JP2019533424A - プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ変異体およびこれを用いる除草剤耐性付与および/または増進のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書で、「植物または藻類の除草剤に対する耐性付与および/または増進」または「植物または藻類の除草剤に対する耐性増進」とは、除草剤に対する耐性がない植物または藻類に対して耐性を付与すること、または除草剤に対する耐性を有している植物または藻類に対してその耐性をより向上させること、またはこれらを両方とも包括する広範囲な意味として解釈される。
配列番号1のポリペプチドとPPO活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号1のアミノ酸(例えば、配列番号1のポリペプチドのPPO活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸)からなる群より選択された1種以上がそれぞれ独立して欠失または該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと95%以上、98%以上、または99%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド変異体;
配列番号3のポリペプチドとPPO活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号3のアミノ酸(例えば、配列番号3のポリペプチドのPPO活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸)からなる群より選択された1種以上がそれぞれ独立して欠失または該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと95%以上、98%以上または99%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド変異体;
配列番号5のポリペプチドとPPO活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号5のアミノ酸(例えば、配列番号5のポリペプチドのPPO活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸)からなる群より選択された1種以上がそれぞれ独立して欠失または該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと95%以上、98%以上、または99%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド変異体;およびこれらの組み合わせ
からなる群より選択される1種以上のポリペプチド変異体が提供される。
本明細書で提供される配列番号1、3、または5のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその変異体は原核生物(例えば、藍色細菌)に由来するPPO蛋白質であって、PPO阻害除草剤に対して耐性を有する除草剤耐性PPO蛋白質である。具体的に、オシラトリアニグロ−ビリディス(Oscillatoria nigro−viridis)PCC 7112に由来したPPO蛋白質が提供され、これをCyPPO2と命名し、そのアミノ酸配列を配列番号1と、これを暗号化する遺伝子の塩基配列を配列番号2と表す。また、リングビア属(Lyngbya sp.)PCC 8106菌株に由来したPPOが提供され、これをCyPPO4と命名し、そのアミノ酸配列を配列番号3と、これを暗号化する遺伝子の塩基配列を配列番号4と表す。また、ハロテース属(Halothece sp.)PCC 7418菌株に由来したPPOが提供され、これをCyPPO8と命名し、そのアミノ酸配列を配列番号5と、これを暗号化する遺伝子の塩基配列を配列番号6と表す。本明細書で、前述のポリペプチドおよびポリペプチドの変異体は、それぞれPPO阻害除草剤に対して耐性を有する除草剤耐性PPO蛋白質または除草剤耐性PPO蛋白質変異体と表現することができる。また、本明細書に使用されたものとして、「除草剤耐性PPOまたはその変異体」は、前記除草剤耐性PPO蛋白質または除草剤耐性PPO蛋白質変異体、除草剤耐性PPO蛋白質暗号化遺伝子または除草剤耐性PPO蛋白質変異体暗号化遺伝子、またはこれら全てを意味するために使用することができる。
一例は、配列番号1のポリペプチド(CyPPO2)とPPO活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号1のアミノ酸(配列番号1のポリペプチドのPPO活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸)からなる群より選択された1種以上がそれぞれ独立して欠失または元のアミノ酸(即ち、野生型の該当位置のアミノ酸)とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと95%以上、98%以上、または99%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか前記アミノ酸配列からなるポリペプチド変異体を提供する。
前記ポリペプチド変異体(除草剤耐性PPO蛋白質変異体)は、野生型PPO蛋白質の酵素活性は維持しながら、野生型と比較して増進された除草剤耐性を示すものであってもよい。
(1)配列番号1、配列番号3、配列番号5、またはこれらと95%以上、98%以上、または99%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)前述のポリペプチド変異体、
(3)前記ポリペプチド(1)またはポリペプチド変異体(2)を暗号化するポリヌクレオチド、
(4)前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
(5)前記組換えベクターを含む組換え細胞
からなる群より選択された1種以上を含む、植物および/または藻類の除草剤に対する耐性付与および/または増進用組成物を提供する。本明細書で除草剤とは、植物または藻類を死滅させるか防除するか、または植物または藻類の生長を不利に調整する活性成分をいう。また、本願で除草剤耐性とは、正常または野生型植物または藻類を正常に死滅させるかその生長を正常に抑制させる除草剤を処理しても、正常または野生型の植物または藻類に比べて植物または藻類生長の阻害程度が弱化されるか除去され、植物または藻類の生長が持続的に行われることをいう。前記除草剤は、植物または藻類のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(PPO)を抑制する除草剤を含む。このようなPPO阻害除草剤は、化学構造によってピリミジンジオン系(pyrimidinediones)、ジフェニルエーテル系(diphenyl−ethers)、フェニルピラゾール系(phenylpyrazoles)、フェニルフタルイミド系(N−phenylphthalimides)、フェニルエステル系(phenylesters)、チアジアゾール系(thiadiazoles)、オキサジアゾール系(oxadiazoles)、トリアゾリノン系(triazolinones)、オキサゾリジンジオン系(oxazolidinediones)およびその他の除草剤を例示することができる。
オシラトリアニグロ−ビリディス(Oscillatoria nigro−viridis)PCC7112、リングビア属(Lyngbya sp.)PCC8106、ハロテース属(Halothece sp.)PCC7418菌株の分譲をパスツール研究所(フランス)から受け、各菌株からPPO遺伝子を分離した。BT3 E.coliでより効率的な除草剤抵抗性スクリーニングのために各PPO遺伝子をコドン最適化(codon optimization)して合成した(GenScript)。表1のプライマーを使用してPCRを通じてPPO遺伝子を増幅させた。
前記準備されたCyPPO2、CyPPO4、およびCyPPO8の除草剤耐性をPPO遺伝子が欠乏した大腸菌を用いて試験した。
前記準備されたCyPPO2、CyPPO4、およびCyPPO8遺伝子をpACBBベクター(Plasmid#32551;Addgene;図3参照)にクローニングした。このクローニングしたプラスミドをそれぞれBT3コンピテントセル(BT3 competent cell)100μlに入れて熱衝撃方法で形質転換した。各変異遺伝子種類別にクロラムフェニコール(Duchefa)が含まれているLB(Luria−Bertani)寒天培地で培養した。
PPO蛋白質と除草剤の結合構造情報の確認のために、PPO蛋白質の代表例としてCyPPO2を、PPO阻害除草剤の代表例としてチアフェナシルを使用して試験した。水溶性CyPPO2蛋白質の純粋分離精製および結晶化を行った後、放射光加速器を用いてCyPPO2のX線回折データを確保し、分子水準の3次元構造を糾明してCyPPO2−チアフェナシル複合体の構造を分析した。これによって除草剤耐性を付与するPPO蛋白質内アミノ酸変異位置に関する情報を収集した。
CyPPO2、CyPPO4およびCyPPO8のPPO阻害除草剤耐性を高めるためにそれぞれPPOアミノ酸配列中の前記実施例2で得られた除草剤と相互作用する位置のアミノ酸に変異を誘発した。このような変異が誘発されたPPO遺伝子を設計してPPOが欠乏したBT3大腸菌(BT3(ΔPPO))に形質転換した後、PPO阻害除草剤を処理した環境で培養して、形質転換大腸菌の生長阻害の有無を確認した。対照群として各変異遺伝子の野生型を用いた。
実施例1で合成増幅してpACBBベクター(Plasmid #32551;Addgene;図3参照)にそれぞれクローニングしたCyPPO2およびCyPPO4、pACBBベクターまたはpET303−CT−Hisベクター(VT0163;Novagen;図4参照)にクローニングしたCyPPO8を鋳型(Template)にして、下記表2〜4のプライマーを使用してPCRを通じて変異遺伝子を製作した。
試験に使用された除草剤を下記の表5に整理した:
前記得られた結果を表6〜表8および図5〜図25に示した。
除草剤耐性を増加させるためにPPO蛋白質の特定位置のアミノ酸を変異させた変異体の酵素活性を調査しPPO活性阻害除草剤による阻害試験(inhibition assay)を行った。PPO蛋白質は水溶性が低いが、MBP(maltose binding protein)と共に融合タンパク質(fusion protein)(MBP−PPO)で発現させる場合、安定的に水溶性蛋白質が発現されることを確認し、下記の野生型および変異型蛋白質をMBPとの融合蛋白質形態に発現させて本試験に使用した(図26参照)。
誘導(Induction):OD600=0.2、最終濃度0.3mM IPTG添加;
発現温度:23℃、200rpmの振盪培養;
発現時間:16hrs;
培養規模:200ml/1,000mlフラスコ(flask)。
前記培養された形質転換大腸菌に対して以下の過程で細胞破砕および蛋白質抽出を行った:
抽出バッファー:カラムバッファー(Column buffer)(50mM Tris−Cl、pH8.0、200mM NaCl)5ml buffer/g cell;
超音波処理(Sonication):SONICS&MATERIALS社 VCX130(130watts);
15 sec ON、10 sec OFF for 5 min on ice;
4℃および20分条件下で遠心分離(20,000xg);および
前記遠心分離で得られた上澄み液をカラムバッファー(column buffer)を使用して1:6比率で希釈した。
−チアフェナシル、サフルフェナシル、ホメサフェン、ブタフェナシル、フルミオキサジン、およびスルフェントラゾン各除草剤の最終濃度:0、10、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000nM
IC50値は、前記酵素活性測定過程に除草剤を前記濃度で添加してPPO酵素活性を除草剤添加前の50%に阻害する除草剤の濃度として求めた。
このように得られた除草剤別IC50を下記の表10および表11に示した。
5−1.シロイヌナズナ形質転換ベクター製作およびシロイヌナズナ形質転換体製作
シロイヌナズナ形質転換は選抜マーカであるbar遺伝子(グルホシネート耐性遺伝子)のORFとそれぞれのCyPPO2、CyPPO4、またはCyPPO8のアミノ酸変異遺伝子のORFを有するバイナリーベクター(binary vector)を製作して行った。PPO阻害除草剤と作用機序が異なる除草剤を交差使用する場合、その効果を確認するためにbar遺伝子を使用し、前記遺伝子は後代遺伝が安定的に行われているかどうかを検証することにも使用した。bar遺伝子の発現のためにNOSプロモーターと転写終結のためのE9ターミネーターを使用した。
前記製作されたCyPPO2のY373M変異体、CyPPO4のY375M変異体、またはCyPPO8のF363Mの変異体が挿入された形質転換体(それぞれCyPPO2 Y373M形質転換体、CyPPO4 Y375M形質転換体、およびCyPPO8 F363M形質転換体)の中の1μMチアフェナシルのスプレー処理下でも生存した個体のT2世代種子を用いてチアフェナシル耐性を確認した。このために、70nMチアフェナシルが含まれている1/2MS培地に前記得られたT2シロイヌナズナ種子を播種した。50nMチアフェナシルが含まれている1/2MS培地で野生型シロイヌナズナ(Col−0;Columbia−0生態型)は発芽障害が観察され遅く発芽する特性を示したが、70nM含まれている1/2MS培地でCol−0は正常発芽せずに死滅した。したがって、70nMで生存すればチアフェナシルに対する耐性を有するものと判断することができる。同時にグルホシネート(PPT)が添加された培地でシロイヌナズナ種子を播種してグルホシネート耐性を確認した。
形質転換シロイヌナズナが世代を進展しながら挿入した遺伝子の分離比を確認し同時に除草剤耐性形質を評価した。T2種子を対象にしてbar遺伝子挿入によるPPT系除草剤耐性個体と感受性個体の分離比(segregation ratio)をライン別に判断した。耐性対感受性個体の比が約3:1を示せば、メンデルの法則によってトランス遺伝子(transgene)がシロイヌナズナに単一コピー(single copy)で挿入されて分離および発現されたと判断した。
Y373M変異体の32番、34番、38番、39番ライン、Y373V変異体の34番ライン、Y373I変異体の23番、34番ライン、Y373L変異体の23番、43番ライン、Y373C変異体の40番ライン、V318M+Y373I変異体の1番、3番ライン、V173S+A175C+Y373M変異体の3番、4番、72番、84番、51番ライン、およびA175C+V318M+Y373M変異体の4番、8番ライン。
Y375M変異体の14番、31番ライン。
F363M変異体の22番、51番、52番ライン、F363V変異体の1番、18番ライン、F363L変異体の1番、33番ライン、A162L変異体の1番、5番ライン、およびA162C+V308M+F363M変異体の46番、48番ライン。
導入したCyPPO2のY373M、CyPPO4のY375MおよびCyPPO8 F363M遺伝子がシロイヌナズナ形質転換体(T2)で発現されるか判断して、世代進展時に挿入遺伝子の発現が維持されるかを確認した。形質転換体のT2世代ライン別にシロイヌナズナ形質転換体葉約100mgを液体窒素と共に摩砕した後、蛋白質抽出バッファー(0.05M Tris−Cl pH7.5、0.1M NaCl、0.01M EDTA、1% Triton X−100、1mM DTT)を添加して蛋白質を抽出した。抽出した蛋白質を用いてウェスタンブロットを行った。シロイヌナズナ形質転換ベクターに含まれているHAタグを用いてPPO蛋白質量を検出しようとした。その後、電気泳動してPVDF(polyvinylidene difluoride)膜(membrane)に転移した後、抗−HA抗体(Santa cruz)と抗−actin抗体(loading control、実験蛋白質量比較;Abcam)を用いてウェスタンブロットを行った。
CyPPO2、CyPPO4およびCyPPO8のアミノ酸変異体暗号化遺伝子の植物内除草剤耐性形質とその水準を判断するためにそれぞれの遺伝子が形質転換されたシロイヌナズナのT2世代またはT3世代植物体に対して除草剤耐性をテストした。下記の全ての除草剤処理試験は抽苔直前(移植約4週経過後)に行った。各除草剤を含む溶液100mlを40×60cm(0.24m2)面積に満遍なく処理した。
上記表16の薬害水準(Injury index)は下記の表17の基準で評価した(本明細書に提供された薬害水準(Injury index)に同一に適用される):
本試験は、シロイヌナズナ内挿入した遺伝子が世代を進展しても安定的に遺伝して発現されるか確認するためのものである。
6−1.稲形質転換ベクター製作および稲形質転換体製作
稲形質転換のための植物発現ベクターはbar遺伝子(グルホシネート耐性遺伝子)のORFとそれぞれのCyPPO2またはCyPPO8のアミノ酸変異遺伝子のORFを有するバイナリーベクター(binary vector)を製作して使用した。各遺伝子の発現のためにpCAMBIA3301ベクター(図39参照)を用いた。bar遺伝子の発現のためにCaMV 35Sプロモーターと転写終結のために35Sターミネーターを用いた。
CyPPO2とCyPPO8の変異遺伝子形質転換植物の除草剤耐性とその水準を単子葉作物内で判断するためにそれぞれの遺伝子が形質転換されたドンジン稲のT0世代植物体に対して除草剤耐性をテストした。
CyPPO2 Y373M形質転換体およびCyPPO8 F363M形質転換体で変異蛋白質(CyPPO2 Y373MまたはCyPPO8 F363M)が発現されるか確認するために各形質転換体ライン別に葉から蛋白質を抽出してウェスタンブロットを行った。
CyPPO8 F363M形質転換体で変異遺伝子の存否を確認するために各形質転換体ライン別に葉からDNAを抽出してサザンブロッティング(southern blotting)を行った。
1)脱プリン反応(depurination):0.25N HCl、15分間振盪(shaking)
2)変性(denaturation):0.5M NaOH、1.5M NaCl、30分間振盪(shaking)
3)中和(neutralization):0.5M Tris−Cl(pH7.5)、1.5M NaCl、20分間振盪(shaking)
その後、キャピラリートランスファー(capillary transfer)方法を用いてゲル内のDNA片をニトロセルロース膜(nitrocellulose membrane)(GE Healthcare)に移した後、UV crosslinker(UVC−508;ULTRA LUM Inc.)を用いて架橋結合(cross linking)を行った。
前記ニトロセルロース膜(nitrocellulose membrane)をDIG Easyハイブリダイゼーション溶液(DIG Easyhybridization solution、Roche)で42℃で3時間培養(incubation)した。その後、新たなDIG Easyハイブリダイゼーション溶液で交替した後、プローブ(probe)をいれて、42℃で12時間以上反応させた。
材料
鋳型(Template)(CyPPO8 plasmid DNA) 0.5μl
10Xバッファー 3μl
DIG−dNTP 2μl
フォワードプライマー(forward primer)(10μM) 3μl
リバースプライマー(reverse primer)(10μM) 3μl
DDW 18μl
e−taqポリメラーゼ(Solgent社) 0.5μl
総30μl
Forward primer for CyPPO8 F363M probe:GCGTTAACGGGTGCATTAGGC(配列番号158)
Reverse primer CyPPO8 F363M probe:TGGAAAGAGTGTTGAACTCC(配列番号159)
1)前記膜をブロッキングバッファー(blocking buffer、Roche)に入れて30分間振盪(shaking)
2)DIG抗体(anti−digoxigenin−AP Fab fragments、Roche)を入れて30分間振盪(shaking)
3)洗浄バッファー(Roche)で15分間振盪(shaking)
4)検出バッファー(Roche)を入れて3分間振盪(shaking)
5)CDP−Star、ready−to−use(Roche)を膜(membrane)に塗布した後、X線フィルム(x−ray film)でバンド(band)を現像。
7−1.大豆形質転換体製作
CyPPO2 Y373MおよびCyPPO8 F363M遺伝子を大豆植物体にそれぞれ発現させてチアフェナシル抵抗性を付与するための形質転換用ベクターを製作した。
CyPPO2 Y373M変異遺伝子挿入形質転換大豆T0植物体(12、14、16、24、25、27、28、34、41番ライン)およびCyPPO8 F363M変異遺伝子挿入形質転換大豆T1植物体(3、5、7、9、11、14、17、36、44番ライン)に対して挿入遺伝子数を確認するために、各植物体の葉250mgから実施例6−4を参考にしてCTAB方法でゲノムDNA(genomic DNA)を抽出した。
Forward primer for bar probe 5’−TTC CGT ACC GAG CCG CAG GA−3’(配列番号163)
reverse primer for bar probe 5’−CGT TGG GCA GCC CGA TGA CA−3’(配列番号164)
CyPPO2 Y373MとCyPPO8 F363Mがそれぞれ導入された形質転換大豆の除草剤耐性水準を判断するために、各遺伝子が形質転換されたクァンアン豆T2世代に除草剤を処理した。
大豆のCyPPO2 Y373M形質転換体およびCyPPO8 F363M形質転換体で挿入されたそれぞれの外来遺伝子が正常に発現されて蛋白質を生産するか確認した。この確認結果は挿入した遺伝子の蛋白質発現によって形質転換体の除草剤抵抗性が付与されるのを立証することができる。
8−1.アブラナ形質転換体製作
実施例5−1で製作したCyPPO8 F363M遺伝子が挿入されたベクター(図31参照)を用いてアブラナ形質転換体製作に用いた。アブラナ種子を70%(v/v)エタノールに4分間浸漬した後、1.3%(v/v)次亜塩素酸ナトリウム溶液を入れて30分間消毒した。滅菌水で5回洗浄した後、滅菌されたろ過紙の上で水分を除去し、滅菌された種子はMSO培地(MS粉末(powder)4.43g/L、スクロース(sucrose)30g/L、フィタゲル(phytagel)3g/L、pH5.8)に置床した後、25℃が維持される培養室で16時間明培養(25,000Lux)条件で5日間培養した。
アブラナ形質転換体(T1)およびヨンサンアブラナ(野生型アブラナ、対照群)種子を50%(w/v)次亜塩素酸ナトリウムで30分間消毒後、滅菌水で5回洗浄した後、選抜培地(1/2MS、チアフェナシル50nM、pH5.8)に播種し、野生型アブラナは1/2MS培地に播種した。7日後生存した個体を植木鉢に移植して植物培養室(25$$$1℃、16h light/8h dark)で培養した。移植35日後、10μMチアフェナシルおよび10μMサフルフェナシルをそれぞれ植木鉢が置かれたトレイ(40×60cm、0.24cm2)当り100mL(0.05% シルウェット(Silwet)L−77)ずつスプレー処理した。
CyPPO8 F363M変異遺伝子形質転換アブラナ内で挿入遺伝子の発現を確認して遺伝子の発現と除草剤抵抗性発現の間の関係を確認した。
Claims (23)
- 以下から選択されたポリペプチド:
配列番号1のアミノ酸配列中のS63、P91、R92、F169、V173、A175、E228、L229、P316、V318、F337、L340、G351、T352、I353、およびY373からなる群より選択された1種以上がそれぞれ独立して欠失またはM(Met)、V(Val)、I(Ile)、T(Thr)、L(Leu)、C(Cys)、A(Ala)、S(Ser)、F(Phe)、P(Pro)、W(Trp)、N(Asn)、Q(Gln)、G(Gly)、Y(Tyr)、D(Asp)、E(Glu)、R(Arg)、H(His)、およびK(Lys)からなる群より選択され、野生型の該当位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド;
配列番号3のアミノ酸配列中のN63、S64、S66、P67、P92、R93、F170、S172、G173、V174、Y175、A176、R190、E230、L231、P318、V320、F339、G340、N341、L342、L352、G353、T354、I355、Y375、I424、V458、およびR465からなる群より選択された1種以上がそれぞれ独立して欠失またはM(Met)、V(Val)、I(Ile)、T(Thr)、L(Leu)、C(Cys)、A(Ala)、S(Ser)、F(Phe)、P(Pro)、W(Trp)、N(Asn)、Q(Gln)、G(Gly)、Y(Tyr)、D(Asp)、E(Glu)、R(Arg)、H(His)、およびK(Lys)からなる群より選択され、野生型の該当位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド;
配列番号5のアミノ酸配列中のP84、R85、F156、V160、A162、Q179、P306、V308、F327、L330、I343、N362、およびF363からなる群より選択された1種以上がそれぞれ独立して欠失またはM(Met)、V(Val)、I(Ile)、T(Thr)、L(Leu)、C(Cys)、A(Ala)、S(Ser)、F(Phe)、P(Pro)、W(Trp)、N(Asn)、Q(Gln)、G(Gly)、Y(Tyr)、D(Asp)、E(Glu)、R(Arg)、H(His)、およびK(Lys)からなる群より選択され、野生型の該当位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。 - 前記ポリペプチドは、
配列番号1のアミノ酸配列中のS63、P91、R92、F169、V173、A175、E228、L229、P316、V318、F337、L340、G351、T352、I353、およびY373からなる群より選択された1種以上がそれぞれ独立してM(Met)、V(Val)、I(Ile)、T(Thr)、L(Leu)、C(Cys)、A(Ala)、S(Ser)、およびF(Phe)からなる群より選択されたアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド;
配列番号3のアミノ酸配列中のA176、P318、V320、およびY375からなる群より選択された1種以上がそれぞれ独立してM(Met)、V(Val)、I(Ile)、T(Thr)、L(Leu)、C(Cys)、およびA(Ala)からなる群より選択されたアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド;
配列番号5のアミノ酸配列中のP84、R85、F156、V160、A162、Q179、P306、V308、F327、L330、I343、N362、およびF363からなる群より選択された1種以上がそれぞれ独立してM(Met)、V(Val)、I(Ile)、T(Thr)、L(Leu)、C(Cys)、A(Ala)、S(Ser)、H(His)、およびG(Gly)からなる群より選択されたアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群より選択されたものである、請求項1に記載のポリペプチド。 - 前記ポリペプチドは、
配列番号1のアミノ酸配列において、Y373V、Y373I、Y373T、Y373L、Y373C、Y373M、A175C、A175L、A175I、P316A、P316L、V318M、V318T、V318L、G351A、S63T、P91L、R92A、V173S、V173C、V173T、V173L、F169A、E228A、L229F、F337V、L340T、L340I、L340V、T352V、I353T、I353L、I353V、およびI353Cからなる群より選択された1種以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;
配列番号3のアミノ酸配列において、Y375M、Y375V、Y375I、Y375T、Y375C、A176C、A176L、P318L、V320L、V320M、およびP318Aからなる群より選択された1種以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;
配列番号5のアミノ酸配列において、P84L、R85A、R85C、R85H、R85L、R85T、R85V、F363M、F363V、F363L、F363C、F363I、F363T、A162C、A162L、P306L、P306A、V308L、V308M、N362S、V160S、V160C、I343V、I343T、F156A、Q179G、F327V、およびL330Tからなる群より選択された1種以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群より選択されたものである、請求項1に記載のポリペプチド。 - 前記ポリペプチドは、
配列番号1のアミノ酸配列において、Y373M、Y373V、Y373I、Y373T、Y373L、Y373C、F169A、A175C、A175L、A175I、P316A、P316L、V318M、V318T、V318L、G351A、S63T、P91L、R92A、V173S、V173C、V173T、V173L、E228A、L229F、F337V、L340T、L340I、L340V、T352V、I353T、I353L、I353V、I353C、S63T+Y373M、R92A+Y373M、V173S+Y373M、V173S+Y373I、V173S+Y373L、V173S+Y373V、V173C+Y373M、V173C+Y373I、V173T+Y373M、V173T+Y373I、V173L+Y373M、A175L+Y373M、A175L+Y373I、A175C+Y373M、A175C+Y373I、A175I+Y373M、E228A+Y373M、L229F+Y373T、V318M+Y373M、V318M+Y373I、V318M+Y373V、V318T+Y373I、L340I+Y373M、L340I+Y373I、L340V+Y373M、G351A+Y373M、I353T+Y373M、I353T+Y373I、I353T+Y373L、I353L+Y373M、I353V+Y373M、I353C+Y373M、S63T+V173S+Y373M、S36T+V173S+Y373I、S63T+I353T+Y373M、S63T+I353T+Y373I、V173S+V318M+Y373M、V173T+L340I+Y373M、V173S+A175C+Y373M、A175C+V318M+Y373M、A175L+V318M+Y373M、A175C+I353L+Y373M、A175C+I353V+Y373M、P316A+V318L、P316L+V318L、F337V+Y373M、T352V+Y373M、G351A+T352V+Y373M、またはP91L+Y373Mのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;
配列番号3のアミノ酸配列において、Y375M、Y375V、Y375I、Y375T、Y375C、A176C、A176L、P318L+V320L、V320M、またはP318A+V320Lのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;
配列番号5のアミノ酸配列において、P84L、R85A、R85C、R85H、R85L、R85T、R85V、F363M、F363V、F363L、F363C、F363I、F363T、A162C、A162L、P306L、P306A、V308L、V308M、N362S、V160S、V160C、I343V、I343T、F156A、Q179G、F327V、L330T、P84L+F363M、R85A+F363M、R85A+F363I、R85C+F363M、R85H+F363M、R85L+F363M、R85T+F363M、R85V+F363M、R85A+A162L+F363M、R85A+A162L+F363I、R85A+A162C+F363M、R85A+A162C+F363I、R85A+V308M+F363M、V160S+F363M、V160S+F363I、V160S+V308M+F363I、A162L+F363M、A162C+F363M、A162C+F363I、A162C+F363L、A162C+V308M+F363M、A162C+V308L+F363M、A162L+Q179G+F363M、P306A+V308L、P306L+V308L、V308M+F363M、V308M+F363I、I343T+F363M、I343V+F363M、またはN362S+F363Mのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群より選択されたものである、請求項3に記載のポリペプチド。 - 請求項1〜4のうちのいずれか一項のポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド。
- 請求項5のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項6の組換えベクターを含む形質転換細胞。
- 請求項1〜4のうちのいずれか一項のポリペプチド;前記ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド;前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター;および前記組換えベクターを含む形質転換細胞からなる群より選択された1種以上を含む、植物または藻類の除草剤に対する耐性付与または増進用組成物。
- 前記除草剤は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤である、請求項8に記載の組成物。
- 前記除草剤は、ピリミジンジオン系、ジフェニルエーテル系、フェニルピラゾール系、N−フェニルフタルイミド系、フェニルエステル系、チアジアゾール系、オキサジアゾール系、トリアゾリノン系、オキサゾリジンジオン系、ピラクロニル、フルフェンピル−エチルおよびプロフルアゾルからなる群より選択される1種以上である、請求項9に記載の組成物。
- 前記除草剤は、ブタフェナシル、サフルフェナシル、ベンズフェンジゾン、チアフェナシル、ホメサフェン、オキシフルオルフェン、アクロニフェン、アシフルオルフェン、ビフェノックス、エトキシフェン、ラクトフェン、クロメトキシフェン、クロルニトロフェン、フルオログリコフェン−エチル、ハロサフェン、ピラフルフェン−エチル、フルアゾレート、フルミオキサジン、シニドン−エチル、フルミクロラック−ペンチル、フルチアセット、チジアジミン、オキサジアルギル、オキサジアゾン、カルフェントラゾン、スルフェントラゾン、アザフェニジン、ペントキサゾン、ピラクロニル、フルフェンピル−エチル、プロフルアゾル、フェノピレート、フェノピレートのカルバメート類似体、およびこれらの農薬的に許容可能な塩からなる群より選択される1種以上である、請求項10に記載の組成物。
- 上記植物または藻類は、第2の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含み、前記第2の除草剤に対する耐性が付与または増進されたものである、請求項8に記載の組成物。
- 前記第2の除草剤は、グリホサート、グルホシネート、ジカンバ、2,4−D(2,4−ジクロロフェノキシ酢酸)、イソキサフルトール、ALS(アセト乳酸シンターゼ)阻害性除草剤、光化学系II阻害性除草剤、フェニルウレア系除草剤、ブロモキシニル系除草剤およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるものである、請求項12に記載の組成物。
- 前記第2の除草剤耐性ポリペプチドは、
グリホサート除草剤耐性EPSPS(グリホサート耐性5−ピルビンシキミ酸−3−シンターゼ)、GOX(グリホサートオキシダーゼ)、GAT(グリホサート−N−アセチルトランスフェラーゼ)またはグリホサートデカルボキシラーゼ;
グルホシネート除草剤耐性PAT(ホスフィノリシン−N−アセチルトランスフェラーゼ);
ジカンバ除草剤耐性DMO(ジカンバモノオキシゲナーゼ);
2,4−D(2,4−ジクロロフェノキシ酢酸)除草剤耐性2,4−DモノオキシゲナーゼまたはAAD(アリルオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ);
ALS(アセト乳酸シンターゼ)阻害性スルホニルウレア系除草剤耐性AHAS(アセトヒドロキシ酸シンターゼ)、AHAS(アセト乳酸シンターゼ)またはatahasl(アセトヒドロキシ酸シンターゼ大型サブユニット);
光化学系II阻害性除草剤耐性光化学系IIタンパク質D1;
フェニルウレア除草剤耐性シトクロムP450;
色素体阻害性除草剤耐性HPPD(ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ);
ブロモキシニル除草剤耐性ニトリラーゼ;および
これらの組み合わせからなる群より選択される1種以上である、請求項12に記載の組成物。 - 前記第2の除草剤耐性ポリペプチドを暗号化する遺伝子は、
グリホサート除草剤耐性cp4 epsps、mepsps、2mepsps、goxv247、gat4601またはgat4621遺伝子;
グルホシネート除草剤耐性BARまたはPAT遺伝子;
ジカンバ除草剤耐性dmo遺伝子;
2,4−D(2,4−ジクロロフェノキシ酢酸)除草剤耐性AAD−1またはAAD−12遺伝子;
イソキサフルトール除草剤耐性HPPDPF W336遺伝子;
スルホニルウレア除草剤耐性ALS、Csr1、Csr1−1、Csr1−2、GM−HRA、S4−HRA、Zm−HRA、SurAまたはSurB遺伝子;
光化学系II阻害性除草剤耐性psbA遺伝子;
フェニルウレア除草剤耐性CYP76B1遺伝子;
ブロモキシニル除草剤耐性bxn遺伝子;および
これらの組み合わせからなる群より選択される1種以上である、請求項12に記載の組成物。 - 請求項1〜4のうちのいずれか一項のポリペプチドまたはこれを暗号化するポリヌクレオチドを含む、除草剤に対する耐性を有する植物または藻類の形質転換体、そのクローンまたは子孫。
- 前記形質転換体は、植物細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽または植物体全体である、請求項16に記載の形質転換体、そのクローンまたは子孫。
- 請求項1〜4のうちのいずれか一項のポリペプチドまたはこれを暗号化するポリヌクレオチドを藻類、または植物の細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽または植物体全体に形質転換する段階を含む、除草剤に対する耐性を有する植物または藻類の製造方法。
- 請求項1〜4のうちのいずれか一項のポリペプチドまたはこれを暗号化するポリヌクレオチドを藻類、または植物の原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽または植物体全体に形質転換する段階を含む、植物または藻類の除草剤に対する耐性を付与または増進させる方法。
- 請求項1〜4のうちのいずれか一項のポリペプチドまたはこれを暗号化するポリヌクレオチドを含む植物を栽培地に提供する段階、および
前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階を含む、
栽培地で雑草を防除する方法。 - 前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階は、2種以上のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用することである、請求項20に記載の方法。
- 上記植物は、第2の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含むものであり、
前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤および第2の除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用する、請求項20に記載の方法。 - 請求項1〜4のうちのいずれか一項のポリペプチドまたはこれを暗号化するポリヌクレオチドを含む藻類を培養培地に提供する段階、および
前記培養培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階を含む、培養培地で望まない水生生物を除去する方法。
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