CN114854741A - 一种可用于灰霉病防治的RNA纳米分子RNAtri及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种可用于灰霉病防治的RNA纳米分子RNAtri及其制备方法和应用，包括RNA纳米分子RNAtri，制备方法：根据本抑菌RNAtri分子的序列推导出其编码的DNA模板序列，并在模板序列上游引入T7启动子序列，将这条编码抑菌RNA分子的模板DNA序列化学合成，获得获得编码抑菌RNA分子的DNA模板；然后利用T7RNA体外转录试剂盒，通过体外转录获得所述的RNAtri分子，进而制备灰霉病菌的抑制剂，可直接通过喷洒的方式用于蔬菜作物的灰霉病菌防治。
Description
技术领域
本发明涉及作物灰霉病菌的保护和治疗，具体涉及一种具有抑制灰霉病菌生长发育作用的RNAtri纳米分子及一种作物病菌抑制剂。
背景技术
灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的一种重要的全球农业病害。该病原菌腐生性很强，寄主范围非常广泛，可侵染番茄、草莓、辣椒、葡萄等200多种水果和蔬菜。灰霉病通过气流传播，且传播速度很快，使得该病在设施农业栽培过程中的防治非常困难。目前作物灰霉病的防治还是主要依赖化学农药，如甲酰胺、嘧霉胺、乙霉威、多菌灵、腐霉利和甲基硫菌灵等。由于灰霉病菌繁殖快、传播迅速和易变异等特性，伴随着大量杀菌剂的重复多年使用，灰霉病菌逐渐对各种杀菌剂产生了抗药性，使得化学杀菌剂的防治效果大大降低。并且，随着人们生活水平的逐年提高，人类追求健康饮食的诉求也越来越高。水果和蔬菜在生产过程中大量化学杀菌剂的使用，农药生产和使用过程中对环境和水资源的污染等越来越受到人们的关注。因此迫切的需要一些替代性的防治措施去抵抗灰霉病，所以开发新的无公害、环保型的新型农药成为科学家们首要的研究目标。
喷洒具有触发RNAi潜能的外源性dsRNA或sRNA分子诱导RNAi(外源RNAi)，被认为是一种新型的、环境友好的生物农药，对于植物病毒、真菌和昆虫都有较好的防治效果。然而，由于RNA本身环境稳定性差，易降解、植物吸收效率低下等特点，导致直接喷施裸露的dsRNA或siRNA时，存在RNAi诱导效率低，作用时间短等缺陷，因此这种通过喷洒诱导基因沉默(Spray-induced gene silence,SIGS)的效应在应用中需要递送载体，以提高dsRNA/siRNA的吸收效率，否则只有在连续供应dsRNA时才能维持。因此，选用合适的载体以提高dsRNA/siRNA递送效率和以及RNAi诱导效率是当前RNAi生物农药面临的关键问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，而提供一种可用于植物灰霉病防治的三角形RNA纳米分子——RNAtri，其序列如Seq No.1，设计思路是将对灰霉病菌有抑制作用的dsRNA/siRNA作为三角形RNA纳米颗粒的一部分，借助RNA纳米颗粒所具备的良好的稳定性以及高效的细胞穿透性，以提高dsRNA/siRNA的RNAi触发效率，增强对灰霉病菌的防治能力。
一种可用于灰霉病防治的RNA纳米分子RNAtri，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的RNA序列。
RNA纳米分子序列，通过以下方法得到：推导出其编码的DNA模板序列，在模板序列上游插入T7启动子序列，合成DNA模板,体外转录合成RNAtri分子。
一种灰霉病抑制剂，主要成分为如权利要求1所述的RNAtri分子，可用于蔬菜作物灰霉病害的预防及治疗。
一种与RNAtri的序列或结构相同或高度相似的RNA序列，用于蔬菜作物灰霉病害的预防及治疗。
SEQ ID NO.1：
GGUAGAUGCUAGAGACUUUUGCCUUGAACAUCAGAACGAGGGCGACCCGCAAGGGUCGCCCUCGUUCUGAUGUUCAAGGCUUUUGGCGCCGCAUCUCGAUGGUCAGAAUUCACCGGUAGAUGCUAGAGACUUUUGCCUAGAUGAACAAGUAUGCCGGAUGGCGCAAGCCAUCCGGCAUACUUGUUCAUCUAGGCUUUUGGGACACGACGAUGAGAAUAAGACAUCAAUGACCUGAUGAUGUCUUAUUCUCAUCGUCGUGUCCCUUUUGUCUCUAGCAUCUACCGGUGAAUUCUGACCAUCGAGAUGCGGCGCCUUUUGUCUCUAGCAUCUACCGGUGAAUUAUCUCUAGCAUCUACCGGUGACUUUUGUCUCUAGCAUCAUGACCUGAGAUGCUAGAGACUUUUGCCAUUCUUCCUAUCCACCUCCAAAGCCGCAAGGCUUUGGAGGUGGAUAGGAAGAAUGGCUUUUGUCACCGGUAGAUGCUAGAGAUAAUUCAC。
有益效果：具有诱导触发RNAi效率更高，对灰霉病菌的感染毒力具有极为显著的抑制效果。
附图说明
图1是NC-RNA对灰霉病菌孢子萌发的影响图。
图2是dsRNA对灰霉病菌孢子萌发的影响图。
图3是本发明RNAtri对灰霉病菌孢子萌发的影响图。
图4是NC-RNA对灰霉病菌菌丝生长的抑制效果。
图5是dsRNA对灰霉病菌菌丝生长的抑制效果。
图6是本发明RNAtri分子对灰霉病菌菌丝生长的抑制效果。
图7是NC-RNA在番茄叶片上对灰霉病菌感染的防治效果图。
图8是dsRNA在番茄叶片上对灰霉病菌感染的防治效果图。
图9是本发明RNAtri分子在番茄叶片上对灰霉病菌感染的防治效果图。
图10是NC-RNA在烟草叶片上对灰霉病菌感染的防治效果图。
图11是dsRNA在烟草叶片上对灰霉病菌感染的防治效果图。
图12是本发明RNAtri分子在烟草叶片上对灰霉病菌感染的防治效果图。
图13是NC-RNA在拟南芥叶片上对灰霉病菌感染的防治效果图。
图14是dsRNA在拟南芥叶片上对灰霉病菌感染的防治效果图。
图15是本发明RNAtri分子在拟南芥叶片上对灰霉病菌感染的防治效果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图1-15，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
本发明实施例1：一种可用于灰霉病菌防治的RNA纳米分子RNAtri及其灰霉病菌抑制剂，其制备方法包括以下步骤：
(1)编码抑菌RNAtri的DNA模板的合成：根据本发明提供的抑菌RNA分子的序列，推导出其编码的DNA模板序列，并在模板序列上游插入T7启动子序列，将这条编码抑菌RNA分子的模板DNA序列送生物公司进行化学合成获得。
(2)RNAtri的体外转录合成：利用T7 RNA体外转录试剂盒，按照操作说明获得RNAtri分子，将其稀释的100ng/uL，用于灰霉病菌的防治实验。
对比例1：基于灰霉病菌的DCL基因序列设计上下游引物，然后分别在引物两端加入T7启动子序列；最后以灰霉菌cDNA为模板，分别得到两端含有T7启动子序列的模板片段，利用T7 RNA聚合酶分别进行体外转录即可得到两条互补的RNA片段，等量混合后退火，即可得到靶向DCL的dsRNA。
对比例2：不能靶向灰霉病菌基因的RNA分子作为阴性对照(NC-RNA)。
验证试验：
1、抑菌RNA分子对灰霉菌孢子萌发的抑制作用
选取长势良好的灰霉菌，收集分生孢子，用PD培养基配成浓度为104个/mL。取10uL浓度为4ug/ul的RNAtri溶液，加入到含有500微升孢子溶液的离心管中，使RNA终浓度达到100ng/μL，26℃培养黑暗条件下培养6h，含有相同量的dsRNA和pET28a RNA作为对照，结果如图1-3所示。由图1-3可知，与对比例相比，使用本发明的实施例抑菌RNAtri分子，对灰霉病菌孢子的萌发抑制效率极高，所有孢子几乎没有萌发；而对比例1对灰霉病菌孢子具有一定的抑制萌发作用，但效果远远低于本发明的抑菌RNA分子；对比例2对灰霉病菌孢子的萌发没有任何抑制效果，几乎所有的孢子全部萌发。
2、抑菌RNA分子对灰霉菌菌丝生长的抑制效果
采用生长速率法，测定RNAtri分子对供试病原真菌的抑菌活性。将RNAtri溶液过滤除菌后，在超净工作台中将RNAtri溶液融于已冷却至50℃的PDA培养基中，配置RNA终浓度为100ng/uL的PDA培养基，倒入直径9cm的培养皿中冷却凝固。取预先培养24h的病原菌孢子菌落，移植到培养皿的中心，放置于28℃室内倒置培养6天，结果如图4-6所示。由图4-6可知，与对比例相比，使用本发明的实施例抑菌RNA分子对灰霉病菌丝的生长抑制效率远远高于对比例1对灰霉病菌菌丝生长的抑制。
3、抑菌RNA在不同植物叶片上对灰霉病菌的防治效果
选取生长整齐一致的番茄、烟草和拟南芥等三种植物，向每颗植物喷洒100ng/ul的抑菌RNA溶液后培养3天，以浓度相同的对比例溶液作为对照。剪取大小一致的番茄、烟草和拟南芥三种植物叶片，在叶柄包裹浸有带水棉团。在长势良好的灰霉菌平板边缘打取菌饼，接种在叶片的背面。每片叶接1块菌饼。接种后继续在26℃、85％相对湿度的条件下培养3天，结果如图7-15所示。由图7-15可知，与对比例相比，使用本发明的实施例RNAtri分子在三种植物叶片上对灰霉病菌的防治效果都比对比例1和对比例2效果好。
综上，本发明提供的RNAtri纳米分子具有诱导触发RNAi效率更高，对灰霉病菌的感染毒力具有极为显著的抑制效果。
上述实例只是为说明本发明的应用效果，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，或利用本发明在其它植物上实施对灰霉病菌的防治，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
发明名称：一种可用于灰霉病防治的RNA纳米分子RNAtri及其制备方法和应用
第一申请人：浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司
第二申请人：浙江理工大学
SEQ ID NO.1：
GGUAGAUGCUAGAGACUUUUGCCUUGAACAUCAGAACGAGGGCGACCCGCAAGGGUCGCCCUCGUUCUGAUGUUCAAGGCUUUUGGCGCCGCAUCUCGAUGGUCAGAAUUCACCGGUAGAUGCUAGAGACUUUUGCCUAGAUGAACAAGUAUGCCGGAUGGCGCAAGCCAUCCGGCAUACUUGUUCAUCUAGGCUUUUGGGACACGACGAUGAGAAUAAGACAUCAAUGACCUGAUGAUGUCUUAUUCUCAUCGUCGUGUCCCUUUUGUCUCUAGCAUCUACCGGUGAAUUCUGACCAUCGAGAUGCGGCGCCUUUUGUCUCUAGCAUCUACCGGUGAAUUAUCUCUAGCAUCUACCGGUGACUUUUGUCUCUAGCAUCAUGACCUGAGAUGCUAGAGACUUUUGCCAUUCUUCCUAUCCACCUCCAAAGCCGCAAGGCUUUGGAGGUGGAUAGGAAGAAUGGCUUUUGUCACCGGUAGAUGCUAGAGAUAAUUCAC
Claims (5)
1.一种可用于灰霉病防治的RNA纳米分子RNAtri，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的RNA序列。
2.根据权利要求1所述的RNA纳米分子序列，其特征在于，通过以下方法得到：推导出其编码的DNA模板序列，在模板序列上游插入T7启动子序列，合成DNA模板,体外转录合成RNAtri分子。
3.一种灰霉病抑制剂，其特征在于：主要成分为如权利要求1所述的RNAtri分子，可用于蔬菜作物灰霉病害的预防及治疗。
4.一种与RNAtri的序列或结构相同或高度相似的RNA序列，用于蔬菜作物灰霉病害的预防及治疗。
5.根据权利要求1所述的一种可用于灰霉病防治的RNA纳米分子RNAtri，其特征在于：
SEQ ID NO.1：
GGUAGAUGCUAGAGACUUUUGCCUUGAACAUCAGAACGAGGGCGACCCGCAAGGGUCGCCCUCGUUCUGAUGUUCAAGGCUUUUGGCGCCGCAUCUCGAUGGUCAGAAUUCACCGGUAGAUGCUAGAGACUUUUGCCUAGAUGAACAAGUAUGCCGGAUGGCGCAAGCCAUCCGGCAUACUUGUUCAUCUAGGCUUUUGGGACACGACGAUGAGAAUAAGACAUCAAUGACCUGAUGAUGUCUUAUUCUCAUCGUCGUGUCCCUUUUGUCUCUAGCAUCUACCGGUGAAUUCUGACCAUCGAGAUGCGGCGCCUUUUGUCUCUAGCAUCUACCGGUGAAUUAUCUCUAGCAUCUACCGGUGACUUUUGUCUCUAGCAUCAUGACCUGAGAUGCUAGAGACUUUUGCCAUUCUUCCUAUCCACCUCCAAAGCCGCAAGGCUUUGGAGGUGGAUAGGAAGAAUGGCUUUUGUCACCGGUAGAUGCUAGAGAUAAUUCAC。
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- 2022-04-11 CN CN202210372143.XA patent/CN114854741A/zh active Pending
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