CN107466321B - 通过原卟啉原氧化酶变体赋予或增强植物和/或藻类抵抗除草剂的方法 - Google Patents

Abstract

通过利用原核生物衍生原卟啉原氧化酶变体赋予和/或增强包括农作物在内的植物或藻类的除草剂抗性。

Description

通过原卟啉原氧化酶变体赋予或增强植物和/或藻类抵抗除 草剂的方法

技术领域

本发明提供采用原核细胞衍生的原卟啉原氧化酶变体赋予或增强包括农作物在内的植 物和/或藻类抵抗除草剂的方法。

背景技术

在叶绿体中完成的卟啉生物合成途径是植物代谢过程中起到非常重要作用的叶绿素和 血红素的合成过程。合成过程中，原卟啉原IX氧化酶(以下简称“PPO”；EC：1.3.3.4)在原卟啉原IX氧化为原卟啉IX的过程中起催化作用。原卟啉原IX氧化成原卟啉IX后， 原卟啉IX通过镁螯合酶与镁合成叶绿素，通过铁螯合酶与铁合成血红素。

当PPO活性被抵抗，叶绿素与血红素也将被抵抗，基质原卟啉原IX将脱离正常的卟啉 生物合成途径，迅速从叶绿素中脱离进入细胞质，氧化为原卟啉IX，累积在细胞膜上。积累的原卟啉IX在光和氧分子作用下产生高活性单线态氧(¹O₂)破坏细胞膜，迅速导致植物细胞死亡。根据这一原理开发出可抵抗PPO活性的除草剂。如今，根据化学结构不同除草 剂共分为9大类。其中包括：嘧啶二酮、二苯醚、苯基吡唑、N-苯基酰亚胺、噻二唑、恶 二唑、三唑啉酮、恶唑烷二酮以及其他除草剂。

使用除草剂过程中如想让对象农作物不受除草剂效果影响，有必要在让农作物获得除 草剂抗性。

同理，藻类也属光合生物，藻类可将光能转为能量用来合成多种有用化合物。通过光 合固碳作用，藻类可将二氧化碳(CO₂)转化成糖、淀粉、油脂、脂肪或其他生物分子，比如这些分子可以消除大气中的温室气体。大规模培养藻类可产生众多不同种类的生物分子供我们使用，包括工业酶、治疗性化合物蛋白质、营养产品、商品，燃料产品等。

在生物反应器、开放池或封闭池中大规模培养藻类时遇到的最大问题就是会被其他高 竞争力且不需要的藻类真菌和细菌污染。像轮虫和其他浮游生物会在培养过程中吞噬所有 物种。

因此有必要赋予藻类除草剂抗性，因为既要除草剂能够抵抗没有除草剂抗性基因的竞 争微生物，又要在除草剂存在环境中让具有除草剂抗性的藻类生长。

发明内容

[技术课题]

现已证明，从原核生物衍生出的hemY-型PPO基因针对9大类型的PPO抵抗除草剂可在很大范围内赋予除草剂抗性。此种基因通过植物或藻类体现，可赋予植物或藻类除草剂抗性。根据上述内容，通过原核生物衍生原卟啉原氧化酶变体可赋予和/或增强包括农作物和藻类在内的植物的除草剂抗性。

一个实施例中提供化合物，它可以赋予和/或增强植物或藻类的除草剂抗性。这种化 合物包括选自多个群组的含有SEQ ID NO：1氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸 序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：3氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸 序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：5氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸 序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：7氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸 序列的一个或多个多肽。

另一个实施例提供化合物，它可以赋予和/或增强植物或藻类的除草剂抗性。这种化 合物包括选自多个基因编码对应的多肽群组中含有SEQ ID NO：1氨基酸序列与其同源性高 于95％以上的氨基酸序列的一个或多个基因；含有SEQ ID NO：3氨基酸序列与其同源性高 于95％以上的氨基酸序列的一个或多个基因；含有SEQ ID NO：5氨基酸序列与其同源性高 于95％以上的氨基酸序列的一个或多个基因；含有SEQ ID NO：7氨基酸序列与其同源性高 于95％以上的氨基酸序列的一个或多个基因。

在一个示例性实施例当中包含一个SEQ ID NO：2核苷酸序列或者与其同源性高于95％ 以上的核苷酸序列的基因；包含一个SEQ ID NO：4核苷酸序列与其同源性高于95％以上的 核苷酸序列的基因；包含一个SEQ ID NO：6核苷酸序列与其同源性高于95％以上的核苷酸 序列的基因或包含一个SEQ ID NO：8核苷酸序列与其同源性高于95％以上的核苷酸序列的 基因。

在另一个示例性实施例中包括一个重组植物基因表达盒载体或一个重组藻类基因表达 盒载体。

在另一个示例性实施例中的除草剂是可抵抗原卟啉原氧化酶的除草剂。

在另一个示例性实施例中的除草剂是从嘧啶二酮、二苯醚、苯基吡唑、N-苯基酰亚胺、 噻二唑、恶二唑、三唑啉酮、恶唑烷二酮和它们中的任意组合中选择一种或多种除草剂类 型。

在另一个示例性实施例中除草剂是从包括氟丙嘧草酯、苯嘧磺草胺、双苯嘧草酮、尿 嘧啶类、氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、苯草醚、氟锁草醚、治草醚、氟乳醚、乳氟禾草灵、 甲氧除草醚、草枯醚、乙羧氟草醚、氟硝磺酰胺、吡草醚、异丙吡草酯、丙炔氟草胺、吲 哚酮草酯、氟烯草酸、嗪草酸、噻二唑草胺、丙炔恶草酮、恶草灵、唑草酮、甲磺草胺、 唑啶草酮、环戊恶草酮、双唑草腈、氟哒嗪草酯、氟唑草胺和它们中的任意组合中选择一 种或多种除草剂。

在另一个示例性实施例中植物选择单子叶植物、双子叶植物、草本植物或/和木本植物。

在另一个示例性实施例中植物或藻类包含基因转移为第二多肽和第二基因编码对应的 多肽，对第二除草剂具扩大的除草剂抗性。

在另一个示例性实施例中第二除草剂包含并不仅限于抵抗细胞分裂的除草剂、抵抗光 合作用的除草剂、抵抗氨基酸合成的除草剂、抵抗色素体的除草剂和抵抗细胞膜的除草剂。

在另一个示例性实施例中第二除草剂的扩大选择范围包括但不仅限于草甘膦、草铵膦、 麦草畏、2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)、异恶唑草酮、抵抗ALS(乙酰乳酸合酶)的除草剂、 抵抗光合体系II的除草剂、苯脲除草剂、溴苯腈除草剂或它们的任意组合。

在另一个示例性实施例中赋予植物或藻类除草剂抗性的第二多肽的扩大选择范围并不 仅限于可以赋予除草剂抗性的多种多肽，包括抗草甘膦除草剂的EPSPS(抗草甘膦5-烯醇 式丙酮酰莽草酸-3-磷酸)、GOX(草甘膦氧化酶)、GAT(草甘膦-N-乙酰转移酶)或草甘膦脱 羧酶；抗草铵膦除草剂PAT(草胺膦-N-乙酰转移酶)；抗麦草畏除草剂DMO(单加氧酶)；抗 2，4-D除草剂2，4-D单加氧酶或AAD(芳氧基链烧酸酯加双氧酶)；抗ALS磺酰脲类除草剂 ALS(乙酰乳酸合酶)、AHAS(乙酰醇酸合成酶)或AtAHASL(乙酰醇酸合成酶大次单元)；抗光 合体系II抗除草剂的光合体系II蛋白质D1；抗苯脲类除草剂细胞色素P450；抗色素体抗 除草剂的HPPD(羟基苯丙酮酸加双氧酶)；抗溴苯腈除草剂腈水解酶和它们的任意组合中 的一种或多种。

赋予除草剂抗性的基因编码第二多肽的扩大范围包括但不仅限于抗草甘膦除草剂 CP4 EPSPS、EPSPS(AG)、MEPSPS、2MEPSPS、GOXV247、GAT4601或GAT4621基因；抗草铵 膦除草剂BAR、PAT或PAT(SYN)基因；抗麦草畏除草剂DMO基因；抗2，4-D除草剂AAD-1 或AAD-12基因；抗ALS磺酰脲类抗除草剂的ALS、GM-HRA、S4-HRA、ZM-HRA、CSR1、CSRl-1、 CSR1-2、SURA或SURB；抗光合体系II抗除草剂的PSBA基因；抗苯脲类抗除草剂的CYP76B1 基因；抗异恶唑草酮抗除草剂的HPPDPF W336基因；抗溴苯腈类抗除草剂的BXN基因和它 们的任意组合中的一种或多种。

另一个实施例中提供可隐藏新的或异常的或/和增强的除草剂抗性的转基因生物体或 它的克隆或后代。转基因生物体或它的克隆或后代表达包括选自多个群组的含有SEQID NO： 1氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQID NO：3 氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQID NO：5 氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQID NO：7 氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽和他们的任意组合。

在另一个示例性实施例中转基因标的物可以是藻类、植物细胞、原生质体、胼胝、下 胚轴、种子、子叶、芽或植物。

另一个实施例中提供的方法显示新颖的或/和增强的除草剂抗性的基因转移植物或藻 类。该方法包括转移到藻类、植物细胞、原生质体、胼胝、下胚轴、种子、子叶、芽或植物的过程。表达包括选自多个群组的含有SEQ ID NO：1氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：3氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：5氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：7氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽和他们的任意组合。

另一个实施例中提供可以赋予和/或增强植物或藻类除草剂抗性的方法。该方法包括 通过一个或多个基因转移到藻类、植物细胞、原生质体、胼胝、下胚轴、种子、子叶、芽或植物的过程。该基因选自基因编码对应的多肽含有SEQ ID NO：1氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：3氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：5氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：7氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽和他们的任意组合。

另一个实施例中提供可以控制耕种地区中杂草的方法。该方法包括向耕种地区提供含 有多肽和基因转移到植物的过程。这些多肽包括含有SEQ ID NO：1氨基酸序列与其同源 性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：3氨基酸序列与其同源 性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：5氨基酸序列与其同源 性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：7氨基酸序列与其同源 性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽和他们的任意组合；还要提供在耕种地区 使用时原卟啉原氧化酶抑制型除草剂的有效剂量。

在另一个示例性实施例中提供一个在上述耕种地区使用时原卟啉原氧化酶抑制型除草 剂的有效剂量，通过使用两种以上计量组合的原卟啉原氧化酶抑制型除草剂，依次或同时 使用在上述耕种地区的方法来获取。

在另一个示例性实施例中将基因转移赋予上述植物除草剂抗性的第二多肽或基因编码 对应的多肽。对两种除草剂，即原卟啉原氧化酶抑制型除草剂和第二除草剂，依次或同时 在上述耕种地区按照相同有效剂量使用。

另一个实施例应提供通过培养基控制不需要水生物种的方法。该方法需包括通过转基 因藻类获得培养基的过程。这些转基因藻类所含有的多肽或基因从包括含有SEQ IDNO：1 氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ IDNO：3 氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ IDNO：5 氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ IDNO：7 氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽，或从基因编码对应 的多肽和它们的任意组合中选择，在培养介质中使用有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制型除 草剂。

[课题解决方案]

一个实施例提供赋予和/或增强植物或藻类除草剂抗性的合成物。该合成物包括一个 或多个多肽。该多肽主要包括含有SEQ ID NO：1氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨 基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：3氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨 基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：5氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨 基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：7氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨 基酸序列的一个或多个多肽；和它们的任意组合。

另一个实施例提供赋予和/或增强植物或藻类除草剂抗性的合成物。该合成物包括一 个或多个基因。该基因应该主要选自基因编码对应的多肽包括含有SEQ ID NO：1氨基酸序 列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：3氨基酸序 列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：5氨基酸序 列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：7氨基酸序 列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列的一个或多个多肽；和它们的任意组合。

另一个实施例还提供用于赋予和/或增强植物或藻类除草剂抗性的多肽。该多肽选自 一个或多个多肽包括含有SEQ ID NO：1氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列 的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：3氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列 的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：5氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列 的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：7氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列 的一个或多个多肽；和它们的任意组合。

另一个实施例还提供用于赋予和/或增强植物或藻类除草剂抗性的基因。该基因选自 一个或多个多肽包括含有SEQ ID NO：1氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列 的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：3氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列 的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：5氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列 的一个或多个多肽；含有SEQ ID NO：7氨基酸序列与其同源性高于95％以上的氨基酸序列 的一个或多个多肽；和它们的任意组合。

另一个实施例还提供由基因转移具有除草剂抗性的转移体。

另一个实施例还包括由上述基因转移到藻类、植物细胞、原生质体、胼胝、下胚轴、种子、子叶、芽或植物的方法。从而获得具除草剂抗性的有植物或藻类。

另一个实施例还包括由上述基因转移到藻类、植物细胞、原生质体、胼胝、下胚轴、种子、子叶、芽或植物的方法。从而提供赋予和/或增强植物或藻类除草剂抗性的准备方法。

本发明的具体细节详述如下：

本发明中提供的墨绿颤藻(Oscillatoria nigro-viridis)PCC 7112-衍生PPO，命名为 “CyPPO2”，它的氨基酸序列编号设定为SEQ ID NO：1，基因编码对应肽的核苷酸序列设 定为SEQ ID NO：2。

本发明中提供的旋藻sp.(Lyngbya sp.)PCC 8106株衍生PPO，命名为“CyPPO4”，它的氨基酸序列编号设定为SEQ ID NO：3，基因编码对应肽的核苷酸序列设定为SEQ IDNO： 4.

本发明中提供的Halothece sp.PCC 7418株衍生PPO，命名为“CyPPO8”，它的氨基酸序列编号设定为SEQ ID NO：5，基因编码对应肽的核苷酸序列设定为SEQ ID NO：6.

本发明中提供的具鞘微鞘藻(Microcoleus vaginatus)株衍生PPO，命名为“CyPPO12”， 它的氨基酸序列编号设定为SEQ ID NO：7，基因编码对应肽的核苷酸序列设定为SEQ ID NO： 8。CyPPO12氨基酸序列与CyPPO2有94％的氨基酸序列同源性。

本发明中提供的除草剂抗性PPO蛋白在整体不改变分子活性范围内包含一个追加变异。 这种变异包括氨基酸的置换、缺失、追加和/或插入。例如：在整体不改变分子活性范围 内蛋白质与肽中的氨基酸置换就属于这一范畴。最为常见的置换类型包括但不仅限于Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、 Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly的双向置 换。如需上述蛋白质还可通过磷酸化作用、硫酸盐化作用、丙烯酰化反应、糖基化反应、 甲基化作用、法尼基化等修饰。这里还包括由于氨基酸序列的变异与修饰，蛋白质的热、 pH等结构稳定性或活性强化。

除草剂抗性PPO蛋白包含具有一定生物活性当量的多肽组成的变异体。主要由SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7氨基酸序列。与野生型和对标参考 蛋白质相比，这些变异体包括氨基酸的置换、缺失、追加和/或插入。与野生型和对标参 考蛋白质具有相同或相近的生物活性。术语“序列同源性”是指与野生型或对标氨基酸序 列或核苷酸序列的相似程度。本发明中除草剂抗性PPO蛋白的氨基酸序列含有60％以上、 65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的氨基酸残基，由固定生物活性当量的多肽组成。包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、 SEQID NO：5或SEQ ID NO：7氨基酸序列。这种蛋白质当量与所必需蛋白质具有相同的 活性当量，只要是具备上述条件的蛋白质都将被看成是符合本发明范围内的蛋白质。同源 性比较应通过肉眼或购买容易的比较程序进行。这些商用化电脑程序可计算两个或多个序 列的同源性百分比(％)，也可以计算临近序列的同源性(％)。比较序列比对的方法将采用本 行业所熟知的方法进行。例如：GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA等。

本发明中所使用的除草剂抗性PPO基因包括上述SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，必须按照这个序列组成，或者由这些序列组成的多肽编码基因的核苷酸序列，其功能均衡的密码子；或者(通过密码子退化)具有相同氨基 酸编码的密码子；或者生物学上具有均衡氨基酸编码的密码子。本发明范围内还包含与除 草剂抗性PPO蛋白保持相同活性的编码蛋白质核酸分子。将本发明中的除草剂抗性PPO蛋 白的基因编码核苷酸序列在最大限度内与其他不同的核苷酸序列排列相匹配，比对序列用本行业最为通用的计算方式分析后，显示包含至少60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、 80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上相同的核苷酸。例如上述除草 剂抗性PPO蛋白进行编码就包括在本发明的范围内。

在另一个示例性实施例中，本发明中除草剂抗性PPO蛋白包含SEQ ID NO：1氨基酸序 列或与其有95％或98％以上同源性的氨基酸序列，必须按这个序列组成，或按这个序列组成 的多肽；包含SEQ ID NO：3氨基酸序列或与其有95％或98％以上同源性的氨基酸序列，必 须按这个序列组成，或按这个序列组成的多肽；包含SEQ ID NO：5氨基酸序列或与其有 95％或98％以上同源性的氨基酸序列，必须按这个序列组成，或按这个序列组成的多肽；包 含SEQ ID NO：7氨基酸序列或与其有95％或98％以上同源性的氨基酸序列，必须按这个序 列组成，或按这个序列组成的多肽和它们的任意组合的多肽，从多个多肽组成中选取的一 个或多个多肽。

在另一个示例性实施例中，本发明中除草剂抗性PPO基因是从以下多个多肽组成中选 取的一个或多个基因。其中包括SEQ ID NO：1氨基酸序列或与其有95％或98％以上同源性 的氨基酸序列的编码的基因，必须按这个序列组成，或按这个序列组成的多肽；包含SEQ ID NO：3氨基酸序列或与其有95％或98％以上同源性的氨基酸序列的编码的基因，必须按这个 序列组成，或按这个序列组成的多肽；包含SEQ ID NO：5氨基酸序列或与其有95％或98％ 以上同源性的氨基酸序列的编码的基因，必须按这个序列组成，或按这个序列组成的多肽； 包含SEQ ID NO：7氨氨基酸序列或与其有95％或98％以上同源性的氨基酸序列的编码的基 因，必须按这个序列组成，或按这个序列组成的多肽和它们的任意组合的多肽。

上述基因包含并不仅限于例如：SEQ ID NO：2核苷酸序列或与其有95％或98％以上同 源性的核苷酸序列，必须按这个序列组成，或按这个序列组成的基因组合；SEQ IDNO：4 核苷酸序列或与其有95％或98％以上同源性的核苷酸序列，必须按这个序列组成，或按这个 序列组成的基因组合；SEQ ID NO：6核苷酸序列或与其有95％或98％以上同源性的核苷酸 序列，必须按这个序列组成，或按这个序列组成的基因组合；SEQ ID NO：8核苷酸序列或 与其有95％或98％以上同源性的核苷酸序列，必须按这个序列组成，或按这个序列组成的基 因组合和/或它们的任意组合。

上述除草剂抗性PPO蛋白通过本行业最为通常的自然萃取和提炼方式获取。也可通过 化学合成方法获得合成蛋白质，或通过基因重组技术获得重组蛋白质方式获取。当使用化 学合成方式，蛋白质通过本行业通用的多肽合成方法获取。当使用基因重组技术，除草剂 抗性PPO蛋白的核酸编码将借助适当的表达载体插入，上述载体将转化成宿主细胞。培养 该宿主细胞表达目标蛋白质后，即可在宿主细胞中发现并获取除草剂抗性PPO蛋白。蛋白 质在所选宿主细胞被表达后，采用通用生物化学分离。例如蛋白质沉淀剂(盐析)、离心分 离、超声消融术、超滤、透析、分子筛色谱分析(凝胶过滤)、吸附色谱分析、离子交换色谱分析、亲和色谱分析等类型处理进行隔离和净化。通常为了能够得到高纯度的分离蛋白质，可以结合上述方法中几种方法来进行。

除草剂抗性PPO核酸分子可通过标准分子生物法来分离和准备。例如：化学合成或重 组技术。可在商用化的方法中选择其中之一进行。

在特定的实施例中，上述PPO蛋白在PPO缺陷E杆菌(E.coli)BT3(ΔPPO)除草剂抗性 测试系统中发现，针对根据除草剂化学结构被分成9大类型的PPO活性抵抗除草剂具有非 常广泛的除草剂抗性。通过土壤杆菌介质转化后上述蛋白质可在烟叶中发现，还可通过转 运肽(TP)在植物的叶绿体上发现上述蛋白质。通过植物表达载体拟南芥(Arabidopsisthaliana)(哥伦比亚型)上也可发现上述PPO蛋白。虽然被转移的植物经过PPO活性抵抗 除草剂处理，仍然观察到该植物发芽并成长。遗传研究也证实对除草剂抗性特性可以延续 到下一代。

上述获取的PPO蛋白可转移到植物或/和藻类上，用来增强植物或藻类的除草剂抗性。

本发明中的“除草剂”是指能够杀死或控制或不利于转变植物或藻类生长的活性成 分。本发明中的“除草剂耐性”或“除草剂抗性”是指即便使用过可杀死一般或野生植 物或藻类，或抵抗植物生长，或让植物或藻类的生长能力与野生植物或藻类相比变弱或停 止生长的除草剂，该植物或藻类仍然继续生长。上述除草剂包括植物除草剂抵抗原卟啉原 氧化酶(PPO)。这种PPO抵抗除草剂可分为嘧啶二酮(pyrimidinediones)、二苯醚(diphenyl-ethers)、苯基吡唑(phenylpyrazoles)、N-苯基酰亚胺 (N-phenylphthalimides)、噻二唑(thiadiazoles)、恶二唑(oxadiazoles)、三唑啉 酮(triazolinones)、恶唑烷二酮(oxazolidinediones)和其他不同化学结构的除草剂。

在另一个示例性实施例中，上述嘧啶二酮类除草剂包括但不仅限于氟丙嘧草酯、苯嘧 磺草胺、双苯嘧草酮、尿嘧啶类。

二苯醚类除草剂包括但不仅限于氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、苯草醚、氟锁草醚、治草 醚、氟乳醚、乳氟禾草灵、甲氧除草醚、草枯醚、乙羧氟草醚和氟硝磺酰胺。

苯基吡唑类除草剂包括但不仅限于吡草醚和异丙吡草酯。

苯基酰亚胺类除草剂包括不仅限于丙炔氟草胺、吲哚酮草酯和氟烯草酸。

噻二唑类除草剂包括不仅限于嗪草酸和噻二唑草胺。

恶二唑类除草剂包括不仅限于丙炔恶草酮和恶草灵。

三唑啉酮类除草剂包括不仅限于唑草酮、甲磺草胺和唑啶草酮。

恶唑烷二酮类除草剂包括不仅限于环戊恶草酮。

其他除草剂包括不仅限于双唑草腈、氟哒嗪草酯和氟唑草胺。

上述除草剂抗性PPO基因根据本行业中通用的方法，可转移到植物或藻类上，可通过 适当的植物或藻类转移表达载体进行。

包括载体在内选用任何适当的启动子是进行植物或藻类基因转移时行业内通用的方法。 例如：植物转移启动子包括但不仅限于SP6启动子、T7启动子、T3启动子、PM启动子、 玉米泛素启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、胭脂氨酸合成酶(nos)启动子、玄参花叶病毒35S启动子、甘蔗杆状的病毒启动子、竹节花黄斑驳病毒启动子、光诱导启动 子核酮糖-l，5-酮糖羧化酶(ssRUBISCO小亚基)、大米胞质磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子、 拟南芥腺嘌呤转磷酸核糖基酶(APRT)启动子、章鱼碱合成酶启动子和BCB(蓝铜结合蛋白) 启动子。

植物转移载体包括可引起3’-端聚腺苷酸化的多聚腺苷酸信号序列。例如：他包括但 不仅限于农杆菌的胭脂氨酸合成酶基因的NOS 3’-末端衍生物、农杆菌的章鱼碱合成酶基 因的章鱼碱合成酶端衍生物、番茄或马铃薯蛋白酶抵抗剂I或II基因的3’-末端、CaMV35S 端、稻米a-淀粉酶端RAmy1 A和菜豆碱端。

藻类转移启动子可以是叶绿体特殊启动子、核启动子、组成型启动子或诱导型启动子。 上述除草剂抗性PPO基因的基因编码可连接到藻类核心功能的5’UTR或3’UTR。藻类转 移载体包括藻类核表达基因的转录调控序列。赋予除草剂抗性的重组基因可整合真核宿主 藻类的核基因组或叶绿体基因组。

上述载体要表达叶绿体中的除草剂抗性PPO基因，定标在叶绿体上的转运肽可连接在 PPO基因的5’-末端。

载体也包括可选择性标记为报道分子的基因编码、可选择性标记的例子包括但不仅限 于抗生素(例如：新霉素、羧苄青霉素、卡那霉素、大观霉素、潮霉素、争光霉素、氯霉素等)或抵抗除草剂(草甘膦、草铵膦、草胺膦等)基因。

植物表达的重组载体包括植物中土壤杆菌属二元载体、综合载体或虽无T-DNA区但设 计上表达植物的一般载体。它们当中二元载体是指载体中包含两个独立载体系统，其中在 Ti(肿瘤诱导)质粒当中包含由左缘(LB)和右缘(RB)组成的负责移动的质粒，其他负责定标 转基因的质粒，这些载体包括启动子区和植物中用于表达的聚腺苷酸化信号序列。

当使用二元载体或综合载体时，用来向植物转移重组载体的菌株最适合选择土壤杆菌 属(土壤杆菌介质转化)。因此可使用农杆菌或发根土壤杆菌。当使用无T-DNA区载体时， 需要通过电穿孔、微粒轰击法、聚乙烯乙二醇-介质吸收等方法将重组质粒导入到植物中。

用上述方法获得的基因转移植物通过本行业通常使用的方法转移到胼胝，发根和土壤 适应环境等标准方法，再次分化到植物中。

本发明中对象转移植物包括植物细胞(包含悬浮培养细胞)、原生质体、胼胝、下胚轴、 种子、子叶、芽和成熟的植物体。

转移体的范围不仅包括基因导入的转移体，还包括它的克隆和后代(T1代、T2代或随 后的几代)。例如：拥有本发明中的基因转移植物，通过有性和无性生殖获得拥有上述基因 的后代，具有遗传除草剂抗性特性的植物也包括在内。本发明的范围还包括上述基因转移 植物通过杂交和融合后显示出初次转移植物特点的所有突变体和变体。本发明的范围还包 括植物的一部分，如种子、花、茎、果实、叶、根、块茎、块状茎，这些部分来自通过本 发明中提及的方法提前进行转移的转移植物，或它的后代，至少要由转移细胞的一部分组成。

本发明中采用的植物没有特定限制，包括单子叶或双子叶植物。植物还包括草本植物 或木本植物。单子叶植物包括但不仅限于泽泻科、水鳖科、水麦冬科、芝菜科、眼子草科、 茨藻科、大叶藻科、百合科、血皮草科、龙舌兰科、石蒜科、薯蓣科、雨久花科、鸢尾科、水玉簪科、灯心草科、鸭距草科、谷精草科、禾本科、天南星科、浮萍科、黑三稜科、香 蒲科、莎草科、芭蕉科、姜科、美人蕉科、兰科的植物。

双子叶植物包括但不仅限于岩梅科、山柳科、鹿蹄草科、杜鹃花科、紫金牛科、报春花科、蓝雪科、柿树科、安息香料、山矾属、山矾属、木犀科、马钱科、龙胆科、睡菜科、 夹竹桃科、萝藦科、茜草科、花葱科、旋花科、紫草科、马鞭草科、唇形科、茄科、玄参 科、紫葳科、爵床科、胡麻科、列当科、苦苣苔科、狸藻科、透骨草科、车前草科、忍冬 科、五福花科、败酱科、川绿断科、桔梗科、菊科、杨梅科、胡桃科、杨柳科、桦木科、 山毛榉科、榆科、桑科、荨麻科、檀香科、桑寄生科、蓼科、商陆科、紫茉莉科、番杏科、 马齿苋科、石竹科、藜科、苋科、仙人掌科、木兰科、八角科、樟科、连香树科、毛茛科、 小檗科、木通科、防己科、睡莲科、金鱼藻科、莼菜科、三白草科、胡椒科、金粟蓝科、 马兜铃科、猕猴桃科、山茶科、藤黄科、茅膏菜科、罂粟、黄花菜、十字花科、悬铃木科、 金缕梅科、景天科、虎耳草科、杜仲科、海桐花科、蔷薇科、豆科、酢浆草科、牻牛儿苗 科、旱金莲科、蒺藜科、亚麻科、大戟科、水马齿科、芸香科、木科、楝科、远志科、漆 树科、槭树科、无患子科、七叶树科、清风藤科、凤仙科、冬青科、卫矛科、省沽油科、 黄杨科、岩高兰科、鼠李科、葡萄科、杜英科、椴树科、锦葵科、梧桐科、瑞香科、胡颓子科、大风子科、堇菜科、、柽柳科、沟繁缕科、秋海棠科、葫芦科、干屈菜科、石榴科、 柳叶菜科、小二仙草科、八角枫科、山茱萸科、五加科、伞形科(繖形花科)的植物。

在另一个示例性实施例中，植物包括但不仅限于粮食作物，如：稻米、小麦、大麦、玉米、大豆、马铃薯、小麦、红豆、燕麦、高梁；蔬菜作物，如：拟南芥、大白菜、萝卜、 红辣椒、草莓、番茄、西瓜、黄瓜、白菜、甜瓜、南瓜、大葱、洋葱和胡萝卜；特种作物， 如：人参、烟草、棉花、青饲料、饲料、芝麻、甘蔗、甜菜、紫苏、花生、油菜、草和蓖 麻；果树，如：苹果树、梨树、枣树、桃树、猕猴桃树、葡萄树、柑桔果树、柿子树、李 子树、杏树和香蕉树；木本植物，如：松树、棕榈油、桉树；显花作物，如：玫瑰、唐菖 蒲、非洲菊、康乃馨、菊花、百合和郁金香；饲料作物，如：黑麦草、红三叶、鸭茅、苜 蓿、高羊茅和多年生黑麦草。植物特例包括但不仅限于双子叶植物，如拟南芥、马铃薯、 茄子、烟草、红辣椒、番茄、牛蒡、雏菊、莴苣、桔梗、菠菜、牛皮菜、红薯、芹菜、胡 萝卜、水芹、欧芹、白菜、甘蓝、萝卜、西瓜、甜瓜、黄瓜、南瓜、葫芦、草莓、大豆、 绿豆、芸豆和豌豆。

本发明中采用的藻类没有特定限制，包括原核藻类或真核藻类。在一些实施例中，藻 类可以是蓝藻、绿藻，红藻，宏观藻类或微观藻类。

蓝藻可以是门色球藻目(包括隐球藻属、隐杆藻属、管孢藻属、Chondrocystis(叶囊 藻属)、色球藻属、Chroogloeocystis、鳄球藻、蓝藻、Cyanobium、Cyanodictyon、Cyanosarcina、蓝丝菌属、蓝纤维藻属、蓝球藻属、粘杆藻属、Halothece、墫氏藻、碟状 菌属、微胞藻属、Radiocystis(辐囊藻属)、棒条藻属、Snowella、聚球藻属、集胞藻属、Thermosynechococcus、乌龙藻属)、Gloeobacteria、念珠藻目(包括微毛藻科、念珠藻科、胶须藻科、伪枝藻科)、颤藻(包括伪枝藻科、节旋藻、Rlennothrix、发毛针藻属、Geitlerinema、Halomicronema、盐螺旋藻属、水鞘藻属、Jaaginema、Katagnymene、Komvophoron、细鞘丝藻属、湖丝藻，旋藻、微鞘藻属、颤藻、席藻属、拟浮丝藻属、浮丝 藻、浮丝藻、假鱼腥藻、Pseudophormidium、裂须藻属、螺旋藻属、Starria、束藻属、束 毛藻属、常丝藻)、宽球藻目(包括拟色球藻属、皮果藻属、小皮果蓝细菌属、粘囊藻属、 厚皮藻属、管状蓝细菌属、斯塔尼尔氏菌属、异球藻属)、原绿蓝细菌目或真枝藻目(包括 蒴链藻属、拟绿胶蓝细菌属、侧生藻属、软管藻属、Mastigocladopsis、鞭枝藻属、拟珠 藻属、真枝藻属、聚线藻属、Symphonemopsis、Umezakia、拟惠氏蓝细菌属)。

藻类还可以由绿藻、衣藻属、Volvacales、Dunaliella、栅列藻属、小球藻或Hematococcm 等一些物种组成。

藻类还可以有缢蛏、Amphiprora hyaline、双眉藻属spp.、牟氏角毛藻、舟形藻、Nitzschia communis、二形栅藻、斜生栅藻、浮游生物、莱茵衣藻、小球藻、雨生红球藻、 富油新绿藻、藻青菌细长聚球藻、布朗葡萄藻、无类囊体蓝藻、集胞藻属、蓝细菌、Nannochloropsis oculata(微拟球藻)、微拟球藻、Nannochloropsis gaditana(海洋富 油微拟球藻)、球等鞭金藻、葡萄藻属sudeticus、小眼虫、富油新绿藻、菱形藻属托苞、 颗石藻、扁藻、帕夫洛娃spp.、隐球藻属spp.、集胞藻属spp.微球藻spp等组成。但要 明确，上述行业中所列的技巧都不绝对，其他多种不同的生物属和物种都可以使用。

上述转移除草剂抗性PPO的植物或藻类可以显示对两种或多种PPO抵抗除草剂具有抗 性。

在另一个示例性实施例中，有两种或更多种的PPO抵抗除草剂依次或同时使用来控制 杂草和/或不需要的水生物种。

例如：本发明提供在耕种地区控制杂草的方法。包括向耕种地区提供拥有除草剂抗性 PP0蛋白或基因编码对应肽的植物，再向耕种地区提供两种或更多可以依次或同时有效的 原卟啉原氧化酶抑制型除草剂。

本发明提供控制培养介质中不需要的水生生物的方法。包括向培养介质提供拥有除草 剂抗性PPO蛋白或基因编码对应肽的藻类，在向培养介质提供两种或更多可以依次或同时 有效的原卟啉原氧化酶抑制型除草剂。

本发明中提供的拥有除草剂抗性PPO蛋白或基因可以与第二种除草剂抗性多肽或基因 编码对应肽组合使用。

本发明中上述转移到植物或藻类的除草剂抗性PPO可能会对两种或多种相互具有不同 机理和作用的出除草剂显示出抗性。本发明中，两种或多种在机理和作用上不同的含有PPO 抵抗除草剂可依次或同时使用来控制杂草和/或不需要的水生物种。以下内容中，在机理 和作用上不同的PPO抵抗除草剂简称为“第二除草剂”。

例如：本发明中用来赋予和/或增强植物或藻类除草剂抗性提供的肽或核苷酸合成物。 包括上述描述中除草剂抗性PPO蛋白或基因编码对应肽，以及第二除草剂抗性多肽或基因 编码对应肽。

本发明提供转移体、它的克隆和后代拥有上述描述除草剂抗性PPO蛋白或基因编码对 应肽获得新的/增强的除草剂抗性，转移体、它的克隆和后代；也可拥有第二除草剂抗性 多肽或基因编码对应肽。

本发明提供赋予植物或藻类新的或/和增强的除草剂抗性的方法，包括转移到藻类、 植物细胞、原生质体、胼胝、下胚轴、种子、子叶、芽或拥有上述描述除草剂抗性PPO蛋白或基因编码对应肽的植物；以及拥有第二除草剂抗性多肽或基因编码对应肽的植物。

本发明提供在耕种地区控制杂草的方法。包括向耕种地区提供拥有上述除草剂抗性PPO 蛋白或基因编码对应肽的植物；以及拥有第二除草剂抗性多肽或基因编码对应肽的植物， 采用向耕种地区提供可以依次或同时有效的原卟啉原氧化酶抑制型除草剂和第二除草剂。

本发明提供在培养介质中控制不需要的水生物种的方法。包括向培养介质提供拥有上 述描述除草剂抗性PPO蛋白或基因编码对应肽的藻类；以及第二除草剂抗性多肽或基因编 码对应肽的藻类，向培养介质提供可以依次或同时有效的原卟啉原氧化酶抑制型除草剂和 第二除草剂。

在另一个示例性实施例中，植物或藻类可包括第二除草剂抗性多肽或基因编码对应肽， 从而获得新的和/或增强的第二除草剂的抗性。

在另一个示例性实施例中，第二除草剂包括但不仅限于抵抗细胞分裂除草剂、抵抗光 合作用的除草剂、抵抗氨基酸合成的除草剂、色素体抑制型除草剂、细胞膜抑制型除草剂、 和/或它们的任意组合。第二除草剂的范围扩大包括但不仅限于草甘膦、草铵膦、麦草畏、 2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)、ALS(乙酰乳酸合酶)抑制型除草剂(例如：咪唑啉酮、磺酰脲、 三唑嘧啶、磺苯胺、嘧啶硫代苯甲酸等)、光合体系II抑制型除草剂、苯脲类除草剂、色 素体抑制型除草剂、溴苯腈类除草剂和/或他们的任意组合。

在另一个示例性实施例中，第二除草剂抗性多肽可扩大范围，从下列类型中选择但不 仅限于这些类型。包括草甘膦除草剂抗性EPSPS(草甘膦抗性5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷 酸)、GOX(草甘膦氧化酶)、GAT(草甘膦-N-乙酰转移酶)或草甘膦脱羧酶；草铵膦除草剂 抗性PAT(草胺膦-N-乙酰转移酶)；麦草畏除草剂抗性DMO(单加氧酶)；2，4-D除草剂抗性2，4-D单加氧酶或AAD(芳氧基链烷酸酯(？)加双氧酶)；ALS抑制型磺酰脲除草剂抗性 ALS(乙酰乳酸合酶)、AHAS(乙酰醇酸合成酶)或AtAHASL(乙酰醇酸合成酶大次单元)；光合 体系II抑制型除草剂抗性光合体系II蛋白质D1；苯脲类除草剂抗性细胞色素P450；色素 体抑制型除草剂抗性HPPD(羟基苯丙酮酸加双氧酶)；溴苯腈除草剂抗性腈水解酶和它们的 任意组合。

第二除草剂抗性多肽的基因编码可扩大范围，从下列类型中选择但不仅限于这些类型。 包括草甘膦除草剂抗性CP4 EPSPS、EPSPS(AG)、MEPSPS、2MEPSPS、GOXV247、GAT4601或 GAT4621基因；草铵膦除草剂抗性BAR、PAT或PAT(SYN)基因；麦草畏除草剂抗性DMO基因；2，4-D除草剂抗性AAD-1或AAD-12基因；ALS抑制型磺酰脲除草剂抗性ALS、GM-HRA、S4-HRA、ZM-HRA、CSR1、CSR1-1、CSR1-2、SURA或SURB；光合体系II抑制型除草剂抗性PSBA基因； 苯脲除草剂抗性CYP76B1基因；异恶唑草酮除草剂抗性HPPDPF W336基因；溴苯腈除草剂 抗性BXN基因和他们的任意组合。

本发明可以通过多种不同形式实施，实施方法不受本文阐述方法限制。上述提供的实 施个例是为达到彻底和完全效果提供，行业内人士可充分了解本发明的范围。相同的参考 编号在本说明当中指代相同的因素。

本问中使用的“第一”，“第二”，“第三”是为了描述多种不同因素和成分，这些 因素和成分不受术语限制。这些术语是为区分一个因素和成分和另外一个因素和成分使用。

本文中使用术语是为了描述特定的实施例，不是为了设定限制。除非是文中明确特别 指出的内容外，上述内容中英文版本中使用的“a，”“an”和“the”也包含它们的 复数形式。本文中使用的术语“组成-comprises”和/或“组成-comprising，”或“包括 -includes”和/或“包括-including”特指本文中描述的特点，因素和/或成分的存在， 不排除存在和追加一个或多个其他特点，因素和成分。上述内容中使用的术语“和/或” 包括所有一个或多个组合清单中的项目。

本发明已经通过一系列实施例进行详尽的阐述，但本发明不仅限于上述已经揭示的实 施例。符合本发明范围内任何数量变动，替换，置换等本文中未进行阐述，或可根据灯具 耕种需要进行修改。

本发明的有益效果为：除草剂抗性PPO可使用在包括经济作物在内的植物和藻类上， 根据除草剂抗性特性和除草剂选择使用，从而达到经济地控制杂草生长的目的。

附图说明

图1是未添加尿嘧啶类或添加了2μM或10μM尿嘧啶类后在CRBIP介质(巴斯德研究所，法国)培养8天后，Halothece sp.PCC 7418菌株生长的照片；

图2显示本发明中使用在E.杆菌BT3(ΔPPO)的pACBB载体的结构；当PPO基因克隆到载体，eGFP在使用前被去除；

图3是野生AtPPO1(用WT表示)和突变体AtPPO1(用MT表示)基因各自转移成BT3(ΔP PO)菌株，滴定到含有0～25μM尿嘧啶类的琼脂培养基中，在亮和黑条件下培养后，显现的生长抵抗的照片；

图4是野生AtPPO1(用WT表示)、突变体AtPPO1(用MT表示)、CyPPO2(用2表示)、CyPPO4(用4表示)和CyPPO8(用8表示)基因各自转移成BT3(ΔPPO)菌株后，在各自含有 0～25μM的嘧啶二酮类除草剂、尿嘧啶类、苯嘧磺草胺或氟丙嘧草酯、或N-苯基酰亚胺类PPO除草剂、丙炔氟草胺的琼脂培养基中，显现出的生长抵抗的照片；V代表未插入PPO的 pACBB载体转移转移到BT3(ΔPPO)的菌株；

图5是野生AtPPO1(用WT表示)、突变体AtPPO1(用MT表示)、CyPPO2(用2表示)、CyPPO4(用4表示)和CyPPO8(用8表示)基因各自转移成BT3(ΔPPO)菌株后，在各自含有0～400μM的二苯醚类PPO除草剂、氟磺胺草醚、氟锁草醚或乙氧氟草醚的琼脂培养基中，显 示出的生长抵抗的照片。V代表未插入PPO的pACBB载体转移转移到BT3(ΔPPO)的菌株；

图6是野生AtPPO1(用WT表示)、突变体AtPPO1(用MT表示)、CyPPO2(用2表示)、CyPPO4(用4表示)和CyPPO8(用8表示)基因转移成BT3(ΔPPO)菌株后，琼脂培养基在各自 含有0～400μM的三唑啉酮类PPO除草剂、甲磺草胺、oxizolidinedione类PPO除草剂、 环戊恶草酮、苯基吡唑类PPO除草剂、吡草醚、恶二唑类PPO除草剂、恶草灵、噻二唑类 PPO除草剂、氟噻甲草酯或其他PPO除草剂、双唑草腈的琼脂培养基中，显示出的生长抵 抗的照片；V代表未插入PPO的pACBB载体转移转移到BT3(ΔPPO)的菌株；

图7是野生AtPPO1(用WT表示)、突变体AtPPO1(用MT表示)和CyPPO12基因各自转移成BT3(ΔPPO)菌株后，在含有0～400μM的尿嘧啶类、苯嘧磺草胺、丙炔氟草胺、氟磺 胺草醚或乙氧氟草醚的琼脂培养基中，显示出的生长抵抗的照片；

图8是野生AtPPO1(用WT表示)、突变体AtPPO1(用MT表示)和CyPPO12基因各自转移成BT3(ΔPPO)菌株后，在含有0～400μM的吡草醚、恶草灵、甲磺草胺、环戊恶草酮或 双唑草腈的琼脂培养基，显示出的生长抵抗的图表；

图9是野生AtPPO1(用WT表示)、突变体AtPPO1(用MT表示)、CyPPO2和CyPPO4基 因各自转移成BT3(ΔPPO)菌株后，在含有0～100μM的尿嘧啶类的液体LB介质中培养时， 显示出的生长抵抗曲线；

图10是野生AtPPO1(用WT表示)、突变体AtPPO1(用MT表示)、CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8基因各自转移成BT3(ΔPPO)菌株后，在含有0～100μM的苯嘧磺草胺液体LB介 质中培养时，显示出的生长抵抗的图表；

图11是野生AtPPO1(用WT表示)、突变体AtPPO1(用MT表示)、CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8基因各自转移成BT3(ΔPPO)菌株后，在含有0～100μM的氟磺胺草醚液体LB介质中 培养时，显示出的生长抵抗的图表；

图12是用来检验表达在烟叶叶绿体中的PPO基因的植物表达载体的结构的原理图；

图13显示了YFP、野生AtPPO1(用WT表示)、CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8基因在植物 叶绿体中表达的检验结果，在它们都被亚克隆到图12的载体中后，转移到植物；

图14显示了用PPO基因转移拟南芥时，用来植物转移的载体结构的原理图；

图15是AtPPO1(用MT表示)、CyPPO2和CyPPO8基因各自转移成拟南芥T2种子后， 在含有70nM的尿嘧啶类1/2MS介质1/2MS介质中播种后检查种子发芽的结果；用来对照 的突变体AtPPO1(用MT表示)使用了通过氨基酸替代转移的对PPO类除草剂具有抗性的基 因转移的种子(T2)；

图16是为了验证后代中CyPPO2蛋白质的表达，对每一行拥有CyPPO2基因拟南芥T2后代进行蛋白质印迹的结果；CyPPO2(R)表示除草剂抗性转移体行，CyPPO2(S)表示除草剂敏感性转移体行；图16中下面的部分显示了二元载体中插入BAR基因后通过PCR检验的结果；

图17是为了验证后代中CyPPO8蛋白质的表达，对每一行拥有CyPPO8基因拟南芥T2后代进行蛋白质印迹的结果；CyPPO8(R)表示除草剂抗性转移体行，CyPPO8(S)表示除草剂敏感性转移体行；图17中下面的部分显示了二元载体中插入BAR基因后通过PCR检验的结果；

图18显示了CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8基因、与对照群突变体AtPPO1(用MT表示) 基因各自转移到拟南芥T2后代后，喷洒了1μM尿嘧啶类7天后的生长结果。WT表示野生 拟南芥的结果；

图19显示了CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8基因与对照群突变体AtPPO1(用MT表示)基因各自转移到拟南芥T2后代后，喷洒了0.5μM尿嘧啶类、1μM苯嘧磺草胺或3μM氟磺 胺草醚7天后的生长结果；WT表示野生拟南芥的结果；

图20显示了CyPPO2和BAR插入基因拟南芥转移体的种子和CyPPO8和BAR插入基因拟南芥转移体的种子各自在加入草铵膦介质、加入尿嘧啶类介质、或草铵膦和加入尿嘧啶类介质中培养的结果；

图21显示了CyPPO2或CyPPO8插入基因拟南芥转移体的种子各自在加入尿嘧啶类介 质、加入苯嘧磺草胺介质、或尿嘧啶类和加入苯嘧磺草胺介质中培养的结果；

图22显示了CyPPO2、CyPPO4或CyPPO8蛋白质氨基酸同源性与除草剂抗性之间关系检验的结果，CyPPO2氨基酸序列变异(用2表示M)、CyPPO4氨基酸序列变异(用4表示M) 和CyPPO8氨基酸序列变异(用8表示M)基因各自转移成BT3(ΔPPO)菌株后，在含有不同浓 度的尿嘧啶类、苯嘧磺草胺和氟丙嘧草酯的琼脂培养基中显示出的生长抵抗的图表；野生AtPPO1(用WT表示)和突变体AtPPO1(用MT表示)作为决定生长抵抗的对照组使用；

图23显示了CyPPO2氨基酸序列变异(用2表示M)、CyPPO4氨基酸序列变异(用4表示M)和CyPPO8氨基酸序列变异(用8表示M)基因各自转移成BT3(ΔPPO)菌株后，在含有 不同浓度的氟锁草醚、乙氧氟草醚和氟磺胺草醚的琼脂培养基中显示出的生长抵抗的图表；野生AtPPO1(用WT表示)和突变体AtPPO1(用MT表示)作为决定生长抵抗的对照组使用；

图24显示了CyPPO2氨基酸序列变异(用2表示M)、CyPPO4氨基酸序列变异(用4表示M)和CyPPO8氨基酸序列变异(用8表示M)基因各自转移成BT3(ΔPPO)菌株后，在含有 不同浓度的甲磺草胺、恶草灵、环戊恶草酮和双唑草腈的琼脂培养基中显示出的生长抵抗 的图表；野生AtPPO1(用WT表示)和突变体AtPPO1(用MT表示)作为决定生长抵抗的对照组 使用；

图25显示了CyPPO2氨基酸序列变异(用2表示M)、CyPPO4氨基酸序列变异(用4表示M)和CyPPO8氨基酸序列变异(用8表示M)基因各自转移成BT3(ΔPPO)菌株后，在不同 浓度的氟噻甲草酯、吡草醚和丙炔氟草胺的琼脂培养基显示出的生长抵抗的图表；野生AtPPO1(用WT表示)和突变体AtPPO1(用MT表示)作为决定生长抵抗的对照组使用。

具体实施方式

以下内容是本发明通过实施例进行详细阐述的具体内容。但这些实施例仅为此发明的 举例，本发明的范围不仅限于文中所举的实施例。

实施例1.从原核生物中分离PPO基因

颤藻nigro-viridis PCC 7112、旋藻sp.PCC 8106菌株和Halothece sp.PCC 7418菌株由巴斯德研究所(法国)提供，上述PPO基因由PCR从表1内容中的引物中分离出来。 基因组从每个菌株中分离，并从表1中的引物分离并放大PPO基因。具鞘微鞘藻(金斯瑞) 的PPO基因序列通过基因银行数据库信息，对拟南芥密码子最佳合成后，在利用表1中的 引物放大。在50μl的PCR反应混合物中每个模版(每种菌株的基因组)加入1μl、5μl的 10X缓冲剂、2μl的dNTP混合物(每10mM)、3μl的正向引物(10μM)、3μl的反向引 物(10μM)、35.5μl的DDW和0.5μl的Pfu-X(Solgent、2.5单位/μl)或EF-taq(Solgent、2.5单位/μl)，放大要在94℃的条件下进行4分钟，30个循环(在94℃进行30秒，在 56℃进行30秒，在72℃进行1.5分钟)、在72℃进行5分钟，在4℃进行5分钟。 从颤藻nigro-viridis PCC 7112中分离出的PPO指定为CyPPO2、从旋藻sp.PCC8106菌株 分离出的PPO指定为CyPPO4、从Halothecesp.PCC7418菌株分离出的PPO指定为CyPPO8、 从具鞘微鞘藻分离出的PPO指定为CyPPO12。

对氨基酸序列和核苷酸序列的CyPPO2、CyPPO4、CyPPO8和CyPPO12分别进行检验，用SEQ ID NOS：1到8来代表，要注意，氨基酸序列的CyPPO2显示出与它的CyPPO12有 94％的序列同源性。

[表1]

实施例2.Halothece sp.PCC 7418菌株的除草剂抗性实验

Halothece sp.PCC 7418菌株培养自CRBIP介质1538(巴斯德研究所，法国)。CRBIP介质1538是一种混合介质，是ASNIII和Turks Island Salts 4X按照1∶1(v/v)的比例混 合而成。其中ASNIII介质由25.0g的氯化钠(NaCl)、3.5g的七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、 2.0g的六水氯化镁(MgCl₂·6H₂O)、0.5g的氯化钾(KCl)、0.5g的二水氯化钙(CaCl₂·2H₂O)、 0.75g的硝酸钠(NaNO₃₎、0.02g三水合磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)、0.04g的碳酸钠(NaCO₃)、 2.5ml的铁铵(III)柠檬酸盐/柠檬酸一水化物溶液[300mg的铁铵(III)柠檬酸盐、300mg 的柠檬酸一水化物和250ml蒸馏水的混合物]、2.5ml的镁依地酸二水物溶液[0.1g的Mg EDTA和500ml的蒸馏水的混合物]、1ml的微量金属A5+Co[2.86g的硼酸(H₃BO₃)、 1.81g的氯化亚锰(MnCl₂·4H₂O)、0.222g的七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)、0.39g的钼酸 钠(NaMoO₄·2H₂O)、0.079g的五水硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)、0.049g的六水硝酸钴 (Co(NO₃)₂·6H₂O)和1000ml的蒸馏水的混合液]和1000ml的蒸馏水组成。Turks Island Salts 4X由was composed of 112g的氯化钠(NaCl)、2.68的氯化钾(KCl)、22g的 六水氯化镁(MgCl₂·6 H₂O)、27.7g的七水硫酸镁(MgSO₄·7 H₂O)、5.8g的二水氯化钙 (CaCl₂·2 H₂O)和1000ml的蒸馏水组成。ASNIII介质和Tursk Island Salts 4X分别在 120℃度环境下高压蒸汽处理20分钟后，按照1∶1(v/v)的比例混合。

取5ml的上述培养介质加入试管，不加入，或各再加入2或10μM的尿嘧啶类。 将相同容量的种子培养Halothece sp.PCC 7418菌株加入到各自试管当中，连续8天检测 菌株的生长。检测结果显示、在连续8天加到10μM的尿嘧啶类后，Halothece sp.PCC 7418 菌株仍旧生长，表示该菌株具有除草剂抗性(图1)。

实施例3.通过PPO缺失E.杆菌(琼脂培养基)测试CyPPO2、CyPPO4、CyPPO8和 CyPPO12的除草剂抗性

为测试从实施例1分离出的CyPPO2、CyPPO4、CyPPO8和CyPPO12除草剂抗性，CyPPO2、 CyPPO4、CyPPO8或CyPPO12基因各自转移成PPO缺失BT3E.杆菌[以下简称“BT3(ΔPPO)”] 后，在除草剂存在的情况下培养用来检测是否会抵抗转移E.coli的生长。作为负控制采 用拟南芥衍生的野生PPO(野生AtPPO1)，显示野生AtPPO1对PPO类除草剂反应敏感，其序列信息已在基因银行登记入册标号为：no.AX084732(基因核苷酸序列用SEQ ID NO：10表示，上述氨基酸序列用SEQ ID NO：9表示)。作为正控制采用突变体AtPPO1，其中Y426M 的氨基酸替代体(酪氨酸在426位置的替代体为蛋氨酸)和S305L(丝氨酸在305的位置替 代体为亮氨酸)发生在野生AtPPO1氨基酸序列(氨基酸序列用SEQ ID NO：11表示)(Li X，Volrath SL.，N D B.G.，Chilcott CE，Johnson MA，Ward ER，Law MD(2003)Developmentof protoporphyrinogen oxidase as an efficient selection marker foragrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize.Plant physiology133：736-747)。

BT3(ΔPPO)菌株由北海道大学(日本)提供，是一种hemG-type PPO缺失的E.杆菌对卡 那霉素具有抗性(Watanabe et al.，(2001)Dual targeting of spinachprotoporphyrinogen oxidase II to mitochondria and chloroplasts by alternativeuse of two in-frame inhibition codons.JBC 20474～20481)。

3-1.实验材料与器材准备

本发明中使用了Hirayama公司的HVE-50高压灭菌器，Hansung Instrument的HS2100A 电子秤，杰奥特公司的CB-30V无菌操作台，JSR的JSI-200CL细菌培养，赛默飞世尔公司的1210型紫外可见分光度量计，Apogee公司的MQ-200光度计，并用Bio-Rad MyCycler作为PCR仪器。高压灭菌器在121°C条件下使用15分钟，指示计在37°C环境使用，每14~20小时为一个培养时间时光照单位为160~200 μmol m^-2 s^-1 f。本发明中还使用LB介质(10 g/L的胰化蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的氯化钠、15g/L的细菌用琼脂)和抗生素氯霉素(Duchefa) 。本实验中使用的除草剂提供方如下表：

[表2]

3-2.实验方法

CyPPO2、CyPPO4、CyPPO8和CyPPO12基因的每个克隆在实施例1当中都被分离和放大 到pACBB(结构如图2所示)，准备含有4μl的各种PPO基因、3.5μl的pACBB载体、1μl 的10X缓冲剂A、1μl的10X缓冲剂B、1μl的连接酶(RBC、3单位/μl)的10μl的溶液， 允许在22℃的环境中反应30分钟。将反应溶液加入到100μl的DH5感受态细胞，在冰 上反应20分钟，在42℃环境放置40秒。将细胞放置在冰上2分钟，在上述溶液中加入l ml的LB液体培养基，放入细菌培养器中在37℃环境中震荡1小时。收获插入的各种基 因在培养介质中培养菌株，在含有氯霉素的LB琼脂培养基中继续培养。

通过各种基因培养转移的E.杆菌种子，将上述每个克隆放置在3ml含有氯霉素的LB 液体培养基中过夜，将上述每100μl放在3ml的新鲜LB液体培养基进行继代培养，直到吸收率(OD₆₀₀)达到0.5～1。用LB液体培养基进行稀释直到吸收率(OD₆₀₀)达到0.5。用LB液体培养基来对此稀释溶液按照10倍比率稀释5次。，向含有氯霉素LB琼脂培养基(培养 皿)和多种不同浓度(0～400μM)的除草剂原种中滴入10μl培养好的转移E.杆菌稀释溶液。 LB琼脂培养基容器放在37℃环境中培养。培养16～20小时后，就可以通过肉眼检测到是 否会抵抗生长。还分别在明亮条件(光照单位为169μmol m^-2 s^-1)和黑暗条件下，在含有尿 嘧啶类的介质检测了菌株是否会抵抗生长。

3-3.实验结果

图4到6显示CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8对除草剂抗性的检查结果，图7和8显示CyPPO12对除草剂抗性的检查结果。

如图3所示，野生AtPPO1转移的菌株在含有尿嘧啶类的介质中，无论是明亮条件还是 黑暗条件生长都受到抵抗，在明亮条件中显示出的抵抗生长能力高于黑暗条件。例如：野 生AtPPO1转移的菌株在含有1μM尿嘧啶类的明亮条件下可以完全抵抗生长，但黑暗条件下生长基本保持在一定程度不变。但是，在含有5μM尿嘧啶类的明亮条件和黑暗条件下都可以完全抵抗生长。由此可知，野生AtPPO1转移的菌株抵抗生长可以一定浓度的含有尿嘧啶类的介质中显现，可以检验除草剂的敏感度。野生AtPPO1转移的菌株在25μM的尿嘧啶 类中没有观察到生长抵抗现象，也无法检测除草剂抗性。

野生AtPPO1可作为除草剂敏感性PPO的参考，突变体AtPPO1可作为除草剂抗性PPO的参考，CyPPO2、CyPPO4或CyPPO8对不同PPO族都检测出了除草剂抗性。

图4显示在使用不同浓度的嘧啶二酮类PPO除草剂、尿嘧啶类、苯嘧磺草胺和氟丙嘧 草酯和典型的N-苯基酰亚胺类PPO除草剂、丙炔氟草胺之后各自的结果。在使用尿嘧啶类 和苯嘧磺草胺处理时，突变体AtPPO1转移的菌株，CyPPO2转移的菌株和CyPPO4转移的菌株和CyPPO8转移的菌株在25μM的尿嘧啶类或苯嘧磺草胺中几乎观测不到生长抵抗现象。在用氟丙嘧草酯处理时、突变体AtPPO1转移的菌株、CyPPO2转移的菌株、CyPPO8转移的 菌株在25μM的氟丙嘧草酯中几乎观测不到生长抵抗现象。在用丙炔氟草胺处理时，CyPPO2 转移的菌株、CyPPO4转移的菌株、CyPPO8转移的菌株在25μM的丙炔氟草胺中几乎观测不 到生长抵抗现象。在用四种除草剂处理时，发现野生AtPPO1转移的菌株在0.5μM开始出 现生长抵抗现象，5uM以上时几乎不生长。

图5显示在不同浓度的二苯醚类PPO除草剂、氟磺胺草醚、氟锁草醚和乙氧氟草醚处 理后各自不同的结果。在用氟磺胺草醚处理时，突变体AtPPO1转移的菌株在25μM时观察不到生长抵抗现象。CyPPO2转移的菌株、CyPPO4转移的菌株、CyPPO8转移的菌株在400μM的氟磺胺草醚中几乎观测不到生长抵抗现象。在用氟锁草醚处理时，CyPP02转移的菌株、CyPPO4转移的菌株、CyPPO8转移的菌株在400μM的氟锁草醚中几乎观测不到生长抵抗现象。在用乙氧氟草醚处理时，CyPPO2转移的菌株、CyPPO4转移的菌株、CyPPO8转移的菌 株在400μM的乙氧氟草醚中几乎观测不到生长抵抗现象。在用四种除草剂处理时，发现野 生AtPPO1转移的菌株在0.5μM开始出现生长抵抗现象，5μM以上时几乎不生长。

图6显示在不同浓度的三唑啉酮类PPO除草剂甲磺草胺、典型的恶唑烷二酮类PPO除 草剂环戊恶草酮、典型的苯基吡唑类PPO除草剂吡草醚、典型的恶二唑类PPO除草剂恶草灵、典型的噻二唑类PPO除草剂氟噻甲草酯和其他PPO除草剂双唑草腈处理后各自不同的结果。在用甲磺草胺处理时，CyPPO2转移的菌株、CyPPO4转移的菌株、CyPPO8转移的菌 株在400μM的甲磺草胺中几乎观测不到生长抵抗现象。在用环戊恶草酮、吡草醚、恶草灵、 氟噻甲草酯和双唑草腈处理时，CyPPO2转移的菌株和CyPPO8转移的菌株在400μM的乙氧 氟草醚中几乎观测不到生长抵抗现象。在用七种除草剂处理时，发现野生AtPPO1转移的菌 株在5μM以上时几乎不生长。

图7显示在用尿嘧啶类、苯嘧磺草胺、丙炔氟草胺、氟磺胺草醚和乙氧氟草醚处理时 CyPPO12除草剂抗性的检测结果。CyPPO12转移的菌株在25μM的尿嘧啶类、苯嘧磺草胺、丙炔氟草胺、氟磺胺草醚和乙氧氟草醚处理时几乎观测不到生长抵抗现象；在400μM的氟磺胺草醚或乙氧氟草醚处理时几乎观测不到生长抵抗现象。在用乙氧氟草醚处理时，突变体AtPPO1转移的菌株在5μM是开始观测到生长抵抗现象。在25μM其他除草剂处理时几 乎观测不到生长抵抗现象。相反，野生AtPPO1转移的菌株在除了氟磺胺草醚以外的四种除 草剂当中，0.5μM是开始出现生长抵抗现象，在5μM以上时几乎不生长。在用氟磺胺草 醚处理时，野生AtPPO1转移的菌株在5μM的时候观测到了生长抵抗现象。

图8显示在用吡草醚、恶草灵、甲磺草胺、环戊恶草酮和双唑草腈处理后检测到的CyPPO12除草剂抗性的结果。突变体AtPPO1转移的菌株和CyPPO12转移的菌株25μM处理 时完全没有观测到生长抵抗现象；在400μM时，除了甲磺草胺以外的四种除草剂处理下， 完全没有观测到生长抵抗现象。相反，在用吡草醚、恶草灵、甲磺草胺或双唑草腈处理时， 野生AtPPO1转移的菌株在0.5μM是开始出现生长抵抗现象。在用双唑草腈处理时，在5μM 时检测到生长抵抗现象，在25μM几乎看不到生长抵抗现象。

实施例4.通过PPO缺失E.杆菌对CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8除草剂抗性的测试(LB液 体培养基介质)

在实施例3中，野生AtPPO1、突变体AtPPO1、CyPPO2、CyPPO4或CyPPO8基因各自转移的BT3(ΔPPO)菌株在多种含有除草剂混合琼脂培养基当中进行除草剂抗性的检测，在这个实施例中，上述菌株在含有不同除草剂的LB液体介质中观测到了除草剂抗性。

4-1.实验材料与器材准备

本发明中使用了Hirayama公司的HVE-50高压灭菌器，Hansung Instrument的HS2100A 电子秤，杰奥特公司的CB-30V无菌操作台，JSR的JSI-200CL细菌培养，Apogee公司的MQ-200光度计，赛默飞世尔公司的1210型紫外可见分光度量计。高压灭菌器在121°C条件下使用15分钟，指示计在37°C环境使用，每13.5小时为一个培养时间时光照单位为160~200μmol m^-2 s^-1 f。紫外可见分光度量计在600 nm使用。

本发明中使用的尿嘧啶类(M.W.511.87g/mol)、苯嘧磺草胺(M.W.500.85g/mol)和氟磺胺草醚(M.W.438.76g/mol)分别从Dongbu Farm Hannong Co.、Ltd、Sigma、和Sigma 公司购买。这些药品需要分别用100％丙酮配比成200mM的浓度，在-20℃下保存。本发 明中还使用LB(Luria-Bertani)介质(10g/L的胰化蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L 的氯化钠)和抗生素氯霉素(Duchefa)。

4-2.实验方法

进行各个基因转移的E.杆菌种子培养，上述单菌落在含有氯霉素的3mlLB液体培养 基培养12小时，用LB液体培养基稀释到吸收率(OD₆₀₀)为1.5。将氯霉素和500μl的种 子培养转移的E.杆菌加入到250ml的LB液体介质当中，每50培养液装入250ml-烧瓶。每 个烧瓶都用不同的浓度除草剂原种(尿嘧啶类、苯嘧磺草胺、氟磺胺草醚)处理(0、10μM、 50μM、100μM)，放在37℃、200rpm的环境中培养。每个1.5小时用分光光度仪测量吸 收率(OD₆₀₀)。要反复做三次，图表中标出了上述实验的平均值。误差条表示三次反复实验 的标准误差。

4-3.实验结果

野生AtPPO1可作为除草剂敏感性PPO的参考，突变体AtPPO1可作为除草剂抗性PPO的参考。

尿嘧啶类处理结果如图9所示。

野生AtPPO1转移的菌株在10μM的尿嘧啶类以上几乎无法生长，相反突变体AtPPO1转移的菌株在10μM的尿嘧啶类上可以生长，在50μM的尿嘧啶类以上时可以检测到上述 生长抵抗现象。CyPPO2转移的菌株和CyPPO4转移的菌株通常在100μM的尿嘧啶类时生长。

苯嘧磺草胺处理的结果如图10所示。

所有转移的菌株，抗性的出现和缺失结果都与尿嘧啶类处理的结果相似，但与用尿嘧 啶类处理相比，用苯嘧磺草胺处理时可以检测到更高的抗性。野生AtPPO1转移的菌株在10μM的苯嘧磺草胺时几乎无法生长，但突变体AtPPO1转移的菌株、CyPPO2转移的菌株、CyPPO4转移的菌株、CyPPO8转移的菌株通常在100μM正常生长。

氟磺胺草醚处理结果如图11所示。

野生AtPPO1转移的菌株在50μM开始检测到生长抵抗现象，但是突变体AtPPO1转移的菌株、CyPPO2转移的菌株、CyPPO4转移的菌株和CyPPO8转移的菌株通常在100μM正常 生长。

实验5.CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8在植物上的表达

本实验目的在于，通过实验3和4当中被证实的对PPO除草剂的抗性，找出CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8在植物上的表达，实验中通过荧光蛋白(黄色荧光蛋白，YFP)来验证PPO 蛋白的表达。

5-1.实验方法

准备土壤杆菌属感受态细胞，将土壤杆菌属杆菌GV3101菌株(韩国生命科学研究院) 放在5ml的LB介质中，在30℃，200rpm的环境培养12小时。将此培养液体培养基加 入到200ml的LB介质中，在30℃，200rpm的环境培养3～4小时；3000g、4℃环境 中进行20分钟的离心分离。用无菌蒸馏水洗涤原颗粒，在20ml LB介质中重悬。将上述溶 液按照200μL分量后在液氮急冻，在深度冷冻器保管。

准备野生AtPPO1、CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8基因的各个克隆的载体，在含有CaMV35S 启动子、YFP和NOS端的载体用XbaI和XhoI限制性内切酶进行处理。在PCR放大的转运肽基因(SEQ ID NO：26)上用XbaI和XhoI限制性内切酶进行处理。将上述载体和转运肽基因捆绑到一起后，将转运肽插入到参与转移叶绿体到载体。XhoI和BamHI限制性内切酶用来消化各个PPO基因(野生AtPPO1、CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8基因s)和载体，在他们捆 绑到一起后，将各个PPO基因插入到载体。结果显示，转运肽被连接在PPO基因的5’- 末端，YFP基因被链接在他的3’-末端。最终载体的原理图如图12所示。

下面，进行土壤杆菌介质转化，需要将土壤杆菌属感受态细胞在冰上解冻，将插入各 个PPO基因的载体与3～5μL的细胞混合，在液氮中急冻2～3分钟。将细胞在37℃环境中解冻5分钟，加入1ml的LB介质，在30℃环境中培养2小时。每个培养的结果都放置 在LB/大观霉素介质中，在30℃环境中培养2天。

嫁接烟叶与土壤杆菌属，将各个PPO插入载体转移的土壤杆菌属单菌落放置在LB/大 观霉素介质中，在30℃、200rpm的环境中培养12个小时，在7000rpm离心分离2分钟。 将获得的原颗粒分别在10mM的MgCl₂重悬。在吸收率(OD₆₀₀)调节到0.5后，加入200μM 乙酰丁香酮后保存在室温环境2小时。用1ml注射器将土壤杆菌属浸润到正常生长的烟叶 上培养2-5天。

从烟叶中分离原生质体，需要按照表3或5中所列化合物配制酶浓缩溶液。

[表3]

上述溶液的调节到5.8后，用0.22μm-气孔来进行灭菌过滤。

[表4]

[表5]

组成	容量
		甘露醇	1g
200mM MES(pH 5.7)	150μL
		戊聚糖复合酶	100μL
纤维素酶	50μL
		果胶EX	50μL
1M氯化钙(CaCl<sub>2</sub>)	70μL
		双蒸馏水	直到10ml

将烟叶用剃须刀片切成条状，将烟叶条放在准备好的酶浓缩溶液中用锡箔纸覆盖，在 常温环境中按照40-50rpm搅拌3-5小时。这里使用显微镜(卡尔·蔡司Observer Z1)和生 物材料相关分析系统(蔡司LSM710)通过DIC、YFP和罗丹明这三种过滤器检测原生质体细 胞。图像通过图像工具来获取后，使用ZEN lite 2012(卡尔·蔡司)程序来处理。

用CyPPO2、CyPPO4或CyPPO8蛋白质表达的荧光蛋白(YFP)通过蛋白质印迹来检测。将样品冷冻保存在液氮中，用微研磨棒磨碎。加入IP缓冲剂[50mM Tris-Cl(pH7.5)、75mMNaCl、5mM EDTA、1％Triton X-100、1 mM DTT、1x蛋白酶抵抗剂](最多40μL)并漩涡， 放在冰上10分钟或更长时间。在4℃环境离心分离10分钟后，将上清液导入到一个新 的1.5ml试管中。在上述溶液中加入蛋白质荷载染料，在100℃沸腾5分钟后，放在冰 上。在离心分离后使用它的上清液。电泳时将蛋白质提取液加载在7.5％SDS-PAGE凝胶上， 浓缩胶在100V，分离凝胶在150V分离出蛋白质。电泳后的蛋白质将被转移到PVDF(聚 偏二氟乙烯)膜上，用成块缓冲剂(4％脱脂奶粉、10mM磷酸钠、0.15M氯化钠l、0.05％ 吐温-20、pH7.5)结块化1小时。加入绿色荧光蛋(anti-GFP)抗生素(HRP-conjugated) (SantaCruz)的1/2000稀释物，在常温下反应2小时。抗生素反应后，将膜用PBS-T(磷 酸缓冲盐水吐温)缓冲剂冲洗10分钟三次，喷洒500μL的ECL(电致化学发光)溶液(缓冲 剂合成物或供应商：Bio-Rad)后放置1分钟。膜就会被OHP胶片所覆盖，在X-ray下胶片 显影，洗印胶片。

5-2.实验结果

各个野生AtPPO1、CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8基因转移到植物后检测表达结果如图13 所示。各个植物转移的PPO基因当中观察到了土壤杆菌属菌落的形成。没有观察到标定标 叶绿素的负控制YFP蛋白质，但观察到他在细胞质和细胞核的表达。观测到PPO蛋白和叶绿素自身荧光融合的图像，发现他们荧光信号相互重叠，为定标叶绿体，受连接在N-端的cTP(叶绿体转运肽)的影响定标在叶绿体上。

实施例6.准备植物转移载体和转移体

进行植物转移选择，需准备和使用BAR基因(草铵膦抵抗基因)合并后的ORF和各个CyPPO2、CyPPO4或CyPPO8基因的ORF的二元载体。BAR基因用来检测PPO类除草剂各自不 同的作用机理下，除草剂的交叉处理效果。这个基因同样用来检测下一代是否可以稳定继 承相关特性。表达BAR基因，需要使用NOS启动子，E9端用来终止转录。同时，向植物表 达转移CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8，需要使用CaMV35S启动子；蛋白质移动定标叶绿体， 通过XbaI和XhoI限制性内切酶插入到AtPPO1基因转运肽(TP)区。未确认表达蛋白质，需 要通过BamHI和SacI限制性内切酶将血球凝集素(HA)标记插到3’-末端。将转运肽区插 入载体用SEQ IDNO：27来表示，插入HA标记序列用SEQ ID NO：28表示。将CyPPO2和 CyPPO8基因插入到转运肽和HA标记之间要通过XhoI和BamHI限制性内切酶，将NOS端插 入到HA标记后引导PPO基因终止转录。植物转移二元载体结构的原理图如图14所示。

准备植物转移体过程如下：首先，在抗生素介质中选择转移的土壤杆菌属，在液体介质中培养菌落。获得土壤杆菌属细胞，在含有5％蔗糖和0.05％有机硅超级展扩剂L-77的溶液中悬浮沉淀。吸收率(OD₆₀₀)调节到0.8，将生长5～6周的拟南芥花器放入土壤杆菌属容液。为保持湿度用塑料袋将花盆盖住，放置在阴暗处一天。让土壤杆菌属嫁接的拟南芥再生长1-2个月，培养出种子收获种子。从转移植物收获的种子由转移和非转移种子掺杂在一起，需要从这些种子当中将转移的种子筛选出来。

在准备载体来选择转移体(转移体选择通过草铵膦)过程中，用来插入选择转移个体的 BAR基因，移植到土壤中生长，来获得T1植物。

检测移植植物T1植物对PPO类除草剂的抗性，植物需要在生长3-4周，在花柄伸长之 前施以除草剂。当在每株植物用2-3ml的1μM尿嘧啶类(+0.05％有机硅超级展扩剂L-77)发现拟南芥生态型Col-0被杀死。需要在每株植物上均匀施以固定的是当量的1μM尿嘧啶类。7天后，检测出PPO类除草剂转移体抗体。那些显示出抗性植物生存下来并且继续生 长，然后收获它们的种子(T2种子)，将T2种子放在1/2 MS介质培养一个星期，移植到土 壤中获得T2植物。

实施例7.发芽测试

为监测在1μM尿嘧啶类处理后存活下来的T2代种子的尿嘧啶类抗性，在CyPPO2和CyPPO8转移体中，将拟南芥种子播种在含有70nM尿嘧啶类的1/2MS介质(1.125g/L的 MS盐、10g/L的蔗糖、7g/L的琼脂)中。野生拟南芥(Col-0；哥伦比亚型-0生态型)在含有 50nM尿嘧啶类的1/2MS介质中发现种子发芽减少，在含有70nM尿嘧啶类的1/2MS介质 中发现Col-0没有正常种子发芽全部死亡。因此，在70nM尿嘧啶类存活意味着该植物拥有 尿嘧啶类抗性。

正如图5中的结果显示，在含有70nM尿嘧啶类的1/2 MS介质中CyPPO2转移体T2代编号为1和49行发芽，CyPPO8转移体T2代编号为6、16和40发芽。野生拟南芥(Col-0) 种子作为负控制比较组在含有70nM尿嘧啶类的1/2MS介质中没有发芽。AtPPO1转移体突 变体作为正控制比较组在含有70nM尿嘧啶类的1/2MS介质中发芽。

实施例8.遗传检测

8-1.T2代种子分离比检测

判断转移的拟南芥的下一代中观察到除草剂抗特性是否可以遗传，需要通过每行T2种 子BAR基因抗性和敏感性分离比来判断。

在10行CyPPO2转移体当中编号为10、20、38和40的分离比接近3∶1，显示每个基 因组当中插入了单拷贝转基因，并根据孟德尔方法进行隔离和表达。剩余6行没有显示出 3∶1的分离比，可能会有双拷贝以上的基因。

在5行CyPP08转移体当中编号为6、16和40的分离比接近3∶1，显示每个基因组当中插入了单拷贝转基因，并根据孟德尔方法进行隔离和表达。剩余2行的分离比低于3∶1。

[表6]

[表7]

8-2.除草剂抗性T2代种子CyPP02和CyPPO8蛋白质表达的检测

检测CyPPO2和CyPPO8蛋白质表达是否会保留在下一代，在T2代每行萃取转移体蛋白 质进行蛋白质印迹。检测HA-标记PPO蛋白的量，从100mg拟南芥的叶中萃取蛋白质进行电泳。将蛋白质转移到PVDF膜上，用anti-HA抗生素进行蛋白质印迹。将1μM尿嘧啶类 喷洒到T1代植物。存活的植物就分类为具有抗性，被杀死的植物就是敏感性的。

CyPPO2转移体，喷洒上述除草剂后，编号为8、23、30、38、40和49行检测到了PPO 蛋白，但是在敏感性行(图16)没有检测到蛋白质。CyPPO8转移体，编号为6、23、38和40具有抗性行检测到PPO蛋白，但在敏感性行(图17)没有检测到蛋白质。综上所述，CyPP02 和CyPPO8蛋白质的表达在下一代抗性行表达，提供抗性。

8-3.利用BAR基因对转基因稳定遗传的检测

通过插入转移基因，BAR插入基因组来检测转基因在下一代的稳定遗传。基因组是从 100mg CyPPO2和CyPPO8转移体叶分离出来，通过PCR来检测是否有BAR基因插入。结果显示，CyPPO2转移体和CyPPO8转移体中尿嘧啶类-抗性和敏感性行中都可以观测到BAR基因插入基因组，证明转移基因可以稳定遗传到下一代。

实施例9.转移的拟南芥的除草剂抗性检测

检测除草剂抗性特性是否会在植物的下一代保留下来，各取CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8 基因转移的T2代植物拟南芥进行除草剂抗性实验。将2～3ml的0.5μM尿嘧啶类、1μM苯嘧磺草胺或3μM氟磺胺草醚喷洒到每株生长大概4周的拟南芥植物。喷洒7天后，野生Col-0植物死亡，但正控制比较组，AtPPO1转移体突变体和实验组，CyPPO2转移体、CyPPO4转移体和CyPPO8转移体没有损伤继续生长(图18和图19)，证明T1植物的除草剂抗性特 性可在T2代保留。

实施例10.多种不同作用机理的除草剂的交叉使用实验

在实施例6植物转移载体转移获得的包含CyPPO2或CyPPO8基因的拟南芥转移体中， PPO活性抵抗除草剂抗性基因和草铵膦-抵抗基因同时被表达。因此，对拟南芥转移体用两 种除草剂交叉处理进行测试，即，检测PPO活性抵抗除草剂和草铵膦同时使用时是否可以 达到控制杂草的目的。结果显示，对CyPPO2种子和BAR插入基因拟南芥转移体或CyPPO8和 BAR插入基因拟南芥转移体灭菌在4℃温度中处理2天。将种子分别播种在1/2MS介质 (Duchefa)、含有70nM尿嘧啶类的1/2MS介质、含有50uM草铵膦的1/2MS介质、含有70nM尿嘧啶类和50uM草铵膦的1/2MS介质，在23℃环境中生长，在明亮条件16小时/8小时 黑暗条件生长7～14天。除草剂媒介中的拟南芥各自为CyPPO2或CyPPO8转移种子和野生 Col0控制组。转移体和控制组在除草剂媒介中培养。2周后进行了检查。结果显示，在加 入草铵膦的介质、加入尿嘧啶类的介质或加入草铵膦和尿嘧啶类的介质中CyPPO2和CyPPO8 都观测到可以正常生长，但是控制组ColO未发芽(参考图20)。

综上所述，本发明中PPO除草剂抗性基因和BAR基因的二元载体重组之后获转移植物， 对这些GM植物用不同作用机理的除草剂进行交叉或双重处理后，不需要的植物就可以得到 控制。

在这个实施例中，与CyPPO基因重组的BAR基因仅为抗性基因，在本发明中使用的基 因类型没有限制。根据行业中熟知的推理原则，可以得出这样的结论，当抗性基因满足目 的需要，推荐采用CyPPO 2、4、8或12二元载体，当除草剂对各个基因在交叉处理时也具有抗性，可获得需要的抗性。

实施例11.多种PPO除草剂交叉使用实验

在实施例9当中，已经证明本发明中拟南芥转移体对两种PPO类除草剂，尿嘧啶类和 苯嘧磺草胺同时具有抗性。本实施例是为检测用尿嘧啶类和苯嘧磺草胺对拟南芥转移体进 行交叉处理是否可以有效控制杂草。最终发现，CyPPO2或CyPPO8基因插入拟南芥转移体 的种子灭菌在4℃环境中处理2天。将种子分别播种在1/2MS介质、含有70nM尿嘧啶类 1/2MS介质、含有70nM苯嘧磺草胺的1/2MS介质、或含有35nM尿嘧啶类和35nM苯嘧磺草 胺的1/2MS介质中，在23℃环境中，在明亮条件16小时/8小时黑暗条件生长7～14天。 除草剂媒介中的拟南芥分别为CyPPO2或CyPPO8-转移种子和野生ColO控制组。将转移体 和控制组在除草剂媒介中培养。2周后进行检测。结果显示，加入尿嘧啶类介质、加入苯 嘧磺草胺介质或加入尿嘧啶类和苯嘧磺草胺介质中，CyPPO2和CyPPO8可以正常生长，但 控制组ColO未发芽(参考图21)。

综上所述，本发明中通过PPO除草剂抗性基因的GM植物，用多种PPO类除草剂交叉或 双重处理，或用一种PPO类除草剂单独处理，不需要的植物都可以得到控制。

实施例12.根据CvPPO2、CvPPO4和CvPPO8氨其酸序列同源性检验除草剂抗性

检测保留除草剂抗性的CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8氨基酸序列同源性范围，CyPPO2、CyPPO4或CyPPO8蛋白质的部分氨基酸序列用部分NtPPO(烟草的衍生PPO基因)氨基酸序列来代替。CyPPO2变异的结果氨基酸序列用SEQ ID NO：12来表示，它的核苷酸序列用SEQ IDNO：13来表示。CyPPO2变异氨基酸序列和核苷酸序列与CyPPO2分别显示出98％的序列同 源性。CyPPO4变异氨基酸序列用SEQ ID NO：14来表示，它的核苷酸序列用SEQ ID NO：15 来表示。CyPPO4变异氨基酸序列和核苷酸序列与CyPPO4分别显示出98％的序列同源性。 CyPPO8变异氨基酸序列用SEQ ID NO：16来表示，它的核苷酸序列用SEQ ID NO：17来表 示。CyPPO8变异氨基酸序列和核苷酸序列与CyPPO8分别显示出98％的序列同源性。.

通过PPO缺失BT3 E.杆菌[BT3(ΔPPO)]检测到CyPPO2氨基酸序列变异，CyPPO4氨基 酸序列变异和CyPPO氨基酸序列变异的除草剂抗性，具体实验方法与实施例3相同。采用与实施例3相同的方法，拟南芥野生PPO(野生AtPPO1)作为负控制的除草剂敏感性对照组。作为正控制对照组突变体AtPPOI，即从野生氨基酸序列中氨基酸置换的Y426M和S305L作为除草剂抗性的对照组。

12-1.实验材料与器材准备

本发明中使用高压灭菌器在121℃条件进行15分钟，细菌培养器在37℃环境下在光照度为169μmol m^-2 s^-1的环境中进行培养，时间为14～16小时。在600nm使用紫外可 见分光度量计。在94℃条件下进行PCR时间为4分钟，25个循环(在94℃进行30秒， 56～60℃进行30秒，在72℃进行3分钟)，在72℃进行5分钟，在4℃进行5分钟。 实验中使用的除草剂根据下列表8准备。各种除草剂都需要在DMSO按照200mM的密度，并 且保存在-20℃的环境中。在使用前，要稀释除草剂加入到LB液体培养基介质(含有34 mg/ml的氯霉素)中。

[表8]

12-2.实验方法

将嫁接的标准细胞放入3ml含有氯霉素的LB液体介质，在37℃，200rpm环境培养5小时。培养细胞密度设定在600nm，将转移体用LB液体介质稀释到吸收率(OD₆₀₀)/ml (OD₆₀₀＝0.5)。向LB液体介质按照1％的密度加入琼脂，进行高压灭菌器。加入氯霉素(34 μg/ml)和除草剂之后混合。稀释细胞分别达到10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5不同的密 度。每10μl的细胞滴入1％琼脂、LB固体介质，放在37℃环境的细菌培养器内培养14～16 小时(光照条件：169μmol m^-2 s^-1)。

pACBB-CyPPO2、pACBB-CyPPO4和pACBB-CyPPO8作为模版来作为引物提供置换位置(表 9)，通过PCR来准备pACBB-CyPPO2变异、pACBB-CyPPO4变异和pACBB-CyPPO8变异载体。将PCR反应混合物与1μl每一种引物混合(pACBB-CyPPO2、pACBB-CyPPO4和pACBB-CyPPO8 原液)，5μl的10X缓冲剂，1μl的dNTP混合物(每10mM)，1μl的正向引物(10μM)、 1μl of a反向引物(10μM)、35μl of DDW和1μl的Pfu-X(Solgent、2.5单位/μl) 配成的反应液50μl，在94℃的条件下进行反应4分钟后，反复25循环(在94℃进行 30秒，在56℃进行30秒，在72℃进行3分钟)，在72℃进行5分钟，最后在4℃ 进行5分钟反应然后放大。

[表9]

准备BT3(ΔPPO)感受态细胞，将BT3(ΔPPO)菌株加入到5ml的含有50μg/ml卡那霉素和血色素的LB液体培养基中，在37℃的振荡细菌培养器中保持黑暗条件培养12小时。 将5ml的培养也加入100ml含有20μg/ml血色素的LB液体培养基当中，在37℃振荡 细菌培养器，黑暗条件中培养直到OD₆₀₀达到0.5。使用CaCl₂根据使用方法从培养的E.杆 菌中获得感受态细胞的方法准备BT3(ΔPPO)感受态细胞。从BT3(ΔPPO)菌株获得含有 CyPPO2变异、CyPPO4变异和CyPPO8变异的各个载体，将5μl的载体加到100μl的 BT3(ΔPPO)感受态细胞中，将混合物均匀混合，放置在冰上反应20分钟，放置在42℃ 环境中40秒。在冰上稳定放置2分钟，将1ml的LB液体培养基加入到BT3(ΔPPO)当中， 在37℃环境中振荡培养1小时。在介质中培养的细胞根据插入的基因类型进行收集，散 布到含有氯霉素(34μg/ml)的LB固体介质上，在37℃环境下培养12小时以上。将上述 单菌落在LB液体介质中培养。根据明亮条件下的除草剂处理标准来测量生长抵抗，与在没 有除草剂的LB固体介质中培养的BT3转移的菌株相比较，用多种不同密度的除草剂对LB 固体介质中培养BT3转移的菌株进行检测。

12-3.实验结果

图22到25显示与CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8原始序列分别具有98％序列同源性的CyPPO2变异、CyPPO4变异和CyPPO8变异基因除草剂抗性检测结果。野生AtPPO1作为除草 剂敏感性参考负控制对照组。突变体AtPPO1作为除草剂抗性参考正控制对照组。如果菌株 显示出对以上抗性与菌株转移的突变体AtPPO1相同或更高，这就意味着该菌株具有除草剂抗性。

综上所述，9大家族的共13种除草剂(尿嘧啶类、苯嘧磺草胺、氟丙嘧草酯、氟磺胺草醚、氟锁草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、甲磺草胺、环戊恶草酮、吡草醚、双唑草腈、 恶草灵、氟噻甲草酯)在明亮条件下，BT3菌株转移的CyPPO2变异、CyPPO4变异和CyPPO8 变异都正常生长，它们都显示出除草剂抗性与正控制的突变体AtPPO1(生长抵抗现象在 25μM时都几乎观察不到)相比相同或更高。

因此，与CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8具有98％序列同源性的CyPPO2变异、CyPPO4变异和CyPPO8变异与CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8相比也显示出相同或更高的抗性，虽然CyPPO2、CyPPO4或CyPPO8的序列出现一些变化，但仍保持了PPO功能和对除草剂抗性的和生物学 活性。

<110> 福阿母韩农株式会社

<120> 通过原卟啉原氧化酶变体赋予或增强植物和／或藻类抵抗除草剂的方法

<150> KR10-2014-0181791

<151> 2014-12-16

<160> 34

<170> KopatentIn 1.71

<210> 1

<211> 486

<212> PRT

<213> Oscillatoria nigroviridis PCC 7112

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(486)

<223> CyPPO2

<400> 1

Met Glu Leu Leu Asp Thr Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Leu

1 5 10 15

Ser Leu Ala His Ala Leu His Lys Glu Ala Thr Ser Ala Ser Pro Leu

20 25 30

Lys Ile Leu Val Ala Glu Ser Gln Gly Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr

35 40 45

Thr Val Thr Ala Glu Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe

50 55 60

Ser Pro Thr Pro Glu Leu Met Lys Leu Ala Val Asp Val Gly Leu Lys

65 70 75 80

Gln Glu Leu Ile Phe Ala Asp Arg Lys Leu Pro Arg Phe Val Tyr Trp

85 90 95

Glu Asn Lys Leu Gln Pro Val Pro Met Thr Pro Pro Ala Met Ile Gln

100 105 110

Ser Gln Leu Leu Ser Phe Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Phe Gly Ala

115 120 125

Leu Gly Phe Val Ala Pro Ala Met Gly Asp Arg Leu Ser Gln Gln Gly

130 135 140

Asn Glu Glu Thr Val Ser Gln Phe Phe Arg Arg His Leu Gly Thr Glu

145 150 155 160

Val Met Gln Arg Leu Val Glu Pro Phe Val Ser Gly Val Tyr Ala Gly

165 170 175

Asp Pro Gln Gln Leu Ser Ala Ala Ala Ala Phe Gly Arg Val Ala Lys

180 185 190

Met Ala Asp Val Gly Gly Gly Leu Val Ala Gly Ala Leu Leu Ser Ala

195 200 205

Lys Asn Arg Pro Lys Lys Met Pro Ala Asp Pro Asn Val Pro Lys Thr

210 215 220

Lys Pro Gly Glu Leu Gly Ser Phe Lys Gln Gly Leu Lys Ala Leu Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ile Ala Ala Lys Leu Gly Asp Arg Val Lys Leu Asn Trp His

245 250 255

Leu Thr Arg Leu Gln Arg Thr Glu Arg Glu Thr Tyr Ile Ala Glu Phe

260 265 270

Ser Thr Pro Asp Gly Gln Gln Glu Val Glu Ala Arg Thr Val Val Leu

275 280 285

Thr Thr Pro Ala Tyr Val Thr Ala Asp Leu Leu Gln Pro Leu Glu Pro

290 295 300

Gln Val Ser Ser Ala Leu Gln Ala Phe Thr Tyr Pro Thr Val Ala Ser

305 310 315 320

Val Val Leu Ala Tyr Pro Gln Ser Asp Val Lys Gly Lys Leu Val Gly

325 330 335

Phe Gly Asn Leu Ile Pro Arg Gly Gln Gly Ile Arg Cys Leu Gly Thr

340 345 350

Ile Trp Thr Ser Ser Leu Phe Pro Asp Arg Ala Pro Ala Gly Trp Gln

355 360 365

Thr Leu Thr Ser Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asp Ser Glu Ile Gly Asn

370 375 380

Leu Asp Ser Glu Gln Ile Val Arg Glu Val His Arg Asp Leu Ser Arg

385 390 395 400

Ile Leu Leu Lys Pro Asp Val Pro Gln Pro Lys Val Leu Thr Val Lys

405 410 415

Leu Trp Lys Arg Ala Ile Pro Gln Tyr Asn Leu Gly His Phe Asp Arg

420 425 430

Leu Gln Gln Ile Asp Glu Gly Leu Lys Ser Leu Pro Gly Val Tyr Leu

435 440 445

Cys Ser Asn Tyr Val Gly Gly Val Ala Leu Gly Asp Cys Val Arg Arg

450 455 460

Gly Phe Asp Arg Ala Arg Glu Val Gly Glu Tyr Leu Gln Lys Lys Gln

465 470 475 480

Ser Asp Thr Arg Ser Ile

485

<210> 2

<211> 1461

<212> DNA

<213> Oscillatoria nigroviridis PCC 7112

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1461)

<223> CyPPO2

<400> 2

atggaactat tagatacctt gattgtgggt gcgggtatta gcggtttgag tttggcgcac 60

gcacttcaca aggaagcaac gagtgcatcg ccgctgaaga ttttagtcgc tgagagtcag 120

ggacgtgtgg gcgggaacat cacgactgtg acagcagagg ggtttctctg ggaggagggc 180

ccgaacagtt tttcgccgac gccggaattg atgaagttgg ctgtggatgt gggattgaag 240

caggagttga tttttgccga tcgcaaattg cctcgttttg tgtattggga aaataagctg 300

caaccggtgc cgatgactcc accggcgatg attcagtctc agttgctgag ttttccgggg 360

aaactgcggg cgttgttcgg ggctttgggg tttgtcgcgc cggcaatggg cgatcgactt 420

tcgcagcagg gtaacgagga aacagtttct caatttttcc gccgtcatct cggtacggaa 480

gtgatgcagc ggttggtgga accttttgtt tctggggttt atgccggcga tccgcaacaa 540

cttagcgcgg cggcggcttt tggccgggta gccaagatgg ctgatgtggg tggcgggctg 600

gtggcggggg cgctgctttc tgctaaaaac agaccgaaga aaatgcctgc agacccgaat 660

gttcctaaaa ctaagccggg ggagttgggt tcgttcaagc aggggttgaa ggctttgcca 720

gaggcgatcg ctgctaagtt gggcgatcga gtgaaactca actggcactt gactcgcctc 780

cagcgcacag aacgcgaaac ttacattgct gaattctcga cgcccgacgg acagcaggaa 840

gttgaggcgc gcaccgtggt tttgacaacg cccgcttacg ttacagccga tttgttgcaa 900

cctctggaac cgcaagttag cagcgcttta caagctttta cttatcctac ggttgcctcc 960

gttgtcttag catacccgca gtcggatgtc aagggtaaat tagtgggttt tggaaattta 1020

attccgaggg ggcagggaat tcgctgtctc gggacgattt ggacatcgag tttatttccc 1080

gatcgcgcgc ctgcagggtg gcaaactctc accagttaca tcggcggggc aacagactcg 1140

gaaattggca atctcgactc agaacaaatc gttcgggagg tacaccgaga tttgtctcgg 1200

attttgctga aaccagatgt gccacagcca aaagttttaa cggtgaagct gtggaaacgg 1260

gcgattcctc agtacaattt ggggcatttc gatcgcctgc aacaaatcga tgagggctta 1320

aaatctttgc ctggagtgta tttgtgcagc aactacgttg gcggagtggc tttgggagat 1380

tgcgtgcgaa ggggtttcga tcgtgcgcga gaagtgggcg agtatttgca gaagaaacaa 1440

tcagatactc gatcgatctg a 1461

<210> 3

<211> 479

<212> PRT

<213> Lyngbya sp. PCC 8106

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(479)

<223> CyPPO4

<400> 3

Met Thr His Val Leu Asp Ser Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly

1 5 10 15

Leu Ala Leu Ala His Ala Leu His Gln Asn Gln Asp His Gln Leu Pro

20 25 30

Leu Asn Ile Leu Val Ser Glu His Gln Gly Arg Val Gly Gly Asn Ile

35 40 45

Thr Thr Val Ser Glu Gly Glu Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser

50 55 60

Phe Ser Pro Thr Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ala Val Glu Val Gly Leu

65 70 75 80

Lys Pro Glu Leu Val Phe Ala Asp Arg Lys Leu Pro Arg Tyr Val Tyr

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Trp Asn Gly Gln Leu Met Pro Val Pro Met Ser Pro Pro Ala Leu Leu

100 105 110

Ser Thr Lys Leu Leu Ser Pro Gly Gly Lys Leu Arg Ala Leu Thr Gly

115 120 125

Ala Leu Gly Phe Val Gln Pro Ala Met Gly Glu Ser Leu Ser Gln Gln

130 135 140

Asn Gly Glu Glu Thr Ile Ser Gln Phe Phe Glu Arg His Leu Gly Ser

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Glu Val Leu Lys Arg Leu Val Glu Pro Phe Val Ser Gly Val Tyr Ala

165 170 175

Gly Asp Pro Gln Gln Leu Glu Ile Ser Ser Ala Phe Ala Arg Val Ala

180 185 190

Arg Met Ala Tyr Ser Gly Gly Gly Leu Val Ala Gly Ala Val Leu Ser

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Gln Thr Lys Arg Gly Glu Leu Gly Ser Phe Arg Gln Gly Ile Gly Ala

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Leu Pro Asn Ala Ile Ala Lys Gln Leu Gly Asp Gln Leu Lys Leu Asn

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Trp Gln Leu Thr Arg Leu Glu Arg Thr Glu Asn Gln Thr Tyr Arg Ala

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Glu Phe Ser Thr Pro Glu Gly Val Gln Gln Val Glu Thr Arg Thr Val

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Val Leu Thr Thr Pro Ala Tyr Val Thr Ala Glu Ile Leu Lys Pro Leu

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Gln Leu Gln Val Ser Gln Thr Leu Thr Glu Ile Pro Tyr Pro Pro Val

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Gly Thr Ile Trp Thr Ser Ser Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Gln Gly

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Trp Gln Val Leu Thr Ser Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asp Pro Glu Ile

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Gly Glu Leu Glu Asp Asp Gln Ile Val Glu Ala Val His Gln Asp Leu

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Arg His Ile Leu Leu Lys Glu Asp Ile Ser Pro Lys Val Leu Ala Val

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<212> DNA

<213> Lyngbya sp. PCC 8106

<220>

<221> gene

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ggtaaacttc gagcattaac gggggcattg gggtttgtac aacccgcgat gggagaatcg 420

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gaagttctca agcgactggt tgaacccttt gtttctggtg tttatgcagg cgatccccag 540

caactcgaaa ttagctcggc ttttgcccga gtcgcacgta tggcttacag tggcggtgga 600

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ttacccaatg cgatcgccaa acagttaggc gatcaactca aattaaactg gcaactcacc 780

cgtctcgaac ggactgaaaa ccaaacctat cgggctgaat tttcgactcc agaaggggtt 840

caacaggtag aaactcgaac ggtggtgttg acgactccgg cctatgtcac agcagaaatt 900

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gcttgcgtcg ttttagccta tcccgtttca gctttaaagc agaaattaac cggatttggc 1020

aatttagttc cccgaggaca agggattcgg acgttaggca cgatttggac atcgagttta 1080

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gatccagaaa ttggagagtt agaagatgat caaattgttg aggcggttca tcaagatttg 1200

cgtcacattt tactcaaaga agatatctct cccaaagtgc tagccgtgca tctgtggaaa 1260

cgtgctatcc ctcaatacaa tctcggacac caacaacggt tacaacacgt taatgagggt 1320

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gattgtgtgc gtcgttctat cggacaagct aacgaaattc tcagtttttt gggtcaatag 1440

1440

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<211> 466

<212> PRT

<213> Halothece sp. PCC 7418

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<213> Halothece sp. PCC 7418

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<221> gene

<222> (1)..(1401)

<223> CyPPO8

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<220>

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<213> Microcoleus vaginatus

<220>

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acttatccta cggttgcctc cgttgtctta gcatacccgc agtcggatgt caagggtaaa 960

ttagtgggtt ttggaaattt aattccgagg gggcagggaa ttcgctgtct cgggacgatt 1020

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atcggcgggg caacagactc ggaaattggc aatctcgact cagaacaaat cgttcgggag 1140

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165 170 175

Arg Val Ala Arg Met Ala Tyr Ser Gly Gly Gly Leu Val Ala Gly Ala

180 185 190

Val Leu Ser Arg Arg Gln Asn Lys Ser Pro Arg Ser Pro Ala Asp Pro

195 200 205

Ser Ile Pro Gln Thr Lys Arg Gly Glu Leu Gly Ser Phe Arg Gln Gly

210 215 220

Ile Gly Ala Leu Pro Asn Ala Ile Ala Lys Gln Leu Gly Asp Gln Leu

225 230 235 240

Lys Leu Asn Trp Gln Leu Thr Arg Leu Glu Arg Thr Glu Asn Gln Thr

245 250 255

Tyr Arg Ala Glu Phe Ser Thr Pro Glu Gly Val Gln Gln Val Glu Thr

260 265 270

Arg Thr Val Val Leu Thr Thr Pro Ala Tyr Val Thr Ala Glu Ile Leu

275 280 285

Lys Pro Leu Gln Leu Gln Val Ser Gln Thr Leu Thr Glu Ile Pro Tyr

290 295 300

Pro Pro Val Ala Cys Val Val Leu Ala Tyr Pro Val Ser Ala Leu Lys

305 310 315 320

Gln Lys Leu Thr Gly Phe Gly Asn Leu Val Pro Arg Gly Gln Gly Ile

325 330 335

Arg Thr Leu Gly Thr Ile Trp Thr Ser Ser Leu Phe Pro Gly Arg Ala

340 345 350

Pro Gln Gly Trp Gln Val Leu Thr Ser Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asp

355 360 365

Pro Glu Ile Gly Glu Leu Glu Asp Asp Gln Ile Val Glu Ala Val His

370 375 380

Gln Asp Leu Arg His Ile Leu Leu Lys Glu Asp Ile Ser Pro Lys Val

385 390 395 400

Leu Ala Val His Leu Trp Lys Arg Ala Ile Pro Gln Tyr Asn Leu Gly

405 410 415

His Gln Gln Arg Leu Gln His Val Asn Glu Gly Leu Glu Ala Met Pro

420 425 430

Gly Leu Tyr Leu Cys Ser Asn Tyr Ile Asp Gly Val Ala Leu Gly Asp

435 440 445

Cys Val Arg Arg Ser Ile Gly Gln Ala Asn Glu Ile Leu Ser Phe Leu

450 455 460

Gly Gln

465

<210> 15

<211> 1401

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CyPPO4 mutant

<400> 15

atgactcacg tactcgatag tttaatcgtc ggtgcaggca ttagcggcct ggcgttagct 60

catgctctcc atcagaacca agatcatcaa ttgcctctca acattcttgt cagcgagcat 120

caaggacggg taggaggaaa tataaccaca gtatccgaag gagaatttct ttgggaagaa 180

ggccccaata gtttttctcc aacccctgag ttactgaagt tagcggtaga agtaggtctt 240

aagcctgagc tagtctttgc cgatcgcaag ttacctcggt acgtttactg gaatggtcaa 300

ctcatgcctt taagtcctgg aggtaaactt cgagcattaa cgggggcatt ggggtttgta 360

caacccgcga tgggagaatc gttaagtcaa caaaatgggg aagaaacgat ctcgcagttt 420

tttgagcgtc atttgggttc agaagttctc aagcgactgg ttgaaccctt tgtttctggt 480

gtttatgcag gcgatcccca gcaactcgaa attagctcgg cttttgcccg agtcgcacgt 540

atggcttaca gtggcggtgg attggttgct ggagcggttt tatcgcgtcg tcagaacaaa 600

tctccgcgat cgcctgccga cccgtctatt ccccaaacta aacggggaga gttggggtct 660

tttcgtcagg ggattggagc cttacccaat gcgatcgcca aacagttagg cgatcaactc 720

aaattaaact ggcaactcac ccgtctcgaa cggactgaaa accaaaccta tcgggctgaa 780

ttttcgactc cagaaggggt tcaacaggta gaaactcgaa cggtggtgtt gacgactccg 840

gcctatgtca cagcagaaat tctcaaaccg ttgcaactcc aagtcagtca aacgttaact 900

gaaattccct atcccccggt ggcttgcgtc gttttagcct atcccgtttc agctttaaag 960

cagaaattaa ccggatttgg caatttagtt ccccgaggac aagggattcg gacgttaggc 1020

acgatttgga catcgagttt atttcctggt cgcgcccccc aaggctggca agtcctcacc 1080

agttatattg gcggagcgac ggatccagaa attggagagt tagaagatga tcaaattgtt 1140

gaggcggttc atcaagattt gcgtcacatt ttactcaaag aagatatctc tcccaaagtg 1200

ctagccgtgc atctgtggaa acgtgctatc cctcaataca atctcggaca ccaacaacgg 1260

ttacaacacg ttaatgaggg tctagaggca atgccggggt tatatctgtg tagcaactat 1320

atcgacggtg tagcgttggg agattgtgtg cgtcgttcta tcggacaagc taacgaaatt 1380

ctcagttttt tgggtcaata g 1401

<210> 16

<211> 453

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CyPPO8 mutant

<400> 16

Met Ile Asp Thr Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Leu Ser Ala

1 5 10 15

Ala Tyr Arg Leu Asp Glu Lys Gln Arg Gln Val Leu Val Ala Glu Lys

20 25 30

Arg Asp Arg Ala Gly Gly Asn Ile Thr Ser Gln Gln Ser Gly Asp Phe

35 40 45

Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Ser Pro Thr Pro Glu Leu Leu

50 55 60

Lys Leu Ala Val Asp Ala Gly Leu Arg Asn Glu Leu Ile Phe Ala Asp

65 70 75 80

Arg Gly Leu Pro Arg Tyr Val Tyr Trp Glu Gly Lys Leu Arg Pro Leu

85 90 95

Ser Pro Ile Gly Lys Leu Arg Ala Leu Thr Gly Ala Leu Gly Phe Ile

100 105 110

Pro Pro Gln Val Ser Ser Gln Glu Glu Thr Val Ala Asp Phe Phe Thr

115 120 125

Arg His Leu Gly Ser Glu Val Ala Gln Arg Leu Val Ser Pro Phe Val

130 135 140

Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Val Asp Gln Leu Ser Ala Glu Ala Ala

145 150 155 160

Phe Gly Arg Val Thr Gln Leu Ala Asp Val Gly Gly Gly Leu Val Ala

165 170 175

Gly Ala Ile Leu Cys Arg Arg Gln Lys Pro Lys Ser Thr Pro Lys Thr

180 185 190

Ala Lys Pro Ser Asp Ile Pro Glu Thr Lys Ser Gly Gln Leu Gly Ser

195 200 205

Phe Lys Glu Gly Leu Gln Gln Leu Pro Ser Ala Ile Val Ser Gln Leu

210 215 220

Gly Asp Lys Val Lys Phe Gln Trp Glu Leu Lys Asn Ile Ser Pro His

225 230 235 240

Pro Glu Ser Gly Tyr Val Ala Thr Phe Ser Thr Pro Glu Gly Glu Gln

245 250 255

Thr Val Glu Ala Lys Thr Val Ile Leu Thr Thr Pro Ala Tyr Val Thr

260 265 270

Ala Ser Leu Val Lys Asp Leu Ser Pro Gln Ala Ser Gln Ala Leu Asn

275 280 285

Glu Ile Ser Tyr Pro Pro Val Ala Cys Val Val Leu Ala Tyr Pro Asp

290 295 300

Glu Ala Leu Arg Phe Pro Leu Lys Gly Phe Gly Asn Leu Asn Pro Arg

305 310 315 320

Ser Gln Gly Ile Arg Thr Leu Gly Thr Ile Trp Ser Ser Thr Leu Phe

325 330 335

Pro Gly Arg Thr Pro Lys Gly Trp His Leu Leu Thr Asn Phe Ile Gly

340 345 350

Gly Ala Thr Asp Pro Ala Ile Ala Glu Leu Ser Glu Asp Gln Ile Ile

355 360 365

Glu Gln Val His Gln Asp Leu Gln Gln Ala Val Ile Lys Ser Gly Ser

370 375 380

Ile Pro Lys Pro Leu Ala Val His Leu Trp Ser Lys Ala Ile Pro Gln

385 390 395 400

Tyr Asn Leu Gly His Leu Lys Arg Leu Glu Thr Ile Arg Asn His Leu

405 410 415

Lys Pro Phe Ser Gly Leu Phe Leu Ser Ser Asn Tyr Leu Asp Gly Val

420 425 430

Ala Leu Gly Asp Cys Val Arg Arg Gly Glu Glu Ser Ser Gln Ala Val

435 440 445

Leu Asp Tyr Leu Gly

450

<210> 17

<211> 1362

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CyPPO8 mutant

<400> 17

atgatagata ctttaattgt gggagcaggg attagtggtt taagtgctgc gtatcgactc 60

gatgagaagc agcgccaagt gctggttgca gaaaagcgcg atcgcgctgg gggaaatatc 120

accagccaac aaagtggcga tttcctctgg gaagaaggac cgaacagttt ttctcccaca 180

ccagaactcc taaaactagc ggttgatgcg ggcttaagaa atgagttaat ctttgctgat 240

cgcggacttc cccgttatgt ttattgggag gggaaactgc gccctctgag tccaatcggg 300

aaactacggg cgttaacggg tgcattaggc tttattcccc cgcaagtgtc gagtcaggaa 360

gaaacggttg cggacttttt tacccgtcat ctcggttcag aagtagccca acggttagtg 420

agtccgtttg tgtctggggt ttatgcaggg gatgtggatc aactcagtgc ggaagctgca 480

tttggacgag ttacccaact ggcggatgtg ggcggtggac tggtcgcagg tgcgatttta 540

tgtcgtcgtc aaaagccaaa gtcaacccca aaaacggcta aaccgtctga tattccagaa 600

acaaagtctg gacagttagg ttcatttaag gaaggattac aacaattacc cagcgcgatc 660

gtttctcaac tgggagacaa agtaaagttt caatgggaac tgaaaaatat ctcccctcat 720

ccagaatcgg gttacgtcgc gacattttcc acaccagagg gagaacaaac agtcgaagcc 780

aaaaccgtta tcctcaccac tcccgcctac gttaccgcct ctctggtcaa agatttatca 840

cctcaagcca gtcaagcctt aaacgaaatt tcctatcccc ccgtagcttg tgtggtctta 900

gcctatcccg atgaagccct ccgttttccc ctcaaaggat ttggtaatct taaccctcgc 960

agtcaaggaa tccgcactct tggtacaatt tggagttcaa cactctttcc aggacgcacg 1020

ccgaaaggtt ggcatctctt aaccaatttt attggcggtg caactgatcc cgcaattgct 1080

gaactcagtg aagatcaaat tattgaacaa gtccatcaag acttacaaca agcggtgatt 1140

aaatcgggaa gtatcccgaa acccttagcc gttcatttgt ggtcaaaagc gattccgcaa 1200

tacaatctcg gacatctgaa acggttagaa accatccgca atcacttaaa acccttctct 1260

ggactctttt tatcgagtaa ctatctcgat ggcgttgcgt tgggtgattg tgtgcgccga 1320

ggggaagaga gtagtcaagc cgtgttagat tatttgggtt aa 1362

<210> 18

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCC7112_BmHIF primer

<400> 18

ccccggatcc atggaactat tagatacctt gattgtggg 39

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCC7112_StuIR primer

<400> 19

cccaggcctg atcgatcgag tatctgattg 30

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCC7418_BmHIF primer

<400> 20

ccccggatcc atgatagata ctttaattgt ggg 33

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCC7418_XhoIR primer

<400> 21

ccccctcgag acccaaataa tctaacacgg 30

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCC8106_BglIIF primer

<400> 22

ccccagatct atgactcacg tactcgatag 30

<210> 23

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCC8106_XhoIR primer

<400> 23

ccccctcgag ttgacccaaa aaactgagaa tttc 34

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CyPPO12_BamHIF primer

<400> 24

ccccggatcc atggaactct tggatactct 30

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CyPPO12_XhoIR primer

<400> 25

ccccctcgag gattgacctg gtatcagatt 30

<210> 26

<211> 212

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cTP (chloroplast transit peptide) PCR product

<400> 26

tctagaatgg agttatctct tctccgtccg acgactcaat cgcttcttcc gtcgttttcg 60

aagcccaatc tccgattaaa tgtttataag cctcttagac tccgttgttc agtggccggt 120

ggaccaaccg tcggatcttc aaaaatcgaa ggcggaggag gcctcgaggc gcgccgggcc 180

caggcctacg cgtttaatta aacctaggat cc 212

<210> 27

<211> 156

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cTP(chloroplast transit peptide)

<400> 27

atggagttat ctcttctccg tccgacgact caatcgcttc ttccgtcgtt ttcgaagccc 60

aatctccgat taaatgttta taagcctctt agactccgtt gttcagtggc cggtggacca 120

accgtcggat cttcaaaaat cgaaggcgga ggaggc 156

<210> 28

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HA(hemaglutinin) tag

<400> 28

atgtatcctt atgatgttcc agattatgct agtcttatgt acccatacga cgtgcctgac 60

tacgcatcat tg 72

<210> 29

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CyPPO2Nt98%_F primer

<400> 29

atctgatcaa aagcaatttt ctgagttttc cggggaaac 39

<210> 30

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CyPPO2Nt98%_R primer

<400> 30

caattggatt tgaaggtaac ggttgcagct tattttcc 38

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CyPPO4-Nt-98%_F primer

<400> 31

atctgatcaa aagcaatttt ttaagtcctg gaggtaaact 40

<210> 32

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CyPPO4-Nt-98%_R primer

<400> 32

caattggatt tgaaggtaaa ggcatgagtt gaccattc 38

<210> 33

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CyPPO8_Nt98%-F primer

<400> 33

atctgatcaa aagcaatttt ctgagtccaa tcgggaaac 39

<210> 34

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CyPPO8_Nt98%-R primer

<400> 34

caattggatt tgaaggtaaa gggcgcagtt tcccctccc 39

Claims (16)

1.一种来源于Halothece sp.PCC 7418株的衍生PPO的在赋予或增强植物或藻类除草剂抗性上的应用，所述衍生PPO由SEQ ID NO:5氨基酸序列的多肽组成；

所述除草剂为原卟啉原氧化酶抑制型除草剂。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述多肽的基因由SEQ ID NO:6的核苷酸序列组成。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述多肽的基因由重组植物表达载体或重组藻类表达载体的形式组成。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述除草剂是选自嘧啶二酮、二苯醚、苯基吡唑、N-苯基酰亚胺、噻二唑、恶二唑、三唑啉酮、恶唑烷二酮及其任意组合的一个或多种。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述除草剂是选自氟丙嘧草酯、苯嘧磺草胺、双苯嘧草酮、尿嘧啶类、氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、苯草醚、氟锁草醚、治草醚、氟乳醚、乳氟禾草灵、甲氧除草醚、草枯醚、乙羧氟草醚、氟硝磺酰胺、吡草醚、异丙吡草酯、丙炔氟草胺、吲哚酮草酯、氟烯草酸、嗪草酸、噻二唑草胺、丙炔恶草酮、恶草灵、唑草酮、甲磺草胺、唑啶草酮、环戊恶草酮、双唑草腈、氟哒嗪草酯、氟唑草胺及其任意组合的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物或藻类进一步包括第二除草剂抗性多肽或编码对应肽的基因，从而对第二除草剂具有新的或增强的抗性。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述第二除草剂是选自草甘膦、草铵膦、麦草畏、2,4-二氯苯氧基乙酸、异恶唑草酮、乙酰乳酸合酶抵抗型除草剂、光合体系II抵抗型除草剂、苯脲类除草剂、溴苯腈类除草剂及其任意组合的一种或多种。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述第二除草剂抗性多肽是选自草甘膦除草剂抗性抗草甘膦5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化酶、草甘膦-N-乙酰转移酶或草甘膦脱羧酶；

草铵膦除草剂抗性草胺膦-N-乙酰转移酶；

麦草畏除草剂抗性单加氧酶；

2,4-二氯苯氧基乙酸除草剂抗性2,4-D单加氧酶或芳氧基链烷酸酯加双氧酶；

乙酰乳酸合酶抑制型磺酰脲除草剂抗性乙酰醇酸合成酶或乙酰醇酸合成酶大次单元；

光合体系II抑制型除草剂抗性光合体系II蛋白质D1；

苯脲类除草剂抗性细胞色素P450；

色素体抵抗型除草剂抗性羟基苯丙酮酸加双氧酶；

溴苯腈除草剂抗性腈水解酶及其组合中的一种或多种。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，编码第二除草剂抗性多肽的基因是选自草甘膦除草剂抗性CP4 EPSPS、MEPSPS、2MEPSPS、GOXV247、GAT4601或GAT4621基因；

草铵膦除草剂抗性BAR或PAT基因；

麦草畏除草剂抗性DMO基因；

2,4-二氯苯氧基乙酸除草剂抗性AAD-1或AAD-12基因；

异恶唑草酮除草剂抗性HPPDPF W336基因；

磺酰脲除草剂抗性ALS、Csr1、Csr1-1、Csr1-2、GM-HRA、S4-HRA、ZM-HRA、SURA或SURB；

光合体系II抑制型除草剂抗性PSBA基因；

苯脲除草剂抗性CYP76B1基因；

溴苯腈除草剂抗性BXN基因及其任意组合中的一种或多种。

11.一种制备除草剂抗性的植物或藻类的方法，所述方法包括利用权利要求1所述的应用中的多肽或权利要求2所述的应用中的基因来转化的藻类、植物细胞、原生质体、胼胝、下胚轴、种子、子叶、芽或包括经济作物的植物。

12.一种赋予或增强植物或藻类除草剂抗性的方法，所述方法包括利用权利要求1所述的应用中的多肽或权利要求2所述的应用中的基因来转化藻类、植物细胞、原生质体、胼胝、下胚轴、种子、子叶、芽或包括经济作物的植物。

13.一种控制耕种地区杂草的方法，其特征在于，包括向耕种地区提供含有权利要求1所述的应用中的多肽或权利要求2所述的应用中的基因的植物的步骤；以及将有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制型除草剂适用于耕种地区的步骤。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法中向耕种地区喷洒有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制型除草剂，是根据有效剂量依次或同时喷洒原卟啉原氧化酶抑制型除草剂的两种或两种以上组合。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法中的植物是进一步包括第二除草剂抗性多肽或编码对应肽的基因的植物，并且原卟啉原氧化酶抑制型除草剂和第二除草剂是以有效剂量依次或同时施用于耕种地区。

16.一种控制培养基中不需要的水生物种的方法，所述方法包括向所述培养基提供包含权利要求1所述的应用中的多肽或权利要求2所述的应用中的基因的藻类，并向所述培养基施用有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制型除草剂。

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