에 융합하였다.
통계분석
원형질체 수확량 사이의 유의한 차이는 one-way Analysis of Variance( ANOVA)과 Prism software version 7.0b(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)를 사용하는 Turkey’s multiple comparison tests 에 의해 통계적으로 결정되었다.
2. 결과
남극개미자리 잎에서의 원형질체 분리 최적화
완전히 분화된 남극개미자리 잎(도 1a 참조)으로부터 엽육 원형질체를 분리하기 위하여 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 펙틴과 같은 단단한 폴리사카라이드를 갖는 식물 세포벽을 분해할 수 있는 다양한 효소 칵테일을 적용하였다. 그 결과 하기 표 2에서 나타낸 바와 같이, Cellulase RS 및 Macerozyme R-10를 다양한 농도 및 비율로 사용하여 실험하였으나, 수확량은 생중량(g FW) g 당 원형질체 세포수가 103-104 로 나타나 예상외로 상대적으로 낮은 원형질체 수확량을 보여주었다. 이러한 결과를 통해 남극개미자리의 경우 일반적인 식물과 다른 효소 칵테일 최적 조건이 적용되야 할 것으로 판단하였다. 이에, 본 발명에서는 종래와 다른 셀룰로오스 가수분해용 비스코자임(아라바네이즈, 셀룰레이즈, 베타-글루타네이즈, 헤미셀룰레이즈 및 자일레이즈를 포함하는)을 적용하였으며, 다양한 분해 효소와의 적절한 조합을 통해 원형질체의 수율을 향상시킬 수 있었다. 자세하게는, Cellulase RS, Macerozyme R-10 및 Viscozyme를 특정 조합비로 조성하는 경우 생중량 1g 당 5.8(±0.8) × 106 원형질체를 보여주었다(one-way ANOVA test, p<0.001)(도 1b 및 하기 표 1의 No. 4 참조). 한편, 생존 가능한 원형질체의 분리 및 유지에 있어서 만니톨과 같은 삼투압 안정제의 중요한 역할에 기초하여, 만니톨의 상이한 농도 (0.4, 0.5, 0.6 또는 0.7 M)가 원형질체 수율에 영향을 주는지 여부를 조사하였다. 그 결과 0.5M 만니톨의 농도에서 원형질체가 최고 수율로 수득되는 것을 확인하였다(표 1의 No. 4-7 참조). 또한 효소의 최적 pH를 결정하기 위해 다양한 pH 조건 하에서 원형질체를 분리하고 계수하였다. 그 결과 MES에 의해 완충된 pH 4.0 조건에서 가장 높은 원형질체 수율(8.7±0.5 × 105 원형질체/ gFW; one-way ANOVA test, p<0.001)을 보였으며, 반면에 pH가 높아질수록 수율이 점차적으로 감소하는 것으로 나타났다(표 1의 No. 8-11 참조). 분리된 원형질체의 생존율은 플루오레스세인 다이아세테이트(fluorescein diacetate) 염색으로 측정했을때 거의 90%로 나타났다(그림 1c-e).
효소 칵테일(다양한 효소의 조합 및 이들의 조성비), 만니톨 및 pH 조건에 따른 남극개미자리 잎으로부터 분리되는 원형질체 수율
No Cellulase RS (%) Macerozyme R-10 (%) Viscozyme (%) Mannitol (M) MES pH Protoplast yield p
　 　 　 　 　 　 (mean ± SD/gFW) 　
1 1.5 0.3 - 0.5 5.7 3.6 ± 1.9×103 ns
2 2 0.6 - 0.5 5.7 7.7 ± 2.9×103 ns
3 3 1.2 - 0.5 5.7 1.2 ± 0.4×104 ***
4 3 1.2 1.5 0.5 5.7 5.8 ± 0.8×105 ***
5 3 1.2 1.5 0.4 5.7 4.6 ± 0.3×105 ***
6 3 1.2 1.5 0.6 5.7 3.2 ± 0.5×105 ***
7 3 1.2 1.5 0.7 5.7 2.6 ± 0.2×105 ***
8 3 1.2 1.5 0.5 4 8.7 ± 0.5×105 ***
9 3 1.2 1.5 0.5 5 5.2 ± 0.6×105 ***
10 3 1.2 1.5 0.5 6 4.2 ± 0.3×105 ***
11 3 1.2 1.5 0.5 7 1.7 ± 0.2×105 ***
SD, standard deviation (n = 7-9);
*** significant difference (one-way ANOVA test, p<0.001); ns, not significant
남극개미자리 원형질체에 대한 일시적인 발현 시스템의 확립
일시적 발현 시스템의 가능성을 연구하기 위해, 본 실험에서는 남극개미자리 식물의 다양한 이종상동성 유전자를 남극개미자리 원형질체 내로 도입하였다. 이들 유전자는 다른 종에서 다양한 비생물적 스트레스에 반응하는 것으로 알려져있다. 본 발명의 원형질체 시스템에서, 모든 유전자의 단백질 발현은 실온에서 6시간 배양한 후에 충분하였다. 발현 수준은 독립적인 형질주입 사건(도 2, 레인 2-5 참조)과 유전자에 의존한 다양화된 단백질 안정성 사이에서 높은 일관성이 있기 때문에(도 2의 레인 8 참조), 이러한 결과를 통해 남극개미자리로부터 준비된 원형질체가 단백질 발현에 기반한 세포 기반 에세이를 위해 신뢰할 수 있는 시스템이라고 판단되었다. 게다가, 모든 단백질은 이전에 기술되어진 구성적인 35S 프로모터 벡터 시스템을 이용하여 발현되어짐으로써, 이러한 결과는 모델 식물에서 사용된 보편적인 발현 시스템이 남극개미자리 원형질체에서도 적용할 수 있다는 것을 증명하는 것이다.
원형질체를 이용한 남극개미자리 GFP 융합 단백질의 세포 내 위치 규명
본원발명의 원형질체 시스템이 단백질의 세포내 위치를 연구하는데 유용한 도구인지 여부를 확인하기 위해 남극개미자리 원형질체에서 GFP 단독 및 GFP와 융합된 AtWRKY29의 발현을 조사하였다. 참고로, AtWRKY29 유전자는 애기장대의 방어신호경로에 수반되는 핵심 전사인자로서 알려져 있다. 그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, GFP 단독 유전자를 형질주입한 경우 원형질막, 세포질 및 핵에서 녹색 형광 신호를 보이는 반면(도 3a), AtWRKY29-GFP로 형질주입된 원형질 세포에서는 핵 국지화 신호가 분명하게 발견되었다(도 3b). 이러한 결과를 통해 본원발명의 남극개미자리 원형질체가 단백질의 세포내 위치를 결정하기 위한 도구로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
MES: (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)
HA: human influenza hemagglutinin
GFP: Green Fluorescence Protein

Claims (10)

  1. 남극개미자리 원형질체 분리용 효소액으로,
    상기 효소액은 셀룰레이스, 마세로자임, 비스코자임, 만니톨 및 MES 버퍼를 포함하고,
    상기 셀룰레이스, 마세로자임, 비스코자임은 3 : 1.2 : 1.5의 중량비로 포함되며,
    상기 만니톨은 0.5M의 농도이며,
    상기 MES 버퍼는 pH 4 ~ 4.5인 남극개미자리 원형질체 분리용 효소액.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 남극개미자리로부터 원형질체를 분리하는 방법으로서,
    상기 방법은 남극개마자리 잎을 잘라 절편체를 준비하는 단계; 및
    남극개미자리 잎 절편체에 셀룰레이스, 마세로자임, 비스코자임, 만니톨 및 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 버퍼를 포함하는 효소액을 처리하는 단계를 포함하고,
    상기 셀룰레이스, 마세로자임 및 비스코자임은 3 : 1.2 : 1.5의 중량비로 포함되며,
    상기 만니톨은 0.5M 농도이며,
    상기 MES 버퍼는 pH 4 ~ 4.5인 남극개미자리로부터 원형질체를 분리하는 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 상기 제5항의 방법으로 분리된 남극개미자리 원형질체.
  10. 삭제
KR1020180051427A 2018-05-03 2018-05-03 남극개미자리 원형질체 분리용 효소액 및 이를 이용하여 남극개미자리로부터 원형질체를 분리하는 방법 KR102015925B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0589357A2 (de) 1992-09-22 1994-03-30 MADAUS Aktiengesellschaft Verfahren zur Gewinnung von Protoplasten aus Silybum marianum und entsprechende Pflanzenregeneration
KR20160146629A (ko) * 2014-12-16 2016-12-21 주식회사 팜한농 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 이용한 식물 및/또는 조류의 제초제 저항성 부여 또는 증진 방법

Patent Citations (2)

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EP0589357A2 (de) 1992-09-22 1994-03-30 MADAUS Aktiengesellschaft Verfahren zur Gewinnung von Protoplasten aus Silybum marianum und entsprechende Pflanzenregeneration
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