CN107709563B - 通过采用基于RNAi的策略使真菌病原体的小RNA途径失效来控制真菌病原体 - Google Patents

通过采用基于RNAi的策略使真菌病原体的小RNA途径失效来控制真菌病原体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及增强植物或植物的部分的病原体抗性的方法。一方面，所述方法包括使植物或植物的部分接触靶向真菌的Dicer‑样(DCL)基因的双链RNA或小RNA双链体，其中相比未接触所述双链RNA或小RNA双链体的对照植物或对照植物的部分，所述植物或植物的部分具有增强的对真菌病原体的抗性。

Description

通过采用基于RNAi的策略使真菌病原体的小RNA途径失效来 控制真菌病原体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年4月27日提交的第62/153,440号美国临时申请和于2015年7月24日提交的第14/809,063号美国专利申请的优先权，为了所有目的将上述申请各自的全部内容通过引用并入本文。
关于在联邦政府赞助的研究和开发下完成的发明的权利的声明
在由国家科学基金会、NIH基金(R01 GM093008)授予的批准号MCB-0642843、IOS-1257576下，由政府支持完成了本发明。政府拥有本发明的一些权利。
发明背景
在植物中，病原体攻击引起了多层次的宿主免疫反应。许多植物和动物的病原体将效应物递送至宿主细胞中以抑制宿主免疫力，并且许多植物已经进化了抗性蛋白以识别效应物并引发强的抗性。
灰色葡萄孢菌(Botrytis cinerea)是感染花和几乎所有蔬菜和果实作物的真菌病原体，并且每年在全世界造成100亿-1000亿的损失。由于其广泛的宿主范围，灰色葡萄孢菌是研究入侵性真菌病原体致病性的有用模型。
发明概述
一方面，本申请提供了具有增强的对病原体(例如，真菌病原体或卵菌病原体)的抗性的植物(或植物细胞、种子、花、叶、果实、或来自这些植物的其他植物部分、或来自这些植物的加工的食品或食品成分)。另一方面，提供了制备病原体抗性植物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：
使植物或植物的部分接触靶向真菌或卵菌的Dicer-样(DCL)基因或长末端重复(LTR)区的双链RNA、小RNA(sRNA)、或小RNA双链体，其中所述植物是以下属的物种：天门冬属(Asparagus)、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、芸苔属(Brassica)、柑橘属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、黄瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、草莓属(Fragaria)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、萱草属(Heterocallis)、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、毒麦属(Lolium)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、Majorana、苜蓿属(Medicago)、烟草属(Nicotiana)、稻属(Oryza)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pannesetum)、鳄梨属(Persea)、豌豆属(Pisum)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、蔷薇属(Rosa)、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、胡芦巴属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)、或玉蜀黍属(Zea)，并且相比未接触双链RNA、sRNA或小RNA双链体的对照植物或植物的部分，所述植物或植物的部分具有增强的对真菌病原体或卵菌病原体的抗性。
在一些实施方案中，所述方法包括：
使果实、蔬菜或花接触靶向真菌或卵菌的Dicer-样(DCL)基因或长末端重复(LTR)区的双链RNA或小RNA双链体，其中相比未接触双链RNA、sRNA或小RNA双链体的对照果实、蔬菜或花，所述果实、蔬菜或花具有增强的对真菌病原体或卵菌病原体的抗性。
在一些实施方案中，病原体是真菌病原体。在一些实施方案中，病原体是葡萄孢属(Botrytis)或轮枝菌属(Verticillium)。
在一些实施方案中，双链RNA、sRNA或小RNA双链体靶向真菌或卵菌的DCL基因。在一些实施方案中，双链RNA、sRNA或小RNA双链体靶向SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31中的任何序列或其片段(例如，其至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500个或更多个连续核苷酸)。在一些实施方案中，双链RNA、sRNA或小RNA双链体包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中的任何序列、或其片段、或其互补链相同或基本相同(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)的序列的反向重复序列。在一些实施方案中，双链RNA、sRNA或小RNA双链体包含反向重复序列之间的间隔区。
在一些实施方案中，双链RNA是siRNA。在一些实施方案中，将双链RNA、sRNA或小RNA双链体喷洒或涂刷在植物或植物的部分(例如，叶、果实、蔬菜或花)上。
在一些实施方案中，所述方法还包括使植物或植物的部分接触靶向第二真菌病原体DCL基因的第二双链RNA或第二小RNA双链体或第二sRNA。在一些实施方案中，所述方法包括使植物或植物的部分接触靶向第一真菌病原体物种的DCL基因的一种或多种双链RNA或小RNA双链体或sRNA(例如，用于靶向葡萄孢属的DCL基因，例如，靶向灰色葡萄孢菌的DCL1的双链RNA、sRNA或小RNA双链体，以及靶向灰色葡萄孢菌的DCL2的双链RNA、sRNA或小RNA双链体)，并且还包括使植物或植物的部分接触靶向第二真菌病原体物种的DCL基因的一种或多种双链RNA或小RNA双链体或sRNA(例如，用于靶向轮枝菌属的DCL基因，例如，靶向大丽轮枝菌(V.dahliae)的DCL1的双链RNA、sRNA或小RNA双链体，以及靶向大丽轮枝菌的DCL2的双链RNA、sRNA或小RNA双链体)。
另一方面，提供了增强对多种病原体(例如，真菌病原体或卵菌病原体)的病原体抗性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：
使植物或植物的部分接触：(1)靶向第一真菌病原体或卵菌病原体物种的Dicer-样(DCL)基因或长末端重复(LTR)区的第一双链RNA、sRNA或小RNA双链体，以及(2)靶向第二真菌病原体或卵菌病原体物种的DCL基因或LTR区的第二双链RNA、sRNA或小RNA双链体，其中相比未接触第一和第二双链RNA、sRNA或小RNA双链体的对照植物或植物的部分，所述植物或植物的部分具有增强的对第一病原体物种和第二病原体物种的抗性。
在一些实施方案中，所述方法包括使植物接触用于靶向第一病原体物种的两种或更多种DCL基因或LTR区的两种或更多种双链RNA、sRNA或小RNA双链体(例如，用于靶向葡萄孢属的DCL基因，例如，灰色葡萄孢菌的DCL1和DCL2)，并且接触用于靶向第二病原体物种的两种或更多种DCL基因或LTR区的两种或更多种双链RNA、sRNA或小RNA双链体(例如，用于靶向轮枝菌属的DCL基因，例如，大丽轮枝菌的DCL1和DCL2)。
另一方面，制备具有增强的对多种病原体的病原体抗性的植物的方法包括：
向植物引入：(1)第一异源表达盒，其包含第一启动子，所述第一启动子可操作地连接至抑制第一真菌病原体或卵菌病原体物种的Dicer-样(DCL)基因或长末端重复(LTR)区表达的第一多核苷酸，以及(2)第二异源表达盒，其包含第二启动子，所述第二启动子可操作地连接至抑制第二真菌病原体或卵菌病原体物种的DCL基因或LTR区表达的第二多核苷酸；以及
选择包含第一表达盒和第二表达盒的植物。
在一些实施方案中，所述方法包括向植物引入用于靶向第一病原体物种的两种或更多种DCL基因或LTR区的两种或更多种异源表达盒(例如，用于靶向葡萄孢属的DCL基因，例如，灰色葡萄孢菌的DCL1和DCL2)，并且引入用于靶向第二病原体物种的两种或更多种DCL基因或LTR区的两种或更多种异源表达盒(例如，用于靶向轮枝菌属的DCL基因，例如，大丽轮枝菌的DCL1和DCL2)。在一些实施方案中，多核苷酸包含靶向DCL基因或LTR区或其片段的反义核酸或抑制性RNA(RNAi)。
另一方面，提供了培养多种病原体抗性植物的方法。
附图简述
图1.灰色葡萄孢菌基因组具有两个Dicer-样(DCL)基因。来自不同病原真菌物种的DCL蛋白的系统发生树，也包括来自卵菌病原体致病疫霉(Phytophthora infestans)的DCL蛋白。粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)用作参照。
图2A-C.灰色葡萄孢菌(Bc)-sRNA依赖于两种灰色葡萄孢菌DCL蛋白。灰色葡萄孢菌dcl1、dcl2和dcl1 dcl2突变体菌株均显示出生长阻滞和延迟的分生孢子的发育(A)，但仅有双突变体菌株不能产生Bc-sRNA效应物(B)。DCL非依赖性sRNA用作对照(C)。
图3A-D.灰色葡萄孢菌DCL对于其致病性是至关重要的。相比在拟南芥属(Arabidopsis)(A-B)和番茄(S.lycopersicum)(C-D)中的野生型，灰色葡萄孢菌dcll dcl2双突变体产生了弱得多的疾病症状，但dcll单突变体或dcl2单突变体未产生弱得多的疾病症状。
图4A-C.DCL依赖性小RNA对于真菌毒力是重要的。相比野生型葡萄孢属菌株，灰色葡萄孢菌dcl1 dcl2双突变体对果实、蔬菜和花的毒力小得多。通过灰色葡萄孢菌野生型菌株B05(WT)或dcl1 dcl2双突变体菌株来感染番茄果实和叶(A)，洋葱和莴苣(B)，以及玫瑰花(C)。对于番茄叶在3天后拍摄照片，并且对于番茄果实、洋葱、莴苣和玫瑰在4天后拍摄照片。
图5A-B.葡萄孢属DCL负责生成长末端重复序列(LTR)来源的sRNA。对于dcl1 dcl2和野生型的全基因组比较sRNA分析显示，葡萄孢属DCL负责生成LTR来源的sRNA，其中许多为sRNA效应物。
图6.LTR来源的Bc-sRNA效应物依赖于DCL1和DCL2。
图7A-D.逆转录转座子来源的Bc-sRNA主要是BcDCL依赖的。从野生型灰色葡萄孢菌和dcl1 dcl2双突变体构建两个文库，并且使用使用Illumina深度测序来进行测序。(A)根据sRNA大小来自两个文库的全部Bc-sRNA读取的读取数。(B)根据sRNA大小来自两个文库的逆转录转座子来源的Bc-sRNA的读取数。(C)来自两个文库的Bc-siR3.1、Bc-siR3.2和Bc-siR5的标准化读取数。(D)根据5′核苷酸(A、U、C或G)和sRNA大小的逆转录转座子来源的Bc-sRNA的读取数。A、B和D中的X轴表示核苷酸内的RNA大小。
图8.感染后一些轮枝菌属小RNA在AGO1拉下(pull-down)部分高度富集。进行根培养以得到用于感染后的野生型(WT)和ago1-27突变体拟南芥属的AGO1-相关小RNA的免疫沉淀反应的材料。将与拟南芥属AGO1相关的sRNA拉下，并且进行深度测序。
图9A-B.在转基因拟南芥属中通过宿主诱导基因沉默(HIGS)来敲低BcDCL增强了植物对灰色葡萄孢菌的抗性。(A)使用灰色葡萄孢菌来感染三种选择的灰色葡萄孢菌dcl1dcl2(HIGS-BcDCL)系以及野生型的植物。在感染后4天(dpi)拍摄照片。三组生物学重复显示出类似的结果。(B)通过Northern印迹法测量的来自野生型和三种所选的用HIGS-BcDCL改造的转基因系的siRBcDCL表达水平。U6用作负载对照。
图10A-B.在番茄中通过病毒诱导基因沉默(VIGS)来敲低BcDCL增强了植物对灰色葡萄孢菌的抗性。(A)将番茄VIGS-RB和VIGS-BcDCL植物的第5、第6和第7片叶分离，并且使用喷洒接种用灰色葡萄孢菌进行感染。在感染后3天拍摄照片。三组生物学重复显示出类似的结果。(B)通过Northern印迹法测量来自相应受感染叶的siRBcDCL水平。U6用作负载对照。
图11.当使用含有siRBcDCL的RNA喷洒时，番茄对灰色葡萄孢菌的抗性更强。模拟RNA：从模拟物浸润的烟草提取的总RNA。siRBcDCL RNA：从携带有siRBcDCL-产生载体(pHellsgate8-B052DCL)的农杆菌浸润的烟草提取的小RNA。
图12.当与含有siRBcDCL的本塞姆氏烟草(N.benthamiana)总RNA混合时，灰色葡萄孢菌对番茄的毒力减小。模拟RNA：从模拟物浸润的烟草提取的总RNA。siRBcDCL RNA：从携带有siRBcDCL-产生载体(pHellsgate8-B052DCL)的农杆菌浸润的烟草提取的小RNA。
图13.当与含有siRBcDCL的RNA混合时，灰色葡萄孢菌对草莓的毒力减小。模拟RNA：从模拟物浸润的烟草提取的总RNA。siRBcDCL RNA：从携带有产生siRBcDCL的载体(pHellsgate8-B052DCL)的农杆菌浸润的烟草提取的小RNA。
图14.当与含有siRBcDCL的RNA混合时，灰色葡萄孢菌对黄瓜的毒力减小。模拟RNA：从模拟物浸润的烟草提取的总RNA。siRBcDCL RNA：从携带有产生siRBcDCL的载体(pHellsgate8-B052DCL)的农杆菌浸润的烟草提取的小RNA。
图15A-B.使用从表达靶向Bc-DCL的sRNA的本塞姆氏烟草提取的RNA喷洒果实，表现出了减少的由灰色葡萄孢菌引起的灰霉病症状。(A)将番茄叶和果实、草莓果实以及葡萄果实，使用来自用pHELLSGATE-BcDCL和pHELLSGATE-EV浸润的本塞姆氏烟草的总RNA喷洒24小时来预处理，然后在果实的被喷洒的区域进行灰色葡萄孢菌滴液接种。对于番茄和葡萄果实，在感染后4天记录疾病症状，并且对于番茄叶和草莓果实，在感染后3天记录疾病症状。三组生物学重复显示出类似的结果。(B)BcDCL RNAi引发物的表达水平，包括长dsRNA-BcDCL和siRBcDCL，其来自从用pHELLSGATE-BcDCL或pHELLSGATE-EV浸润的本塞姆氏烟草提取的总RNA。U6用作负载对照。
图16.使用针对BcDCL的体外转录的dsRNA喷洒番茄叶和果实，减少了番茄和草莓上的灰色葡萄孢菌引起的灰霉病。将番茄叶和果实以及草莓果实，用水或针对BcDCL的体外转录的长dsRNA预处理24小时，然后在叶或果实的经预处理的区域进行灰色葡萄孢菌滴液接种。对于番茄果实，在感染后4天记录疾病症状，并且对于番茄叶和草莓果实，在感染后3天记录疾病症状。
图17A-B.灰色葡萄孢菌和大丽轮枝菌的DCL基因的HIGS，增强了植物对两种病原体的耐受。(A)通过在叶上进行滴液接种，使用灰色葡萄孢菌感染两种所选的HIGS-4DCL系(4周龄)以及野生型的拟南芥属植物。在感染后4天后拍摄图片。两组生物学重复显示出类似的结果。(B).通过根接种，使用大丽轮枝菌感染两种所选的HIGS-4DCL系(2周龄)和野生型的拟南芥属植物。在感染后3周拍摄图片。两组生物学重复显示出类似的结果。
图18A-B.灰色葡萄孢菌dcl1 dcl2双突变体对果实、蔬菜和花瓣具有减小的毒力。(A)灰色葡萄孢菌dcl1dcl2双突变体显示出对果实(番茄、草莓和葡萄)、蔬菜(莴苣和洋葱)和花瓣(玫瑰)减小的毒力，而灰色葡萄孢菌dcl2单突变体显示出与WT菌株类似的毒力，或者比WT菌株略微减小的毒力。由至少三组生物学重复得到了类似的结果。(B)上图：使用ImageJ在接种后3至5天(dpi)测量受感染的植物样品的病斑大小，并且误差柱表示各个实验中至少10个样品的SD。下图：在接种后3至5天通过定量PCR测量灰色葡萄孢菌生物量。误差柱表示三组重复的SD。星号表示统计学显著的差异(P＜0.01；Studentt检验)。对于b和c进行了三次同样的实验，并且得到了类似的结果。
图19A-H.在拟南芥属和番茄植物中表达Bc-DCL1/2-sRNA增强了植物对灰色葡萄孢菌的抗性.(A)如通过sRNA Northern印迹法检测的，Bc-DCL1/2-sRNA在拟南芥属转基因植物中高度表达。(B)表达Bc-DCL1/2-sRNA的拟南芥属植物显示出了增强的对灰色葡萄孢菌的疾病抗性。由三组生物学重复得到了类似的结果。(C)使用imageJ在感染后3天测量了病斑大小，并且误差柱表示至少10个样品的SD。在感染后3天通过定量PCR测量灰色葡萄孢菌生物量，并且误差柱表示三组重复的SD。由(B)和(C)的三组生物学重复得到了类似的结果。(D)如通过定量RT-PCR所测量的，在受感染的表达Bc-DCL1/2-sRNA的拟南芥属植物中，Bc-DCL1和Bc-DCL2的表达下调。(E)Northern印迹法分析显示出通过VIGS表达Bc-DCL1/2-sRNA的番茄植物中的Bc-DCL1/2-sRNA表达水平。(F)相比对照植物，表达Bc-DCL1/2-sRNA的番茄植物对灰色葡萄孢菌的抗性更强。(G)在感染后3天测量灰色葡萄孢菌生物量，并且误差柱表示三组重复的SD。(H)如通过定量RT-PCR所测量的，在受感染的表达Bc-DCL1/2-sRNA的番茄植物中，Bc-DCL1和Bc-DCL2被沉默。由(E)-(H)的三组生物学重复得到了类似的结果。星号表示统计学显著的差异(P＜0.01；Studentt检验)。
图20A-B.外部应用的Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA抑制了对果实、蔬菜和花瓣的病原体毒力。(A)相比对照，Bc-DCL1/2-dsRNA和Bc-DCL1/2-sRNA的外部应用抑制了灰色葡萄孢菌对果实(番茄、草莓和葡萄)、蔬菜(莴苣和洋葱)和花瓣(玫瑰)的毒力。由4组生物学重复得到了类似的结果。(B)在感染后3至5天分别使用imageJ和定量PCR测量病斑大小和真菌生物量，并且误差柱表示分别针对相对病斑大小和相对生物量的10个样品和三组重复的SD。星号表示统计学显著的差异(P＜0.01；Studentt检验)。将这些实验重复三次，得到类似的结果。
图21A-C.使用表达Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA的本塞姆氏烟草RNA提取物对植物进行处理，减少了由灰色葡萄孢菌引起的灰霉病症状。(A)来自表达pHELLSGATE(EV)或表达pHELLSGATE-Bc-DCL1/2的植物的本塞姆氏烟草总RNA提取物，用于通过Northern印迹法分析测量Bc-DCL-sRNA和Bc-DCL-dsRNA的表达水平。32P-标记的Bc-DCL-DNA用作探针。(B)当与不含有Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA的本塞姆氏烟草总RNA提取物的外部应用比较时，含有Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA的本塞姆氏烟草总RNA提取物对果实(番茄、草莓和葡萄)、蔬菜(莴苣和洋葱)和花瓣(玫瑰)的外部应用减少了灰霉病症状。(C)在感染后3至5天使用imageJ测量病斑大小，并且误差柱表示10个植物样品的SD。还使用定量PCR计算了灰色葡萄孢菌的生物量。星号表示统计学显著的差异(P＜0.01；Studentt检验)。将这些实验重复三次，并且得到了类似的结果。
图22A-C.灰色葡萄孢菌细胞得到Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA，其沉默了Bc-DCL1和Bc-DCL2。(A)在固体ME培养基上与灰色葡萄孢菌孢子共培养12小时后，检测了灰色葡萄孢菌细胞中的荧光Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA。在灰色葡萄孢菌细胞中检测到荧光标记的DCL1/2-sRNA和DCL1/2-dsRNA。在微球激酶(MNase)处理后，DCL1/2-sRNA和DCL1/2-dsRNA仍然存在于灰色葡萄孢菌细胞。(B)在液体YEPD培养基中与灰色葡萄孢菌孢子共培养16小时后，在灰色葡萄孢菌原生质体中观察到了荧光Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA。所述原生质体的微球激酶(MNase)处理不会消除荧光。(C)在液体YEPD培养基中将灰色葡萄孢菌孢子与Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA共培养40小时后检测了Bc-DCL1和Bc-DCL2。靶向Bc-DCL2的sRNA和dsRNA仅下调Bc-DCL2，但不下调Bc-DCL1。
图23A-E.同时表达靶向灰色葡萄孢菌和大丽轮枝菌的DCL基因的sRNA的拟南芥属植物，显示出增强的对两种病原体的疾病抗性。(A)Northern印迹法分析表明了在表达Bc+Vd-DCL-sRNA的拟南芥属转基因植物中的Bc-DCL1/2-sRNA和Vd-DCL1/2-sRNA的表达水平。(B)定量RT-PCR显示，相比WT植物，受到灰色葡萄孢菌感染的表达Bc+Vd-DCL-sRNA的拟南芥属植物中的Bc-DCL1和Bc-DCL2被沉默。(C)表达Bc+Vd-DCL-sRNA的拟南芥属植物抑制了灰色葡萄孢菌毒力。在感染后3天使用ImageJ测量病斑大小，并且误差柱表示10片叶的SD。在感染后3天通过定量PCR测量灰色葡萄孢菌生物量。(D)Vd-DCL1和Vd-DCL2的表达水平在受到大丽轮枝菌感染的表达Bc+Vd-DCL-sRNA的拟南芥属植物中受到抑制。(E)相比WT植物，表达Bc+Vd-DCL-sRNA的拟南芥属植物更不容易受到大丽轮枝菌的影响。在接种后3周测量大丽轮枝菌的生物量。星号表示统计学显著的差异(P＜0.01；Studentt检验)。由(B)-(E)的三组重复得到了类似的结果。
定义
术语“病原体抗性(pathogen-resistant)”或“病原体抗性(pathogenresistance)”是指植物阻止或抵抗病原体感染或病原体诱导的症状的能力增强。病原体抗性可以是相对于具体病原体种或属(例如，葡萄孢属)的增强的抗性，对于多种病原体的增强的抗性，或者对于所有病原体的增强的抗性(例如，系统获得性抗性)。在一些实施方案中，当一种或多种病原体感染的症状相对于对照(例如，抑制真菌病原体DCL基因表达的多核苷酸未表达的植物)减少时，植物对病原体的抗性“增强”。
“病原体”包括但不限于，病毒、细菌、线虫、真菌或昆虫(参见，例如，Agrios，PlantPathology(Academic Press，San Diego，CA(1988))。在一些实施方案中，病原体是真菌病原体。在一些实施方案中，病原体是葡萄孢属。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指从5′至3′端读取的脱氧核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。核酸还可以包括修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸允许通过聚合酶正确读取，并且不显著改变由该核酸编码的多肽的表达。
术语“核酸编码”或“多核苷酸编码”是指，指导特定蛋白或肽的表达的核酸。核酸序列包括转录成为RNA的DNA链序列和翻译成为蛋白的RNA序列。核酸序列包括全长核酸序列以及来源于全长序列的非全长序列。还应理解，所述序列包括天然序列的简并密码子，或者可以被引入以便在特定宿主细胞内提供密码子偏向的序列。
如果核苷酸或氨基酸残基的序列分别在两组序列中在对齐后达到下文描述的最大一致性时相同，则这两组核酸序列或多肽被称为“相同”。通过在比较窗口比较两组最佳对齐的序列来确定“序列同一性的百分比”，其中多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分，可以包含相比参照序列(其不包含添加或删除)的添加或删除(即，空位)以用于两组序列的最佳对齐。通过以下步骤来计算百分比：通过确定相同的核酸碱基或氨基酸残基在两组序列中均出现的位置的数量以得到匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置的总数，并且将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。当序列同一性百分比用于指蛋白或肽时，应认识到，不相同的残基位置通常由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被取代为其他具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的氨基酸残基，并且因此不改变分子的功能性质。当序列区别在于保守取代时，可以将百分比序列同一性上调以校正取代的保守性质。进行这种调节的手段是本领域技术人员熟知的。通常其涉及将保守取代作为部分不匹配来评分，而不是作为完全不匹配来评分，从而提高百分比序列同一性。因此，例如，当对相同的氨基酸给出1的得分并且对非保守取代给出0的得分时，对保守取代给出0和1之间的得分。根据，例如，Meyers&Miller，Computer Applic.Biol.Sci.4∶11-17(1988)的算法，例如，如程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)中所实施的，来计算保守取代的得分。
在多核苷酸或多肽序列的背景中使用的术语“基本相同(substantialidentity)”或“基本相同(substantially identical)”，是指对于参照序列有至少60％序列同一性的序列。或者，百分比同一性可以是60％至100％的任何整数。示例性的实施方案包括，使用本文描述的程序(优选使用下文描述的标准参数的BLAST)，相比参照序列，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读取框定位等，这些值可以适当地调整以确定相应的由两组核苷酸序列编码的蛋白的同一性。
为了序列比较，通常将一组序列当作与测试序列进行比较的参照序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入计算机，指定子序列坐标，并且如果有必要，指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，或者可以指定可选的参数。然后，序列比较算法可计算出基于程序参数的测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性。
如本文所用，“比较窗口”包括提及选自20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150的任何一种连续位置数量的片段，其中在两组序列最佳地对齐后，可以将序列与相同数量的连续位置的参照序列进行比较。用于比较的序列的对齐方法是本领域熟知的。用于比较的序列的最佳对齐可以通过以下来进行：Smith和Waterman Add.APL.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，Needleman和WunschJ.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性对齐算法，Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444(1988)的搜寻相似性的方法，通过计算机实施这些算法(Wisconsin Genetics Software Package，GeneticsComputer Group(GCG)，575Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA)，或者手动对齐和视觉检测。
适于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul et al.(1977)Nucleic Acids Res.25：3389-3402。进行BLAST分析的软件是公众可通过国家生物技术信息中心(NCBI)网址获得的。算法包含首先通过识别待查序列中长度W的短字来识别高得分序列对(HSP)，所述短字当与数据库序列中相同长度的字对齐时匹配或满足一些正值阈值分数T。T被称为相邻字得分阈值(Altschul et al，supra)。这些起始相邻字串充当用于起始搜索的种子，以找到含有它们的更长的HSP。然后字串在两个方向沿各自的序列延长，直至累积的对齐分数可以提高。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配残基对的奖励分数；始终＞0)和N(不匹配残基的处罚分数；始终＜0)来计算累积分数。对于氨基酸序列，将得分矩阵用于计算累积分数。当以下情况时，字串在在各方向的延长停止：累积对齐分数从其最大达到的值降低了量X；由于一个或多个负得分残基对齐的累积，累积分数达到0或更低；或者到达了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了对齐的敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用默认是28的字大小(W)，10的期望(E)，M＝1，N＝-2，以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认是3的字大小(W)，10的期望(E)，以及BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。
BLAST算法还进行了两组序列之间相似性的统计学分析(参见，例如，Karlin&Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一种相似性的测量是最小相加概率(P(N))，其提供了两组核苷酸或氨基酸序列之间偶然出现匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参照核酸比较的最小相加概率小于约0.01，更优选地小于约10-5，并且最优选地小于约10-20，则认为核酸与参照序列相似。
如本文所用，术语“与...互补”意指多核苷酸序列与参照多核苷酸序列的全部或部分互补。在一些实施方案中，多核苷酸序列与至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200或更多个参照多核苷酸序列的连续核苷酸互补。在一些实施方案中，如果至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的多核苷酸序列与参照多核苷酸序列互补，则多核苷酸序列是与参照多核苷酸序列“基本互补的”。
如果多核苷酸序列来源于外来物种，或者如果其来源于相同物种但由原始形式经修饰，则所述多核苷酸序列是与有机体或第二多核苷酸序列是“异源的”。例如，当启动子据称可操作地连接至异源编码序列时，其意指编码序列来源于一种物种，而启动子序列来源于另一种不同的物种；或者，如果两者均来源于相同的物种，编码序列并非天然地与启动子相关(例如，是基因工程化的编码序列，例如，来自相同物种的不同基因，或者来自不同生态学或变体的等位基因)。
“表达盒”是指当被引入至宿主细胞时分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译的核酸构建体。本定义明确地包括不翻译或不能翻译的反义构建体或有义构建体。技术人员将认识到，插入的多核苷酸序列不需要相同，而可以仅与其来源的基因序列基本相似。
如本文所用，术语“启动子”是指能够驱使细胞内编码序列转录的多核苷酸序列。因此，本发明的多核苷酸构建体使用的启动子包括涉及调控或调整基因转录的时机和/或速度的顺式转录控制元件和调控序列。例如，启动子可以是顺式转录控制元件，包括涉及转录调控的增强子、启动子、转录终止子、复制原点、染色体整合序列、5′和3′未翻译的区域、或内含子序列。这些顺式序列通常与蛋白或其他生物分子作用以进行(启动/关闭、调控、调整等)基因转录。“植物启动子”是能够在植物细胞中启动转录的启动子。“组成型启动子”是能够在几乎所有组织类型种启动转录的启动子，而“组织特异性启动子”仅在一种或几种特定组织类型中启动转录。“可诱导启动子”是仅在特定环境条件或发育条件下启动转录的启动子。
术语“植物”包括完整植物、分支生出的植物器官和/或结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药)、胚珠(包括卵和中心细胞)、种子(包括合子、胚、胚乳和种皮)、果实(例如，成熟的子房)、籽苗、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)、细胞(例如，保卫细胞、卵细胞、毛状体等)、以及其后代。本发明的方法中可以使用的植物分类，通常与服从转化技术的高级或低级植物的分类一样宽泛，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。其包括多种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。
发明详述
I.引言
已发现，入侵性真核真菌病原体如葡萄孢属和轮枝菌属已进化了新的毒力机制，其通过使用小RNA作为效应物分子来抑制宿主免疫应答以实现成功的感染。还发现了，大部分小RNA效应物由转座子区域生成，主要由逆转录转座子长末端重复(LTR)生成。如其他真菌病原体和卵菌病原体的基因组研究所报导的，许多真菌蛋白效应物基因也在转座子区域(包括LTR)富集。这些LTR来源的小RNA(包括大多数小RNA效应物)由真菌Dicer-样蛋白(DCL)生成。
如本文所示，DCL基因对于诸如真菌病原体葡萄孢属和轮枝菌属的具有小RNA效应物的真核病原体的致病性是重要的。因此，DCL基因是用于控制那些使用小RNA作为效应物的真核病原体的优秀靶标。例如，葡萄孢属是不仅在本领域还在收获后阶段是重要的病原体，并且可以感染许多不同的果实、蔬菜和开花植物。
因此，本发明的一方面涉及通过使入侵性真菌病原体和卵菌病原体的DCL基因和LTR沉默(例如，使用宿主诱导基因沉默(HIGS)机制)来控制由入侵性真菌病原体和卵菌病原体引起的疾病。在一些实施方案中，通过生成表达靶向真菌DCL或卵菌DCL的反义(例如，RNAi)构建体的转基因植物来实现沉默。在一些实施方案中，通过使植物接触(例如，喷洒)靶向病原体DCL的小RNA双链体或双链RNA来实现沉默。葡萄孢属DCL和轮枝菌属DCL是示例性的可以靶向的基因。
II.真菌病原体DCL基因和LTR区
一方面，提供了抑制或沉默真菌病原体Dicer-样(DCL)基因或长末端重复(LTR)区的表达的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使这样的表达盒在植物中表达：所述表达盒包含可操作地连接至抑制真菌病原体DCL基因表达的多核苷酸的启动子，或者所述表达盒包含可操作地连接至抑制真菌病原体LTR区表达的多核苷酸的启动子。在一些实施方案中，所述方法包括使植物接触这样的构建体：所述构建体包含可操作地连接至抑制真菌病原体DCL基因表达的多核苷酸的启动子，或者所述构建体包含可操作地连接至抑制真菌病原体LTR区表达的多核苷酸的启动子。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与DCL基因或其片段互补的反义核酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含靶向DCL基因或其片段的小RNA双链体或双链RNA。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列包含靶向DCL基因的序列的反向重复序列，其任选地具有存在于反向重复序列之间的间隔。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与LTR区或其片段互补的反义核酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含靶向LTR区或其片段的小RNA双链体或双链RNA。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列包含靶向LTR区的序列的反向重复序列，其任选地具有存在于反向重复序列之间的间隔。在一些实施方案中，所述启动子是可诱导启动子。在一些实施方案中，所述启动子是组成型活性启动子。
另一方面，提供了病原体DCL基因或LTR区的表达被抑制或沉默的植物。在一些实施方案中，使植物接触抑制病原体DCL基因或病原体LTR区表达的多核苷酸，其中所述植物相对于未接触多核苷酸的对照植物具有增强的病原体抗性。在一些实施方案中，所述植物包含异源表达盒，所述表达盒包含抑制病原体DCL或LTR区表达的多核苷酸，其中所述植物相对于缺乏所述表达盒的对照植物具有增强的病原体抗性。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与DCL基因或LTR区或其片段互补的反义核酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含靶向DCL基因或LTR区或其片段的双链核酸。
另一方面，提供了包含可操作地连接至抑制病原体DCL基因表达的多核苷酸的启动子的表达盒，或者包含所述表达盒的分离的核酸。在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至包含反义核酸的多核苷酸的启动子，所述反义核酸与DCL基因或其片段互补。在一些实施方案中，所述表达盒包含可操作地连接至包含靶向DCL基因或其片段的双链核酸的多核苷酸的启动子。在一些实施方案中，相比缺乏所述表达盒的对照植物，引入所述表达盒的植物具有增强的对病原体的抗性。
病原体DCL基因以及靶向病原体DCL基因的多核苷酸
在一些实施方案中，待靶向或待沉默的病原体DCL基因或DCL启动子来自：病毒、细菌、真菌、线虫、卵菌、或昆虫病原体。在一些实施方案中，DCL基因来自真菌病原体。植物真菌病原体的实例包括但不限于：葡萄孢属(Botyritis)、轮枝菌属、稻瘟病菌属(Magnaporthe)、核盘菌属(Sclerotinia)、柄锈菌属(Puccinia)、镰刀菌属(Fusarium)、球腔菌属(Mycosphaerella)、布氏白粉属(Blumeria)、刺盘孢属(Colletotrichum)、黑粉菌属(Ustilago)以及栅锈菌属(Melampsora)。参见，例如，Dean et al.，Mol Plant Pathol 13：804(2012)。在一些实施方案中，所述病原体是葡萄孢属。在一些实施方案中，所述病原体是葡萄孢菌。在一些实施方案中，所述病原体是轮枝菌属。在一些实施方案中，所述病原体是大丽轮枝菌。
在一些实施方案中，靶向、沉默或抑制了一种或多种病原体DCL基因，以便通过在植物中表达抑制病原体DCL基因表达的多核苷酸、或者使与DCL基因或其片段互补的多核苷酸与所述植物接触，来增强对病原体的抗性。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与DCL基因或其片段互补的反义核酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含靶向DCL基因或其启动子或其片段的双链核酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含具有与DCL基因或其片段相同或基本相似(至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)的序列的双链核酸。在一些实施方案中，DCL基因或启动子的“片段”包含DCL基因或启动子的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多个连续核苷酸的序列(例如，包含至少(例如，SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：28、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31中任何序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多个连续核苷酸)。在一些实施方案中，所述双链核酸是小RNA双链体或双链RNA。
在一些实施方案中，所述多核苷酸抑制了编码葡萄孢属或轮枝菌属DCL蛋白的真菌病原体DCL基因的表达。在一些实施方案中，所述多核苷酸抑制了编码与SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：4、或其片段相同或基本相同(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)的葡萄孢属DCL蛋白的真菌DCL基因的表达。在一些实施方案中，所述多核苷酸抑制了编码与SEQ ID NO：6、或SEQ IDNO：8、或其片段相同或基本相同(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)的轮枝菌属DCL蛋白的真菌DCL基因的表达。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、或SEQ ID NO：3、或其片段或其互补链相同或基本相同(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)的序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：7、或其片段或其互补链相同或基本相同(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)的序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、或SEQ ID NO：12、或其片段或其互补链相同或基本相同(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)的序列。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中的任何序列、或其片段、或其互补链相同或基本相同(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)的序列的反向重复序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含反向重复序列之间的间隔。
在一些实施方案中，所述多核苷酸靶向真菌病原体DCL基因的启动子区域。例如，在一些实施方案中，所述多核苷酸靶向SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30或SEQID NO：31中的任何序列中的启动子区域。
在一些实施方案中，靶向了两种或更多种真菌病原体DCL基因或启动子(例如，来自相同真菌病原体或者来自两种或更多种真菌病原体的两种、三种、四种或更多种DCL基因或启动子)。在一些实施方案中，靶向了两种或更多种葡萄孢属DCL基因或启动子。例如，在一些实施方案中，靶向了SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29中的两种或更多种或者其中任何序列的片段，以抑制表达。在一些实施方案中，靶向了两种或更多种轮枝菌属DCL基因或启动子。例如，在一些实施方案中，靶向了SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31中两种或更多种或者其中任何序列的片段，以抑制表达。
病原体LTR区以及靶向病原体LTR区的多核苷酸
可以靶向生成大多数小RNA效应物的LTR区以便沉默。在一些实施方案中，例如对于灰色葡萄孢菌，sRNA效应物来源于LTR逆转录转座子区域。另外，还可以靶向LTR的启动子区域以便沉默。靶向LTR启动子区域可以引发转录基因沉默，其会避免宿主基因被LTR小RNA随机沉默。
在一些实施方案中，所述多核苷酸靶向或抑制了病原体LTR区或病原体LTR的启动子区域的表达，其中所述病原体是真菌病原体。在一些实施方案中，所述病原体是葡萄孢属。在一些实施方案中，所述病原体是葡萄孢菌。在一些实施方案中，所述病原体是轮枝菌属。在一些实施方案中，所述病原体是大丽轮枝菌。
在一些实施方案中，所述多核苷酸靶向了SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26或SEQID NO：27中的任何序列，或其片段，或其互补链。在一些实施方案中，LTR区或LTR启动子的“片段”包含所述LTR区或LTR启动子的至少15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多个连续核苷酸的序列(例如，包含SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：26或SEQ ID NO：27中任何序列的至少15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多个连续核苷酸)。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27中任何序列或其片段互补的反义核酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含具有与SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27中任何序列或其片段相同或基本相似(至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)的序列的双链核酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27中任何序列的片段的反向重复序列，并且还包含分隔所述反向重复核苷酸序列的间隔区域。
在一些实施方案中，所述多核苷酸靶向了真菌LTR的启动子区域。例如，在一些实施方案中，所述多核苷酸靶向了SEQ ID NO：27的序列中的启动子区域。
宿主诱导基因沉默
在一些实施方案中，抑制或沉默真菌病原体DCL基因或LTR区表达的方法，利用宿主诱导基因沉默(HIGS)机制以在宿主植物中产生抑制性RNA，随后所述抑制性RNA转移进入病原体以抑制病原体基因或区域的表达。在一些实施方案中，将HIGS用于在植物中产生靶向一种或多种病原体DCL或LTR的抑制性RNA(例如，sRNA)。在一些实施方案中，其中病原体具有超过一种的DCL，将HIGS用于产生靶向病原体的每种DCL的抑制性RNA(例如，sRNA)(例如，对于葡萄孢属，靶向DCL1和DCL2)。在一些实施方案中，将HIGS用于产生针对多种病原体的DCL或LTR的抑制性RNA(例如，sRNA)。
在例如Nowara et al.(Plant Cell(2010)22：3130-3141)；Nunes et al.(MolPlant Pathol(2012)13：519-529)；和Govindarajulu et al.(Plant BiotechnologyJournal(2014)1-9)中，描述了HIGS用于沉默植物中病原体基因表达的用途。在例如US2015/0203865中描述了病原体sRNA，其通过引用并入本文。
反义技术
在一些实施方案中，反义技术用于沉默或灭活(inactive)病原体DCL基因或LTR。经转化进入植物的反义核酸序列将与待沉默基因的至少一段基本相同。在一些实施方案中，经转化进入植物的反义核酸序列与待阻断的病原体DCL序列或LTR序列相同或基本相同。在一些实施方案中，所述反义多核苷酸序列与待阻断的病原体DCL序列或LTR序列互补。然而，所述序列不是必须完全相同以抑制表达。因此，在一些实施方案中，可以使用与待阻断的病原体DCL序列或LTR序列基本互补(例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％互补)的反义多核苷酸序列(例如，在异源启动子控制下的表达盒中，然后其经转化进入植物使得反义核酸产生)。
在一些实施方案中，仅包含病原体DCL基因序列或LTR序列的片段或仅与病原体DCL基因序列或LTR序列的片段互补的反义或有义核酸分子，可用于产生病原体基因表达被沉默的植物。例如，可以使用约15、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸的序列。
催化性RNA分子或核酶也可以用于抑制病原体DCL基因或LTR的表达。有可能设计特异性地与几乎任何靶标RNA配对并且在特定的位置断裂磷酸二酯骨架从而在功能上使靶标RNA失活的核酶。在进行这种断裂时，所述核酶自身不改变，并且因此能够回收并且断裂其他的分子，使其成为真正的酶。反义RNA内包含核酶序列为其赋予了RNA-断裂活性，从而增强了构建体的活性。
已鉴定了多类核酶。一类核酶来源于多种能够在植物中自身断裂并复制的小环形RNA。所述RNA单独复制(类病毒RNA)或者与辅助病毒一起复制(卫星RNA)。实例包括来自鳄梨日斑类病毒的RNA，以及来自烟草环斑病毒、紫花苜蓿短暂条纹病毒、绒毛烟草斑驳病毒、莨菪斑驳病毒和地三叶斑驳病毒的卫星RNA。靶标RNA特异性核酶的设计和用途描述于Haseloff et al.Nature，334：585-591(1988)。
抑制的另一个方法是有义抑制(也被称为共抑制)。其中核酸以启动子的有义方向设置的表达盒的引入，已经显示出是阻断靶标基因的转录的有效手段。通常，当需要抑制表达时，发生一些引入序列的转录。当引入的序列本身不含有编码序列，而仅含有与内源性序列的初级转录物中存在的序列同源的内含子或非翻译序列时，可以发生作用。所述引入的序列通常将与待抑制的序列基本相同。对于靶标基因序列(例如，DCL或LTR序列)，这种最小同一性通常将高于约65％，但更高的同一性可以对内源性序列的表达施加更有效的抑制。在一些实施方案中，使用了具有高得多的同一性的序列，例如，使用了至少约80％，至少约95％或100％的同一性。对于反义调控，可以对所述作用进行设计和测试，以便不会显著影响表现出同源性或基本同源性的类似家族的基因中其他蛋白的表达。
对于有义抑制，表达盒中引入的序列不需要绝对同一性，相对于初级转录产物或完全加工的mRNA也不需要是全长的。这可以是优选的，以避免同时产生一些过表达的植物。短于全长的序列中更高的同一性，补偿了较长的、同一性较低的序列。此外，引入的序列不必具有相同的内含子或外显子模式，并且非编码片段的同一性将同样有效。在一些实施方案中，使用了用于反义调控的上述大小范围的序列，例如，至少约15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多个核苷酸。
也可以通过RNA干扰(RNAi)来抑制基因表达(并且实际上共抑制可以被认为是一种RNAi)，所述RNA干扰使用具有与靶标基因序列相同或相似的序列的双链RNA。RNAi是这样的现象：当将具有与靶标基因序列相同或相似的序列的双链RNA引入细胞时，插入的外源基因和靶标内源基因的表达均被抑制。双链RNA可以由两条单独的互补RNA形成，或者可以是具有形成双链RNA的内部互补序列的单个RNA。虽然RNAi机制的完整详细内容仍然未知，但认为引入的双链RNA最初断裂为小片段，然后所述小片段以一些方式用作靶标基因的指示(indexes)，从而降解靶标基因。也已知RNAi在植物中是有效的(参见，例如，Chuang，C.F.&Meyerowitz，E.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985(2000)；Waterhouse et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：13959-13964(1998)；Tabara et al.Science 282：430-431(1998)；Matthew，Comp Funct.Genom.5：240-244(2004)；Lu，et al.，Nucleic AcidsResearch32(21)：e171(2004))。例如，为了使用RNAi实现病原体DCL表达的抑制，可以在植物中表达反向重复方向的具有间隔的基因片段(例如，来自DCL基因)以生成具有编码DCL蛋白的mRNA序列或其基本类似的序列(包括那些被工程化不翻译蛋白的序列)或其片段的双链RNA，将所述双链RNA引入植物或其他目标有机体。然后，可以对得到的植物/有机体筛选与靶标蛋白有关的表型，和/或通过监控编码所述蛋白的转录物的稳态RNA水平进行筛选。虽然用于RNAi的基因不需要与靶标基因完全相同，但它们可以与靶标基因序列有至少70％、80％、90％、95％或更高的相同。参见，例如，第2004/0029283号美国专利公开的用于抑制基因表达的非相同siRNA序列的实例。编码具有与靶标基因无关且位于对目标基因有特异性的序列远端的茎环结构的RNA分子的构建体，也可以用于抑制靶标基因表达。参见，例如，第2003/0221211号美国专利公开。还描述了通过表达小RNA双链体在植物中进行基因沉默，例如，在Lu et al.，Nucleic Acids Res.32(21)：e171(2004)中描述。
RNAi多核苷酸可以涵盖全长的靶标RNA，或者可以与靶标RNA的片段对应。在一些情况下，所述片段将具有少于100、200、300、400、500、600、700、800、900或1,000个与靶标序列对应的核苷酸。另外，在一些实施方案中，这些片段为至少，例如，10、15、20、50、100、150、200或更多个核苷酸的长度。在一些情况下，用于RNAi的片段将至少与以下靶标蛋白的区域基本相似：所述区域在有机体的其他蛋白中不存在，或者可以选择以具有与其他有机体转录物尽可能小的相似性，例如，在分析公众可用的序列数据库时通过进行序列比较来选择。
在瞬时转染和稳定转染的细胞中连续表达siRNA的表达载体已被工程化，以便表达小发夹RNA，其在体内加工成为能够进行基因特异性沉默的siRNA分子(Brummelkamp etal.，Science 296：550-553(2002)，以及Paddison，et al.，Genes&Dev.16：948-958(2002))。通过双链RNA进行转录后基因沉默，由Hammond et al.，Nature Rev Gen 2：110-119(2001)，Fire et al.，Nature 391：806-811(1998)以及Timmons and Fire，Nature395：854(1998)更详尽地讨论。
在植物中抑制基因表达的另一种方式，是通过抑制靶标基因的微RNA的重组表达。人造的微RNA是单链RNA(例如，18-25mers，通常21mers)，其并非通常存在于植物中，并且由内源性miRNA前体加工。根据植物miRNA靶标选择的决定子来设计它们的序列，使得人造微RNA特异性地沉默其预期的靶标基因，所述序列通常描述于Schwab et al，The Plant Cell18：1121-1133(2006)，以及在本文描述的设计此类微RNA的基于互联网的方法中描述。还参见第2008/0313773号美国专利公开。
在植物中抑制基因表达的另一种方式，是通过将dsRNA应用至植物表面或植物的部分(例如，应用至叶、花、果实或蔬菜上)，例如通过将dsRNA喷洒至表面，或者将dsRNA涂刷至表面。例如，在WO2013/02560和Gan et al.，Plant CellReports 29：1261-1268(2010)中描述了将dsRNA应用至外部植物部分上的方法，所述文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，诸如dsRNA或sRNA的反义序列可以在植物内合成并且由所述植物提取，以便之后用于靶标植物。作为非限制性实例，产生一种或多种目标dsRNA或sRNA序列的构建体，可以例如通过用土壤杆菌属(Agrobacterium)浸润来瞬时引入植物(例如，本塞姆氏烟草)中。所述dsRNA或sRNA序列通过所述植物产生然后从所述植物的一种或多种组织提取RNA，以便提取目标dsRNA或sRNA序列。由本塞姆氏烟草表达并提取反义序列的示例性方法，在下文的实施例部分描述。
III.制备具有增强的病原体抗性的植物的方法
另一方面，提供了制备具有增强的病原体抗性的植物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：
向植物引入异源表达盒，所述异源表达盒包含可操作地连接至抑制病原体DCL基因的真菌表达的多核苷酸的启动子；以及
选择包含所述表达盒的植物。
在一些实施方案中，所述方法还包括向所述植物引入第二异源表达盒，所述第二异源表达盒包含可操作地连接至抑制第二病原体DCL基因的真菌表达的第二多核苷酸的第二启动子；以及选择包含第二表达盒的植物。
在一些实施方案中，本文描述了抑制病原体DCL基因的真菌表达的多核苷酸(例如，在上文的部分II中，例如，诸如发夹RNA或微RNA前体的反义多核苷酸)。例如，在一些实施方案中，所述多核苷酸抑制了一种、两种、三种、四种或更多种葡萄孢属或轮枝菌属DCL基因的表达。在一些实施方案中，所述多核苷酸抑制了SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQID NO：30或SEQ ID NO：31中的一种、两种、三种、四种或更多种的表达。
在一些实施方案中，相对于缺乏表达盒的对照植物，引入了表达盒的植物具有增强的病原体抗性。在一些实施方案中，相对于缺乏表达盒的对照植物，引入了表达盒的植物具有增强的对真菌病原体(例如，葡萄孢属或轮枝菌属)的抗性。
在一些实施方案中，所述启动子与所述多核苷酸异源。在一些实施方案中，编码sRNA抗性靶标的多核苷酸可操作地连接至可诱导启动子。在一些实施方案中，所述启动子是病原体可诱导的(例如，葡萄孢属可诱导启动子)。在一些实施方案中，所述启动子是胁迫可诱导的(例如，非生物胁迫可诱导启动子)。
在一些实施方案中，所述方法包括：
使多种植物接触构建体，所述构建体包含可操作地连接至抑制病原体DCL基因或病原体LTR区的真菌表达的多核苷酸的启动子，其中相比未接触所述构建体的对照植物，所述植物具有增强的对病原体的抗性。
在一些实施方案中，所述方法还包括选择具有增强的病原体抗性的植物。
在一些实施方案中，所述方法包括：
使植物或植物的部分接触靶向病原体DCL基因或病原体LTR区的双链RNA、小RNA双链体或小RNA(sRNA)，其中相比未接触所述双链RNA或小RNA双链体的对照植物，所述植物或植物的部分具有增强的对病原体的抗性。
在一些实施方案中，所述双链RNA或小RNA双链体(例如，siRNA)或sRNA靶向葡萄孢属DCL或轮枝菌属DCL。在一些实施方案中，所述双链RNA、或小RNA双链体或sRNA靶向SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中的任何序列或其片段。在一些实施方案中，所述双链RNA为siRNA。在一些实施方案中，所述siRNA包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中的任何序列或其片段(例如，至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个连续核苷酸的片段)或其互补链相同的序列。
在一些实施方案中，所述方法包括使植物或植物的部分接触两种、三种、四种、五种或更多种双链RNA、或小RNA双链体(例如，siRNA)或sRNA，以便靶向来自一种、两种、三种或更多种不同病原体的两种、三种、四种、五种或更多种病原体DCL基因或病原体LTR区。作为非限制性实例，在一些实施方案中，使植物接触靶向葡萄孢属DCL1的双链RNA或小RNA双链体(例如，siRNA)或sRNA，以及靶向葡萄孢属DCL2的双链RNA或小RNA双链体(例如，siRNA)或sRNA。作为另一个非限制性实例，在一些实施方案中，使植物接触靶向轮枝菌属DCL1的双链RNA或小RNA双链体(例如，siRNA)或sRNA，以及靶向轮枝菌属DCL2的双链RNA或小RNA双链体(例如，siRNA)或sRNA。作为另一个非限制性实例，在一些实施方案中，使植物接触靶向葡萄孢属的一种或多种DCL(例如，葡萄孢属DCL1和/或葡萄孢属DCL2)的双链RNA或小RNA双链体(例如，siRNA)或sRNA，并且接触靶向轮枝菌属的一种或多种DCL(例如，轮枝菌属DCL1和轮枝菌属DCL2)的双链RNA或小RNA双链体(例如，siRNA)或sRNA。
在一些实施方案中，将所述双链RNA或小RNA双链体(例如，siRNA)或sRNA喷洒或涂刷至植物或植物的部分上(例如，喷洒或涂刷至叶、果实、蔬菜或花上)。在一些实施方案中，使所述双链RNA或小RNA双链体(例如，siRNA)或sRNA接触(例如，喷洒或涂刷至)从植物分离的植物的部分。作为非限制性的实例，所述双链RNA或小RNA双链体(例如，siRNA)或sRNA可以接触(例如，喷洒或涂刷至)已从植物剪下的果实、蔬菜或花。在一些实施方案中，使所述双链RNA或小RNA双链体(例如，siRNA)或sRNA接触(例如，喷洒或涂刷至)植物的部分(例如，果实、蔬菜或花)，而所述部分仍然与植物连接。
IV.多核苷酸和重组表达载体
本发明的多核苷酸的分离可以通过多种技术来完成。例如，基于本文公开的序列的寡核苷酸探针，可以用于识别来自期望的植物物种的cDNA或基因组DNA文库中所期望的多核苷酸。为了构建基因组文库，通过随机断裂(例如使用限制性内Dicer-)生成基因组DNA的大片段，并且连接至载体DNA以形成可以包装至适当载体中的串联体。或者，可以构建来自植物或植物的部分(例如，花)的cDNA文库。
然后可以使用基于本文公开的序列的探针来筛选cDNA或基因组文库。探针可以用于与基因组DNA或cDNA序列杂交以隔离相同或不同植物物种中的同源基因。或者，针对多肽生成的抗体可以用于筛选mRNA表达文库。
或者，可以使用扩增技术从核酸样品扩增目标核酸。例如，聚合酶链反应(PCR)技术直接从mRNA、cDNA、基因组DNA、基因组文库或cDNA文库扩增基因序列。PCR和其他体外扩增方法也可以在以下方面是有用的，例如，克隆编码待表达的蛋白的核酸序列，制备核酸以用作检测期望mRNA在样品中存在、核酸测序或其他目的的探针。PCR的总体概述，参见PCRProtocols：A Guide to Methods andApplications.(Innis，M，Gelfand，D.，Sninsky，J.and White，T.，eds.)，Academic Press，San Diego(1990)。
也可以通过技术文献中描述的熟知技术来合成多核苷酸。参见，例如，Carrutherset al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-418(1982)，以及Adams et al.，J.Am.Chem.Soc.105：661(1983)。然后双链DNA片段可以通过以下方式获得：合成互补链并且在适当的条件下将所述链一起退火，或者通过使用具有适当引物序列的DNA聚合酶添加互补链。
一旦得到抑制真菌Dicer-样(DCL)基因或LTR区表达的多核苷酸序列，或者与真菌病原体DCL基因或LTR区或其片段互补的多核苷酸序列，其可以用于制备在植物中表达的表达盒。在一些实施方案中，所述多核苷酸的表达直接通过异源启动子。
多种本领域熟知手段中的任何手段，可以用于驱动目标多核苷酸序列在植物中表达。可以靶向任何器官，例如分支生出的植物器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)以及果实。或者，表达可以条件为仅在某些条件(例如，使用可诱导启动子)下发生。
例如，植物启动子片段可以用于直接表达再生植物的所有组织中的目标多核苷酸序列。此类启动子在本文被称为“组成型”启动子，并且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下具有活性。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区域，来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1′-启动子或2′-启动子，以及来自技术人员已知的多种植物基因的其他转录起始区域。
或者，植物启动子可以在特定组织中(组织特异性启动子)或者可以在另外的更严格环境控制下(可诱导启动子)直接表达目标多核苷酸序列。在发育控制下的组织特异性启动子的实例，包括仅在某些组织如叶或保卫细胞中起始转录的启动子(包括但不限于在WO/2005/085449；第6,653,535号美国专利；Li etal.，Sci China C Life Sci.2005Apr；48(2)：181-6；Husebye，et al.，PlantPhysiol，April 2002，Vol.128，pp.1180-1188；和Plesch，et al.，Gene，Volume 249，Number 1，16May 2000，pp.83-89(7)中描述的那些)。可以通过可诱导启动子影响转录的环境条件的实例，包括病原体的存在、厌氧条件、高温、或光的存在。
在一些实施方案中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，所述启动子是可诱导启动子。在一些实施方案中，所述启动子是胁迫可诱导的(例如，非生物胁迫可诱导)。在一些实施方案中，所述启动子是病原体可诱导的。在一些实施方案中，所述启动子通过葡萄孢属感染诱导。病原体可诱导启动子的非限制性实例，包括葡萄孢属诱导激酶1(BIK1)和植物防御基因PDF1.2。参见，例如，Penninckx et al.，Plant Cell 10：2103-2113(1998)；还参见Veronese et al.，Plant Cell18：257-273(2006)。
在一些实施方案中，可以在编码区域的3′-端包含聚腺苷酸化区域。聚腺苷酸化区域可以来源于NH3基因，来源于多种其他植物基因，或来源于T-DNA。
包含序列的载体通常会包含赋予植物细胞可选择的表型的标记基因。例如，标记基因可以编码杀生物剂抗性，尤其是抗生素抗性，例如对卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素的抗性，或除草剂抗性，例如对氯磺隆(chlorosluforon)或Basta的抗性。
V.转基因植物的产生
如本文详细描述的，本发明的实施方案提供了包含用于表达本文描述的多核苷酸序列(例如，抑制真菌病原体Dicer-样(DCL)基因表达的多核苷酸，或抑制真菌病原体LTR区表达的多核苷酸，例如表达发夹RNA或微RNA前体的多核苷酸)的重组表达盒的转基因植物。在一些实施方案中，生成的转基因植物含有来源于不同于转基因植物物种的一个物种的多核苷酸的完整或部分序列。应认识到，转基因植物涵盖引入了表达盒的植物或植物细胞，以及此类含有所述表达盒的植物或植物细胞的后代，包括具有稳定整合在染色体中的表达盒的后代。
在一些实施方案中，包含用于表达本文描述的多核苷酸序列的重组表达盒的转基因植物，相比缺乏所述重组表达盒的植物具有增大的或增强的病原体抗性，其中包含用于表达所述多核苷酸序列的重组表达盒的转基因植物，与缺乏所述重组表达盒的植物具有几乎相同的生长。描述了用于确定增强的病原体抗性的方法，例如，在下文的部分VI中描述。
本文描述的重组表达载体，可以通过多种常规技术引入期望的植物宿主的基因组。例如，可以使用诸如电穿孔和植物细胞原生质体的显微注射的技术，将DNA构建体直接引入植物细胞的基因组DNA，或者可以使用冲击方法(例如DNA颗粒轰击)将DNA构建体直接引入植物组织。或者，DNA构建体可以与适合的T-DNA侧翼区域结合并引入常规根癌农杆菌宿主载体。根癌农杆菌宿主的毒力功能将会导致当细胞被细菌感染时，所述构建体和相邻的标记物插入植物细胞DNA中。当本发明涵盖目标多核苷酸序列的瞬时表达时，本发明构建体的一般表达将来自将表达盒插入植物基因组中，例如，使得至少一些植物后代也含有整合的表达盒。
显微注射技术也适用于此目的。这些技术是本领域所熟知的，并且在文献中全面地进行了描述。使用聚乙二醇沉淀来引入DNA构建体，在Paszkowski et al.EMBOJ.3：2717-2722(1984)中描述。电穿孔技术在Fromm et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5824(1985)中进行了描述。冲击转化技术在Klein et al.Nature 327：70-73(1987)中进行了描述。
根癌农杆菌介导的转化技术，包括双运载体的卸除和使用，在科学文献中很好地进行了描述。参见，例如，Horsch et al.Science233：496-498(1984)，以及Fraley etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：4803(1983)。
可以培养由任何上述转化技术产生的转化的植物细胞，以便再生成具有转化的基因型并因此具有期望的表型(如增强的病原体抗性)的完整植物。这种再生技术依靠对组织培养生长培养基中某些植物激素的调控，通常依靠与期望的核苷酸序列一同引入的杀生物剂和/或除草剂标记物。由培养的原生质体再生的植物，在Evans et al.，ProtoplastsIsolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture，pp.124-176，MacMillilanPublishing Company，New York，1983；以及Binding，Regeneration of Plants，PlantProtoplasts，pp.21-73，CRC Press，Boca Raton，1985中进行了描述。再生也可以来自植物愈伤组织、外植体、器官或其部分。此类再生技术在Klee et al.Ann.Rev.of PlantPhys.38：467-486(1987)中进行了概述。
技术人员将认识到，在表达盒稳定地并入转基因植物并且证实可操作后，其可以通过有性杂交来引入至其他植物。根据待杂交的物种，可以使用众多标准育种技术中的任何技术。
VI.选择具有增强的病原体抗性的植物
本发明的表达盒和反义构建体(例如，双链RNA或小RNA双链体，例如，siRNA)，可以用于为基本上任何植物或植物的部分赋予增大的或增强的病原体抗性。因此，本发明在广泛的植物范围中具有用途，所述植物包括但不限于以下属的物种：葱属(Allium)、天门冬属、颠茄属、燕麦属、芸苔属、柑橘属、西瓜属、辣椒属、黄瓜属、南瓜属、胡萝卜属、草莓属、大豆属、棉属、向日葵属、萱草属、大麦属、天仙子属、莴苣属、亚麻属、毒麦属、番茄属、苹果属、木薯属、Majorana、苜蓿属、烟草属、稻属、黍属、狼尾草属、鳄梨属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、蔷薇属、黑麦属、千里光属、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、胡芦巴属、小麦属、葡萄属、豇豆属以及玉蜀黍属。在一些实施方案中，所述植物是蔓生植物，例如，来自葡萄属(Vitis)的物种。在一些实施方案中，所述植物是观赏植物，例如，来自蔷薇属(Rosa)的物种。在一些实施方案中，所述植物是产生蔬菜或果实的植物，例如，番茄植物或草莓植物。在一些实施方案中，所述植物是单子叶植物。在一些实施方案中，所述植物是双子叶植物。
具有增强的病原体抗性的植物(或植物的部分)可以以多种方式选择。本领域普通技术人员将认识到，以下方法仅仅是一些可能的方式。选择具有增强的病原体抗性的植物或植物的部分(例如，果实、蔬菜、叶和花)的一个方法是，确定植物对具体的植物病原体的抗性。可能的病原体包括但不限于：病毒、细菌、线虫、真菌或昆虫(参见，例如，Agrios，Plant Pathology(Academic Press，San Diego，CA)(1988))。本领域技术人员将认识到，植物的抗性反应根据多种因素而变化，包括所使用的病原体、化合物或植物。通常，在与对照植物比较时，通过疾病症状的减少或消除(例如，植物或植物的部分上病斑数量或大小的减小，或者真菌生物量的减小)来测量增强的抗性。在一些实施方案中，当相对于对照(例如，相对于其中靶向真菌病原体DCL或LTR的异源多核苷酸未表达的植物)，植物或植物的部分上病斑数量或大小或者真菌生物量减小至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多时，抗性增强。
在一些情况中，也可以通过植物的超敏反应(HR)产生来测量增强的抗性(参见，例如，Staskawicz et al.(1995)Science 268(5211)：661-7)。相对于对照植物，具有增强的病原体抗性的植物可以产生增强的超敏反应。
也可以通过测量可操作地连接至防御相关启动子的基因的表达增多，来确定增强的病原体抗性。此类表达的测量，可以通过定量RNA或后续蛋白产物的累积来测量(例如，分别使用Northern或Western印迹技术，参见，例如，Sambrook et al.和Ausubel et al.)。
VII.实施例
实施例1：靶向DCL基因以减弱真菌毒力
真核小RNA(sRNA)是以转录水平和转录后水平诱导靶标基因沉默的短的调控非编码RNA。内切核糖核酸酶Dicer-或Dicer-样蛋白(DCL)加工双链RNA(dsRNA)或具有发夹结构的RNA，产生大多数20-30-nt长度的sRNA，其载入Argonaute(AGO)蛋白，以便通过引导mRNA断裂或降解、翻译抑制、DNA甲基化和组蛋白修饰来诱导其互补靶标的基因沉默。sRNA在植物病原体相互作用中的作用，包括来自细菌病原体和真核植物病原体的非编码sRNA在致病性方面的作用，在Weiberg et al.，Annu.Rev.Phtopathol.2014，52：22.1-22.22中进行了描述，该文献通过引用并入本。
sRNA效应物，如在灰色葡萄孢菌中存在的那些效应物，由转座元件(TE)转录，并且抑制宿主免疫相关的基因。宿主植物抗性基因常在富集有TE的基因组基因座中聚集。类似地，常发现蛋白效应物基因为聚集物并且散布着TE。参见，例如，图2的Weiberg。
因为大部分的葡萄孢属小RNA效应物由LTR区生成，各个LTR存在多重拷贝，这使得Bc-sRNA敲除是不切实际的，甚至是不可能的。因此，为解决该问题，生成了葡萄孢属DCL敲除突变体。
如图1所示，灰色葡萄孢菌基因组具有两种DCL(dcl-1和dcl-2)。生成了单突变体和双突变体(dcl1突变体、dcl2突变体、和dcl1 dcl2突变体)菌株。如图2所示，所有灰色葡萄孢菌dcl1突变体、dcl2突变体和dcl1 dcl2突变体菌株，显示出分生孢子的生长阻滞和延迟发育(图2A)，但仅有双突变体菌株(dcl1 dcl2)不能产生Bc-sRNA效应物(图2B)。
灰色葡萄孢菌DCL对于灰色葡萄孢菌的致病性是重要的。如图3所示，相比拟南芥属和番茄中的野生型，dcl1 dcl 2双突变体产生了弱得多的疾病症状，并且大程度地减弱了灰色葡萄孢菌的毒力，但dcl1单突变体或dcl2单突变体不能。类似地，图4显示出灰色葡萄孢菌dcl1dcl2双突变体对果实、蔬菜和花的毒力小得多。
对dcl1 dcl2突变体菌株和野生型的全基因组比较sRNA分析显示出，葡萄孢属DCL负责生成LTR来源的sRNA，其中许多为sRNA效应物。参见，图5A-B，图6和图7A-D。
灰色葡萄孢菌将小RNA递送至宿主细胞(例如，植物细胞)中以抑制宿主免疫系统。参见，例如，图2的Weiberg。另一种真菌植物病原体，大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)，其致病性也取决于AGO1功能。参见，例如，Ellendorf et al.，J.Exp Bot 2009；60：591-602。这说明，轮枝菌属可能与灰色葡萄孢菌具有类似的RNAi毒力机制。因为轮枝菌属通过根感染植物，我们使用了根培养来得到更多的用于拟南芥属AGO1相关小RNA的免疫沉淀反应的材料。将与拟南芥属AGO1相关的sRNA拉下，并经受深度测序。我们发现，一些轮枝菌属小RNA在感染后高度富集。我们发现，41Vd-sRNA具有拟南芥(A.thaliana)(At)靶标(使用100rpm和10倍富集作为截止值)。下文的表1示出了具有潜在宿主靶标的感染富集的轮枝菌属小RNA的实例。
这些结果说明，靶向真菌Dicer-样蛋白基因以减弱真菌毒力的RNAi构建体，可以在宿主植物(包括但不限于：番茄、葡萄和其他商业上重要的农作物)中表达。或者，RNAi构建体可以接触植物，例如通过喷洒在植物表面(例如，喷洒至叶的表面)，以提升真菌抗性。如图9所示，宿主诱导的针对灰色葡萄孢菌dcl1 dcl2的基因沉默(HIGS)(滴液接种)，增强了植物对灰色葡萄孢菌的耐受。另外，如图10所示，病毒诱导的针对灰色葡萄孢菌dcl1dcl2的基因沉默(VIGS)(喷洒接种)，增强了植物对灰色葡萄孢菌的耐受。
实施例2：通过真菌病原体DCL的体外沉默，在果实和蔬菜中增强真菌抗性或耐受
当用靶向真菌病原体DCL基因的sRNA处理果实、叶和蔬菜时，观察到了增强的真菌抗性。使用以下方案，用从表达靶向Bc-DCL的sRNA的本塞姆氏烟草提取的RNA来处理果实、叶或蔬菜。
方案
1.质粒构建。使用灰色葡萄孢菌cDNA作为模板，正向引物BcDCL1RNAi-F：
5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGCGGAAGAACTTGAAGGTTTGCTACA-3’，以及反向引物BcDCL1RNAi-R：5’-GTCCAGATCTGGTCAACACACCAAG-3’，252bp，扩增灰色葡萄孢菌DCL1(BcDCL1)RNAi片段。通过正向引物BcDCL2RNAi-F：5’-CTTGGTGTGTTGACCAGATCTGGACGGATGCCATTTGCTGCACGC-3’，以及反向引物BcDCL2RNAi-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACTCTTGAGTACTTTCGC CAGCTCAC-3’，238bp，扩增BcDCL2RNAi片段。通过重叠PCR，将这两类RNAi片段整合在一起成为BcDCL-RNAi，通过BP反应(Life Technologies)将其克隆至pDONR207中，并最终通过LR反应(Life Technologies)克隆至目的载体pHELLSGATE 8.0成为pHELLSGATE-BcDCL-RNAi。将这种载体以及阴性对照pHELLSGATE 8.0空载体转化进入根癌农杆菌(A.tumefaciens)GV3101菌株。
2.在本塞姆氏烟草中生成靶向DCL的sRNA。将携带pHELLSGATE-BcDCL-RNAi的根癌农杆菌GV3101菌株(RNAi菌株)和携带pHELLSGATE 8.0空载体的根癌农杆菌GV3101菌株(EV菌株)，在具有抗生素(100μg/μl壮观霉素，50μg/μl庆大霉素和50μg/μl利福平)的液体LB中，在28℃振动器上培养过夜。将EV和RNAi根癌农杆菌(A.tumefaciens)培养物在室温下以4000rpm离心15min，并且用5mL浸润缓冲液(10mM MgCl2，10mM MES，以及0.2mM乙酰丁香酮)再悬浮细菌团块。将EV和RNAi菌株溶液的OD600调节至1.0，并且在室温下保持4小时。在浸润即将开始前将两组溶液通过浸润缓冲液稀释至OD600＝0.5。然后，将EV和RNAi菌株溶液用于浸润4周龄的本塞姆氏烟草叶，并且进行2天的感染以便在RNAi菌株处理的组织中过表达靶向DCL的sRNA。
3.从本塞姆氏烟草提取sRNA。根据浸润的菌株(EV或RNAi)，分别收获浸润的本塞姆氏烟草叶组织，并且立即将它们在液氮中冷冻。使用研钵和研杵在液氮中将10g的各个组织研磨成细粉末，并且通过使用TRIzol试剂(Life Technologies)提取总RNA。将RNA团块再溶解于500μl DEPC处理的H2O，并且通过nanodrop检测EV和RNAi总RNA的浓度。将这两组RNA样品的最终浓度调节至50ng/μl备用。靶向Bc-DCL的sRNA仅存在于RNAi组中，但不存在于EV组，所述EV组用作阴性对照。
4.使用RNA提取物处理蔬菜或果实。将在类似条件(例如，类似的新鲜度、成熟度、大小、形状等)下的两组蔬菜或果实轻柔地洗涤，并且置于底部具有润湿滤纸来保湿的塑料盒中。第一组使用来自EV菌株浸润组织的RNA提取物均匀地处理，另一组使用来自RNAi菌株浸润组织的RNA提取物均匀地处理。通过喷洒或通过滴液接种来应用RNA提取物。
5.灰色葡萄孢菌感染。在喷洒RNA提取物后，进行灰色葡萄孢菌感染。将来自在麦芽提取物琼脂(Malt Extract Agar)培养基上生长的10天龄灰色葡萄孢菌的孢子洗脱在无菌H2O中，并且通过尼龙布从孢子中过滤真菌菌丝。通过血细胞计数器来计算灰色葡萄孢菌孢子浓度，并且在B5培养基(10mM蔗糖，10mM KH2PO4，Tween-200.025％)中稀释。将15μl的葡萄孢属孢子溶液(2×10-5)喷洒在经喷洒的果实或蔬菜的表面，并允许2-4天的灰色葡萄孢菌接种。不同的蔬菜或果实花费不同的时间来获得明显的疾病症状。
或者，使用“混合”方法来施用上文描述的总RNA和葡萄孢属孢子溶液(4×10-5)的1∶1混合物。在类似的条件下，将15ul的混合溶液直接滴至2组果实或蔬菜的表面。
结果
如图11所示，在使用含有siRBcDCL的RNA喷洒后，番茄对灰色葡萄孢菌的抗性更强。另外，图12-14显示出，灰色葡萄孢菌在与含有siRBcDCL的本塞姆氏烟草总RNA混合并应用至番茄(图12)、草莓(图13)或黄瓜(图14)时毒力减弱。
在另一个实验中，以来自用pHELLSGATE-BcDCL和pHELLSGATE-EV浸润的本塞姆氏烟草的总RNA，通过喷洒24小时来预处理番茄叶和果实、草莓果实和葡萄果实，然后在果实的经喷洒区域进行灰色葡萄孢菌滴液接种，减少了由灰色葡萄孢菌引起的灰霉病症状。参见，图15A-B。
在另一个实验中，使用针对BcDCL的体外转录的dsRNA喷洒番茄叶和果实，减少了番茄和草莓上由灰色葡萄孢菌引起的灰霉病。使用水或针对BcDCL的体外转录的长dsRNA，将番茄叶和果实以及草莓果实预处理24小时，然后在叶或果实的经预处理的区域进行灰色葡萄孢菌滴液接种。参见，图16。
实施例3：增强植物对多种病原体的耐受
将宿主诱导的基因沉默(HIGS)用于沉默植物中两种真菌病原体的Dicer-样蛋白(DCL)基因。将用于靶向来自葡萄孢属的两种DCL和来自轮枝菌属的两种DCL的RNAi方法用于拟南芥属，导致“HIGS-4DCL”系的生成。将HIGS-4DCL系以及野生型拟南芥属植物，使用灰色葡萄孢菌通过在叶上滴液接种来感染，并且使用大丽轮枝菌通过根接种来感染。感染后三周，相对于野生型植物，HIGS-4DCL系表现出对两种病原体增强的耐受。参见，图17。因此，本文描述的基因靶向方法可以用于同时靶向多种病原体。
实施例4：针对灰色葡萄孢(Botrytis cinerea)和其他利用小RNA效应物的病原体的靶向Dicer的小RNA介导的植物保护
真核病原体(如真菌和卵菌)每年在世界范围内导致数十亿美元的农作物损失。灰色葡萄孢菌通过在收获前和收获后阶段引起灰霉病对超过200种植物物种具有严重的威胁，包括几乎所有的蔬菜和果实以及多种花。Williamson et al.，Mol Plant Pathol8，561-580(2007)；van Kan，Trends in Plant Science 11：247-253(2006))。目前疾病控制主要通过应用杀真菌剂来实现，这成本高昂并且对环境有害。HIGS有效地作用于多种真菌和卵菌病原体，例如小麦白粉病菌(Blumeria graminis)(Nowara et al.，Plant Cell22，3130-3141(2010)；Pliego et al.，Molecular Plant-Microbe Interactions 26，633-642(2013)；Whigham et al.，Molecular Plant-Microbe Interactions 28，968-983(2015))、小麦条锈菌(Puccinia tritici)(Panwar et al，Plant Molecular Biology 81，595-608(2013))、镰孢菌(Fusarium spp.)(Koch et al.，PNAS 110，19324-19329(2013)；Ghag etal.，Plant Biotechnology Journal12：541-553(2014)；Cheng et al.，PlantBiotechnology Journal，doi：10.1111/pbi.12352(2015))、致病疫霉(Jahan et al.，Journal of Experimental Botany66：2785-2794(2015)；Sanju et al.，Functional&Integrative Genomics15：697-706(2015)、以及辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)(Vega-Arreguin et al.，Molecular Plant-Microbe Interactions 27，770-780(2014)。然而，成功的HIGS主要依靠对多种农作物不可用的植物转化技术，此外，转基因有机体(GMO)的安全性仍然是公众关注的主要问题。
结果
如上文在实施例1中讨论的，仅灰色葡萄孢菌的dcl1dcl2双突变体不能产生Bc-sRNA效应物，但dcl1单突变体或dcl2单突变体可以产生Bc-sRNA效应物，说明这些Bc-sRNA效应物依赖于Bc-DCL1和Bc-DCL2二者。为了完整地评估Bc-DCL依赖性Bc-sRNA效应物对于灰色葡萄孢菌针对众多经济重要农作物的致病性的影响，使用dcl1dcl2双突变体接种了各种果实(番茄-Solanum lycopersicum′Roma′，草莓-Fragaria×ananassa，和葡萄-Vitislabrusca ′Concord′)、蔬菜(卷心莴苣--Lactuca sativa和洋葱-Allium cepa L.)、以及花瓣(玫瑰-Rosahybrida L.)。dcl2单突变体和野生型(WT)菌株用作对照。dcl1 dcl2双突变体显示出弱得多的致病性，并且相比WT菌株对所有样品(图18A-B，P＜0.01)产生了明显更小的病斑，而dcl2单突变体相比WT菌株对番茄产生了更小的病斑，但对草莓、葡萄、莴苣、洋葱和玫瑰花瓣产生了与WT菌株相当的病斑(图18A-B)。这些结果说明，sRNA效应物在灰色葡萄孢菌致病性中具有重要的作用。因为即使dcl2菌株显示出明确降低真菌生长，其仍然能够产生Bc-sRNA效应物并且引起明显的疾病症状。
为了整体评估DCL1和DCL2依赖性Bc-sRNA群体，我们扼要描述了从dcl1 dcl2双突变体以及WT菌株分离的总sRNA。在WT菌株中，Bc-sRNA为20至35个核苷酸(nt)的长度(数据未示出)，24-27-nt种类富集。在dcl1 dcl2双突变体中20-27-nt sRNA种类的丰度明显减少但未完全消除(数据未示出)，说明在灰色葡萄孢菌中存在DCL-非依赖性sRNA生物生成途径，如同粗糙脉孢菌中报导的(Lee et al.，Molecular Cell 38：803-814(2010)；Jin al.，Molecular Cell 38：775-777(2010))。最显著地，来源于逆转录转座子的sRNA(范围是20-26-nt，并且主要是21-22-nt)在dcl1 dcl2双突变体中几乎完全消除(数据未示出)，说明Bc-DCL1/2主要负责从逆转录转座子生成sRNA。来自基因间非编码(IGN)区域的sRNA(主要是21、22和24-nt sRNA)以及与开发阅读框反义的sRNA(ORF-反义，主要是21-22-nt sRNA)在dcl1 dcl2中也大幅减少，尽管来自ORF的有义转录的sRNA(ORF-有义)未显著改变。如之前所报导的(Weiberg et al.)以及如实施例1中所讨论的，大多数预计的sRNA效应物来自逆转录转座子长末端重复序列(LTR)；因此，Bc-DCL1/2主要负责生成sRNA效应物，并且显著影响灰色葡萄孢菌致病性。这使得Bc-DCL1/2成为检测sRNA介导的沉默是否是控制灰霉病的有效策略的理想靶标。
为了检测宿主生成的sRNA是否可以从植物细胞转移至灰色葡萄孢菌，以及沉默Bc-DCL1/2是否会有效抑制植物上的灰色葡萄孢菌疾病症状，我们生成了表达靶向两种Bc-DCL的sRNA的转基因拟南芥属植物。将含有分别来自Bc-DCL1和Bc-DCL2的非保守区域的252个碱基对(bp)片段和238bp片段的DNA片段，克隆进入pHELLSGATE载体系统(Helliwell etal.，Methods inEnzymology 392：24-35(2005))。使用了两种DNA片段，Bc-DCL1和Bc-DCL2各一种，因为保守域外没有在两种DCL之间具有足够同源性以沉默两种DCL的DNA区域。避免了保守功能域中的DNA区域，以消除对来自其他物种的DCL基因的任何脱靶标效应。这些选择的Bc-DCL DNA区域与拟南芥属DCL仅具有3.5％至4.8％的序列同一性，并且实际上，没有宿主DCL基因被沉默(数据未示出)。由转基因植物中的pHELLSGATE构建体转录的发夹RNA产物，通过植物DCL加工成为sRNA以靶向Bc-DCL1和Bc-DCL2(图19A)。相比WT植物，在灰色葡萄孢菌感染后这些植物表现出小得多的病斑和更少的真菌生长(图19B-C)。相比来自WT植物的那些，从转基因植物收集的灰色葡萄孢菌中的Bc-DCL1和Bc-DCL2的相对表达被显著抑制(图19D)。这些结果说明，在植物细胞中产生的靶向Bc-DCL1/2的sRNA(Bc-DCL1/2-sRNA)被转移至真菌细胞中，并且有效沉默了Bc-DCL1和Bc-DCL2，其导致真菌毒力和真菌生长的抑制，以及疾病的抑制。
为了确定这种靶向Bc-DCL1/2的RNAi策略是否也能够有效地控制番茄植物中的灰霉病，我们将相同的Bc-DCL1/2片段引入烟草脆裂病毒(TRV)沉默系统(Liu et al.，PlantJournal31：777-786(2002)，其在番茄中引发Bc-DCL1/2-sRNA的表达。农杆菌浸润后三周，使用灰色葡萄孢菌通过喷洒接种来感染番茄植物。表达Bc-DCL1/2-sRNA的番茄叶在感染后3天显示出非常轻微甚至几乎不存在的疾病症状(图19E-G)，而表达了靶向番茄中不存在的马铃薯晚疫病抗性基因RB的sRNA(Song et al.，PNAS 100：9128-9133(2003)的对照叶显示出非常严重的水浸透疾病病斑(图19F-G)。相比对照，在表达Bc-DCL1/2-sRNA的叶上也显著减少了灰色葡萄孢菌的生长，并且在这些叶上生长的灰色葡萄孢菌中Bc-DCL1和Bc-DCL2的表达也大幅减少(图19H)。这些数据进一步支持了sRNA可以从植物细胞转移至真菌细胞，并且它们可以有效地沉默真菌DCL基因并抑制病原体毒力。
除了拟南芥属和番茄之外，灰色葡萄孢菌也感染许多其他的植物物种。灰霉病是收获后管理中的非常严重的问题，因为其每年在包装、运输和储存的过程中破坏了数百万的果实、蔬菜和花。不幸的是，在许多宿主物种中没有研发出稳定转化以及病毒诱导基因沉默技术。在秀丽线虫(C.elegans)和其他昆虫中观察到了从环境摄取RNA，即被称为环境RNAi的现象。参见，例如，Winston et al.，PNAS 104：10565-10570(2007)；Ivashuta etal.，RNA 21：840-850(2015)。在马铃薯叶上喷洒靶向薯虫马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata)的肌动蛋白基因的dsRNA，能够抑制幼虫生长(San Miguel et al.，PestManagement Science，doi：10.1002/ps.4056(2015))。因此，我们尝试在果实、蔬菜和花的表面外部应用合成的Bc-DCL1/2-sRNA或其双链RNA前体(Bc-DCL1/2-dsRNA)，以检测灰色葡萄孢菌是否能够从环境摄取dsRNA和/或sRNA并且诱导其自身基因的沉默。将相同的Bc-DCL1/2片段在体外从两端转录，并且得到Bc-DCL1/2-dsRNA。使Bc-DCL1/2-dsRNA经受RNA酶III处理，以便在体外生成Bc-DCL1/2-sRNA。将Bc-DCL1/2-sRNA和前体dsRNA(20ng/μl)外部应用至果实(番茄、草莓和葡萄)、蔬菜(莴苣和洋葱)和花瓣(玫瑰)，然后进行灰色葡萄孢菌感染。相比YFP-dsRNA处理的对照，所有用Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA处理的植物发展了弱得多的疾病症状(图20A-B)并且支持了显著更少的灰色葡萄孢菌生长(图20B)，说明外部应用的Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA可以抑制病原体毒力，这有可能是通过对两种真菌生长和Bc-sRNA效应物生物生成的抑制。Bc-DCL1/2-sRNA具有比Bc-DCL1/2-dsRNA略强的作用。
虽然Bc-DCL1/2-sRNA和前体Bc-DCL1/2-dsRNA的外部处理可以抑制真菌疾病，但体外RNA合成过于昂贵。为了以低得多的成本获得大量的Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA，我们在本塞姆氏烟草中瞬时表达了pHELLSGATE-Bc-DCL1/2载体，其在农杆菌接种后2至3天产生了大量的Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA前体(图21A)。将pHELLSGATE空载体(EV)用作对照。将纯化的总RNA应用至果实、蔬菜和玫瑰花瓣的表面，然后进行灰色葡萄孢菌感染。相比使用来自EV植物的RNA提取物处理的那些植物，所有使用含有Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA的RNA提取物处理的植物发展了严重程度更低的疾病症状并且显示出减少的真菌生长(图21B-C)。该结果证明，Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA能够保护植物免于灰色葡萄孢菌感染，而不是本塞姆氏烟草总RNA。
外部应用的Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA分子对于灰色葡萄孢菌毒力和生长的作用，可以是以下两方面的结果：灰色葡萄孢菌从周围环境直接摄取dsRNA和sRNA，或者涉及植物摄取和加工后转移至灰色葡萄孢菌细胞的间接过程。为了检测sRNA和dsRNA是能够直接进入灰色葡萄孢菌细胞，还是需要涉及植物宿主的间接步骤，我们将不相干的植物移除，并且将Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA直接应用至灰色葡萄孢菌孢子，并且使它们在固体麦芽糖提取物(ME)培养基上发芽。为了显现RNA，我们使用荧光素-12-UTP通过体外转录标记了RNA。在12小时后，发芽的分生孢子的显微检查显示出真菌细胞中累积的荧光RNA信号(图22A)。为了消除观察的荧光RNA附着在外细胞壁的可能性，我们用微球菌核酸酶(MN酶)处理了真菌菌丝，并且荧光信号仍然保留，说明RNA确实被摄取进入灰色葡萄孢菌细胞。为了进一步证实这一结论，将荧光RNA添加至发芽的灰色葡萄孢菌孢子的液体培养基中，并且使生长的灰色葡萄孢菌经受原生质体制备。即使在MN酶处理后仍在灰色葡萄孢菌原生质体中清楚地检测到了荧光信号(图22B)。Bc-DCL1/2被Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA两者沉默，并且仅Bc-DCL2被Bc-DCL2-sRNA和Bc-DCL2-dsRNA沉默，但Bc-DCL1不能被沉默(图22C)。相比水处理，使用Bc-DCL1/2-sRNA处理减少了灰色葡萄孢菌的生长，并且所述生长通过使用Bc-DCL1/2-dsRNA、Bc-DCL2-sRNA和Bc-DCL2-dsRNA处理减少至更少的程度(数据未示出)。这些数据支持了，Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA确实转移进入了真菌细胞，并且它们有效地沉默了真菌DCL基因。这种RNA摄取机制使得有可能发展出新一代环境友好的基于RNA的“杀真菌剂”。
如果此类基于RNAi的疾病控制方法对于多种病原体有效，则它可以是强力的。例如，我们可以设计靶向DCL的dsRNA或sRNA以沉默利用sRNA效应物的多种病原体的DCL基因。土壤病害真菌病原体大丽轮枝菌(Verticillium dahilae)是另一种经济上重要的真菌病原体，其在众多植物物种引起黄萎病，包括草本一年生植物、多年生植物、以及木本物种(Fradin et al.，Mol Plant Pathol.7∶71-86(2006)；Klosterman et al.，AnnualReviewof Phytopathology 47：39-62(2009)。迄今为止，除了应用有毒杀真菌剂之外，还没有有效的控制方法。如上文在实施例1中讨论的，大丽轮枝菌还利用宿主AGO1进行其sRNA效应物功能；因此，靶向Vd-DCL基因也可以是用于控制黄萎病的潜在策略。
为了检测基于RNAi的方法是否可以同时控制大丽轮枝菌和灰色葡萄孢菌，我们生成了表达靶向两种真菌的DCL基因的发夹RNA的拟南芥属转基因植物。大丽轮枝菌也具有两种DCL基因。再一次地，我们不能找到保守域外的在Vd-DCL1和Vd-DCL2(Vd-DCL1/2)之间具有足够同源性或者在大丽轮枝菌和灰色葡萄孢菌的DCL之间具有足够同源性以沉默两种或多种DCL的DNA区域。因此，我们不得不选择两种DNA片段，Vd-DCL1(156bp)和Vd-DCL2(156bp)各一种，其与四种At-DCL具有2.2％至3.1％的同一性(数据未示出)，并且将它们融合至Bc-DCL1的164bp片段和Bc-DCL2的151bp片段(二者均来源于Bc-DCL1/2RNAi DNA片段)。然后将这种连接的产物克隆至pHELLSGATE载体中。这些转基因植物表达了高水平的Bc-DCL1/2-sRNA和Vd-DCL1/2-sRNA(图23A)。如同预期，在这些转基因系中拟南芥属DCL基因的表达不受影响(数据未示出)。病原体感染测定显示出，这些转基因植物确实对灰色葡萄孢菌和大丽轮枝菌的抗性更强(图23C和23E)。相比来自WT植物的那些灰色葡萄孢菌和大丽轮枝菌，在这些转基因植物上生长的灰色葡萄孢菌和大丽轮枝菌中Bc-DCL1/2和Vd-DCL1/2的表达水平显著降低(图23B和23D)。因此，这种靶向病原体DCL基因的基于RNAi的疾病控制策略，有效地控制了多种使用sRNA效应物的真菌病原体。
讨论
我们提供了在真菌病原体和它的作用宿主之间的双向sRNA运输的第一个实例。植物宿主生成的靶向Bc-DCL的sRNA，可以运输至灰色葡萄孢菌中以沉默Bc-DCL基因进行疾病控制。在秀丽线虫(C.elegans)中，从环境摄取dsRNA需要长于50bp的dsRNA，而不是较短的dsRNA或成熟sRNA。参见，例如，Winston et al.，PNAS104：10565-10570(2007)；McEwan etal.，Molecular Cell 47：746-754(2012)。一些食草性昆虫也能够摄取长于50-60bp的dsRNA，但不能摄取sRNA(Ivashuta et al.，RNA 21：840-850(2015)。在本文中，我们示出了灰色葡萄孢菌可以直接摄取sRNA和dsRNA，并且两者均可以有效地诱导灰色葡萄孢菌基因的沉默，说明RNA摄取渠道或途径在不同的有机体中可以不同。
真核病原体，包括真菌和卵菌，每年导致严重的农作物损失。目前，杀真菌剂和化学品喷洒仍然是最常见的疾病控制策略，然而它们对人类健康和环境具有严重的威胁。在过去数年，稳定的基于植物转化的HIGS系统已被证明在各种植物模型和农作物物种中有效地控制一系列害虫、线虫、丝状病原体和寄生植物。参见，例如，Baum et al.，NatBiotechnol 25：1322-1326(2007)；Huang et al.，PNAS103：14302-14306(2006)；Nowaraet al.(Plant Cell 22：3130-3141(2010)。然而，这些成功的HIGS研究依靠对多种农作物不可用的植物转化系统。一些常选择的对于病原体传播和感染重要的病原体靶标基因，包括寄生基因、效应物编码基因、或真菌麦角甾醇生物合成相关基因。我们发现，灰色葡萄孢菌DCL基因对于sRNA效应物的生物生成以及真菌生长和发育是重要的。它们是用于控制使用sRNA效应物的病原体的理想靶标。在本文中，我们发现灰色葡萄孢菌可以从环境摄取dsRNA或sRNA并且诱导环境RNAi，使得有可能直接使用这些dsRNA和sRNA用于疾病控制。我们示出了将BcDCL1/2-sRNA和BcDCL1/2-dsRNA喷洒至各种果实、蔬菜和花的表面可以有效地控制灰霉病。这种基于RNAi的新一代的“RNA杀菌剂”，可以避免转化的技术限制以及公众对GMO的担忧，并且为收获前和收获后的农作物产品提供了易于使用并且环境友好的疾病控制工具。此外，此类基于RNA的策略可以简单地进行设计以靶向多种病原体。
材料和方法
质粒构建：按照对Hellsgate8.0系统概述的方法(Helliwell et al.，Methods inEnzymology 392：24-35(2005))，构建质粒pHELLSGATE-Bc-DCL1/2和pHELLSGATE-Bc+Vd-DCL。通过重叠PCR来整合Bc-DCL1(252bp)和Bc-DCL2(238bp)片段以获得Bc-DCL1/2RNAi片段。通过重叠PCR来整合315bp Bc-DCL1/2RNAi片段(164bp的Bc-DCL1和151bp的Bc-DCL2)以及Vd-DCL1(156bp)和Vd-DCL2(156bp)的RNAi片段以获得Bc+Vd-DCL RNAi片段。使用BP克隆酶(Life Technologies，Carlsbad，CA)，将RNAi片段分别地克隆至pDONR207中，然后使用/>LR克隆酶(Life Technologies，Carlsbad，CA)克隆至目的载体pHELLSGATE8.0中。对于pTRV2-Bc-DCL1/2质粒，使用LR克隆酶(Life Technologies，Carlsbad，CA)将pDONR207-Bc-DCL1/2载体克隆至pTRV2EV中以得到pTRV2-Bc-DCL1/2(Weiberg et al.，Science 342：118-123(2013))。
YFP-dsRNA、Bc-DCL1/2-dsRNA和Bc-DCL1/2-sRNA的体外合成：按照RNAi试剂盒说明(Life Technologies，Carlsbad，CA)，通过PCR将T7启动子序列分别引入YFP和Bc-DCL1/2RNAi片段的5’端和3’端。纯化后，将在两个末端均含有T7启动子的DNA片段用于体外转录。为了得到Bc-DCL1/2-sRNA，使用/>RNA酶III(NEB Ipswich，MA)将合成的Bc-DCL1/2-dsRNA消化成为sRNA。
体外RNA荧光标记和共焦显微检查：按照Fluorescein RNA Labeling Mix试剂盒说明(Sigma，St.Louis，MO)，用荧光标记Bc-DCL-dsRNA。使用RNA酶III(NEBIpswich，MA)消化荧光Bc-DCL-dsRNA，得到荧光Bc-DCL-sRNA。为了对显微载玻片上生长的荧光RNA处理的灰色葡萄孢菌进行共焦检查，将4μl的105个孢子/ml溶液与4μl的100ng/μl荧光Bc-DCL-sRNA或Bc-DCL-dsRNA混合，并滴至显微载玻片上制备的固体ME培养基。在黑暗中孵育12小时后，使用共焦显微镜SP5检查荧光。为了检测运输进入灰色葡萄孢菌原生质体的荧光RNA，将107个灰色葡萄孢菌孢子在10ml YEPD中培养，并且添加2μg的荧光Bc-DCL-sRNA或Bc-DCL-dsRNA。在40小时后，按照先前的描述分离原生质体(Gronover et al.，Molecular Plant-Microbe Interactions 14：1293-1302(2001))，然后用KCl缓冲液或75U微球菌核酸酶(Thermo Scientific，Waltham，MA)在37℃下处理30min。使用共焦显微镜SP5检查荧光。
含有或不含有Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA的本塞姆氏烟草总RNA的制备：使用携带pHellsgate-Bc-DCL1/2或pHellsgate-EV的根癌农杆菌(A.tumefaciens)菌株，浸润4周龄的本塞姆氏烟草植物。在感染后2天收获叶组织并用于总RNA提取。
将RNA外部应用至植物材料的表面：在使用前用不含RNA酶的水将所有RNA调节至20ng/μl的浓度。对于体外合成的YFP-dsRNA、Bc-DCL1/2-sRNA和Bc-DCL1/2-dsRNA，将20μlRNA(20ng/μl)滴至或喷洒至植物材料的表面。对于本塞姆氏烟草总RNA提取物，用20ng/μlRNA对植物材料的表面均匀喷洒。
真菌病原体测定和疾病量化：将灰色葡萄孢菌菌株B05.10和大丽轮枝菌菌株JR2，分别在麦芽提取物琼脂(2％麦芽提取物，1％细菌蛋白胨)和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上培养。将灰色葡萄孢菌孢子在1％Sabouraud麦芽糖液体培养基缓冲液中稀释至104个孢子/ml的最终浓度用于在番茄叶上喷洒接种，以及稀释至105个孢子/ml的最终浓度用于其他植物材料的滴液和喷洒(Mengiste et al.，Plant Cell14：2551-2565(2003))。所有植物材料的滴液或喷洒区域使用10μl孢子悬浮液，除了番茄果实滴液20μl。按照先前描述进行大丽轮枝菌土壤接种测定。
拟南芥属根培养和感染：为了拟南芥属液体根培养物接种，使2周龄的拟南芥属在根培养物(0.32％MS盐，2％蔗糖，0.1％MES，通过KOH调节为pH5.8)中生长，并且将大丽轮枝菌孢子添加至培养物直至最终浓度为106个孢子/ml。在接种后5min，将根培养物用新鲜无菌溶液替代。按照先前描述进行真菌生物量定量(Gachon et al.，Plant PhysiolBioch42：367-371(2004))。
拟南芥属AGO1和AGO2相关sRNA的克隆和数据分析：在感染后2天和4天收集液体根培养物中制备的大丽轮枝菌感染的拟南芥属。使用抗-AGO1和抗-AGO2肽抗体进行At-AGO1和At-AGO2免疫沉淀反应(Zhang et al.，MolCell42：356-366(2011))。将At-AGO1和At-AGO2相关RNA提取，并用于sRNA文库构建和Illumina HiSeq2000深度测序(Weiberg etal.，Sciennce 342：118-123(2013))。将At-AGO1和At-AGO2IP文库中Vd-sRNA的读取数，用去除tRNA、rRNA、snoRNA、snRNA等后的总大丽轮枝菌sRNA标准化。选择了标准化后具有高于100的RPM并且还具有拟南芥属中的宿主靶标基因的Vd-sRNA。At-AGO1相关Vd-sRNA效应物定义为，所选的Vd-sRNA在At-AGO1IP文库中的读取数比At-AGO2IP文库多10倍。At-AGO2相关Vd-sRNA效应物定义为，所选的Vd-sRNA在At-AGO2IP文库中的读取数比At-AGO1IP文库多10倍。
实施例5：示例性的DCL基因和蛋白序列
SEQ ID NO：1-灰色葡萄孢菌(Botrytis cinerea)DCL1基因组DNA序列(所选的RNAi片段由粗体文本标记)
ATGACGAGAGACGCAGCAGCAGCAAAAAGTCTCTACCATTGGCGAAGAAAAGGCGTCACTCCTTCAGCCGAAGAGGATCTTCTATCGTTTGATGATATTGTTACTGCCGTTCCACCTACAATCTTGTCTTCGTCTGTCGCTCCATATACTTCTCGAGATAAGATACCTTCTGCATCTGGCAACGGAGATGCTATAGCAGATGTTAGCAGTGGTTACCTCAAACAGGCTACCGTATCTTCTCATTCTGCTCAAGTCCGATCATCTTCAAACGGCAATCAAGGTGATGCCAAAAGTTCTCCCTCTCTTTCACCTGATAGTAAACTGGAATTCATCTTTGGGCCTCCTTTAAGGGAGCCAGAGAAGCCATTCTTTAATAAATCTTCTTATTCGTTTCGAGATTCGAGAGGGTTGAGCAGAAATCGGGCTTCTTCTTCTATGGAAAATTCGAGAACTCTCGATCCAAAGATACTCAAACCAGTTATCATCAATAATCACCAGGGCGAATGCTTCCAAGAGGCTTCCAGAACAGGTATACCTCAGGCTGATACTTTTGATAAATCTTCCCTTGCTAAGACTGCGGATATGGATTTGTCACCAGTTTCTCACCATGCGGATGTGCTTGC
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SEQ ID NO:2–灰色葡萄孢菌(Botrytis cinerea)DCL1蛋白序列
MTRDAAAAKSLYHWRRKGVTPSAEEDLLSFDDIVTAVPPTILSSSVAPYTSRDKIPSASGNGDAIADVSSGYLKQATVSSHSAQVRSSSNGNQGDAKSSPSLSPDSKLEFIFGPPLREPEKPFFNKSSYSFRDSRGLSRNRASSSMENSRTLDPKILKPVIINNHQGECFQEASRTGIPQADTFDKSSLAKTADMDLSPVSHHADVLATTVTAQHSAIAAQNAAQSSKMPGPEAFLLAEKDEAGSPVVISLGSANQIPSGNISLQLDSPSLENHSPNVTPINKVPTPFALSTRTTDDVFAELRRPLHPQAIQSQIDIKTSSCVDSYNTNDEILDNNQGSNQKDLHVVEKDKEEEEEEDMNQAIPDIKRISARKQKNAAIFDVFLKEATKLPKTEKTSHANDEAIQSTRWLIDQAEKQHIIESPRDYQLELFEKAKKQNIIAVLDTGSGKTFIAVLLLRWIIDQELEDRAIGKPHRVSFFLWKKRLDTNMVIVCTAEILRQCLHHSFVTMAQINLLIFDEAHHAKKDHPYARIIKDFYRNDTEKDIALPKIFGMTASPVDARDNVKKAAEELEGLLHSQICTAEDPSLLQYSIKGKPETLAYYDPLGPKFNTPLYLQMLPLLKDNPIFRKPFVFGTEASRTLGSWCVDQIWTFCLQEEESKKLQARTEQAHHKKRVPEPLEVLEKRKEQLEQAKSIVENHTFEPPHFASRLLDDFTTKVHYSNNLSTKVVALLSILKDRFQRPTNDKCIVFVKERYTARLLASLLSTPEAGTPFLKAAPLVGTTSASAGEMHITFRSQTLTMHNFRNGKINCLIATSVAEEGLDIPDCNLVVRFDLYNTVIQYIQSRGRARHINSRYYHMVESHNEEQIRTIKEVLKHEKMLKLFASALPEDRKLTGNNFNMDYFLRKERGHRIYPVPNSDAKLTYRMSLTVLSAFVDSLPRAPESVLRVDYVVTTVDKQFICEAILPEEAPIRGAIGRPATTKQVAKCSAAFETCVILHQKGYINDYLLSTFKRSAHMMRNALLAVDGKKQEAYDMQTKPTLWSSKGKQGIFYMTVLSLKSPDNLDRASQPLGLLTRSPLPDLPEFVLHFGAGRNSPTSCVPLASSITLEKNKLDQVNMFTLCLFQDVFSKAYKSDPDSMPYFLVPINCLNAIVDWKSQNPMSIIDWETVEYVQDFENKQADKPWEHKPWLGKPDDYFKDKFITDPFDGSRKLWSVGITKEYRPLDPVPPNTAPRKGARKNNSNIMEYSCSLWAKARAKRTFDEEQPVIEATYISLRRNLLDEFDGGELETSKKSFIILEPLKVSPLPTTVGAMAYLLPAIIHRVESYLIALEATDLLHLDIRPDLALEAVTKDSDNSGEHGEEQTNFQRGMGNNYERLEFLGDCFLKMGTSISLYGLNPDSDEFRYHVDRMCLICNKNLFNTALKLELYKYIRSAAFNRRAWYPEGPELLRGKTATAPNTHKLGDKSVADVCEAMIGAALLSHHESKSMDNAVRAVTEVVNSDNHNAVVWSDYYKLYEKPKWQTATATAAQIDMARQVEMKHPYHFKHPRLLRSAFIHPAYLFIYEQIPCYQRLEFLGDSLLDMACVNFLFHNHPTKDPQWLTEHKMAIVSNQFLGALCVKLGFHKHLLTLDSQVQKMIADYSSDINEALIQAKTDAKRVGKVEDDYARDYWIAVRQPPKCLPDIVEAFIGAIFVDSEYDYGEVEKFFEMHIRWYFEDMGIYDTYANKHPTTFLTNFLQKNMGCEDWAPVSKEVPGEDGRKNVVVCGVIIHNKVVSTATAESMRYARVGAARNALRKLEGMSVREFRDEYGCSCEGDVVDEEGNIEFVEREDGMEGIGMGY*
SEQ ID NO:3–灰色葡萄孢菌(Botrytis cinerea)DCL2基因组DNA序列(所选的RNAi片段由粗体文本标记)
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ATGAAGCTGGAACTCTGTCTTCC
AATTGATCCACCGGCAATACCCCCATTAAAGCTTTATTGGGATGCTGACACCGAGTTCTTTGTTGACTTTACAAACGATATCGAGATCGGCACCAGCGAGAATATGTTGGCACAGGCGTTGAACGATACCAATCTACTATTATCAGATCGTGGTCGTAAAGTTCACATCCAGTCACGTCGAACAGTTGTGCAATTTATCTTGCTTCAAGATTCGGGCTCGCTCAGTTCAGATTGTTTTCCGGTTGACCCCAACGGTAATATTAAAAGTACAGGTTTTATCAGAGAAGTCGGTAAACTAGAATCGCCCTACATCTTTGAAAAATGGTTGCCCAATGCACCAGAAGACGTCCCATATCTAGCTGTGGTTAAAGTAAGTCGCCGTGCAGACTTTTTGCACAAGGTACAGAACGAAAAACCCTCGTCATTCACTAAACAATTCTCGTCTGTTCTACCTGCCTCGACATGTGTACAGGATGTAATGCCCGCACAGTTGTCTCGGTTCGGCATGATGATTCCTTCCATCACACACCACATTGAGGTGCAACTCGTTGTAGACCGACTATCCAGGACCATCCTCAAGGATCTCGAAATTAGTGACCAGAGTCTTATTCAGACCGCCATCACACATGCCAGTTATTCGTTAGACTCGAATTATCAGCGTCTCGAATTTCTGGGCGACTCAATTCTCAAATTGTGTACATCGGTACAATTGGTGGCAGAGCATCTAGATTGGCACGAAGGATATTTGTCGGCTATGAAGGATCGTATCGTGTCCAATTCACGGTCATCAAGAGCGGCGGCTGAAGTCGGTTTGGATGAGTATATAATGACCAAGAAATTCACAGGTGCAAAATGGCGACCAATGTACGTGGATGATCTGGTCGTCACAGAACAAAAAACAAGAGAAATGTCCTCCAAAATTCTTTCCGACGTTGTGGAAGCACTCATCGGCGCATCTCTCCGGCCCGTCGAGCAAATCCTCGCATATACCTTCACCAAAAAATCTCTCCTCGTCGAAGCCATGACGCACCCCTCTTACACCAGCGGCACGCAATCCCTCGAGCGACTCGAGTTCCTCGGCGATTCCATTCTCGACAACATCATCGTCACAGCCATGTGGTCGCACTCGACGCCGCTCTCCCACTTCCACATGCATCTCCTGCGCTCTGCGCTCGTCAACGCCGATTTCCTCGCCTTTCTCTGCATGGAAATGAGCATCGACCAAAACGTCACCAATCTGACCGAAGGAAAAAACCATCGCATCCACGAAACCCACTCGCGACGCCGCGTTTCCCTCGTCAGTTTTCTCCGTCACTCAAGCGTTCGTCTCTCTATCTATCAAAAAGAAGCGCTTTCTCGCCATGCAGAATTGCGCGATCAGATCCTCGAGGCAATATACACCGGTGATACATTCCCCTGGGCTCTATTATCCCGATTGGACGCGCGGAAATTTTTCTCCGATATGATTGAGAGTTTGCTGGGCGCGGTATGGATTGATAGCGGCTCGATGGAAGTGTGCACGCAGCTGATCGAAAGAATGGGCGTCCTGAGATACATGCGACGGATTTTGAAAGATGGCGTGCGCATCATGCATCCGAAGGAGGAACTGGGCATCGTGGCCGATTCTGAAAACGTCAGGTACGTTTTGCGGCGGGAGAAGATGGGTGGGGATGCTACCGAGGTAAATGCGGACGCGGATGAAGAGGTACGCACGGAGTACCGGTGCACAGTATTTGTGGGCGGGGAGGAAATTGTAGAGGTGAGGGGTGGAGCGAGGAAAGAGGAGATTCAGGCAAGGGCTGCGGAGCAGGCGGTGCGGATTTTGAAGGCGAGGGGTCATGAGAAGAGGAATGGGGGTGCGGGGGAGGGGAAAAAGAGAAAATCGCTGGATGAATAG
SEQ ID NO:4–灰色葡萄孢菌(Botrytis cinerea)DCL2蛋白序列
MEYTSEPDTDPDTRGSLIDGRDGIEGDLIALTSGERLNETVEDLCSDSSGLIVENEDDDNSAGEKGEIVIVTPRTYQLEMLEESLKRNVIVAMDTGSGKTHVAVLRILAELERMKPGKIIWFLAPTVALCAQHHEYLQLNIPSVLIKMLIGADGVDRWTEQRQWDTVLKDVKVVVSSYQVLLDALTHGFVRMGRLSLIIFDEAHNCVNKAPGAKIMKSFYHPYKSIFPLPHILGLSASPVMRSSPQSLSDIEETLDAICCTPKIHRADLRLRVKLPLLSIIYYTPESNIIVTKTVASLRKIVQSLNIFEDPYVLTLKRSDSEKSQRELAKVLKSFKTYSQTQLKSIDKTSNEIILVELGPWAADYYISTVVTRYLKAMSAKDTFIVEDSPAAEKLYIAKALRQVEISPSTLSDTGKISNKVEKLLGIIAQQKPPFSAIIFVQERATVSVLAHLLSHHPLTKDRFKIGTMVGTSLNGKRTDQIGELVDVNQQKDTLSSFKRGKIDILIATNVLEEGIDVPACNLVICFSKPANLKSFVQRRGRARQQDSKLILLDASGDKATNWHELERKMREEYGKEMRELQHIYEIETADEQSEDDRVLRIESTGAQLDLDSALPHLYHFCSVLTTKDFVDLRPDFVYSSELGSEYVRAKVILPGSVSKPLRVHESRGSWLSERSAAKDAAFEAYSALYRGGLVNDNLLPLMVHDKVIDELTSKPVDTRASLLEVKERLNPWIDIARAWKEAEHHAGIVRTSVMIFNGMKLELCLPIDPPAIPPLKLYWDADTEFFVDFTNDIEIGTSENMLAQALNDTNLLLSDRGRKVHIQSRRTVVQFILLQDSGSLSSDCFPVDPNGNIKSTGFIREVGKLESPYIFEKWLPNAPEDVPYLAVVKVSRRADFLHKVQNEKPSSFTKQFSSVLPASTCVQDVMPAQLSRFGMMIPSITHHIEVQLVVDRLSRTILKDLEISDQSLIQTAITHASYSLDSNYQRLEFLGDSILKLCTSVQLVAEHLDWHEGYLSAMKDRIVSNSRSSRAAAEVGLDEYIMTKKFTGAKWRPMYVDDLVVTEQKTREMSSKILSDVVEALIGASLRPVEQILAYTFTKKSLLVEAMTHPSYTSGTQSLERLEFLGDSILDNIIVTAMWSHSTPLSHFHMHLLRSALVNADFLAFLCMEMSIDQNVTNLTEGKNHRIHETHSRRRVSLVSFLRHSSVRLSIYQKEALSRHAELRDQILEAIYTGDTFPWALLSRLDARKFFSDMIESLLGAVWIDSGSMEVCTQLIERMGVLRYMRRILKDGVRIMHPKEELGIVADSENVRYVLRREKMGGDATEVNADADEEVRTEYRCTVFVGGEEIVEVRGGARKEEIQARAAEQAVRILKARGHEKRNGGAGEGKKRKSLDE*
SEQ ID NO:5–大俪轮枝菌(Verticillium dahilae)DCL(VAD_00471.1)基因组DNA序列(所选的RNAi片段由粗体文本标记)
ATGACGACTGACGAGCTCTCTGTTGGTCTGGACGCCACCGGCATCTCAATCCTCGCAGATGGACCGGAAAACATATCGTCCAGCACATCAACATCTACGACTGGAAAGGAAGATGGATACCTCTGTATCAACAGATTCACTCAGAATACCGCCACGACCCAGGACAACCAGAGCCGAGATTCTGACGACGATGAGGATGACTGCGGCAGCCACGATGAAGCTGACGAAGATTCAGACGAAAGACAGTACAGCATGACCCCAGAAAGGCCTCATAAAATTACCGAGAAGAAGCGCGCAGATCATGCTGCCTTTCACGACTGGCTTCAGAGCAACTCCAGCGAGATTGCTCAGTCAACCCCTCAGCCGGCTCAAAACCTCAACCACACCTCCACGGCCCTGATGGTACGCGAGAGTGAGAATCGTAAGATCATCGAA
CGGTGATTCAGTACATACAATCCAAAGGCCGCGCTCGGCACTTGAACTCGGAGTATATTTGCATGGCCGAGCTAGGCAACGGCAAGCATACAAGGGCGAAGATACAAGCAAATTATGACCTCTCCCTCATCCGCCAATTCTGCAGCACACTGCCAGAAGACCGCAAGATCGTGGGCTGGGACCCCGAGGCAGCTCTTCACCATGGCGAGCGCGACCATAAGTTCCACATCGTTCCATCCACCGGGGCCAAACTCACCTGGACCGGCAGCCTCGTGGTTCTGTCAAATTTTGCCTCTTCTCTACAGGTGAACGACGAAACACTAAGTCCTTCCTATATGGTCTCTCTCATCGGTAGCGAGTACATCTGCGAGGTCCAGCTTCCGAGCAAGTCTCCCATTTTGAGCGTGTCAGGCACGCTCCAAAAGAACAAAGCAGAGGCCAGGTGCTCCGCAGCGTTTGAGATGTGCATGAAGCTCATCAAAGGTGGGTTCATCAGCAGTCACCTTCAGCCGACGTTTACCAGGAAGCTCCCGGCCATGCGAAACGCACGCCTAGCCATCAGCTCCAAGAAGCGTGAACGGTACAATATGAGGGTCAAGCCAGAGGTATGGTCACGGCGTGGACCGGCATCCTCTCTGTTCCTCACAGTCCTGAAGCTTCGTACACCTGGTGCATTGAACAGACCATCACAGCCACTCGCCCTCCTCACACGAGAGGCACTGCCAGAGCTTCCAGGAGTTCCGCTATTTTTCGGTAACTGTGGTCGGTCCATAGCGGAGGTAGTATCTGTGGCGAAACCCATGCACTTGGATGAAGTACGTCTAGACAGCCTCAGAGTATTCACCCTGCGCATTTTCAAAGATGTCTTCAGCAAGGTATACGATTCTCAAGTCGCAGACCTTCCATACTTCCTGGCACCTGCTGCTCATGACCACAGTCATGAGTTCTCACCGAATGAAGACCCAGGGTCACTGATCGACTGGAGCCATCTGCTGTCGACCAAAGAGGTTGAGTACTTGCCTTGGGATGAAGATCACAGTCCCAGCTTCTATCAAAGCAAGTTTGTGATTGATCCATACACGGGATCGCGCAAGCTGTTTCTCAGAGGTATTCGGACAGATCTCAAGCCGACCGACTTGGTTCCAGATGGAGTTCCCGAACCCACATTCAGGCTCTGGAAGGACGTTGAGCATACCATAAAGGAATACAGCATCAGCCTCTGGGCAAAGAGTCGAGCCCGGAGAGCTGGCGAATGGTTGGACACTCAACCCGTGGTAGAAGCCGAGTTGGTCTCGCTGCGCCGGAATCTTCTCGACGAATTTGCCGATTCCAAGCATGAAGGGTCTAGGGTCTGTTATGTGATTCTCCAGCCGCTACAGATCTCAACACTCCCTGTCGAGGTCGTCGCTATGGCCTACAACTTTCCCGCCATCATCCATCGGATTGAATCGAATATGATCGCCCTTGACGCCTGCCGTATGTTGAACCTTCGAGTTCGTCCCGACCTGGCTCTCGAGGCGATGACCAAAGATTCAAGCAACAGTGAAGAGCACGATCAGGAAAAGATTGATTTCCAGGCCGGCATGGGCAATAATTATGAGCGACTCGAGTTTCTCGGAGACTGCTTTCTCAAAATGGCAACCACCATCGCACTTTTTACTCGGATCCCTGACAGCAACGAGTTTGAGTGTCACGTCGAGCGAATGCTTCTTATTTGCAACCAGAATCTGTTCAATGTCGCATTAAAGAAGAACTTGCAAGAGTACATTCGATCAAAGCAATTCGATCGACGCAGTTGGTACCCCCAGGGTCTGAAGCAGAAGGCGGGCAAAGCCCAAGGAGCACAAAACTCACACTCATTGGCCGACAAGTCTATTGCTGATGTATGCGAGGCCATCATTGGCGCCTCATATTTGTCGTACACTGACGAGGGCAACTTTGACATGGCCGTACGCGCTGTGACGGCCGTCGTGAGGAACAAAAATCACGACATGAAATCATACGAGGACTATTACAAAGCATTTAAGATGCCGATCTGGCAAGCGGCGGAGCCAAGTGCTGTGCAGATGGAAGCGTCTTTACAGATTAAAGAGCAGATGGGATATGAGTTCAAGTCTCCTGCCCTGCTGCGGAGTGCCTTCAAGCACCCGTCCTACCCCCGTCAGTTTGAGAGCGTGCCCAATTATCAGCGCCTCGAGTTCCTCGGTGACGCGCTTCTAGACATGGTCTGCGTAGACTTTCTCTTCAGGAAGTTTCCCGACG
CCGATCCTCAATGGCTCACTGAACACAAGATGGCCATGGTTTCGAACCACTTCCTCGGAAGTCTGAGTGTAGAGTTGGGCTTCTACCGGCGTGTCCTTCACTTTAACAGCATCATGGCCAATCAAATCAAGGACTACGTCGACGCACTTACTCATGCACGCCAAGAAGCCGAAGCGGTGGCCCAGATCTCTGGCACAGTCTCGCGAGATTACTGGCTCAACGTGAAGCACCCCCCCAAATTCCTCTCAGACGTGGTCGAGGCATACATCGGTGCTATTTTCGTTGATTCAGGATACGATTATGGCCAGGTACAGGCGTTCTTCGAGAAGCATATCCGGCCTTTCTTCGCAGACATGGCGCTATATGATTCCTTTGCCAGCAGCCACCCTGTCACAACGCTGGCGCGTATGATGCAGCAGGACTTTGGCTGCCAGGACTGGCGGCTTCTTGTAAGTGAACTGCCGCCGAGCTGCGAAGACGGCGGGGCAGCTGCGATCACTGAGACGGAAGTGATTTGTGGGTTCATGGTCCACGGAAGAATCCTGCTACATGCCAAGTCGTCGAGTGGACGGTACGCCAAAGTGGGTGCTGCAAAGAGAGCGGTCGAGAAGCTCATGGGTCTCGGCAACGACAAAGAGGTCTTTCGGACGGACTTCGGCTGTGACTGTGACTGTGAAGGTCAAGCAATCTAG
SEQ ID NO:6–大丽轮枝菌(Verticillium dahilae)DCL(VAD_00471.1)蛋白序列
MTTDELSVGLDATGISILADGPENISSSTSTSTTGKEDGYLCINRFTQNTATTQDNQSRDSDDDEDDCGSHDEADEDSDERQYSMTPERPHKITEKKRADHAAFHDWLQSNSSEIAQSTPQPAQNLNHTSTALMVRESENRKIIENPREYQIELFERAKRKNIIAVLPTGSGKTLIAALLLRHTLEQETADRRAGKPKRIAFFLVEKVALALQQHAVLECNLEFPIDRVCGDMVRSDWIKESWMKRWDDNMVMVCTAAILQQCLARSFIRMDQINLLVFDEAHHAKGNHPYARIIKDYYITEPDKERRPKIFGMTASPVDALTDVKIAAAQLEGLLHSEIATIEEDSVSFKQIQKEVVEQDCKYPALEPPFTTNLHKKIQEQVRYNKNFAKALSNSLEMSSSLGSWCVDRFWQIFLTEETLARLAAQTAQDNIFADRAEKERVAIEEVRNIIKQHQFLPITKTLQDLSSKVLCLLGQLELRFSAPTDHKCIIFVEKRNTAMILAHLLSLPGIGPLYLKPAALVGNPSDNSPLAMSYKEQVMTITKFRRGEYNCLLATSVAEEGIDIADCNIVIRFDLFNSVIQYIQSKGRARHLNSEYICMAELGNGKHTRAKIQANYDLSLIRQFCSTLPEDRKIVGWDPEAALHHGERDHKFHIVPSTGAKLTWTGSLVVLSNFASSLQVNDETLSPSYMVSLIGSEYICEVQLPSKSPILSVSGTLQKNKAEARCSAAFEMCMKLIKGGFISSHLQPTFTRKLPAMRNARLAISSKKRERYNMRVKPEVWSRRGPASSLFLTVLKLRTPGALNRPSQPLALLTREALPELPGVPLFFGNCGRSIAEVVSVAKPMHLDEVRLDSLRVFTLRIFKDVFSKVYDSQVADLPYFLAPAAHDHSHEFSPNEDPGSLIDWSHLLSTKEVEYLPWDEDHSPSFYQSKFVIDPYTGSRKLFLRGIRTDLKPTDLVPDGVPEPTFRLWKDVEHTIKEYSISLWAKSRARRAGEWLDTQPVVEAELVSLRRNLLDEFADSKHEGSRVCYVILQPLQISTLPVEVVAMAYNFPAIIHRIESNMIALDACRMLNLRVRPDLALEAMTKDSSNSEEHDQEKIDFQAGMGNNYERLEFLGDCFLKMATTIALFTRIPDSNEFECHVERMLLICNQNLFNVALKKNLQEYIRSKQFDRRSWYPQGLKQKAGKAQGAQNSHSLADKSIADVCEAIIGASYLSYTDEGNFDMAVRAVTAVVRNKNHDMKSYEDYYKAFKMPIWQAAEPSAVQMEASLQIKEQMGYEFKSPALLRSAFKHPSYPRQFESVPNYQRLEFLGDALLDMVCVDFLFRKFPDADPQWLTEHKMAMVSNHFLGSLSVELGFYRRVLHFNSIMANQIKDYVDALTHARQEAEAVAQISGTVSRDYWLNVKHPPKFLSDVVEAYIGAIFVDSGYDYGQVQAFFEKHIRPFFADMALYDSFASSHPVTTLARMMQQDFGCQDWRLLVSELPPSCEDGGAAAITETEVICGFMVHGRILLHAKSSSGRYAKVGAAKRAVEKLMGLGNDKEVFRTDFGCDCDCEGQAI*
SEQ ID NO:7–大丽轮枝菌(Verticillium dahilae)DCL(VAD_06945.1)基因组DNA序列(所选的RNAi片段由粗体文本标记)
ATCACTCTACGGGTAAAAGCGCTGAGAGAATGATCATGATGAATTTCTATCATCCACGCAAACAATCGGCACTATCTGTTCCCCACGTCCTGGGACTGACCGCAAGCCCCATAATGCGATCTAGGCTCGAAGGCCTTGAGGCACTGGAACAGACACTGGACTCGGTTTGCGTTACGCCCAGATTGCACCGAGATGACTTAATGACCCATGTCAAAAGGCCCACCGTCTGTTATGTCCATTACGAAACGACAGATGCTAAGGATGAGCCCAAGCCGGTCAGCATTTCAAGTCTTCGCGAAGCATGCAGAAATATGGACATCAGGCAAGATCCATACGTTATCTGTCTAAGAGACAAAGGCACTGATCGAGCACGACGTGAGCTCATCAAGGTCCTTACAAGCCATAAAACAGATTCGCAACAGCAAATGAAGTCTTTCTTCAATCAAAGCTTGCGAGTCCTGCGAGATCTCGGGCCCTGGGCGGCCGAGTACTACATTTGGAAGGTTGTTACAGATTTTCTGGCAATCATTGAAGCAAGAGATCACCGCATGAATCAACGGAATACCGAAGAAAAGCAGTATCTGGCCAACATCCTTCGACAAATCAGTATCAGCGAGCCGCCAGTCAGCATGTTGAGTGCTCATAACACGTCGAACAAAGTAATGGTGCTCATGGAATACTTGTCATCTAAAGCTACCGATGGTACTGTCGGGATCATATTTGTCAAAGAGCGATCAACTGCGGCGATGCTTGCACACGTGATTGAGTCGCATCCACTGACACAGAATAGGCACTCGAGCGTTGGGGTTGTTGTTGGTGCTTCCACTCATCTGGTAAGGAAGAAAGACATGTGGGATCTGTCTCGAGCAGCCCACGAGACAGAGCCCCTTCTTCAGTTCAGATCTGGCCACCTCAATTTGCTCATCGCCACGAGTGTGCTTGAAGAGGGCATCGACGTTCCTGCCTGCAACCTCGTGATCTGTTTTGATGAGCCCGAGAATCTCAAAGCCTTTGTCCAGCGGCGCGGCCGAGCCCGGAAGAAGGATTCTAGCCTCGTGGTTCTTCTCCCCGGGACAGACCACGTGCCTCAGGACTGGGAAAGCATGGAAGCGACAATGAGGACACACTACGAGAGAGAACAGCGCGAAATACAAATCATGGAGCAGATCGAAGCATCCGAGTCTGCAAAGTACGAAGAGTACGTTGTCGAGAGTACTAATGCCAGACTCGACTTCGAGAACGCCAAAGCGCATCTCAGCAACTTTTGTGGGCAGCTCTCTCCCGGGGAGTTTATAGACAAGAGGCCCGAATACATACCCCGTGTGGTAGACAACGGAGTACCTCCATCTCTGAGGGTCACGGTACTGTTGCCAAGCTATGTTCCAGCTGCCGTCCGCCATGCTGAGAGTCGTCGAAGCTGGAAGTCGGAGCATCAGGCCTCAAAGGATGCCGCTTTTCAGGCATACGTGGCTCTTTACAAAGCGGGACTGGTCAATGAACACATGCTTCCACTCACGGTAAAAGATATCGTACCCGCAAACGAACCTCGAGTAGCAACCTTGCAGGTCAATGGCCTCTTGAATGTCTGGCTTGGTATTGCCCAGGCCTGGATCACGAGCACTGAAACCTGGTTAACTCCAGTGCACCTCCGAGACGCGACGGGATTGACGCGAGGAACGTATATCATGAGAATGCCGGTAGCATTGCCGGCACTGCCTTCCACGCCGGTGTACTTCGATCGCGAAGGACCATGGCTTCTGGATTTTGGCCCACAAGAACGAAAGGAGAATCTTGAAATGCCTGATCATACTTCAGTGCTGCTTGCACTCCACTTTGGCCATCACTGGTC
/>
SEQ ID NO:8-大丽轮枝菌(Verticilliumdahilae)DCL(VAD_06945·1)蛋白序列
MIMMNFYHPRKQSALSVPHVLGLTASPIMRSRLEGLEALEQTLDSVCVTPRLHRDDLMTHVKRPTVCYVHYETTDAKDEPKPVSISSLREACRNMDIRQDPYVICLRDKGTDRARRELIKVLTSHKTDSQQQMKSFFNQSLRVLRDLGPWAAEYYIWKVVTDFLAIIEARDHRMNQRNTEEKQYLANILRQISISEPPVSMLSAHNTSNKVMVLMEYLSSKATDGTVGIIFVKERSTAAMLAHVIESHPLTQNRHSSVGVVVGASTHLVRKKDMWDLSRAAHETEPLLQFRSGHLNLLIATSVLEEGIDVPACNLVICFDEPENLKAFVQRRGRARKKDSSLVVLLPGTDHVPQDWESMEATMRTHYEREQREIQIMEQIEASESAKYEEYVVESTNARLDFENAKAHLSNFCGQLSPGEFIDKRPEYIPRVVDNGVPPSLRVTVLLPSYVPAAVRHAESRRSWKSEHQASKDAAFQAYVALYKAGLVNEHMLPLTVKDIVPANEPRVATLQVNGLLNVWLGIAQAWITSTETWLTPVHLRDATGLTRGTYIMRMPVALPALPSTPVYFDREGPWLLDFGPQERKENLEMPDHTSVLLALHFGHHWSIAHGQQQVISFASQDGELNIRQLSARGFTTADADREEMLYLVRDESGCPYVYDHFLNGKPSLELVQRPFRRIGDSPGFQDAPSNIPYLALRKWPRYLALLHQQKVNDLLPQATNKKPYARVYPAPWAKVDTIPLDHAYFGALIPFISHIVEVRLVAEQLSSSLLRDLNFSDPSLVLAAISTKGSLEATNYERLELLGDSILKLCTTANAAALHGLVSNSRLCRAALDAGLDKFVLTENFTCRTWRPIYVNDMMEKGARDSGPRIMSTKTLADIVEALIGAAYIDGGLPKALGCISIFLRELDWKPLPACQEILYSLASPDVPLPPMLVPLEDLIGYTMHLLKTASVNGDLLGFLALECHAEEDEVIIDIDFSPSDTDFNPQNSAGVEQKLKQTRRKIPLWKFMRHSSIEVVQQQTKAASVHADLRGQIMHALEHGSSYPWSLLARLHPAKFFSDMVEAVLGAVWVDSGDMGACIRVAERLGILPVLSRLAKEDVHVLHPKQELGEIAGPRTVKYLLTLPEDAAGLQSATRKYACKVMVGDRCVAEVDDGVARDEVETKAAEVAVQTLKNEQADAKQVAEH*
SEQ ID NO：9-来自灰色葡萄孢菌(B.cinerea)DCL1 cDNA的RNAi片段
TGCGGAAGAACTTGAAGGTTTGCTACACAGTCAAATATGTACTGCAGAAGATCCCAGCTTGCTGCAGTACTCAATCAAAGGTAAACCTGAGACTCTTGCCTACTATGATCCCTTGGGCCCGAAATTCAATACTCCTCTTTATCTTCAAATGCTCCCGCTTCTAAAAGACAATCCTATCTTTCGGAAGCCATTTGTATTTGGGACAGAAGCCAGTAGAACTCTAGGATCTTGGTGTGTTGACCAGATCTGGACTTTCTGTC
SEQ ID NO：10-来自灰色葡萄孢菌(B.cinerea)DCL2cDNA的RNAi片段
TCTTTAAGTGATATCGAGGAGACTTTGGATGCCATTTGCTGCACGCCAAAAATACATCGAGCAGATCTTCGCCTTCGAGTAAAGCTACCACTTCTATCTATTATCTACTATACCCCAGAGTCAAATATCATCGTGACGAAAACTGTGGCGAGCCTGAGAAAGATTGTGCAAAGTCTCAACATTTTCGAAGACCCCTACGTTTTGACACTAAAAAGGAGTGATAGCGAAAAAAGTCAACGTGAGCTGGCGAAAGTACTCAAGAGTTTTAAGACATATAGTCAAACCCAATTAAAGTC
SEQ ID NO：11-来自大丽轮枝菌(V.dahliae)DCL(VDAG_00471)cDNA的RNAi片段
GGCAAGCCCAAGAGAATCGCCTTTTTCCTCGTGGAAAAGGTTGCTCTTGCCCTCCAACAGCACGCGGTTCTGGAGTGCAATCTGGAATTTCCCATTGACCGGGTATGCGGTGACATGGTACGGTCGGACTGGATCAAGGAGTCATGGATGAAAAGATGGGATGACAACATGGTCATGGTCTGCACCGCCGCCATCCTTCAGCAATGCCTTGCCAGATCATTCATCCGCATGGATCAGATCAACCTGCTTGTCTTCGATGAAGCACATCACGCCAAGGGAAATCATCCGTACGC
SEQ ID NO：12-来自大丽轮枝菌(V.dahliae)DCL(VDAG 06945.1)cDNA的RNAi片段
ACAGACACGCCGGAAAATCCCCCTTTGGAAGTTTATGCGCCACTCCTCAATAGAGGTTGTGCAGCAGCAGACCAAAGCTGCCAGCGTTCATGCCGATCTCCGAGGACAGATCATGCACGCTCTGGAACATGGGTCAAGCTACCCCTGGTCTCTTCTCGCCCGTTTACATCCCGCAAAGTTCTTCTCCGACATGGTCGAAGCTGTACTGGGTGCCGTCTGGGTCGATTCGGGCGACATGGGCGCGTGCATTCGTGTGGCGGAACGACTGGGCATTCTGCCTGTGCTCTCCCGACTGGCAAAGGAGGACGTTCATGTGCTG
SEQ ID NO：13-siR3的LTR
＞灰色葡萄孢菌(B.cinerea)(B05.10)灰色葡萄孢菌(Botrytis cinerea)超级重叠群1.56[DNA]218751-219771-
CTCCTGGATCAGGCAGATGAATTAGGGAACTGATTTCGACCTTCCAGAGTTCTCTTTGCGTGATGGGTCACTTGGGTTTGGTTGTCGGTATGCTGTGGGTTCGGAGGAGTTGTCCTTTCTGGTTTCTTTGTTGGATAGTCCTTTTTGGGTAGCTTGGTGTGATGCATGCGTTCTGGGTGTGGGTCTCGTGAGGTCTTTTTGTATCAAGTATTTTTAAGCTTTTTTCTTGTTCTCTTCTTTTTCTGTATTGGTAATGCTTCTTCTTTATGAT
TATGCTTGCCCGCTGGTTTTTATACCCGTCACGACAAAGGGGCCTATAAATCGATCGGAGAATTTTTTCTTAGGTCGCAGTTGTTTAATGTTCTTTGTGCTTAGCATCACCTTGTCCCCGATGCTATATCGCTGTGGTGACCCCTTCGTAGTGTTCTTGTTTTTCTGATTGGTTGCCGATTTCCAGAATTCTTTCAGCTTTTCTCTTTCTTTCTCTAAAGCGTCGATGCGCTCGCGTGCTGCCGGCGCCCTTCCCTCTAAATCGGCGTCCTCGCCGATATAATGGAATGTGGGTTGGAACCCATACATAGCCTGGAATGGGCTTGTATTGGTTGTACTGTGCCATGTCGCGTTATATGTGAATTCAGCAAGGGGCAATAGCGATGCCCAGTCGTCTTGCCTATAGTTGGTGTAGCAACTTATATAGTGAATCAAATTTTGGTTTTGTCGTTCGGTTTGACCGTCGGTCTGCGGGTGGAACG
SEQ ID NO：14-siR5的LTR
＞BC1G 08572.1逆转录转座元件Tf21蛋白1型(转录物：BC1T 08572)ATGGCATCCAGAGCTACCGCCACAGGTCAATCTGCCGGAGACACCAACGACATCGAGATGACCGACGCCCCAAAGGAGATCACTATCAACGAAACCCTTAAGATCGCCTTACCAGACAAGTACCAAGGTAGTCGACAAGAGCTCGATACTTTCCTCTTACAACTTGAGATCTACTTTCGATTCAATGAGGACAAGTTCACTACCAAGGAATCCAAGAGTATATGGGCCGCATCATACCTTCGAGGTGAAGCAACCAAATGGATCCAACCATATTTGCGCGACTATTTCGAGCATGACGATAAGGATCGTATGCAACCCACCCGAACAATCTTCAATAGTTTTGAAGGATTTAAGACAGAGATTCGTAGAATCTTCGGAAATTCCAACGAGTTAGAGGTAGCGGAAGATAAGATCTTCAACCTCAAGCAGACAGGATCAGCATTGAAATATGCTACGGAATTTCGAAGATATGCTGGAACAACCAAGTGGGACGAAATCGCTATCATGAGTCACTACCGCAAGGGACTCAAACCAGAAGTCAGACTGGAATTAGAAAGATCTGCCGAGAGTACAGATCTGAACGATCTAATTCAGGACTCCATCGAATCAGATGATCGTCTCTACAGATATCGACAAAGCCAGAGATCATACAAACCCCAAGGAAATCAGAAGCAAGGGCGTTACCGCAAAAATGAGGGTAGACCACGTTACAATCCACAGAGATACGGAGACCCCATGGAACTAGACGCCACGCACTACACAAACGGGAACGATGACTCGGAAAAGAGACGAAGACGAGAAAACAACTTATGCTTTGAATGTGGAAAAGCAGGGCACCGAGCAGCAGACTGCCGAAGCAAGAAGACAGGAGGAAAAAGGGGCAACTTCAAACCTAAGTTCGGCAAAGGCCAACTTAACGCTACCTTTACAATCCCAGAAAATCCAACTAAATCCGAAAATACTGAGACTTTCACCGTTGAGGAATTCCAGCAATTACTAAAGGAATTACCACGAAATCAAGAGGGCATGAATGCAATAGACTTATGGGAGCAAGAGTATTACAGAACCCCAACACCCTCTGTGACAGAAGAAAGTCATCAGGACGAGGCAGAAGCAGACCACGCCACGATGAGCTGGACAGCTTGCTATGATGAATTCTGCGGAATCCATCGATCAGATAAAGAAGCAACCGGATGGTCCCCTAAGAAGAGAAAGACGAAGAACCATCAGAATAATGTAACATGCGAGGATTTAACTCCCAATATAACTTCGCAAGAAGTTCGCAAAGTTACCCAGCAGTTAAATGCTACGGGACAGGCAGGACAGATATACTGCAAGGTTCAGATAAATGGACACATACAATCAGCCATGATAGATTCAGGGGCTACAGGAAATTTTATTGCACCGGAAGCTGAGACAATCCCAATACGAATGGGCATAACCCAACATACAGAGGTTATACAGCTTGACGTTGTGCCATTGGGCCAACAACAGATCATCTTAGGAATGCCATGGTTAAAGGCACATAATCCGAAAATAGATTGGGCACAAGGAATTGTGACATTTGATCAGTGCAAAAGCGGTCACAGGGACACGCTAGAGGCGTTCGCGAGACGTAACACGCGCCAAGGAGAGTTGAACGCGAACAACACCGGCGACGTAGGACACCCAGTCCAGGGTCCTCCATTAAGAGCGAAGGCCAGTACACCTCCTCTACAAATGCAGAAGCCAACGACACGGCACGAAATCGCAATCGAGGCAAAAGAAAAGCCTACGATACCAGAACAGTACAAGAATTATGAACATGTTTTCAAAGAACCAGGGATCCATGAGGCTTTACCGGAACACAAGCCATGGGATCATGAGATAATATTGGAGGAAGGCAAGATGCCTGTGCACACCCCAATTTATTCAATGTCAGCCGATGAGTTAAAGAGGCTCAGAGAGTACATCGACGACAATTTAGCCAAGGGATGGATCAGGGAATCCGCGTCCCAAGTGGCCAGTCCAACTATGTGGAAGGATCGATATCCACTTCCATTAGCTACGGAATTAAGAGATCGATTAGGCGGAGCTACGATATTTACCAAGATGGACCTACGTAATGGTTACCACTTGATCAGAATGAAGGAAGGCGAAGAATGGAAAACCGCTTCAAAACAAGATACGGGCTATACGACTACTTTCATGAGGCTTATGAACAATGTGTTGTCACAATATTTGGATACTTGCTGTATATGCTACTTGGACGACATCCTAGTATATTCAAACAACAAGGTTCAACACATTAAGGACGTTAG
CAACATCCTCGAAAGCCTATCCAAGGCAGACTTGCTGTGCAAACCAAGCAAATGCGAATTCCATGTCACAGAGACAGAATTCTTGGGATTCACCGTATCAAGCCAAGGGCTCAAGATGAGCAAAGGCAAGGTTAAGGCAGTGCTCGAATGGAAGCAGCCGACCACAATCAAGGAAGTACAATCCTTTCTAGGGTTCGTCAACTTCTACAGAAGATTCATCAAGGGTTATTCAGGGATTACTACACCCTTGACCACGTTAACCAGAAAAGATCAAGGAAGCTTCGAATGGACTGCCAAAGCACAGGAGTCATTCGATACGCTCAAACAAGCAGTGGCAGAAGAGCCAATACTGTTGACTTTTGACCCAGAGAAAGAAATCATAGTGGAGACGGACTCCTCGGATTTCGCTATAGGAGCAGTTCTGAGCCAACCGGGCCAGAATGGAAAATACCAGCCAATCGCATTCTACTCCCGAAAACTATCACCAGCCGAATTGAATTACGAGATATATGACAAAGAATTACTGGCGATAGTCGATGCATTTAGAGAATGGCGAGTGTATTTGGAAGGATCGAAATACACGGTACAGGTGTATACAGATCATAAGAACTTGGTTTACTTCACCACAACGAAGCAGTTAAACAGACGACAGGTCAGATGGTCGGAGACCATGGCCAACTACAATTTCAGAATTTCATATGT
SEQ ID NO：15-siR5的LTR
＞BC1 G_15284.1-酶多聚蛋白
ATGGCATCCAGAGATATCGCCACAGGTCAATCTGCCGGAGACACCAACGACATCGAGATGACCGATGCCCCAAAAGAGATCACTATCAACGAAACACTTAAGATCGCCTTACCAGACAAGTACCAAGGTAGTCGACAAGAACTCGATACTTTCCTCTTACAACTTGAGATCTACTTCCGATTCAATGAGGACAAGTTCACTACCAAGGAATCCAAGAGTATATGGGCCGCATCATACCTTCGAGGTGAAGCAACCAAATGGATCCAACCATATTTGCGCGACTATTTCGAGCATGACGATAAGGATCGCATGCAACCCACCCGAACAATCTTCAATAGTTTTGAAGGATTTAAGACAGAGATTCGTAGAATCTTCGGAAATTCCAACGAGTTAGAGGTAGCGGAAGATAAGATCTTCAACCTCAAGCAGACAGGATCAGCATTGAAATATGCTACGGAATTTCGAAGATATGCTGGAACAACCAAGTGGGACGAAATCGCTATCATGAGTCACTACCGTAAGGGACTCAAACCAGAAGTCAGACTGGAATTAGAAAGATCTGCCGAGAGTACAGATCTGAACGATCTAATTCAGGACTCCATCGAATCAGATGATCGTCTCTACAGATATCGACAAAGCCAGAGATCATACAAACCCCAAGGAAATCAGAAGCAAGGGCGTTACCGCAAGAATGAGGGTAGACCACGTTACAACCCACAGAGATACGGAGACCCCATGGAACTAGACGCTACGCACTACACAAACGGGAACGATGACTCAGAAAAGAGACGAAGACGAGAAAACAACTTATGCTTTGAATGTGGAAAAGCAGGGCACCGAGCAGCAGAATGCCGAAGCAAGAAGACAGGAGGAAAAAGGGGCAACTTCAAACCTAAGTTCGGCAAGGGCCAACTTAATGCCACCTTTGCAATCTCAGAAAACTCAACTAAACCCGAAAATACTGAGACTTTCACCGTTGAGGAATTCCAGCAATTATTAGAGGAATTACCACGAAACCAAGAGGGCATGAATGCAATAGACTTATGGGAACAAGAGTATTACAGAACTCCAACACCCTCTGTGACAGAAGAAAGTCACCAGGACGAGGCAGAAGCGGACCACGCCACGATAAGCTGGACAGCTTGCTATGACGAATTCTGCGGAATCCATCGATCAGATAAAGAAGCAACCGGATGGTTCCCTAAGAAGAGAAAGACGAAGAACCATCAGAATAATGTAACATGCGAGGATTTAACTCCCAATATAACTTCGCAAGAAGTTCGCAAAGTTACCCAGCAGTTAAATGCTACGGGACAGGCAGGACAGATATACTGCAAGGTTCAGATAAATGGACACATACAATCAGCCATGATAGATTCAGGGGCTACAGGAAATTTTATTGCACCAGAAGCGGCAAAGTACTTGGAAATACCACTTCAGAGGAAACAATACCCCTATCGATTGCAGTTAGTTGACGGACAGCTAGCAGGGTCTGACGGAAAGATTTCGCAGGAGACAATCCCAGTACGAATGAGCATAACCCAACATACAGAGGTTATACAGCTTGATGTTGTGCCATTGGGCCAACAACAGATCATCTTAGGAATGCCATGGTTAAAGGCACATAATCCGAAAATAGATTGGGCACAAGGAGTTGTGACATTTGATCAGTGCAAAAGCGGTCACAGGGACACGATAGAGGCGTCCGCGAGACGTAACACGCGCCAAGGAGAGTTGAACGCGAACAACACCGGCGACGTAGGACACCCAGTCCAGGGTCCTCCATTAAGAGCGAAGGCCAGTACACCTCCTCTACAAATGCAGAAGCCAACGACACGGCACGAAATCGCAATCGAGGCAAAAGAAAGGCCTACGATACCAGAACAGTACAAGAAATATGAACATGTTTTCAAAGAACCAGGGATCCATGAGGCTTTACCGGAACACAAGCCATGGGATCATGAGATAATATTGGAGGAAGGCAAGATGCCTGTGCACACCCCAATTTATTCAATGTCAGCCGATGAGTTAAAGAGGCTCAGAGAGTACATCGACGACAATTTAGCCAAGGGATGGATCAGGGAATCCGCGTCCCAAGTGGCCAGTCCAACTATGTGGGTACCCAAGAAGGATGGACCCGATAGACTAGTTGTAGACTATAGAAAGCTTAACGCACTCACTAAGAAGGATCGATATCCACTTCCATTAGCTACGGAATTAAGAGATCGATTAGGCGGAGCTACGATATTCACCAAGATGGACCTACGTAATGGTTACCACTTGATCAGAATGAAGGAAGGCGAAGAATGGAAAACCGCTTTCAAAACAAGATACGGGCTATACGAGTACCAAGTTATGCCATTCGGGCTAACCAACGCACCAGCTACTTTCATGAGGCTTATGAACAATGTGTTGTCACAATATTTGGATACTTGCTGTATATGCTACTTGGACGACATCCTAGTATATTCAAACAACAAGGTTCAACACATTAAGGACGTTAGCAACATCCTCGAAAGCCTATCCAAGGCAGACTTGCTGTGCAAACCAAGCAAATGCGAATTCCATGTCACAGAGACAGAATTCTTGGGATTCACCGTATCAAGCCAAGGGCTCAAGATGAGCAAAGACAAGGTTAAGGCAGTGCTCGAATGGAAGCAGCCGACCACAATCAAGGAAGTACAATCCTTTCTAGGGTTCGTCAACTTCTACAGAAGATTTATCAAGGGTTATTCAGGGATTACTACACCCTTGACCACGTTAACCAGAAAAGATCAAGGAAGCTTCGAATGGACTGCCAAAGCACAGGAGTCATTCGATACGCTCAAACAAGCAGTGGCAG
ACCACGAAAATCACACCAGCACGAGCTAATTTTGGGTTTAATCCACAAGCGTATAAAATCCCGATACCACAAGAAGTTAATGCCGAATCAGCGATAGTACAAATCGAACAGCTGAAAGATCTCCAAGAGCAACTGGCTCTTGATCTAAGATTCATATCTTCCAGAACAGCAGCGTACTACAATACGAAACGTAGTATGGAACCTACGCTTAAAGAGGGGGATAAAGTTTATTTGCTACGACGAAACATCGAAACCAAGAGACCAAGCAATAAACTCGACCACAGGAAACTAGGACCATTCAAGATTGATAAGGTAATAGGAACGGTTAATTATCGATTGAAATTACCAGACACAATGAATATCCACCCAGTATTCCACATATCCTTGCTCGAACCAGCACCACCAGGAGCGCCAAATGCGCCATTTACAGAAATTGAACCAG
TCAACCCAAACGCCATATACGATGTCGAAACAATACTAGACTGCAAATACGTCAGAAACAAGGTCAAGTATTTGATCAAATGGTTAGACTACCCACATTCAGAAAACACATGGGAACTCAAGGAAGATCTCAGCTGCCCTGAGAAGCTACGGGCATTCCACCTGAAGTACCCACACCTGCCAATAAAGCCTCAAGATCCGCTTCGGACAACTCAGGCAAAGAAGGATCGAAGAAATCGAAGGAAGAAGAATCAATAGSEQ ID NO：16-siR5的LTR
＞BC1G_04408.1逆转录转座元件Tf21蛋白1型
ATGGCATCCAGAGCTACCGCCACAGGTCAGTCTACCGGAGATACCAACGACATCGAGATGACCGATGCCCCAAAGGAGATCACTATCAACGAAACACTTAAGATCGCCTTACCAGACAAGTACCAAGGTAGTCGACAAGAGCTCGATACTTTCCTCTTACAACTTGAGATCTACTTCCGATTCAATGAGGACAAGTTCACTACCAAGGAATCCAAGAGCATATGGGCTGCATCATACCTCCGAGGTGAAGCAACCAAATGGATTCAACCATATTTGCGCGACTATTTCGAGCATGACGATAAGGATCGCATGCAACCCACCCGAACAATCTTCAATAGTTTTGAAGGATTTAAGACAGAGATTCGTAGAATCTTCGGAAATTCCAACGAGTTAGAGGTAGCGGAAGATAAGATCTTCAACCTCAAGCAGACAGGATCAGCATTGAAATATGCTACGGAATTTCGAAGATATGCTGGAACAACCAAGTGGGACGAAATCGCTATCATGAGTCACTATCGTAAGGGACTCAAACCAGAAGTCAGACTGGAATTAGAAAGATCTGCCGAGAGTACAGATCTGAACGATCTAATTCAGGACTCCATCGAATCAGATGATCGTCTCTACAGATATCGACAAAGCCAGAGATCATACAAACCCCAAGGAAATCAGAAGCAAGGGCGTTACCGCAAAAATGAGGGTAGACCACGTTACAATCCACAGAGATACGGAGACCCCATGGAACTAGACGCCACGCACTACACAAACGGGAACGATGACTCGGAAAAGAGACGAAGACGAGAAAACAACTTATGCTTTGAATGTGGAAAAGCAGGGCACCGAGCAGCAGACTGCCGAAGCAAGAAGACAGGAGGAAAAAGGGGCAACTTCAAACCTAAGTTCGGCAAAGGCCAACTTAACGCTACCTTTACAATCCCAGAAAATCCAACTAAATCCGAAAATACTGAGACTTTCACCGTTGAGGAATTCCAGCAATTACTAAAGGAATTACCACGAAATCAAGAGGGCATGAATGCAATAGACTTATGGGAGCAAGAGTATTACAGAACCCCAACACCCTCTGTGACAGAAGAAAGTCATCAGGACGAGGCAGAAGCAGACCACGCCACGATGAGCTGGACAGCTTGCTATGATGAATTCTGCGGAATCCATCGATCAGATAAAGAAGCAACCGGATGGTTCCCTAAGAAGAGAAAGACGAAGAACCATCAGAATAATGTAACATGCGAGGATTTAACTCCCAATATAACTTCGCAAGAAGTTCGCAAAGTTACCCAGCAGTTAAATGCTACGGGACAGGCAGGACAGATATACTGCAAGGTTCAGATAAATGGACACATACAATCAGCCATGATAGATTCAGGGGCTACAGGAAATTTTATTGCACCGGAAGCTGTAAAGTACTTGGGAATACCACTTCAAACGAAACAACACCCCTATCGATTGCAGGACACGCTAGAGGCGTCCGCGAGACGTAACACGCGCCAAGGAGAGTTGAACGCGAACAACACCGGCGACGTAGGACACCCAGTCCAGGGTCCTCCATTAAGAGCGAAGGCCAGTACACCTCCTCTACAAATGCAGAAGCCAACGACACGGCACGAAATCGCAATCGAGGCAAAAGAAAGGCCTACGATACCAGAACAGTACAAGAAATATGAACATGTTTTCAAAGAACCAGGGATCCATGAGGCTTTACCAGAACACAAGCCATGGGATCATGAGATAATATTGGAGGAAGGCAAGATGCCTGTGCACACCCCAATTTATTCAATGTCAGCCGATGAGTTAAAAAGGCTCAGAGAATACATCGACGACAATTTAGCCAAGGGATGGATCAGGGAATCCGCGTCCCAAGTGGCCAGTCCAACTATGTGGGTACCCAAGAAGGATGGACCCGATAGACTAGTTGTAGACTATAGAAAGCTTAACGCACTCACTAAGAAGGATCGATATCCACTTCCATTAGCTACGGAATTAAGAGATCGATTAGGCGGAGCTACGATATTTACCAAGATGGACCTACGTAATGGTTACCACTTGATCAGAATGAAGGAAGGCGAAGAATGGAAGACCGCTTTCAAAACAAGATACGGGCTATACGAGTACCAAGTTATGCCGTTCGGGCTAACCAACGCACCAGCTACTTTCATGAGGCTTATGAACAATGTGTTGTCACAATACTTGGATACTTGCTGTATATGCTACTTGGACGACATCCTAGTATATTCAAACAACAAGGTTCAACACATTAAGGACGTTAGCAACATCCTCGAAAGCCT
ATCCAAGGCAGACTTGCTGTGCAAACCAAGCAAATGCGAATTCCATGTCACAGAGACAGACTTCTTGGGATTCACCGTATCAAGCCAAGGGCTCAAGATGAGCAAAGACAAGGTTAAGGCAGTGCTCGAATGGAAACAGCCAACCACAATCAAGGAGGTACAATCCTTTCTAGGGTTCGTCAACTTCTACAGAAGATTTATCAAGGGTTATTCAGGGATTACTACACCCTTGACCACGTTAACCAGAAAAGATCAAGGAAGCTTCGAATGGACTGCCAAAGCACAGGAGTCATTCGATACGCTCAAACAAGCAGTGGCAGAAGAGCCAATACTATTGACTTTTGACCCAGAGAAAGAAATCATAGTGGAGACGGACTCCTCGGATTTCGCTATAGGAGCAGTTCTGAGCCAACCGGGCCAGAATGGAAAATACCAGCCAATCGCATTCTATTCCCGAAAACTATCACCAGCTGAGTTGAATTACGAGATATATGACAAAGAATTGCTGGCGATAGTCGATGCATTTAGAGAATGGCGAGTATATTTGGAAGGATCGAAATACACAGTACAGGTGTATACAGATCATAAGAACTTGGTTTACTTCACCACAACGAAGCAGTTAAACAGACGACAGGTCAGATGGTCGGAGACCATGGCCAACTACAATTTCAGAATTTCATATGTCAAAGGATCAGAAAACGCTAGAGCCGACGCTCTTAGCCGAAAACCAGAATATCAAGAAAAC
SEQ ID NO：17-siR5的LTR
＞BC1G_12842.1逆转录转座元件Tf21蛋白1型(转录物：BC1T_12842)
ATGGCATCCAGAGCTACCGCCACAGGTCAGCCTACCGGAGATACCAACGACATCGAGATGACCGATGCCCCAAAGGAGATCACTATCAACGAAACCCTTAAGATCGCCTTACCAGACAAGTACCAAGGTAGTCGACAAGAGCTCGATACTTTCCTCTTACAACTTGAGATCTACTTTCGATTCAATGAGGACAAGTTCACTACCAAGGAATCCAAGAGTATATGGGCCGCATCATACCTTCGAGGTGAAGCAACCAAATGGATCCAACCATATTTGCGCGACTATTTCGAGCATGACGATAAGGATCGCATGCAACCCACCCGAACAATCTTCAATAGCTTTGAAGGATTTAAGACAGAGATTCGTAGAATCTTCGGAAATTCCAACGAGCTAGAGGTAGCGGAAGATAAGATCTTCAACCTCAAGCAGACAGGATCAGCATTGAAATATGCTACGGAATTTCGAAGATACGCTGGAACAACCAAGTGGGACGAAATCGCTATCATGAGTCACTACCGCAAGGGACTCAAACCAGAAGTCAGACTGGAATTAGAAAGATCTGCCGAGAGTACAGATCTGAACGATCTAATTCAGGACTCCATCGAATCAGATGATCGTCTCTACAGATATCGACAAAGCCAGAGATCATACAAACCCCAAGGAAATCAGAAGCAAGGGCGTTACCGCAAGAATGAGGGTAGACCACGTTACAATCCACAAAGATACGGAGACCCCATGGAACTAGACGCTACGCACTACACAAACGGGAACGATGACTCAGAAAAGAGACGAAGACGAGAAAACAACTTATGCTTTGAATGTGGAAAAGCAGGGCACCGAGCAGCAGACTGCCGAAGCAAGAAGACAGGAGGAAAAAGGGGCAACTTCAAACCTAAGTTCGGCAAAGGCCAACTTAACGCTACCTTTACAATCCCAGAAAACCCAACTAAATCCGAAAATACTGAGACTTTCACCGTTGAGGAATTCCAGCAATTACTAAAGGAATTACCACGAAATAAAGAGGGCATGAATGCAATAGACTTATGGGAACAAGAGTATTACAGAACCCCAACACCCTCTGTGACAGAAGAAAGTCACCAGGACGAGGCAGAAGCGGACCACGCCACGATGAGCTGGACAGCTTGCTATGATGAATTCTGCGGAATCCATCGATCAGATAAAGAAGCAACCGGATGGTTCCCCAAGAAAAGGAAGACGAAGAACCATCAGAATAATGTAACATGCACGGATTTAACTTCAAATATAACTTCGCGAAAAGTTCGCAAAGTTACCCAGCAGTTGAATGCTACGGGACAAGCAGGACAGATATACTGCAAGGTTCAGATAAATGGACACATACAATCAGCCATGATAGATTCAGGGGCTACAGGAAATTTTATTGCACCAGAAGCTGCAAAGTACTTGGAAATACCACTTCAGACGAAACAATACCCCTATCGATTGCAGTTAGTTGACGGACAGCTAGCAGGGTCTGACGGAAAGATTTCGCAGGAGACAATCCCAGTACGAATGGGCATAACCCAACATACAGAGGTTATACAGCTTGACGTTGTGCCATTGGGCCAACAACAGATCATCTTAGGAATGCCATGGTTGAAGGCACATAATCCGAAAATAGATTGGGCACAAGGAATTGTGACATTTGATCAGTGCAAAAGCGGTCACAGGGACACGCTAGAGGCGTCCGCGAGACGTAACACGCGCCAAGGAGAGTTGAACGCGAACAACACCGGCGACGTAGGACACCCAGTCCAGGGTCCTCCATTAAGAGCGAAGGCCAGTACACCTCCTCTACAAATGCAGAAGCCAACGACACGGCACGAAATCGCAATCGAGGCAAAAGAAAGGCCTACGATACCAGAACAGTACAAGAAATATGAACATGTTTTCAAAGAACCAGGGATCCATGAGGCTTTACCGGAACACAAGCCATGGGATCATGAGATAATATTGGAGGAAGGCAAGATGCCTGTGCACACCCCAATTTATTCAATGTCAGCCGATGAGTTAAAAAGGCTCAGAGAATACATCGACGACAATTTAGCCAAGGGATGGATCAGGGAATCCGCGTCCCAAGTGGCCAGTCCAACTATGTGGGTACCCAAGAAGGATGGACCCGATAGACTAGTTGTAGACTATAGAAAGCTTAACGCACTCACTAAGAAGGATCGATATCCACTTCCATTAGCTACGGAATTAAGAGATCGATTAGGCGGAGCTACGATATTCACCAAGATGGACCTACGTAATGGTTACCACTTGATCAGAATGAAGGAAGG
CGAAGAATGGAAAACCGCTTTCAAAACAAGATACGGGCTATACGAGTACCAAGTTATGCCGTTCGGGCTAACCAACGCACCAGCTACTTTCATGAGGCTTATGAACAATGTGTTGTCACAATATTTGGATACTTGCTGTATATGCTACTTGGACGACATCCTAGTATATTCAAACAACAAGGTTCAACACATTAAGGACGTTAGCAGCATCCTCGAAAGTCTATCCAAAGCAGACTTGCTGTGCAAACCAAGCAAATGCGAATTCCATGTCACAGAAACAGAATTCTTGGGATTCACCGTATCAAGCCAAGGGCTCAAGATGAGCAAAGACAAGGTTAAGGCAGTGCTCGAATGGAAGCAGCCGACCACAATCAAGGAAGTACAATCCTTTCTAGGATTTGTCAACTTCTATAGAAGATTTATCAAGGGTTATTCAGGGATTACTACACCCTTGACCACGTTAACCAGAAAAGATCAAGGAAGCTTCGAATGGACTGCCAAAGCACAGGAGTCATTCGATACACTCAAACAAGCAGTGGCAGAAGAACCAATACTGTTGACTTTTGACCCAGA
ATTTTGGGTTTAATCCACAAGCGTATAAAATCCCGATACCACAAGAAGTTAATGCCGAATCAGCAATAGTACAAGTCGAACAGCTGAAAAATCTCCAAGAGCAACTGGCTCTTGATCTAAGATTCATATCTTCCAGAACAGCAGCGTACTACAATACGAAACGTAGTATGGAACCTACGCTTAAAGAGGGGGATAAAGTTTATTTGCTACGACGAAACATCGAAACCAAGAGACCAAGCAATAAACTCGACCACAGGAAACTAGGACCATTCAAGATTGATAAGGTAATAGGAACGGTTAATTATCGATTGAAATTACCAGACACAATGAATATCCACCCAGTATTCCACATATCCTTGCTCGAACCAGCACCACCAGGAGCGCCAAATGCGCCATTTACAGAAATTGAACCAG
TCAACCCAAACGCCATATACGATGTCGAAACAATACTAGACTGCAAATACGTCAGAAACAAGGTCAAGTATTTGATCAAATGGTTAGACTACCCACATTCAGAAAACACATGGGAATTCAAGGAGGATCTCAGCTGCCCTGAGAAGCTACGGGCATTCCACCTGAAGTACCCACACCTGCCAGTAAAGCCTCAAGATCCG
CTTCGGACAACTCAGGCAAAGAAGGATCGAAGAAGTCGAAGGAAGAAGAATCAATAG
SEQ ID NO：18-siR5的LTR
＞BC1 G_07532-逆转录转座元件Tf21蛋白1型
ATGGCATCCAGAGCTACCGCCACAGGTCAATCTGCCGGAGACACCAACGACATCGAGATGACCGACGCCCCAAAGGAGATCACTATCAACGAAACCCTTAAGATCGCCTTACCAGACAAGTACCAAGGTAGTCGACAAGAGCTCGATACTTTCCTCTTACAACTTGAGATCTACTTTCGATTCAATGAGGACAAGTTCACTACCAAGGAATCCAAGAGTATATGGGCCGCATCATACCTTCGAGGTGAAGCAACCAAATGGATCCAACCATATTTGCGCGACTATTTCGAGCATGACGATAAGGATCGTATGCAACCCACCCGAACAATCTTCAATAGTTTTGAAGGATTTAAGACAGAGATTCGTAGAATCTTCGGAAATTCCAACGAGTTAGAGGTAGCGGAAGATAAGATCTTCAACCTCAAGCAGACAGGATCAGCATTGAAATATGCTACGGAATTTCGAAGATATGCTGGAACAACCAAGTGGGACGAAATCGCTATCATGAGTCACTACCGCAAGGGACTCAAACCAGAAGTCAGACTGGAATTAGAAAGATCTGCCGAGAGTACAGATCTGAACGATCTAATTCAGGACTCCATCGAATCAGATGATCGTCTCTACAGATATCGACAAAGCCAGAGATCATACAAACCCCAAGGAAATCAGAAGCAAGGGCGTTACCGCAAAAATGAGGGTAGACCACGTTACAATCCACAGAGATACGGAGACCCCATGGAACTAGACGCCACGCACTACACAAACGGGAACGATGACTCGGAAAAGAGACGAAGACGAGAAAACAACTTATGCTTTGAATGTGGAAAAGCAGGGCACCGAGCAGCAGACTGCCGAAGCAAGAAGACAGGAGGAAAAAGGGGCAACTTCAAACCTAAGTTCGGCAAAGGCCAACTTAACGCTACCTTTACAATCCCAGAAAATCCAACTAAATCCGAAAATACTGAGACTTTCACCGTTGAGGAATTCCAGCAATTACTAAAGGAATTACCACGAAATCAAGAGGGCATGAATGCAATAGACTTATGGGAGCAAGAGTATTACAGAACCCCAACACCCTCTGTGACAGAAGAAAGTCATCAGGACGAGGCAGAAGCAGACCACGCCACGATGAGCTGGACAGCTTGCTATGATGAATTCTGCGGAATCCATCGATCAGATAAAGAAGCAACCGGATGGTCCCCTAAGAAGAGAAAGACGAAGAACCATCAGAATAATGTAACATGCGAGGATTTAACTCCCAATATAACTTCGCAAGAAGTTCGCAAAGTTACCCAGCAGTTAAATGCTACGGGACAGGCAGGACAGATATACTGCAAGGTTCAGATAAATGGACACATACAATCAGCCATGATAGATTCAGGGGCTACAGGAAATTTTATTGCACCGGAAGCTGTAAAGTACTTGGGAATACCACTTCAAACGAAACAACACCCCTATCGATTGCAGGACACGCTAGAGGCGTCCGCGAGACGTAACACGCGCCAAGGAGAGTTGAACGCGAACAACACCGGCGACGTAGGACACCCAGTCCAGGGTCCTCCATTAAGAGCGAAGGCCAGTACACCTCCTCTACAAATGCAGAAGCCAACGACACGGCACGAAATCGCAATCGAGGCAAAAGAAAGGCCTACGATACCAGAACAGTACAAGAAATATGAACATGTTTTCAAAGAACCAGGGATCCATGAGGCTTTACCGGAACACAAGCCATGGGATCATGAGATAATATTGGAGGAAGGCAAGATGCCTGTGCACACCCCAATTTATTCAATGTCAGCCGATGAGTTAAAAAGGCTCAGAGAATACATCGACGACAATTTAGCCAAGGGATGGATCAGGGAATCCGCGTCCCAAGTGGCCAGTCCAACTATGTGGGTACCCAAGAAGGATGGACCCGATAGACTAGTTGTAGACTATAGAAAGCTTAACACACTCACTAAGAAGGATCGATATCCACTTCCATTAGCTACGGAATTAAGAGATCGGTTAGGCGGAGCTACGATATTTACCAAGATGGACCTACGTAATGGTTACCACTTGATCAGAATGAAGGAAGGCGAAGAATGGAAGACCGCTTTCAAAACAAGATACGGGCTATACGAGTACCAAGTTATGCCGTTCGGGCTAACCAACGCACCAGCTACTTTCATGAGGCTTATGAACAATGTGTTGTCACAATACTTGGATACTTGCTGTATATGCTACTTGGACGACATCCTAGTATATTCAAACAACAAGGTTCAACACATTAAGGACGTTAGCAACATCCTCGAAAGCCTATCCAAGGCAGACTTGCTGTGCAAACCAAGCAAATGCGAATTCCATGTCACAGAGACAGAATTCTTGGGATTCACCGTATCAAGCCAAGGGCTCAAGATGAGCAAAGACAAGGTTAAGGCAGTGCTCGAATGGAAGCAGCCAACCACAATCAAGGAAGTACAATCCTTTCTAGGGTTCGTCAACTTCTACAGAAGATTTATCAAGGGTTATTCAGGGATTACTACACCCTTGACCACGTTAACCAGAAAAGATCAAGAAAGCTTCGAATGGACTGCCATAGCACAGGAGTCATTCGATACGCTCAAACAAGCAGTGGCAGAAGAGCCAATACTATTGACTTTTGACCCAGAGAAAGAAATCATAGTGGAGACGGACTCCTCGGATTTCGCTATAGGAGCAGTTCTGAGCCAACCGGGCCAGAATGGAAAATACCAGCCAATCGCATTCTACTCCCGAAAACTATCACCAGCCGAATTGAATTACGAGATATATGACAAAGAATTGCTGGCGATAGTCGATGCATTTAGAGAATGGCGAGTATATTTGGAAGGATCGAAATACACAGTACAGGTGTATACAGATCATAAGAACTTGGTTTACTTCACCACAACGAAGCAGTTAAACAGACGACAGGTCAGATGGTCGGAGACCATGGCCAACTACAATTTCAGAATTTCATATGTCAAAGGATCAGAAAACGCTAGAGCCGACGCTCTTAGCCGAAAACCAGAATATCAAGAAAACAAAACGTACGAGTCATA
SEQ ID NO：19-siR5的LTR
＞BC1G_09712-酶多聚蛋白
ATGGCATCCAGAGCTACCGCCACAGGTCAGTCTACCGAAGATACCAACGACATCGAGATGACCGATGCCCCAAAGGAGATCACTATCAACGAAACACTTAAGATCGCCTTACCAGACAAGTACCAAGGTAGTCGACAAGAGCTCGATACTTTCCTCTTACAACTTGAGATCTACTTCCGATTCAATGAAGACAAGTTCACTACCAAGGAATCCAAGAGCATATGGGCTGCATCATACCTCCGAGGTGAAGCAACCAAATGGATTCAACCATATTTGCGCGACTATTTCGAGCATGACGATAAGGATCGCATGCAACCCACCCGAACAATCTTCAATAGTTTTGAAGGATTTAAGACAGAGATTCGTAGAATCTTCGGAAATTCCAACGAGTTAGAGGTAGCGGAAGATAAGATCTTCAACCTCAAGCAGACAGGATCAGCATTGAAATATGCTACGGAATTTCGAAGATATGCTGGAACAACCAAGTGGGACGAAATCGCTATCATGAGTCACTACTGTAAGGGACTCAAACCAGAAGTCAGACTAGAGTTAGAAAGATCTGCCGAGAGTACAGATCTGAACGATCTAATTCAGGACTCCATCGAATCAGATGATCGTCTCTATAGATATCGACAAAGCCAAAGATCATACAAACCCCAAGGAAACCAAAAGCAAGGGCGTTACCGCAAGAATGAGGGTAGACCACGTTACAATCCACAGAGATACGGAGACCCCATGGAACTAGACGCCACGCACTACACAAACGGGAACGATGACTCAGAAAAGAGACGAAGACGAGAAAACAACTTATGCTTTGAATGTGGAAAAGCAGGGCACCGAGCAGTAGACTGCCGAAGCAAGAAGACAGGAGGAAAAAGGGGCAACTTCAAACCTAAGTTCGGCAAGGGCCAACTTAACGCCACCTTTGCCATCTCAGAAAACTCAACTAAAACCGAAAATACTGAGACTTTCACCGTTGAGGAATTTCAGCAATTACTAAAGGAATTACCACGAAATAAAGAGGGCATGAATGCAATAGACTTATGGGAACAAGAGTATTACAGAACCCCAACACCCTCTGTGACAGAAGAAAGTCACCAGGACGAGGCAGAAGCGGACCACGCCACGATGAGCTGGACAGCTTGCTATGATGAATTCTGCGGAATCCATCGATCAGATAAAGAAGCAACCGGATGGTTCCCCAAGAAAAGGAAGACGAAGAACCATCAGAATAATGTAACATGCGAGGATTTAACTCCCAATATAACTTCGCAAGAAGTTCGCAAAGTTACCCAGCAGTTGAATGCTACGGGACAGGCAGGACAAGTGTACTGCAAGGTCCAGATAAATGGACACATACAATCAGCCATGATAGATTCAGGGGCTACAGGAAATTTTATTGCACCAGAAGCTGCAAAGTACTTGGAAATACCACTTCAAACGAAACAACACCCCTATCGATTGCAGGACACGCTAGAGGCGTCCGCGAGACGTAACACGCGCCAAGGGGAGTTGAACGCGAACAACACCGGCGACGTAGGACACCCAGTCCAGGGTCCTCCATTAAGAGCGAAGGCCAGTACACCTCCTCTACAAATGCAGAAGCCAACGACACGGCACGAAATCGCAATCGAGGCAAAAGAAAGGCCTACGATACCAGAACAGTACAAGAAATATGAACATGTTTTCAAAGAACCAGGGATCCATGAGGCTTTACCGGAACACAAGCCATGGGATCATGAGATAATATTGGAGGAAGGCAAGATGCCTGTGCACACCCCAATTTATTCAATGTCAGCCGATGAGTTAAAAAGGCTCAGAGAATACATCGACGACAATTTAGCCAAGGGATGGATCAGGGAATCCGCGTCCCAAGTGGCCAGTCCAACTATGTGGGTACCCAAGAAGGATGGACCCGATAGACTAGTTGTAGACTATAGAAAGCTTAACGCACTCACTAAGAAGGATCGATATCCACTTCCATTAGCTACGGAATTAAGAGATCGATTAGGCGGAGCTACGATATTCACCAAGATGGACCTACGTAATGGTTACCACTTGATCAGAATGAAGGAAGGCGAAGAATGGAAAACCGCTTTCAAAACAAGATACGGGCTATACGAGTACCAAGTTATGCCATTCGGGCTAACCAACGCACCAGCTACTTTCATGAGGCTTATGAACAATGTGTTGTCACAATATTTGGATACTTGCTGTATATGCTACTTGGACGACATCCTAGTATATTCAAACAACAAGGTTCAACACATTAAGGACGTTAGCAACATCCTCGAAAGTCT
ATCCAAAGCAGACTTGCTGTGCAAACCAAGCAAATGCGAATTCCATGTCACAGAAACAGAATTCTTGGGATTCACCGTATCAAGCCAAGGGCTCAAGATGAGCAAAGACAAGGTTAAGGCAGTGCTCGAATGGAAGCAGCCAACCACAATCAAGGAGGTACAATCCTTTCTAGGGTTCGTCAACTTCTACAGAAGATTTATCAAGGGTTATTCAGGGATTACTACACCCTTGACCACGTTAACCAGAAAAGATCAAGGAAGCTTCGAATGGACTGCCAAAGCACAGGAGTCATTCGATACACTCAAACAAGCAGTGGCAGAAGAACCAATACTGTTGACTTTTGACCCAGAGAAAGAAATCATAGTGGAAACGGATTCCTCAGATTTCGCTATAGGAGCAGTTCTGAGCCAACCGGGCCAGAATGGAAAATACCAGCCAATCGCATTCTACTCCCGAAAACTATCACCAGCTGAGTTAAATTACGAGATATATGACAAAGAATTACTGGCAATAGTCGATGCATTTAGAGAATGGCGAGTATATTTGGAAGGATCGAAATACACAGTACAGGTGTATACAGATCATAAGAACTTGGTTTACTTCACCACAACGA
SEQ ID NO：20-siR5的LTR
＞BC1G_15972-酶多聚蛋白
ATGGCATCCAGAGCTACCGCCACAGGTCAATCTGCCGGAGACACCAACGACATCGAGATGACCGACGCTCCAAAGGAGATCACTATCAACGAAACCCTTAAGATCGCCTTACCAGACAAGTACCAAGGTAGTCGACAAGAGCTCGATACTTTCCTCTTACAACTTGAGATCTACTTCCGATTCAATGAGGACAAGTTCACTACCAAGGAATCCAAGAGCATATGGGCCGCGTCATACCTTCGAGGTGAAGCAACCAAATGGATTCAACCATATTTGCGCGACTATTTCGAGCATGACGATAAGGATCGCATGCAACCCACCCGAACAATCTTCAATAGTTTTGAAGGATTTAAGACAGAGGTTCGTAGAATCTTCGGAAATTCCAACGAGTTAGAGGTAGCGGAAGATAAGATCTTCAACCTCAAGCAGACAGGATCAGCATTGAAATATGCTACGGAATTTCGAAGATATGCTGGAACAACCAAGTGGGACGAAATCGCTATCATGAGTCACTACCGCAAGGGACTCAAACCAGAAGTCAGACTAGAATTAGAAAGATCTGCCGAGAGTACAGATCTAAACGATCTAATTCAGGACTCCATCGAATCAGATGATCGTCTCTACAGATATCGACAAAGCCAAAGATCATACAAACCCCAAGGAAATCAGAAGCAAGGGCGTTACCGCAAGAATGAGGGTAGACCACGTTACAATCCACAGAGATACGGAGACCCCATGGAACTAGACGCTACGCACTACACAAACGGGAACGATGACTCAGAAAAGAGACGAAGACGAGATAACAACTTATGCTTTGAATGTGGAAAAGCAGGGCACCGAGCAGCAGACTGCCGAAGCAAGAAGACAGGAGGAAAAAGGGGCAACTTCAAACCTAAGTTCGGCAAGGGCCAACTTAATGCCACCTTTGCAATCTCAGAAAACTCAACTAAACCCGAAAATACTGAGACTTTCACCGTTGAGGAATTCCAGCAATTATTAGAGGAATTACCACGAAACCAAGAGGGCATGAATGCAATAGACTTATGGGAACAAGAGTATTACAGAACTCCAACACCCTCTGTGACAGAAGAAAGTCACCAGGACGAGGCAGAAGCGGACCACGCCACGATAAGCTGGACAGCTTGCTATGACGAATTCTGCGGAATCCATCGATCAGATAAAGAAGCAACCGGATGGTTCCCCAAGAAGAGAAAGACGAAGAACCGACAGAATAATGTAACATGCAAGGATTTAACTCCAAATGTAACTTCGCGAAAAGTTCGCAAAGTTACACAGCAATTGAATGCTACGGGACAGGCAGGACAAATATACTGCACGGTTCAGATAAATGGACACATACAATCAGCCATGATAGATTCAGGGGCTACAGGGAATTTTATTGCACCAGAAGCTGCAAAGTACTTGGAAATACCACTTCAAACGAAACAACACCCCTACCGATTGCAGTTAGTTGACGGACAGCTAGCAGGGTCTGACGGAAAGATTTCGCAGGAGACAATCCCAGTACGAATGGGCATAACCCAACATACAGAGGTTATACAGCTTGACGTTGTGCCATTGGGCCAACAACAGATCATCTTAGGAATGCCATGGTTAAAGGCACATAATCCGAAAATAGATTGGGCACAAGGAATTGTGACATTTGATCAGTGCAAAAGCGGTCACAGGGACACGCTAGAGGCGTTCGCGAGACGTAACACGCGCCAAGGAGAGTTGAACGCGAACAACACCGGCGACGTAGGACACCCAGTCCAGGGTCCTCCATTAAGAGCGAAGGCCAGTACACCTCCTCTACAAATGCAGAAGCCAACGACACGGCACGAAATCGCAATCGAGGCAAAAGAAAAGCCTACGATACCAGAACAGTACAAGAATTATGAACATGTTTTCAAAGAACCAGGGATCCATGAGGCTTTACCGGAACACAAGCCATGGGATCATGAGATAATATTGGAGGAAGGCAAGATGCCTGTGCACACCCCAATTTATTCAATGTCAGCCGATGAGTTAAAGAGGCTCAGAGAGTACATCGACGACAATTTAGCCAAGGGATGGATCAGGGAATCCGCGTCCCAAGTGGCCAGTCCAACTATGTGGGTACCCAAGAAGGATGGACCCGATAGACTAGTTGTAGACTATAGAAAGCTTAACGCACTCACTAAGAAGGATCGATATCCACTTCCATTAGCTACGGAATTAAGAGATCGATTAGGCGGAGCTACGATATTTACCAAGATGGACCTACGTAATGGTTACCACTTGATCAGAATGAAGGAAGG
CGAAGAATGGAAAACCGCTTTCAAAACAAGATACGGGCTATACGAGTACCAAGTTATGCCATTCGGGCTAACCAACGCACCAGCTACTTTCATGAGGCTTATGAACAATGTGTTGTCACAATATTTGGATACTTGCTGTATATGCTACTTGGACGACATCCTAGTATATTCAAACAACAAGGTTCAACACATTAAGGACGTTAGCAACATCCTCGAAAGCCTATCCAAGGCAGACTTGCTGTGCAAACCAAGCAAATGCGAATTCCATGTCACAGAGACAGAATTCTTGGGATTCACCGTATCAAGCCAAGGGCTCAAGATGAGCAAAGGCAAGGTTAAGGCAGTGCTCGAATGGAAGCAGCCGACCACAATCAAGGAAGTACAATCCTTTCTAGGGTTCGTCAACTTCTACAGAAGATTTATCAAAGGTTATTCAGGGATTACTACACCCTTGACCACGTTAACCAGAAAAGATCAAGGAAGC
GACAATTGGGTAGAGCTATTACCCATGGCACAGTTCGCATACAATACATCAGAAACGGAAACCACGAAAATCACACCAGCACGAGCTAATTTTGGGTTTAATCCACAAGCGTATAAAATCCCGATACCACAAGAAGTTAATGCCGAATCAGCGATAGTACAAGTCGAACAGTTGAAAGATCTCCAAGAGCAACTGGCTCTTGATCTAAGATTCATATCTTCCAGAACAGCAGCGTACTACAATACGAAACGTAGTATGGAACCTACGCTTAAAGAGGGGGATAAAGTTTATTTGCTACGACGAAACATCGAAACCAAGAGACCAAGCAATAAACTCGACCACAGGAAACTAGGACCATTCAAGATTGATAAGGTAATAGGAACGGTTAATTATCAATTGAAATTACCAGACACAATGAATATCCACCCAGTATTCCACATATCCTTGCTCGAACCAGCACCACCAGGAGCGCCAAATGCGCCATTTACAGAAATTGAACCAG
TCAACCCAAACGCCATATACGATGTCGAAACAATACTAGACTGCAAATACGTCAGAAACAAGGTCAAGTATTTGATCAAATGGTTAGACTACCCACATTCAGAAAACACATGGGAACTCAAGGAAGATCTCAGCTGCCCTGAGAAACTACGGGCATTCCACCTGAAGTACCCACATCTGCCAACAAAGCCTCAAGCTCCG
CATCAGACAACAAAGGCAACGAGGGGTCGAAGAAACCAAAAGAAGAACCACTAG
SEQ ID NO：21-siR5的LTR
＞BC1G_13999逆转录转座元件Tf21蛋白1型
ATGTGGGTACCCAAGAAGGATGGACCCGATAGACTAGTTGTAGACTATAGAAAGCTTAACGCACTCACTAAGAAGGATCGATATCCACTTCCATTAGCTACGGAATTAAGAGATCGATTAGGCGGAGCTACGATATTCACCAAGATGGACCTACTATATTCAAACAACAAGGTTCAACACATTAAGGACGTTAGCAACATCCTCGAAAGCCTATCCAAGGCAGACTTGCTGTGCAAACCAAGCAAATGCGAATTCCATGTCACAGAGACAGAATTCTTGGGATTCACCGTATCAAGCCAAGGGCTCAAGATGAGCAAAGGCAAGGTTAAGGCAGTGCTCGAATGGAAGCAG
TAGCACTTATGGGTATCAAGAGAAAGCTATCGACATCTTTCCACCCACAAACAGATGGTCAAACAGAGAGGACCAATCAGACAATGGAAGCATATCTTAGATGCTATGTAAATTATCGACAAGACAATTGGGTAGAGCTATTACCCATGGCACAGTTCGCATACAATACATCAGAAACGGAAACCACGAAAATCACACCAGCACGAGCTAATTTTGGGTTTAATCCACAAGCGTATAAAATCCCGATACCACAAGAAGTTAATGCCGAATCAGCGATATATGGAACCTACGCTTAA
SEQ ID NO：22-siR5的LTR
＞BC1 G_04888.1逆转录转座元件Tf21蛋白1型(转录物：BC1T_04888)
TCGACATCTTTCCACCCACAAACAGATGGTCAAACAGAGAGGACCAATCAGACAATGGAAGCATATCTTAGATGCTATCGTATAAAATCCCGATACCACAAGAAGTTAATGCCGAATCAGCGATAG
SEQ ID NO：23-siR5的LTR
＞BC1G_16375.1假设蛋白，与截短的Pol类似(转录物：BC1T_16375)
SEQ ID NO：24-siR5的LTR
＞BC1G_06254.1逆转录转座元件Tf21蛋白1型(转录物：BC1T_06254)ATGGCATCCAGAGCCACCGCCACAGGTCAGTCTACCGGAGATACCAACGACATCGAGATGACCGATGCCCCAAAGGAGATCACTATCAACGAAACACTTAAGATCGCCTTACCAGACAAGTACCAAGGTAGTCGACAAGAGCTCGATACTTTCCTCTTACAACTTGAGATCTACTTCCGATTCAATGAAGACAAGTTCACTACCAAGGAATCCAAGAGCATATGGGCTGCATCATACCTCCGAGGTGAAGCAACCAAATGGATTCAACCATATTTGCGCGACTATTTCGAGCATGACGATAAGGATCGCATGCAACCCACCCGAACAATCTTCAATAGTTTTGAAGGATTTAAGACAGAGATTCGTAGAATCTTCGGAAATTCCAACGAGTTAGAGGTAGCGGAAGATAAGATCTTCAACCTCAAGCAGACAGGATCAGCATTGAAATATGCTACGGAATTTCGAAGATATGCTGGAACAACCAAGTGGGACGAAATCGCTATCATGAGTCACTACCGTAAGGGACTCAAACCAGAAGTCAGACTAGAGTTAGAAAGATCTGCCGAGAGTACAGATCTGAACGATCTAATTCAGGACTCCATCGAATCAGATGATCGTCTCTATAGATATCGACAAAGCCAAAGATCATACAAACCCCAAGGAAACCAAAAGCAAGGGCGTTACCGCAAGAATGAGGGTAGACCACGTTACAATCCACAGAGATACGGAGACCCCATGGAACTAGACGCCACGCACTACACAAACGGGAACGATGACTCAGAAAAGAGACGAAGACGAGAAAACAACTTATGCTTTGAATGTGGAAAAGCAGGGCACCGAGCAGTAGACTGCCGAAGCAAGAAGACAGGAGGAAAAAGGGGCAACTTCAAACCTAAGTTCGGCAAGGGCCAACTTAACGCCACCTTTGCCATCTCAGAAAACTCAACTAAAACCGAAAATACTGAGACTTTCACCGTTGAGGAATTTCAGCAATTACTAAAGGAATTACCACGAAATAAAGAGGGCATGAATGCAATAGACTTATGGGAACAAGAGTATTACAGAACCCCAACACCCTCTGTGACAGAAGAAAGTCACCAGGACGAGGCAGAAGCGGACCACGCCACGATGAGCTGGACAGCTTGCTATGATGAATTCTGCGGAATCCATCGATCAGATAAAGAAGCAACCGGATGGTTCCCCAAGAAAAGGAAGACGAAGAACCATCAGAATAATGTAACATGCGAGGATTTAACTCCCAATATAACTTCGCAAGAAGTTCGCAAAGTTACCCAGCAGTTGAATGCTACGGGACAGGCAGGACAAGTGTACTGCAAGGTCCAGATAAATGGACACATACAATCAGCCATGATAGATTCAGGGGCTACAGGAAATTTTATTGCACCAGAAGCTGCAAAGTACTTGGAAATACCACTTCAAACGAAACAACATCCCTACCGATTGCAGGACACGCTAGAGGCGTCCGCGAGACGTAACACGCGCCAAGGGGAGTTGAACGCGAACAACACCGGCGACGTAGGACACCCAGTCCAGGGTCCTCCATTAAGAGCGAAGGCCAGTACACCTCCTCTACAAATGCAGAAGCCAACGACACGGCACGAAATCGCAATCGAGGCAAAAGAAAGGCCTACGATACCAGAACAGTACAAGAAATATGAACATGTTTTCAAAGAACCAGGGATCCATGAGGCTTTACCGGAACACAAGCCATGGGATCATGAGATAATATTGGAGGAAGGCAAGATGCCTGTGCACACCCCAATTTATTCAATGTCAGCCGATGAGTTAAAAAGGCTCAGAGAATACATCGACGACAATTTAGCCAAGGGATGGATCAGGGAATCCGCGTCCCAAGTGGCCAGTCCAACTATGTGGGTACCCAAGAAGGATGGACCCGATAGACTAGTTGTAGACTATAGAAAGCTTAACGCACTCACTAAGAAGGATCGATATCCACTTCCATTAGCTACGGAATTAAGAGATCGATTAGGCGGAGCTACGATATTCACCAAGATGGACCTACGTAATGGTTACCACTTGATCAGAATGAAGGAAGGCGAAGAATGGAAAACCGCTTTCAAAACAAGATACGGGCTATACGAGTACCAAGTTATGCCATTCGGGCTAACCAACGCACCAGCTACTTTCATGAGGCTTATGAACAATGTGTTGTCACAATATTTGGATACTTGCTATCAAGGAAGCTTCGAATGGACTGCCAAAGCACAGGAGTCATTCGATACGCTCAAGCAAGCAGTGGCAGAAGAACCAATACTGTT
GACTTTTGACCCAGAGAAAGAAATCATAGTGGAGACGGACTCCTCGGATTTCGCTATAGGAGCAGTTCTGAGCCAACCGGGCCAGAATGGAAAATACCAGCCAATCGCATTCTACTCCCGAAAACTATCACCAGCTGAGTTAAATTACGAGATATATGACAAAGAATTACTGGCAATAGTCGATGCATTTAGAGAATGGCGAGCATATTTGGAAGGATCG
AATGGAAGCATATCTTAGATGCTATCGTATAAAATCCCGATACCACAAGAAGTTAATGCCGAATCAGCAATAG
SEQ ID NO：25-siR5的LTR
＞BC1G_08449.1逆转录转座元件Tf21蛋白1型(转录物：BC1T_08449)
ATGGCATCCAGAGATACCGCCACAGGTCA ATCTGCCGGAGACACCAACGACATCGAGATGACCGATGCCCCAAAGGAGATCACTATCAACGAAACCCTTAAGATCGCCTTACCAGACAAGTACCAAGGTAGTCGACAAGAGCTCGATACTTTCCTCTTACAACTTGAGATCTACTTCCGATTCAATGAGGACAAGTTCACTACCAAGGAATCCAAGAGTATATGGGCCGCATCATACCTCCGAGGTGAAGCAACCAAATGGATTCAACCATATTTGCGCGACTATTTCGAACATGACGATAAGAATCGCATGCAACCCACCCGAACAATCTTCAATAGTTTTGAAGGATTTAAGACAGAGATTCGTAGAATCTTCGGAAATTCCAACGAGTTAGAGGTAGCGGAAGATAAGATCTTCAACCTCAAGCAGACAGGATCAGCATTGAAATATGCTACGGAATTTCGAAGATATGCTGGAACAACCAAGTGGGACGAAATCGCTATCATGAGTCACTACCGCAAGGGACTCAAACCAGAAGTCAGACTGGAATTAGAAAGATCTGCCGAGAGTACAGATCTGAACGATCTAATTCAGGACTCCATCGAATCAGATGATCGTCTCTACAGATATCGACAAAGCCAGAGATCATACAAACCCCAAGGAAATCAGAAGCAAGGGCGTTACCGCAAGAATGAGGGTAGACCACGTTACAATCCACAGAGGTACGGAGACCCAATGGAACTAGACGCTACGCACTACACAAACGGGAACGATGACTCAGAAAAGAGACGAAGACGAGAAAACAACTTATGCTTTGAATGTGGAAAAGCAGGGCACCGAGCAGCAGAGTGCCGAAGCAAGAAGACAGGAGGAAAAAGGGGCAACTTCAAACCTAAGTTCGGCAAGGGCCAACTTAACGCCACCTTTGCAATCCCAGAAAACCCAACTAAATCCGAAAATACTGAGACTTTCACCATTGAAGAATTCCAGCAATTACTAGAGGAATTACCACGAAATCAAGAGGGCATGAATGCAATAGACTTATGGGAACAAGAGTATTACAGAACCCCAACACCCTCTGTAACAGAAGAAAGTCACCAGGACGAGGCAGAAGCAGACCACGCCACAATGAGCTGGACAGCCTGCTATGATGAATTCTGCGGAATTCATCGATCAGATAAAGAAGCAACCGGATGGTTCCCCAAGAAAAGGAAGACGAAGAACCATCAGAATAATGTAACATGCGAGGATTTAACTCCCAATACAACTTCGCAAGAAGTTCGCAAAGTTACCCAGCAGTTGAATGCTACGGGACAGGCAGGACAGATATACTGCAAAGTTCAGATAAATGGACACATACAATCAGCCATGATAGATTCAGGGGCTACAGGAAATTTTATTGCACCAGAAGCTGCAAAGTACTTGGAAATACCACTTCAGACGAAACAACACCCCTACCGATTGCAGGACACGCTAGAGGCGTCCGCGAGACGTAACACGCGCCAAGGAGAGTTGAACGCGAACGACACCGGCGACGTAGGACACCCAGTCCAGGGTCCTCCATTAAGAGCGAAGGCCAGTACACCTCCTCTACAAATGCAGAAGCCAACGACACGGCACGAAATCGCAATCGAGGCAAAAGAAAAGCCTACGATACCAGAACAGTACAAGAATTATGAACATGTTTTCAAAGAACCAGGGATCCATGAGGCTTTACCGGAACACAAGCCATGGGATCATGAGATAATATTGGAGGAAGGCAAGATGCCTGTGCACACCCCAATTTATTCAATGTCAGCCGATGAGTTAAAAAGGCTCAGAGAATACATCGACGACAATTTAGCCAAGGGATGGATCAGGGAATCCGCGTCCCAAGTGGCCAGTCCAACTATGTGGGTACCCAAGAAGGATGGACCCGATAGACTAGTTGTAGACTATAGAAAGCTTAACGCACTCACTAAGAAGGATCGATATCCACTTCCATTAGCTACGGAATTAAGAGATCGATTAGGCGGAGCTACGATATTTACCAAGATGGACCTACGTAATGGTTACCACTTGATCAGAATGAAGGAAGGCGAAGAATGGAAAACCGCTTTCAAAACAAGATACGGGCTATACGAGTACCAAGTTATGCCATTCGGGCTAACCAACGCACCAGCTACTTTCATGAGGCTTATGAACAATGTGTTGTCACAATATTTGGATACTTGCTGTATATGCTACTTGGACGACATCCTAGTATATTCAAACAACAAGGTTCAACACATTAAGGACGTTAGCAACATCCTCGAAAGCCT
ATCCAAGGCAGACTTGCTGTGCAAACCAAGCAAATGCGAATTCCATGTCACAGAGACAGAATTCTTGGGATTCACCGTATCAAGCCAAGGGCTCAAGATGAGCAAAGGCAAGGTTAAGGCAGTGCTCGAATGGAAGCAGCCGACCACAATCAAGGAAGTACAATCCTTTCTAGGGTTCGTCAACTTCTACAGAAGATTTATCAAAGGTTATTCAGGGATTACTACACCCTTGACCACGTTAACCAGAAAAGATCAAGGAAGCTTCGAATGGACTGCCAAAGCACAGGAGTCATTCGATACGCTCAAACAAGCAGTGGCAGAAGAGCCAATACTATTGACTTTTGACCCAGAG
SEQ ID NO：26-siR5的LTR
＞BC1G_16170.1假设蛋白，与整合酶类似(转录物：BC1T_16170)
ATGACCAAGGAATTTGTGACGGAACAACATGGGTTGCCGGCACACGGACATCAAGGGATTGCAAGAACATTTGCAAGAATCCGGGAAATCAGTTACTTCCCACGAATGAGAACGATAGTTGAAGAAGTTGTTGGAAATTGTACACACCTGCATACGAAACAAGTCATCACGACATGCGCCGTATGGTCAGCTCCAGACCCCAGACATGCCTTCTCAGCCATGGAAGTCCATCACATGGGACTTTGTGGTCAAACTACCACTCTCAAAGGATCCTACTACAGGAATTGA
SEQ ID NO：27-葡萄孢属(Botrytis)LTR基因组DNA序列
＞灰色葡萄孢菌(B.cinerea)(B05.10)灰色葡萄孢菌(Botrytis cinerea)超级重叠群1.56[DNA]215700-227000+
CAAAGGGGGCATTACGCTTCCAACTGCCGAAACCCTGTTGTATGTCAACACTGTAAAGGA
AGTCACGGATCCAGAGAGTGCCCAGGAACTATGTCACAGCCTTCCCGACAGGGAAACGCT
TAGACCCAGCTGTTATTCTGAGCGTCCCACTGACGCTGGGTCCCCAAATAGAAGGACGTACTACCTTTACCATTATAGCAATGTTCCAACCAAAAGATAAGCCGATAGCGCTTCGATGCCTTATCGACTCAGGAGCACAAGCCAACATCATCCAACAATCCAAGTGTATCGAATGGGACT
GGCTGCCTATTAAGAAAGGAACAGCTTTAGTATCTGCGAACGGTACCACGATGCCGTCGTATGGTAACCATCAGTTCCCCGTCGAAGTAAAAGATCAAAAGGGAGAGAAGAGAACCTTCA
CCCACGAGTTTACTGCTGCTGTACTAGACTTACCCAAAATCGATGCTATATTTGGATTACCCTGGCTACAAGCGGTAAACCCAGATATCGACTGGAAATCGACGTCTCTTCACTATCGCCCCTCTCTTAGCGACCTCGAAATGATTTCTGCAAGCGAACTCTATAGCGAAGTGAAAAAGGGCGTCCATGTATATGTTATACTACCAGAGATCCAGCCCCATTACCGTAGAGACAACGGGTACCGCCGGGTACTCACGCTCTCCACACTAAATATCCCCGAAGAATACCAAGAATACCAAC
AAGCCTTTTCCGAGGAAGAAAGCAGTACTCTACCAGAACACCACTCGATGGAGCATCGCA
TTGATCTCGAAGCCGATTCGAAACCTCCTTGGGGGCCAATCTATTCTTTATCTGAAGAGGAATCAATAGTATTAAGGGAATACTTAGTAGAATATCAAAAAAAGGGATGGATAAGGAGGT
CCATTAGTTCGGCAGGAGCGCCAATCATGTTTGTTCCCAAGAAGGGGGGAGGCTATCGGC
TTTGTGTCGACTACCGGGGTCTAAATAGGATAACCAAAAAGGATCGAACCCCGCTACCCC
TAATCAGCGAGTCCTTAGACCGACTTCGACAAGGTGTCGTCTTCACTAAATTGGACCTGCGAGATGCCTACCACCGTATTCGTATCAGGGAAGGCGACGAATGGAAGACGGCGTTCCGCA
CGCGGTACGGGCAATTCGAATACTTAGTTATGCCATTCGGCCTGACCAATGCTCCAGCAACGTTCCAAACATACATCAATCAAGCACTGTCAGGCTTGACAGACACCATATGCGTAGTGTACCTAGATGATATCCTGATTTACTCTGAGGATAGAGAAAGCCACACGCGGGATGTCCGCA
GGGTCCTCGAACGCCTTATAGAATACAAGCTGTTCGCAAAACTGAAAAAATGTGTCTTTTACACCCATGAGGTTGAATTCCTAGGATTCGTCGTCTCGGGAGCGGGAGTGACGATGGAAT
CCAGCCGCATTCAAACTATTATAGAATGGCCAACACCTACAAACCTTAGGGAGCTACAGG
TGTTCCTGGGCTTCGCGAACTTCTATCGACGGTTTATCAGGACCTATTCGACGGTAGCCCACGGGATGACCGCCCTTATGAAGGGAACAAAGAAAGGTAAAATGGTAGGGGAGTTTATAT
GGACAAAGGAGGCCCAAGATGCATTTGAGGCACTAAAGAAAGCATTCACCACGGCACCGA
TACTCAAGCACTTCGAACCATCGCTCCGCATCATGGTCGAAACCGACTCGTCGGTGTTTGCTCTAGGATGCATCCTATCGCAACTATTCGAAGGAGGGACTGCAGAAGCACCGATACGAC
GGTGGCACCCCGTCGCGTTCTATTCGAGAAAGCTGAACCCTGCAGAACAACGATACTTCACTCACGATCAGGAATTATTAGCAATATACACTGCATTCATGCAATGGCGCCATTACTTGATAGGTAGTCGGCACACAATCGTGGTGAAATCGGACCATAACAGCTTACAACATTTTATGGTGAAAAAGACCCTCAATGGCAGACAAGCTAGATGGGCGGAAGTACTAGCAGCCTACGACT
TCGAAATAGTGTACAGGGCAGGGAAACTGAATCCAGCCGACGGGCCATCGCGCCGCCCCG
ACTACGCTACCGACACGGAGGGTATCAATGATATGCTACCCACACTCCAGAATAAATTAA
AAAGTACCGCAGTTATCGCGAGTTTATTTTACGAATCCACCGTGAAAACGGAACCCCTGCGTATTGCTATTAGTCGCTTGCAAAGGGAAGGGTATAGCTTGCCATTACGTGGACAGTTAG
TTTCACTGGTAAAAACTGGTTGCAAACAGTCGATACCACGTCGGATTGCCAGTGTTTTCGCATCCGACGAAACGGCATTCGAACCTATATCGGAGTCGATGGGAAAAGCTTTATTGCGGC
TTCAGAAAGAAGACGATTTTATAAAGAATAAAGAGTACCTAAGACAAAGATTACGTTCCG
CCGGAGACGCCTCACCACGGCAGGTGGGCGCCGACGAGCTCCTTAGACACAAGGGGAGCG
CGTACGTACCGCCAGACAGCGCTCTCAGAGCAGAAATCTTAGAAACGCATCACGATGACC
CTATTGGAGGTCATTGGGGTGTCGCTAAAACATTGGAAATACTGAAGTCTAAATATTATTGGCCTTCAATGAGAAAAGACGTCAAACAACATGTCAAAACATGTGCGGTATGCCAGCGAA
CCGCTATCAAAAGACATAAGCCACACGGCGAGTTACAGACCCTCCCTATTCCAAAAGGAC
CCTGGAAAGAGATAACTATGGATTTTATTACAGATTTACCTCCTTCGAAACACGGAAAACACGTATACGATTCTATTCTAGTAGTAGTCGACAGGTTCACGAAGCTAGCCCGATATATCGCCGTCAACAAGACGATATCGTCTCCTGAATTAGCTGACACTATGGTCAGCACAGTATTTAAAGACTTTGGTGTGCCAGAGGGCATAGTCTCCGATAGGGGACCGCAATTCGTCAGTAAAT
TTTGGAGTAGCCTAATGTTTTACTTGCGAATCCGTCGTAAGCTGTCGACGGCGTTCCACCCGCAGACCGACGGTCAAACCGAACGACAAAACCAAAATTTGATTCACTATATAAGTTGCT
ACACCAACTATAGGCAAGACGACTGGGCATCGCTATTGCCCCTTGCTGAATTCACATATAACGCGACATGGCACAGTACAACCAATACAAGCCCATTCCAGGCTATGTATGGGTTCCAAC
CCACATTCCATTATATCGGCGAGGACGCCGATTTAGAGGGAAGGGCGCCGGCAGCACGCG
AGCGCATCGACGCTTTAGAGAAAGAAAGAGAAAAGCTGAAAGAATTCTGGAAATCGGCAA
CCAATCAGAAAAACAAGAACACTACGAAGGGGTCACCACAGCGATATAGCATCGGGGACA
AGGTGATGCTAAGCACAAAGAACATTAAACAACTGCGACCTAAGAAAAAATTCTCCGATC
GATTTATAGGCCCCTTTGTCGTGACGGGTATAAAAACCAGCGGGCAAGCATACGAACTTA
GATTACCGCCCACCTACAAGATCCACAATGTATTCCACGTCTCTTTACTCGAACCATGGCACGAACGACAGGGTACCGCCGACCCGCCGCCGCCAGAAGAAATTGACGATCACATAGAGC
ATGAGGTGGAAAGGATTTTAGCACATAGAAAAAGAGGCAGAGGTGTGCAATACCTGGTGC
GATGGAAGGGCTACCAACCGGCGGAAGACACGTGGGAAGCACCCTACAACCTAGAAAATG
CGAAAGCAGCGATGGGAGAATATCATAAAGAAGAAGCATTACCAATACAGAAAAAGAAGA
GAACAAGAAAAAAGCTTAAAAATACTTGATACAAAAAGACCTCACGAGACCCACACCCAG
AACGCATGCATCACACCAAGCTACCCAAAAAGGACTATCCAACAAAGAAACCAGAAAGGA
CAACTCCTCCGAACCCACAGCATACCGACAACCAAACCCAAGTGACCCATCACGCAAAGA
GAACTCTGGAAGGTCGAAATCAGTTCCCTAATTCATCTGCCTGATCCAGGAGGTCAGCTGCAATATCTCGATCGCCAAGAAGGACAGAACCTACATCGCTGGCATATCCCCCGGGACTCG
CGAGCCCGATCTGATCAACCTCACCCCCCCCACTGATCTCATCTTGATCACCGACTCCTT
CCTCCTCGTTCTCGCGAATCTCGCTGACAGGGCGAGCTCCTGTCGGAAAACCAGCGGCAACCCGTTGCCTCTTGGAGACCCGCTCCACATCAGAATTCTCAGAGCGAAGCCTTTGGGGCGAATCTGCTTGACTATCAGACTCACCAATATAGACTTGTTGAACAGTGCTGGGAGCCCTCTTTCGGGATTTAAGAGAGCCTACGGGATGAGAGCGGGGTGTCGGTGTGTTGCGAGAGGCAA
GCTGCGACGACTTAGAAGCGGAAAGGGGAATGGCGGATCTAGTCGCGAGCTTATCGGACC
GAGAACGACGAGGCGTAGCAGGAGGAGCGTTCTTTCTACCCAAGCTTCCAAACAATAAAG
CCGGTACACTCTCATCCAAGGGGTGACGCGGGGCACCGGTGGTCTGATGAGGTTGATCCG
ACACATCATCCTCTTCAGGAGCAGACTCTTCGGATTCATTGGGATCCACGATTACACTCCTCTTCAACTTCGCAGAACCTTTCCGGAGGCCTTGCTGAGCCGTCGTGAAGACAGCGGGGCCCGTCCGGCTCGATGAAGCAGAAGCATGACGGCGACCTAGGGAACCAGCTACCATATTCA
GGCCCTGGTTACCACCTGGGGGCCCCGGAGGAGCTTGAACACCCTGCAGTGCGTCGGCGA
CAGCGCGCACAGCGCGAGGGTGTATAACCGGAGCCATGAACTCCCCTTCTTCGTCCGAGTTTAAGGCGGCGATTAATGGTGCAGTAGGAGCTGCGGCGGCGACGTCCAAGGCAGGCAGGT
TATTCTAAGAACCATCAAATCAGCTATCAACAGCACCAAGGGGCAAGAGCAGGGCAACCG
ACAACGAATCGATACGAATCCACAATGCGCTCCATAAGATCGCCAATTCTACTCAATTTGGACACCAGAAGAAGAGTCAATTCCTCTGCGGACTGCGGTTTGTGAGTCCCCCCTTGTTTAACCTCTTTTCGAAGGAAAGCCTCCACTGCCTTGACGTATCGATTACACCGGCGAATCACCACCTCGGAGGCGTCCTCATCCTCTTGGCTATTATCCGGAGTAAGGCACCAAAAGGCATGAGTCTGATATAAGAGGTTCACGTCGGGAACAAAGCGAGGAGGTATCGGGAGGCAGACTTTC
TTTTGTTTGCGACAATAACTACATTTAGCAGCAGGACCTTTATCAAAATGGCAAAATTCGTCGTTAGAAGAGACGGCAATTCGCTTAGAACATCGAAGGCAAGTAGGGATAACTAACGCG
GAAGGGGCCGCTGCGGACCGATCAGCGATAGCAGCCGGAGCGATGGGTTGCAGTGCAGCC
ATCTTCGTATGAGTAAATAAGGGGGAATAATCTGATTGTGGGAGATATATCAGAGGCAAG
AAGACCCCCCTTATAGAACTATCGGTGATCTGCCGGTAAGGCGGTGAGGCGCGTAAGAAT
GCCGCCGTTTGCTTGTTTATTGTTTGTAATGCCTAAACAAGATTGGAATTGCTTTTGGAATGCGGCGCAGGGTCGGGCATGCAGCGACGCGACGACGCGACCCACATTCCGAGTAAACAA
TACGGAAGGAAGCAAACACTTCTCGGGACGCGAAGTGTAAAGAGAGGGGCTCTGTTACGG
GACAAAACGTGACCGGCTCAATTAGGCACGTGACAGTGGACCTCTCGGGTCTACTGCGTG
CCGAATGGGGCCCGCACACGTATAAATTGTATAATTTGCATAGTTATAGAAAAGCAATGA
AAAGTCTTGGTGCCACAATATACTAGTTGATTCATTTGTTACGGAGGTACCCGCACCGCAACATGGATTATAAGATAAACCTAAGGCCTTGGTGTTGGAACCTACGAAAACAGCACTGTA
GGGACAGTTGAATTAAAGGGTAACTAAAGATAGCAGTAACCGAATCAATAAGCAATGATT
AAAAGATAGGTACCTATCTTTTGTTGGCACCTACCCTACAGTAGGCACAGGAGGGATAGC
GGTTATAGGTTATCTAGTAAGCACAGGTTAGATAAGCAGTAGTATCATGTAGGTCACGGG
GCAAGTGTCACGTGATGGATAGACAGGATAGGCAGGCTATCCAGGCTATCCGTGGATAGA
CAGGATAGACAGTCTACCCAAGCTATCCAGACGAGAACGAAGGTCTATATAAGGGAATGG
GTTTCATTACAATGTAGAGCTTCGTGCTCAAGAACAATCATTAGTTTCATTACTATAGTTACGAGAATTGCAACCAGTTACAACCTTATTGAATTCCTACTTGAAGTCTAGTCTAAACCACCTCGAGAGATCTCTAGACACTTCCACGTGACCCTAGAGGCAGCTCCCGTAACACTTTGAGCACCCTTTCTGCTTCAAGTACCGATTCGATAACCAACCGCTAATATGGCATCCAGAGCTACCGCCACAGGTCAGTCTACCGAAGATACCAACGACATCGAGATGACCGATGCCCCAAAG
GAGATCACTATCAACGAAACACTTAAGATCGCCTTACCAGACAAGTACCAAGGTAGTCGA
CAAGAGCTCGATACTTTCCTCTTACAACTTGAGATCTACTTCCGATTCAATGAAGACAAGTTCACTACCAAGGAATCCAAGAGCATATGGGCTGCATCATACCTCCGAGGTGAAGCAACC
AAATGGATTCAACCATATTTGCGCGACTATTTCGAGCATGACGATAAGGATCGCATGCAACCCACCCGAACAATCTTCAATAGTTTTGAAGGATTTAAGACAGAGATTCGTAGAATCTTCGGAAATTCCAACGAGTTAGAGGTAGCGGAAGATAAGATCTTCAACCTCAAGCAGACAGGA
TCAGCATTGAAATATGCTACGGAATTTCGAAGATATGCTGGAACAACCAAGTGGGACGAA
ATCGCTATCATGAGTCACTACTGTAAGGGACTCAAACCAGAAGTCAGACTAGAGTTAGAA
AGATCTGCCGAGAGTACAGATCTGAACGATCTAATTCAGGACTCCATCGAATCAGATGAT
CGTCTCTATAGATATCGACAAAGCCAAAGATCATACAAACCCCAAGGAAACCAAAAGCAA
GGGCGTTACCGCAAGAATGAGGGTAGACCACGTTACAATCCACAGAGATACGGAGACCCC
ATGGAACTAGACGCCACGCACTACACAAACGGGAACGATGACTCAGAAAAGAGACGAAGA
CGAGAAAACAACTTATGCTTTGAATGTGGAAAAGCAGGGCACCGAGCAGTAGACTGCCGA
AGCAAGAAGACAGGAGGAAAAAGGGGCAACTTCAAACCTAAGTTCGGCAAGGGCCAACTT
AACGCCACCTTTGCCATCTCAGAAAACTCAACTAAAACCGAAAATACTGAGACTTTCACCGTTGAGGAATTTCAGCAATTACTAAAGGAATTACCACGAAATAAAGAGGGCATGAATGCA
ATAGACTTATGGGAACAAGAGTATTACAGAACCCCAACACCCTCTGTGACAGAAGAAAGT
CACCAGGACGAGGCAGAAGCGGACCACGCCACGATGAGCTGGACAGCTTGCTATGATGAA
TTCTGCGGAATCCATCGATCAGATAAAGAAGCAACCGGATGGTTCCCCAAGAAAAGGAAG
ACGAAGAACCATCAGAATAATGTAACATGCGAGGATTTAACTCCCAATATAACTTCGCAA
GAAGTTCGCAAAGTTACCCAGCAGTTGAATGCTACGGGACAGGCAGGACAAGTGTACTGC
AAGGTCCAGATAAATGGACACATACAATCAGCCATGATAGATTCAGGGGCTACAGGAAAT
TTTATTGCACCAGAAGCTGCAAAGTACTTGGAAATACCACTTCAAACGAAACAACACCCC
TATCGATTGCAGTTAGTTGATGGACAGCTAGCAGGGTCTGACGGAAAGATTTCGCAGGAG
ACAATCCCAGTACGAATGGGCATAACCCAACATACAGAGGTTATACAGCTTGACGTTGTG
CCATTGGGCCAACAACAGATCATCTTAGGAATGCCATGGTTGAAGGCACATAATCCGAAA
ATAGATTGGGCACAAGGAATTGTGACATTTGATCAGTGCAAAAGCGGTCACAGGGACACG
CTAGAGGCGTCCGCGAGACGTAACACGCGCCAAGGGGAGTTGAACGCGAACAACACCGGC
GACGTAGGACACCCAGTCCAGGGTCCTCCATTAAGAGCGAAGGCCAGTACACCTCCTCTA
CAAATGCAGAAGCCAACGACACGGCACGAAATCGCAATCGAGGCAAAAGAAAGGCCTACG
ATACCAGAACAGTACAAGAAATATGAACATGTTTTCAAAGAACCAGGGATCCATGAGGCT
TTACCGGAACACAAGCCATGGGATCATGAGATAATATTGGAGGAAGGCAAGATGCCTGTG
CACACCCCAATTTATTCAATGTCAGCCGATGAGTTAAAAAGGCTCAGAGAATACATCGAC
GACAATTTAGCCAAGGGATGGATCAGGGAATCCGCGTCCCAAGTGGCCAGTCCAACTATG
TGGGTACCCAAGAAGGATGGACCCGATAGACTAGTTGTAGACTATAGAAAGCTTAACGCA
CTCACTAAGAAGGATCGATATCCACTTCCATTAGCTACGGAATTAAGAGATCGATTAGGCGGAGCTACGATATTCACCAAGATGGACCTACGTAATGGTTACCACTTGATCAGAATGAAG
GAAGGCGAAGAATGGAAAACCGCTTTCAAAACAAGATACGGGCTATACGAGTACCAAGTT
ATGCCATTCGGGCTAACCAACGCACCAGCTACTTTCATGAGGCTTATGAACAATGTGTTGTCACAATATTTGGATACTTGCTGTATATGCTACTTGGACGACATCCTAGTATATTCAAACAACAAGGTTCAACACATTAAGGACGTTAGCAACATCCTCGAAAGTCTATCCAAAGCAGAC
TTGCTGTGCAAACCAAGCAAATGCGAATTCCATGTCACAGAAACAGAATTCTTGGGATTCACCGTATCAAGCCAAGGGCTCAAGATGAGCAAAGACAAGGTTAAGGCAGTGCTCGAATGG
AAGCAGCCAACCACAATCAAGGAGGTACAATCCTTTCTAGGGTTCGTCAACTTCTACAGAAGATTTATCAAGGGTTATTCAGGGATTACTACACCCTTGACCACGTTAACCAGAAAAGATCAAGGAAGCTTCGAATGGACTGCCAAAGCACAGGAGTCATTCGATACACTCAAACAAGCA
GTGGCAGAAGAACCAATACTGTTGACTTTTGACCCAGAGAAAGAAATCATAGTGGAAACG
GATTCCTCAGATTTCGCTATAGGAGCAGTTCTGAGCCAACCGGGCCAGAATGGAAAATAC
CAGCCAATCGCATTCTACTCCCGAAAACTATCACCAGCTGAGTTAAATTACGAGATATATGACAAAGAATTACTGGCAATAGTCGATGCATTTAGAGAATGGCGAGTATATTTGGAAGGA
TCGAAATACACAGTACAGGTGTATACAGATCATAAGAACTTGGTTTACTTCACCACAACGAAGCAGTTAAACAGACGACAGGTCAGATGGTCGGAGACCATGGCCAACTACAATTTCAGA
ATTTCATATGTCAAAGGATCAGAAAACGCTAGAGCCGACGCTCTTAGCCGAAAACCAGAA
TATCAAGAAAACAAAACGTACGAGTCATACGCTATATTCAAGAAAGACGGCGAATCACTG
GTCTACAATGCACCACAGCTTGCAGCAACACACCTGTTGGAAGACAACCACCTCAGGAAA
CAGATCCAATCACACTACAACAAGGATGCTACTGCCACACGCATACGCAAGACAATAGAA
CCAGGATTCACTATAGAAGATGATACCATATACTTTCATGGAAAAGTATACATTCCGAGTCAAATGACCAAGGAATTTGTGACGGAACAACACGGATTGCCGGCACATGGACACCAAGGA
ATTGCAAGGACATTTGCAAGAATACGGGAAATCAGTTACTTCCCACGAATGAGAACGATA
GTTGAAGAAGTTGTTGGAAATTGTGACACCTGCATACGAAACAAGTCATCACGACATGCT
CCGTATGGTCAGCTCCAGACCCCAGACATGCCTTCTCAGCCATGGAAGTCCATCACATGGGACTTTGTGGTCAAACTACCACTCTCAAAGGATCCTACTACAGGAATTGAGTACGACGCGATACTCAATATAGTAGACAGGCTAACGAAATTTGCATATATGATACCATTCAAGGAAACA
TGGGATGCTGAGCAACTAGCATATGTGTTCCTAAGGGTCATAGTAAGCATACACGGAGTA
CCAGATGAGATAATCTCGGATCGAGACAAGCTCTTTACCTCGAAATTCTGGACTACCTTATTAGCACTTATGGGTATCAAGAGAAAGCTATCGACATCTTTCCACCCACAAACAGATGGTCAAACAGAGAGGACCAATCAGACAATGGAAGCATATCTTAGATGCTATGTAAATTATCGA
CAAGACAATTGGGTAGAGCTATTACCCATGGCACAGTTCGCATACAATACATCGGAAACG
GAAACCACGAAAATCACCCCAGCACGAGCTAATTTTGGGTTTAATCCACAAGCGTATAAA
ATCCCGATACCACAAGAAGTTAATGCCGAATCAGCAATAGTACAAGTCGAACAGCTGAAA
GATCTCCAAGAGCAACTGGCTCTTGATCCTAAGATTCATATCTTCCAGAACAGCAGCGTACTACAATACGAAACGTAGTATGGAACCTACGCTTAAAGAGGGGGATAAAGTTTATTTGCTA
CAACGAAACATCGAAACCAAGAGACCAAGCAATAAACTCGACCACAGGAAAATAGGACCA
TTCAAGATTGATAAGGTAATAGGAACGGTTAATTATCGATTGAAATTACCAGACACAATG
AATATCCACCCAGTATTCCACATATCCTTGCTCGAACCAGCACCACCAGGAGCGCCAAATGCGCCATTTACAGAAATCGAACCAGTCAACCCAAACGCCATATACGACGTTGAAACAATA
CTAGATTGTAAATATGTCAGGGGCAAAATCAAGTATTTGATCAAATGGTTAGACTACCCACATTCGGAAAACACATGGGAA
SEQ ID NO：28-葡萄孢属(Botrytis)DCL1启动子序列
＞灰色葡萄孢菌(B.cinerea)(B05.10)灰色葡萄孢菌(Botrytis cinerea)超级重叠群1.69[DNA]45790-46725-
GAAGAGGTTGTTGGCAATATTTTGAAGAAAGCTGAGGCTGATTTGAATGGAGATTAAAAGGGGAATGAAGCTGCGGGGCCACCGATAGCACAAAAACTACTGAAGATTTGAAGCACGTTAAAATTACACTCAGGAATAAACGGATGGCAAGCTTTTCGATCGCCCAAACACGGATCTACGACTACGAGTTACGCACGACATGATTTAGCCTTTTGTGTGCAATGATGATTAGATAGCATTGCATTTCTCGAAATTGACGGCACGACTTTTACGGGCAGATAATATCAAAGATTCCTAGTGAGCAAGCGGTGATGATACGATGTCATTCCAAAAGTTTTTTCCTCGCGAATTTTATTTCATTTCGAAGGCATCTTTGCTTAGCAGCATATTCACCTTTGATGTCCTCTGTAGGGGATGGAGTCTCTAATCTCGCGGTCACAATGAGACGTGATGCGCTGCGAAGTGGTGACAATTTCCCTTTACTTAGAATAGATCATGCACACATGCATGATGCATAGCTAGCTAGTTTTTTATTCAATGATAGTTTAATGACAAACACGTATCTAGATATCCTCATTCATGTATCTGTGGGAGGTTGACTTAAGTTATGGCTGACTTGATAGTTTCATTATATATGTATATGTGATATCTAAGTAAAGATTAAAGTGAAATCGAAATGCAACGCCGAAATTCTATTAATTCCATGAAATGATGTGATATGGCATGACATGATATCCAAACTCCGATTTGAAATGCTCCAGCTTCGCTTTCTAAAATTGGTAAAAGGGACATTATTTCGTCTGGTTGTGGGTTTTCATTTCTGTGCTCCTACTAGGTGTGAATGATAGAGTATGCTGTGGTGTGGTGTGATCTCGGAATTTGGAAATTTGAGGGCTGTATATCACCTCATTTCGTGTGTCCGAATTTCTACAGACT
SEQ ID NO：29-葡萄孢属(Botrytis)DCL2启动子序列
＞灰色葡萄孢菌(B.cinerea)(B05.10)灰色葡萄孢菌(Botrytis cinerea)超级重叠群1.78[DNA]26792-27461-
AGAGCATTTGTAGGGGAAGGAGGAAAAATTGAGGAGGAGGATAAGATGAATTTTGATAAATTTATTTCCTAACATCAGGTCACAATCTATGAATTACATTTGATAGTATTACGTATGCCGGTCTGTACACAACACAACCATATAGTAAGGTATCAATCAAATGCGATGGATAGTCATTTCAATTTCTTAGTGAATAATTACAACGAACCAGTAAAATAGCAATAACTCTGAAAAGCTTCCGGACTGCCAAAAGGTCTCCAGGACGAGATTATTACGAAGAACCCAAGAATTCGCCTAGGAACCAAGATAAACAAATCATCGACGTGTTGCACTTCCATCTATGCGACAATTATGCCAAGCGAGCCGCCAGTTCTTGGGGGTGGAGCGCTAGGAATAGGGGGCCGGATTGCCATATCCTTATCTAGATCTAGATGGTATCGATATGATAAATCAATGCAATGGAGAGTTAAAAAGTTATATGCCATATGATTGATAATTATTGACAATGCAGGCTATCGCGGGACAATGGTAAATGGTTGTAAAATATGGAGTCTATTTCCTTAGCTAGCGATAAGATGGGTGGTTTAAACACATCCCGCCTTCTCTTTATCATTCTCCTTCTCGTATTCATATATCATAATTGCAAAGTAAGGTTGTATTTTGGACTGTG
SEQ ID NO：30-轮枝菌属(Verticillium)DCL1启动子序列
＞大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)(VdLs.17)的大丽轮枝菌(V.dahliae)VdLs.17超级重叠群1.1[DNA]1574620-1574964-
AAGCTGTCAATTGATGCGGAGGGTGAGTGAACGTCTCGTCGGCGGGGCCCCTTGAGGCGAGCGCCCGTTGGGGGGTGTTGTGGCACTAGGTTCTCTAGGCCGGCGGTGACTTTCATTACTATATTAGAAGCAAATACGGCGCCTTCATCACAATAATAAATATCGATCTCGAGTCGATTCCAGACCCGTTATAAACCTATGTCTGTGCAACCAGTTGGGTGCTAATTTCTTGCATTATCATCATGGATGTTGTCTATTTGAGTCTCAGGTCCAGCTGGTGCTTATAGGTCATCTCCAGTATGCGACTACCTCTCTCCCTCTTTGCCATTCCTAACTGATTCTAAC
SEQ ID NO：31-轮枝菌属(Verticillium)DCL2启动子序列
＞大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)(VdLs.17)的大丽轮枝菌(V.dahliae)VdLs.17超级重叠群1.15[DNA]194566-195565+
CTTCATCTTCCAACCGCCATTACCTCCCCCATACGCGTCCTGCCAAAGAATCATAACTGGCTAAAACATAAGACGGGACTGGTCATCCGCTGAACCATTCCGAGCTATGTGTCCTGATTGACCCATCTCGGCTTATTCGCTCTCAAATACGACTGCAATCGCGTGTGGCTTGGAAACCGTGGAATACCATCCTCATATTGTCAGCACCTGTAGCGATACAGCACAATGCTTGACGATTCGGAATCATTTTCCGCTTCTTTGCGGAGCAGCGGATGTCCAATTGACGATGACTTGACTCCAGAACCAACGTCCGAATCACGCGACTCAACCTCCCTACCGTATGGCCTTCAGGACGACATCGGCCCCCTTGCTGCCACCCCGAGCCAGTCGAGTAACGTCACAATCAATGCACGGGCATACCAGTTGGAGATGCTGGCGGAAAGTAGGAAGAGGAATATCATTCTAGCTGTGCGAACCTTCCCTCTTGCGCCAGTCAACCTCGATTGACACCTCCATAGATGGACACAGGCAGTGGCAAGACCCAAGTGTACGTTCCCTGCAAGCCGAACCTGATTATTGATACTGATTTTCCCAGTGCCGTCCTCCGAATTCGAGCAGAGCTAGAAGAAGGGGCTTCAGACAAGGTTTGACAAACTCCACTTGGTAGCTTCGCAATCACTTACAGGGTTTTAGCTTGTATGGTTCGTGGCTCACAATGTTGAGCTTTGCGCTCAGCAGCATTCTGTACTGCAGTCTCAGATTCCTGCAGTTCAGACCAAGCTGCTTCTTGGCAGCGATAATGTTGATTCATGGTCCAACCAAGAGACTTGGAACGCTGTGCTTCTCAACGTCAAAATTGTGGTGTCAACCCCTCAAGTTCTCTGCGATGCCTTGAGCCACGGCTTTGTCCAGATGGGTTCATTATCCTTGCTTGTCTTTGATGAAGGTATTCAATCAGCGCAGTTTATCAAGTGTTCTTGCCCTAACAACGGTGTAGCGC
应理解，本文描述的实施例和实施方案仅为说明目的，并且对其各种修改和改变是本领域技术人员容易想到的，并且包括在本申请的主旨和范围内以及所附权利要求的范围内。为所有目的，将本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文。

Claims (26)

1.增强植物或植物的部分的病原体抗性的方法，其中所述病原体是葡萄孢属(Botrytis)或轮枝菌属(Verticillium)，所述方法包括：
使所述植物或植物的部分的表面接触靶向真菌病原体的每个Dicer-样(DCL)基因或每个DCL基因启动子的双链RNA、小RNA组或小RNA双链体中的一个或多个，其中相比未接触所述双链RNA、小RNA组或小RNA双链体的对照植物或对照植物的部分，所述植物或植物的部分具有增强的对所述真菌病原体的抗性。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述植物是以下属的物种：天门冬属(Asparagus)、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、芸苔属(Brassica)、柑橘属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、黄瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、草莓属(Fragaria)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、萱草属(Heterocallis)、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、毒麦属(Lolium)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、Majorana、苜蓿属(Medicago)、烟草属(Nicotiana)、稻属(Oryza)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pannesetum)、鳄梨属(Persea)、豌豆属(Pisum)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、蔷薇属(Rosa)、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、胡芦巴属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)或玉蜀黍属(Zea)。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述植物是观赏植物。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述植物是产生果实的植物或产生蔬菜的植物。
5.如权利要求1所述的方法，其中将所述双链RNA、小RNA组或小RNA双链体喷洒至所述植物或植物的部分。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述病原体是灰色葡萄孢菌(B.cinerea)。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述双链RNA、小RNA组或小RNA双链体靶向SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29中的任何序列或其片段。
8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述病原体是大丽轮枝菌(V.dahliae)。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述双链RNA、小RNA组或小RNA双链体靶向SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31中的任何序列或其片段。
10.增强果实、蔬菜或花的病原体抗性的方法，其中所述病原体是葡萄孢属(Botrytis)或轮枝菌属(Verticillium)，所述方法包括：
使所述果实、蔬菜或花的表面接触靶向真菌病原体的每个Dicer-样(DCL)基因或每个DCL基因启动子的双链RNA、小RNA组或小RNA双链体中的一个或多个，其中相比未接触所述双链RNA、小RNA组或小RNA双链体的对照果实、蔬菜或花，所述果实、蔬菜或花具有增强的对所述真菌病原体的抗性。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述果实、蔬菜或花来自以下属的物种的植物：天门冬属、颠茄属、燕麦属、芸苔属、柑橘属、西瓜属、辣椒属、黄瓜属、南瓜属、胡萝卜属、草莓属、大豆属、棉属、向日葵属、萱草属、大麦属、天仙子属、莴苣属、亚麻属、毒麦属、番茄属、苹果属、木薯属、Majorana、苜蓿属、烟草属、稻属、黍属、狼尾草属、鳄梨属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、蔷薇属、黑麦属、千里光属、白芥属、茄属、高粱属、胡芦巴属、小麦属、葡萄属、豇豆属或玉蜀黍属。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述果实、蔬菜或花是收获后的果实、蔬菜或花。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中将所述双链RNA、小RNA组或小RNA双链体喷洒至所述果实、蔬菜或花。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述病原体是灰色葡萄孢菌(B.cinerea)。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述双链RNA、小RNA组或小RNA双链体靶向SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29中的任何序列或其片段。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述病原体是大丽轮枝菌(V.dahliae)。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述双链RNA、小RNA组或小RNA双链体靶向SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31中的任何序列或其片段。
18.增强植物或植物的部分对多种病原体的病原体抗性的方法，所述方法包括：
使所述植物或植物的部分的表面接触：
(1)靶向第一真菌病原体物种的每个Dicer-样(DCL)基因或每个DCL基因启动子的一个或多个双链RNA、小RNA组或小RNA双链体的第一组；以及
(2)靶向第二真菌病原体物种的每个DCL基因或每个DCL基因启动子的一个或多个双链RNA、小RNA组或小RNA双链体的第二组；
其中相比未接触双链RNA、小RNA组或小RNA双链体的第一组和第二组的对照植物或对照植物的部分，所述植物或植物的部分具有增强的对所述第一病原体物种和第二病原体物种的抗性，其中所述第一真菌病原体物种是葡萄孢属(Botrytis)，所述第二真菌病原体物种是轮枝菌属(Verticillium)。
19.如权利要求18所述的方法，其中将双链RNA、小RNA组或小RNA双链体的第一组和第二组喷洒至所述植物或植物的部分。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述植物的部分是果实、蔬菜或花。
21.如权利要求18或19所述的方法，其中所述植物是观赏植物。
22.如权利要求18或19所述的方法，其中所述植物是产生蔬菜的植物或产生果实的植物。
23.使植物具有增强的对多种病原体的病原体抗性的方法，所述方法包括：
向所述植物引入异源表达盒，其包含启动子，所述启动子可操作地连接至(1)编码靶向第一真菌病原体物种的每个Dicer-样(DCL)基因或每个DCL基因启动子的用于抑制每个DCL基因表达的反义核酸或抑制性RNA(RNAi)一个或多个多核苷酸，以及(2)编码靶向第二真菌病原体物种的每个Dicer-样(DCL)基因或每个DCL基因启动子的用于抑制每个DCL基因表达的反义核酸或抑制性RNA(RNAi)一个或多个多核苷酸；以及
选择包含所述表达盒的植物；
其中所述第一病原体物种的DCL基因或DCL基因启动子是葡萄孢属DCL1和葡萄孢属DCL2，并且所述第二病原体物种的DCL基因或DCL基因启动子是轮枝菌属DCL1和轮枝菌属DCL2。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述植物是以下属的物种：天门冬属、颠茄属、燕麦属、芸苔属、柑橘属、西瓜属、辣椒属、黄瓜属、南瓜属、胡萝卜属、草莓属、大豆属、棉属、向日葵属、萱草属、大麦属、天仙子属、莴苣属、亚麻属、毒麦属、番茄属、苹果属、木薯属、Majorana、苜蓿属、烟草属、稻属、黍属、狼尾草属、鳄梨属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、蔷薇属、黑麦属、千里光属、白芥属、茄属、高粱属、胡芦巴属、小麦属、葡萄属、豇豆属或玉蜀黍属。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述植物是观赏植物。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述植物是产生蔬菜的植物或产生果实的植物。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2020004017A (es) 2017-10-17 2020-07-22 Univ California Control de patogenos fungicos utilizando la estrategia basada en arni.
CN110016519B (zh) * 2019-04-30 2020-04-14 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 一种香蕉枯萎菌4号生理小种dcl基因缺失突变体及其小rna
CN110438151B (zh) * 2019-08-28 2021-08-31 福建农林大学 一种植物介导的沉默小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK的RNAi载体及其应用
EP4355098A1 (en) * 2021-06-17 2024-04-24 The Regents of the University of California Vesicle formulations for delivery of antifungal nucleic acids
EP4134439A1 (en) * 2021-08-11 2023-02-15 Valagro S.p.A. Plant extract and uses thereof in agriculture
EP4134436A1 (en) * 2021-08-11 2023-02-15 Valagro S.p.A. Plant extract and uses thereof in agriculture
EP4134438A1 (en) * 2021-08-11 2023-02-15 Valagro S.p.A. Plant extract and uses thereof in agriculture
WO2023017455A1 (en) * 2021-08-11 2023-02-16 Valagro S.P.A. Plant extract and uses thereof in agriculture
CN114854741A (zh) * 2022-04-11 2022-08-05 浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司 一种可用于灰霉病防治的RNA纳米分子RNAtri及其制备方法和应用
WO2023248220A1 (en) * 2022-06-20 2023-12-28 Yeda Research And Development Co. Ltd. Particles comprising double stranded rna and use of same in agriculture

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101679494A (zh) * 2007-04-12 2010-03-24 瑞典树木科技公司 增加植物生长的方法
US20140283211A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5845399A (en) * 1998-09-30 2000-04-17 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture (gliocladium roseum) strains useful for the control of fungal pathogens in plants
US6653535B1 (en) 1999-05-28 2003-11-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for modulating water-use efficiency or productivity in a plant by transforming with a DNA encoding a NAPD-malic enzyme operably linked to a guard cell or an epidermal cell promoter
WO2003064631A1 (en) 2002-01-30 2003-08-07 Arborgen Llc Methods of suppressing gene expression
AU2003251579B2 (en) 2002-06-21 2008-04-03 Monsanto Technology Llc Intron double stranded RNA constructs and uses thereof
ITMI20040363A1 (it) 2004-02-27 2004-05-27 Univ Degli Studi Milano Cassetta per l'espressione di acidi nucleici negli stomi
US20080313773A1 (en) 2007-05-14 2008-12-18 The Rockefeller University Production of artificial micrornas using synthetic microrna precursors
ES2363325B1 (es) * 2009-11-18 2012-06-04 Instituto Valenciano De Investigaciones Agrarias Método para conseguir resistencia frente a enfermedades de los cítricos causadas por insectos, por hongos u omicetos o por bacterias o nematodos.
US9693555B2 (en) * 2011-03-18 2017-07-04 Shanghai Institutes For Biological Sciences, Chinese Academy Of Sciences Insect-combating preparation and method based on RNAi technology
WO2012155109A1 (en) * 2011-05-11 2012-11-15 The Regents Of The University Of California Host-induced gene silencing in vegetable species to provide durable disease resistance
KR101099323B1 (ko) 2011-06-28 2011-12-26 정재근 게시물 홀더
WO2013184768A1 (en) * 2012-06-05 2013-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of gene silencing in plants
US20140068814A1 (en) * 2012-09-03 2014-03-06 A.B. Seeds Ltd. Method of improving abiotic stress tolerance of plants and plants generated thereby
US10119148B2 (en) 2013-10-02 2018-11-06 The Regents Of The University Of California RNAs from pathogens inhibit plant immunity

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101679494A (zh) * 2007-04-12 2010-03-24 瑞典树木科技公司 增加植物生长的方法
US20140283211A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Arne Weiberg.Fungal small RNAs suppress plant immunity by hijacking host RNA interference pathways.《Science》.2013,第342卷(第6154期), *
Fungal small RNAs suppress plant immunity by hijacking host RNA interference pathways;Arne Weiberg;《Science》;20131004;第342卷(第6154期);摘要，第121页第4段、第122页第1段、图4 *
RNA silencing is required for Arabidopsis defence against Verticillium wilt disease;Ursula Ellendorff;《Journal of Experimental Botany》;20081219;第60卷(第2期);第595页右栏第2段 *
夏广清.RNA干扰与植物生长发育.《RNA干扰与植物生长发育》.吉林大学出版社,2013, *
拟南芥DCLl启动子的分离及其表达特性分析;李微微;《中国农业科技导报》;20101231;第12卷(第3期);第98-102页 *
谢小冬.现代生物技术概论.《现代生物技术概论》.军事医学科学出版社,2007, *

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