ES2944944T3 - Control de patógenos fúngicos mediante la desactivación de sus vías de ARN pequeño utilizando una estrategia basada en ARNi - Google Patents
Control de patógenos fúngicos mediante la desactivación de sus vías de ARN pequeño utilizando una estrategia basada en ARNi Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a métodos para aumentar la resistencia a patógenos en una planta o parte de una planta. En un aspecto, el método comprende poner en contacto la planta o la parte de la planta con un ARN bicatenario o un dúplex de ARN pequeño que se dirige a un gen similar a un hongo dicer (DCL), en el que la planta o la parte de la planta ha aumentado resistencia a un patógeno fúngico en comparación con una planta de control o una parte de la planta de control que no se ha puesto en contacto con el ARN de doble cadena o el dúplex de ARN pequeño. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Control de patógenos fúngicos mediante la desactivación de sus vías de ARN pequeño utilizando una estrategia basada en ARNi
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica prioridad sobre la Solicitud provisional de EE.UU. n.° 62/153.440, presentada el 27 de abril de 2015 y la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 14/809.063, presentada el 24 de julio de 20 I 5.
Declaración de derechos a invenciones realizadas bajo investigación y desarrollo con patrocinio federal
La presente invención se realizó con apoyo gubernamental en virtud de la subvención número MCB-0642843, IOS-1257576 otorgada por la National Science Foundation, una subvención de NIH (R01 GM093008). El Gobierno tiene ciertos derechos sobre la presente invención.
Antecedentes de la invención
En las plantas, los ataques de patógenos desencadenan múltiples capas de respuestas inmunitarias del hospedador. Muchos patógenos de plantas y animales liberan efectores en las células hospedadoras para suprimir la inmunidad del hospedador, y muchas plantas han desarrollado proteínas de resistencia para reconocer los efectores y desencadenar una resistencia robusta.
Botrytis cinerea es un patógeno fúngico que infecta las flores y casi todos los cultivos de hortalizas y frutas y causa anualmente pérdidas de entre 10.000 y 100.000 millones de dólares en todo el mundo. Con su amplia gama de hospedadores, B. cinerea es un modelo útil para estudiar la patogenicidad de patógenos fúngicos agresivos.
Breve sumario de la invención
La invención proporciona un método para aumentar la resistencia a patógenos en una planta o una parte de una planta, comprendiendo el método:
poner en contacto la planta o la parte de la planta con un primer ARN de doble cadena, ARN pequeños, o dúplex de ARN pequeños que se dirigen a un primer gen o promotor de tipo Dicer (DCL) del patógeno fúngico y poner en contacto las plantas o parte de la planta con un segundo ARN de doble cadena, ARN pequeños, o dúplex de ARN pequeños que se dirigen a un segundo gen o promotor DCL del patógeno fúngico, en donde
(a) el primer ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a Botrytis DCL1 y el segundo ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a Botrytis DCL2; en donde el primer y segundo gen o promotor DCL comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29, o un fragmento de la misma que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos, o
(b) el primer ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a Verticillium DCL1 y el segundo ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a Verticillium DCL2; en donde el primer y segundo gen o promotor DCL comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos,
en donde la planta es una especie de los géneros Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Oryza, Panieum, Pannesetum, Persea, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Rosa, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Trigonella, Triticum, Vitis, Vigna o Zea, y en donde la planta o la parte de la planta tiene una mayor resistencia al patógeno fúngico en comparación con una planta de control o una parte de la planta de control que no se ha puesto en contacto con el ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños.
La invención proporciona además un método para aumentar la resistencia a patógenos en una fruta, una hortaliza o una flor, comprendiendo el método:
poner en contacto la fruta, hortaliza o flor con un primer ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños que se dirigen a un primer gen o promotor de tipo Dicer (DCL) del patógeno fúngico y poner en contacto la fruta, hortaliza o flor con un segundo ARN de doble cadena, ARN pequeños, o dúplex de ARN pequeños que se dirigen a un segundo gen o promotor DCL del patógeno fúngico, en donde
(a) el primer ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a Botrytis DCL1 y el segundo ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a Botrytis DCL2; en
donde el primer y segundo gen o promotor DCL comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, s Eq ID NO:28 o Se Q ID NO:29, o un fragmento de la misma que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos; o
(b) el primer ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a Verticillium DCL1 y el segundo ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a Verticillium DCL2; en donde el primer y segundo gen o promotor DCL comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos, y
en donde la fruta, la hortaliza o la flor tienen una mayor resistencia al patógeno fúngico en comparación con una fruta, hortaliza o flor de control que no ha estado en contacto con el ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños.
La invención proporciona además un método para producir una planta que tenga una mayor resistencia a los patógenos frente a una primera especie y una segunda especie de patógenos, en donde la primera especie de patógeno es una especie de Botrytis y la segunda especie de patógeno es una especie de Verticillium, comprendiendo el método:
introducir en la planta por transformación
(1) un casete de expresión heteróloga que comprende un promotor unido operativamente a un primer polinucleótido que inhibe la expresión de un promotor o gen Botrytis DCL1 y un casete de expresión heteróloga que comprende un promotor unido operativamente a un segundo polinucleótido que inhibe la expresión de un gen o promotor Botrytis DCL2; en donde el gen o promotor DCL1 y DCL2 comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29, o un fragmento de la misma que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos;
(2) un casete de expresión heteróloga que comprende un promotor unido operativamente a un primer polinucleótido que inhibe la expresión de un gen o promotor Verticillium DCL1 y un casete de expresión heteróloga que comprende un promotor unido operativamente a un segundo polinucleótido que inhibe la expresión de un gen o promotor Verticillium DCL2; en donde el gen o promotor DCL1 y DCL2 comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos; y
seleccionar una planta que comprenda los casetes de expresión.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona plantas (o una célula vegetal, semilla, flor, hoja, fruto u otras partes de la planta de tales plantas o alimentos procesados o ingredientes alimentarios de tales plantas) que tienen mayor resistencia a un patógeno (p. ej., un patógeno fúngico o de oomicetos). En otro aspecto de la divulgación, se proporcionan métodos para producir una planta resistente a patógenos. En algunos aspectos de la divulgación, el método comprende:
poner en contacto la planta o la parte de la planta con un ARN de doble cadena, un ARN pequeño (ARNp) o un dúplex de ARN pequeños que se dirigen a un gen de tipo Dicer (DCL) o región de repetición terminal larga (LTR) fungicos o de oomicetos, en donde la planta es una especie de los géneros Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Oryza, Panieum, Pannesetum, Persea, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Rosa, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Trigonella, Triticum, Vitis, Vigna, o Zea, y en donde la planta o la parte de la planta tiene mayor resistencia a un patógeno fúngico o de oomiceto en comparación con una planta de control o una parte de la planta de control que no se ha puesto en contacto con el ARN de doble cadena, ARNp o dúplex de ARN pequeños.
En algunos aspectos de la divulgación, el método comprende:
poner en contacto una fruta, hortaliza o flor con un ARN de doble cadena o un dúplex de ARN pequeños que se dirigen a un gen de tipo Dicer (DCL) o región de repetición terminal larga (LTR) fungicos o de oomicetos, en donde la fruta, la hortaliza o la flor tiene mayor resistencia a un patógeno fúngico o de oomicetos en comparación con una fruta, hortaliza o flor de control que no ha estado en contacto con el ARN de doble cadena, ARNp o dúplex de ARN pequeños.
En algunos aspectos de la divulgación, el patógeno es un patógeno fúngico. En algunas realizaciones, el patógeno es Botrytis o Verticillium.
En algunos aspectos de la divulgación, el ARN de doble cadena, ARNp o dúplex de ARN pequeños se dirige a un gen DCL fúngico o de oomicetos. En algunos aspectos de la divulgación, el ARN de doble cadena, ARNp o dúplex de ARN pequeños se dirige a cualquiera de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma (p. ej., al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o más nucleótidos contiguos de los mismos). En algunos aspectos de la divulgación, el ARN de doble cadena, ARNp o dúplex de ARN pequeños comprende una repetición invertida de una secuencia que es idéntica o
sustancialmente idéntica (p. ej., al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica) a cualquiera de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, o un fragmento de la misma, o un complemento de la misma. En algunos aspectos de la divulgación, el ARN de doble cadena, ARNp o dúplex de ARN pequeños comprende un espaciador entre las secuencias repetidas invertidas.
En algunos aspectos de la divulgación, el ARN de doble cadena es ARNip. En algunas realizaciones, el ARN de doble cadena, ARNp o dúplex de ARN pequeños se rocía o se aplica con brocha sobre la planta o la parte de la planta (p. ej., una hoja, fruta, hortaliza o flor).
En algunos aspectos de la divulgación, el método comprende además poner en contacto la planta o la parte de la planta con un segundo ARN de doble cadena o un segundo dúplex de ARN pequeños o un segundo ARNp que se dirigen a un segundo gen DCL del patógeno fúngico. En algunos aspectos de la divulgación, el método comprende poner en contacto la planta o la parte de la planta con uno o más ARN de doble cadena o dúplex de ARN pequeños o ARNp que se dirigen a un gen DCL de una primera especie de patógeno fúngico (p. ej., para dirigirse a genes DCL en Botrytis, p. ej., un ARN de doble cadena, ARNp o dúplex de ARN pequeños que se dirigen a DCL1 en B. cinerea y un ARN de doble cadena, ARNp o dúplex de ARN pequeños que se dirigen a DCL2 en B. cinerea) y además comprende poner en contacto la planta o la parte de la planta con uno o más ARN de doble cadena o dúplex de ARN pequeños o ARNp que se dirigen a un gen DCL de una segunda especie de patógeno fúngico (p. ej., para dirigirse a genes DCL en Verticillium, p. ej., un ARN de doble cadena, ARNp o dúplex de ARN pequeños que se dirigen a DCL1 en V. dahilae y un ARN de doble cadena, ARNp o dúplex de ARN pequeños que se dirigen a DCL2 en V. dahilae).
En otro aspecto de la divulgación, se proporcionan métodos para aumentar la resistencia a patógenos a múltiples patógenos (p. ej., patógenos fúngicos u oomicetos). En algunos aspectos de la divulgación, el método comprende: poner en contacto la planta o la parte de la planta con (1) un primer ARN de doble cadena, ARNp o dúplex de ARN pequeños que se dirigen a un gen de tipo Dicer (DCL) o una región de repetición terminal larga (LTr ) de una primera especie de patógeno fúngico u oomiceto, y (2) un segundo ARN de doble cadena, ARNp o dúplex de ARN pequeños que se dirigen a un gen DCL o una región LTR de una segunda especie de patógeno fúngico u oomiceto, en donde la planta o la parte de la planta tiene una mayor resistencia a la primera especie de patógeno y a la segunda especie de patógeno en comparación con una planta de control o parte de una planta de control que no se ha puesto en contacto con el primer y segundo ARN de doble cadena, ARNp o dúplex de ARN pequeños.
En algunos aspectos de la divulgación, el método comprende poner en contacto la planta con dos o más ARN de doble cadena, ARNp o dúplex de ARN pequeños para dirigirse a dos o más genes DCL o regiones LTR de la primera especie de patógeno (p. ej., para dirigirse a genes DCL en Botrytis, p. ej., DCL1 y DCL2 en B. cinerea) y dos o más ARN de doble cadena, ARNp o dúplex de ARN pequeños para dirigirse a dos o más genes DCL o regiones LTR de la segunda especie de patógeno (p. ej., para dirigirse a genes DCL en Verticillium, p. ej., DCL1 y DCL2 en V. dahilae).
En otro aspecto de la divulgación, un método para producir una planta que tenga una mayor resistencia a patógenos frente a múltiples patógenos comprende:
introducir en la planta (1) un primer casete de expresión heteróloga que comprende un primer promotor unido operativamente a un primer polinucleótido que inhibe la expresión de un gen de tipo Dicer (DCL) o una región de repetición terminal larga (LTR) de una primera especie de patógeno fúngico u oomiceto y (2) un segundo casete de expresión heteróloga que comprende un segundo promotor unido operativamente a un segundo polinucleótido que inhibe la expresión de un gen DCL o una región lTr de una segunda especie de patógeno fúngico u oomiceto; y
seleccionar una planta que comprenda el primer casete de expresión y el segundo casete de expresión.
En algunos aspectos de la divulgación, el método comprende introducir en la planta dos o más casetes de expresión heteróloga para dirigirse a dos o más genes DCL o regiones LTR de la primera especie de patógeno (p. ej., para dirigirse a genes DCL en Botrytis, p. ej., DCL1 y DCL2 en B. cinerea) y dos o más casetes de expresión heteróloga para dirigirse a dos o más genes d Cl o regiones LTR de la segunda especie de patógeno (p. ej., para dirigirse a genes DCL en Verticillium, p. ej., DCL1 y DCL2 en V. dahilae). En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende un ácido nucleico antisentido o ARN inhibidor (ARNi) que se dirigen al gen DCL o la región LTR o un fragmento del mismo.
En otro aspecto más de la divulgación, se proporcionan métodos para cultivar una pluralidad de plantas resistentes a patógenos.
Breve descripción de los dibujos
FIG. 1. El genoma de B. cinerea tiene dos genes tipo Dicer (DCL). El árbol filogenético de las proteínas DCL de diferentes especies de hongos patógenos, también se incluyen las proteínas DCL de un oomiceto patógeno Phytophthora infestans. Schizosaccharomyces pombe y Neurospora crasa fueron utilizados como referencias.
FIG. 2A-C. Los ARNp de B. cinerea (Bc) dependen de ambas proteínas DCL de B. cinerea . Todas las cepas mutantes de B. cinerea dcll, dcl2 y dcll dcl2 mostraron retraso en el crecimiento y retraso en el desarrollo de conidiosporas (A), pero solo la cepa doble mutante no pudo producir efectores Bc-ARNp (B). Se utilizaron ARNp independientes de DCL como control (C).
FIG. 3A-D. Las DCL de B. cinerea son esenciales para su patogenicidad. El doble mutante B. cinerea dcll dcl2, pero no los mutantes simples dcll o dcl2, produjo síntomas de enfermedad mucho más débiles que el tipo silvestre en ambos, en Arabidopsis (A-B) y S. lycopersicum (C-D).
FIG. 4A-C. Los ARN pequeños dependientes de DCL son importantes para la virulencia fúngica. El doble mutante B. cinerea dcll dcl2 es mucho menos virulento en las frutas, hortalizas y flores en comparación con una cepa de Botrytis de tipo silvestre. Frutos y hojas de tomate (A), cebollas y lechugas (B) y las flores rosas (C) fueron infectadas por la cepa de B. cinerea de tipo silvestre B05 (WT) o la cepa doble mutante dcl1 dcl2. Las fotografías se tomaron después de 3 días para las hojas de tomate y 4 días para los frutos de tomate, cebolla, lechuga y rosa.
FIG. 5A-B. Las DCL de Botrytis son responsables de generar ARNp derivados de repeticiones terminales largas (LTR). El análisis de ARNp comparativo de todo el genoma en dcl1 dcl2 y de tipo silvestre reveló que las DCL de Botrytis son responsables de generar ARNp derivados de LTR, muchos de los cuales son ARNp efectores.
FIG. 6. Los efectores Bc-ARNp derivados de LTR dependen de DCL1 y DCL2.
FIG. 7A-D. Los Bc-ARNp derivados de retrotransposones son en su mayoría dependientes de BcDCL. Se construyeron dos bibliotecas a partir de B. cinerea de tipo silvestre y el doble mutante dcl1 dcl2 y se secuenciaron usando secuenciación profunda de Illumina. (A) Los números de lectura de todas las lecturas de Bc-ARNp de las dos bibliotecas según el tamaño de ARNp. (B) Los números de lectura de Bc-ARNp derivados de retrotransposones de las dos bibliotecas según el tamaño de ARNp. (C) Los números de lectura normalizados de Bc-siR3.1, BcsiR3.2 y Bc-siR5 de las dos bibliotecas. (D) Los números de lectura de BcARNp derivados de retrotransposones según el nucleótido 5' (A, U, C o G) y el tamaño del ARNp. El eje X en A, B y D indican el tamaño del ARN en nucleótidos.
FIG. 8. La fracción precipitada de AGO1 después de la infección presentaba un alta concentración de algunos ARN pequeños de Verticillium . Se realizó cultivo de raíces para obtener material para inmunoprecipitación de ARN pequeño asociado a AGO1 en Arabidopsis de tipo silvestre (WT) y mutante ago1-27 después de la infección. Los ARNp que están asociados con Arabidopsis AGO1 se extrajeron y se sometieron a una secuenciación profunda.
FIG. 9A-B. La inactivación de BcDCL por silenciamiento génico inducido por el hospedador (HIGS) en Arabidopsis transgénica mejora la resistencia de la planta a B. cinerea. (A) Tres líneas de B. cinerea dcl1dcl2 (HIGS-BcDCL) seleccionadas, así como plantas de tipo silvestre, se infectaron con B. cinerea. Las fotografías se tomaron 4 días después de la infección (dpi). Tres réplicas biológicas indicaban resultados similares. (B) El nivel de expresión de siRBcDCLs de tipo silvestre y tres líneas transgénicas seleccionadas transformadas con HIGS-BcDCL según lo medido por transferencia Northern. U6 se utilizó como control de carga.
FIG. 10A-B. La inactivación de BcDCLs por silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) en tomate mejora la resistencia de la planta a B. cinerea. (A) La quinta, sexta y séptima hojas de plantas de tomate VIGS-RB y VIGS-BcDCLs se desprendieron e infectaron con B. cinerea usando inoculación por aspersión. Las fotografías fueron tomadas 3 dpi. Tres réplicas biológicas indicaban resultados similares. (B) Los niveles de siRBcDCLs de las hojas infectadas correspondientes se midieron mediante transferencia Northern. U6 se utilizó como control de carga.
FIG. 11. El tomate fue más resistente contra B. cinerea cuando se rociaba con ARN que contiene siRBcDCL.
ARN simulado: ARN total extraído del tabaco infiltrado por simulacro. ARN siRBcDCLs: ARN pequeño extraído del tabaco infiltrado por Agrobacteria portadora del vector productor de siRBcDCLs (pHellsgate8-B052DCL).
FIG. 12. B. cinerea fue menos virulento para los tomates cuando se mezclaba con ARN total de N. benthamiana que contiene siRBcDCLs. ARN simulado: ARN total extraído del tabaco infiltrado por simulacro. ARN siRBcDCLs: ARN pequeño extraído del tabaco infiltrado por Agrobacteria portadora del vector productor de siRBcDCLs (pHellsgate8-B052DCL).
FIG. 13. B. cinerea fue menos virulento para las fresas cuando se mezclaba con ARN que contenía siRBcDCL. ARN simulado: ARN total extraído del tabaco infiltrado por simulacro. ARN siRBcDCLs: ARN pequeño extraído del tabaco infiltrado por Agrobacteria portadora del vector productor de siRBcDCLs (pHellsgate8-B052DCL).
FIG. 14. B. cinerea fue menos virulento para los pepinos cuando se mezclaba con ARN que contenía siRBcDCLs. ARN simulado: ARN total extraído del tabaco infiltrado por simulacro. ARN siRBcDCLs: ARN pequeño
extraído del tabaco infiltrado por Agrobacteria portadora del vector productor de siRBcDCLs (pHellsgate8-B052DCL).
FIG. 15A-B. El rociado de frutas con ARN extraídos de N. benthamiana que expresaban ARNp dirigidos a Bc-DCL estaba asociado a síntomas reducidos de la enfermedad del moho gris causada por B. cinerea. (A) Hojas y frutos de tomate, frutos de fresa y frutos de uva se pretrataron con el ARN total de N. benthamiana infiltrado con pHELLSGATE-BcDCLs y pHELLSGATE-EV por rociado durante 24 horas, seguido por inoculación por goteo de B. cinerea en el área rociada de las frutas. Los síntomas de la enfermedad se registraron 4 dpi para frutos de tomate y uva y 3 dpi para hojas de tomate y frutos de fresa. T res réplicas biológicas indicaban resultados similares. (B) Los niveles de expresión de los desencadenantes de BcDCLs ARNi, incluyendo ARNdc-BcDCLs y siRBcDCLs, del ARN total extraído de N. benthamiana infiltrado con pHELLSGATE-BcDCLs o pHELLSGATE-EV. U6 se utilizó como control de carga.
FIG. 16. El rociado de hojas y frutos de tomate con ARNdc transcrito in vitro contra BcDCLs redujo la enfermedad del moho gris causada por B. cinerea en tomate y fresa. Se pretrataron hojas y frutos de tomate y frutos de fresa con agua o ARNdc largo transcrito in vitro contra BcDCLs durante 24 horas, seguido por inoculación por goteo de B. cinerea directamente en el área pretratada de las hojas o frutos. Los síntomas de la enfermedad se registraron 4 dpi para frutos de tomate y 3 dpi para hojas de tomate y frutos de fresa.
FIG. 17A-B. El HIGS de genes DCL de B. cinerea y V. dahilae aumentaron la tolerancia de las plantas a ambos patógenos. (A) Se infectaron dos líneas HIGS-4DCLs seleccionadas (de 4 semanas), así como plantas de Arabidopsis de tipo silvestre con B. cinerea por inoculación por goteo en las hojas. Las fotos fueron tomadas después de 4 dpi. Dos réplicas biológicas indicaban resultados similares. (B). Se infectaron dos líneas de HIGS-4DCLs seleccionadas (de 2 semanas) y plantas de Arabidopsis de tipo silvestre con V. dahilae por inoculación de raíces. Las fotografías fueron tomadas después de 3 semanas de infección. Dos réplicas biológicas indicaban resultados similares.
FIG. 18A-B. El doble mutante B. cinerea dcll dcl2 tiene virulencia reducida en frutas, hortalizas y pétalos de flores. (A) El doble mutante B. cinerea dcll dcl2 mostró virulencia comprometida en frutas (tomate, fresa y uva), hortalizas (lechuga y cebolla), y pétalos de flores (rosa), mientras que el mutante simple B. cinerea dcl2 mostró una virulencia similar o una virulencia ligeramente reducida que la cepa WT. Se obtuvieron resultados similares de al menos tres réplicas biológicas. (B) Panel superior: Los tamaños de las lesiones de las muestras de plantas infectadas se midieron a los 3 a 5 días después de la inoculación (dpi) utilizando ImageJ, y las barras de error indican la DT de al menos 10 muestras en cada experimento. Panel inferior: La biomasa de B. cinerea se midió por PCR cuantitativa a los 3 a 5 dpi. Las barras de error indican la DT de tres réplicas. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (P < 0,01; prueba t de Student). Los mismos experimentos se realizaron tres veces para b y c y dieron resultados similares.
FIG. 19A-H. La expresión de Bc-DCL1/2-ARNp en Arabidopsis y plantas de tomate mejora la resistencia de la planta a B. cinerea. (A) Bc-DCL1/2-ARNp se expresaron altamente en las plantas transgénicas de Arabidopsis, como se detecta por transferencia Northern de ARNp. (B) Las plantas de Arabidopsis que expresan Bc-DCL1/2-ARNp mostraron una mayor resistencia a enfermedades contra B. cinerea. Se obtuvieron resultados similares a partir de tres réplicas biológicas. (C) Los tamaños de las lesiones se midieron 3 dpi usando imageJ, y las barras de error indican la DT de al menos 10 muestras. La biomasa de B. cinerea se midió 3 dpi por PCR cuantitativa, y las barras de error indican la DT de tres réplicas. Se obtuvieron resultados similares de tres réplicas biológicas para (B) y (C). (D) La expresión de Bc-DCL1 y Bc-DCL2 fue regulada a la baja en plantas de Arabidopsis infectadas que expresan Bc-DCL1/2-ARNp, medido por RT-PCR cuantitativa. (E) El análisis de transferencia Northern reveló los niveles de expresión de Bc-DCL1/2-ARNp en las plantas de tomate que expresan Bc-DCL1/2-ARNp a través de VIGS. (F) Las plantas de tomate que expresan Bc-DCL1/2-ARNp fueron más resistentes a B. cinerea en comparación con las plantas de control. (G) La biomasa de B. cinerea se midió 3 dpi y las barras de error indican la d T de tres réplicas. (H) Bc-DCL1 y Bc-DCL2 fueron silenciados en plantas de tomate infectadas que expresaban Bc-DCL1/2-ARNp, medido por RT-PCR cuantitativa. Se obtuvieron resultados similares a partir de tres réplicas biológicas para (E)-(H). Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (P < 0,01; Prueba t de Student).
FIG. 20A-B. Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc aplicados externamente inhibieron la virulencia del patógeno en las frutas, hortalizas y pétalos de flores. (A) La aplicación externa de Bc-DCL1/2-ARNdc y -ARNp inhibió la virulencia de B. cinerea sobre frutas (tomate, fresa y uva), hortalizas (lechuga y cebolla), y pétalos de flores (rosa), en comparación con el control. Se obtuvieron resultados similares a partir de 4 réplicas biológicas. (B) El tamaño de la lesión y la biomasa fúngica se midieron de 3 a 5 dpi usando imageJ y PCR cuantitativa, respectivamente, y las barras de error indican la DT de 10 muestras y tres réplicas para el tamaño relativo de la lesión y la biomasa relativa, respectivamente. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (P < 0,01; Prueba t de Student). Estos experimentos fueron repetidos tres veces con resultados similares.
FIG. 21A-C. El tratamiento de plantas con extractos de ARN de N. benthamiana que expresan Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc redujo los síntomas de la enfermedad del moho gris causada por B. cinerea. (A) Se usaron
los extractos de ARN total de N. benthamiana de plantas que expresan pHELLSGATE (EV) o que expresan pHELLSGATE-Bc-DCL1/2 para medir los niveles de expresión de Bc-DCL-ARNp y -ARNdc mediante análisis de transferencia Northern. Se usó Bc-DCL-ADN marcado con P32 como sonda. (B) La aplicación externa de extractos de ARN total de N. benthamiana que contienen Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc en frutas (tomate, fresa y uva), hortalizas (lechuga y cebolla) y pétalos de flores (rosa) redujeron los síntomas de la enfermedad del moho gris, en comparación con la aplicación externa de extractos de a Rn total de N. benthamiana sin Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc. (C) Los tamaños de las lesiones se midieron de 3 a 5 dpi usando imageJ, y las barras de error representan la DT de 10 muestras de plantas. La biomasa de B. cinerea también se calculó con PCR cuantitativa. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (P < 0,01; Prueba t de Student). Estos experimentos se repitieron tres veces y dieron resultados similares.
FIG. 22A-C. Las células de B. cinerea captan Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc, que silenciaron Bc-DCL1 y Bc-DCL2. (A) Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc fluorescentes se examinaron en células de B. cinerea después de 12 horas de co-cultivo con esporas de B. cinerea en medio ME sólido. Se detectaron DCL1/2-ARNp y -ARNdc marcados con fluorescencia en las células de B. cinerea. Todavía estaban presentes en las células de B. cinerea después del tratamiento con MNasa. (B) Se observaron Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc fluorescentes en protoplastos de B. cinerea después de 16 horas de co-cultivo con esporas de B. cinerea en medio líquido YEPD. El tratamiento con MNasa del protoplasto no eliminó la fluorescencia. (C) Bc-DCL1 y Bc-DCL2 fueron examinados 40 horas después del cocultivo de las esporas de B. cinerea con Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc en el medio YEPD líquido. Los ARNp y ARNdc dirigidos a BC-DCL2 solo regularon a la baja Bc-DCL2 pero no Bc-DCL1.
FIG. 23A-E. Las plantas de Arabidopsis que expresan simultáneamente ARNp que se dirige a los genes DCL de B. cinerea y V. dahilae muestran una mayor resistencia a las enfermedades provocadas por ambos patógenos. (A) El análisis de transferencia Northern indicó los niveles de expresión de Bc-DCL1/2-ARNp y Vd-DCL1/2-ARNp en las plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan Bc+Vd-DCL-ARNp. (B) La RT-PCR cuantitativa mostró que Bc-DCL1 y Bc-DCL2 fueron silenciados en plantas de Arabidopsis infectadas con B. cinerea que expresan Bc+Vd-DCL-ARNp en comparación con plantas WT. (C) Las plantas de Arabidopsis que expresan Bc+Vd-DCL-ARNp inhiben la virulencia B. cinerea. Los tamaños de las lesiones se midieron 3 dpi usando ImageJ, y las barras de error indican la DT de 10 hojas. La biomasa de B. cinerea se midió 3 dpi por PCR cuantitativa. (D) El nivel de expresión de Vd-DCL1 y Vd-DCL2 fue reprimido en plantas de Arabidopsis infectadas con V. dahilae que expresan Bc+Vd-DCLs-ARNp. (E) Las plantas de Arabidopsis que expresan Bc+Vd-DCL-ARNp fueron menos susceptibles a V. dahilae en comparación con las plantas WT. La biomasa de V. dahilae se midió a las 3 semanas después de la inoculación. Los asteriscos representaron diferencias estadísticamente significativas (P < 0,01; prueba t de Student). Se obtuvieron resultados similares a partir de tres réplicas para (B) -(E).
Definiciones
La expresión "resistente a patógenos" o "resistencia a patógenos" se refiere a un aumento en la capacidad de una planta para prevenir o resistir la infección por patógenos o los síntomas inducidos por patógenos. La resistencia a patógenos puede ser una mayor resistencia en relación con una especie o género de patógenos en particular (p. ej., Botrytis), aumento de la resistencia a múltiples patógenos, o aumento de la resistencia a todos los patógenos (p. ej., resistencia sistémica adquirida). En algunas realizaciones, la resistencia de una planta a un patógeno "aumenta" cuando uno o más síntomas de infección por el patógeno se reducen en relación con un control (p. ej., una planta en la que no se expresa un polinucleótido que inhibe la expresión de un gen DCL del patógeno fúngico).
Los "patógenos" incluyen, pero no se limitan a, virus, bacterias, nematodos, hongos o insectos (véase, p. ej., Agrios, Plant Pathology (Academic Press, San Diego, CA (1988)). En algunos aspectos de la divulgación, el patógeno es un patógeno fúngico. En algunas realizaciones, el patógeno es Botrytis.
La expresión "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a un polímero monocatenario o bicatenario de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos leídas desde el extremo 5' al 3'. Los ácidos nucleicos también pueden incluir nucleótidos modificados que permiten una lectura correcta por parte de una polimerasa y no alteran significativamente la expresión de un polipéptido codificado por ese ácido nucleico.
La expresión "ácido nucleico codificante" o "polinucleótido codificante" se refiere a un ácido nucleico que dirige la expresión de una proteína o péptido específico. Las secuencias de ácido nucleico incluyen tanto la secuencia de la cadena de ADN que se transcribe en ARN como la secuencia de ARN que se traduce en proteína. Las secuencias de ácido nucleico incluyen tanto las secuencias de ácido nucleico de longitud completa como las secuencias de longitud no completa derivadas de las secuencias de longitud completa. Debe entenderse además que la secuencia incluye los codones degenerados de la secuencia o secuencias nativas que pueden introducirse para proporcionar preferencia de codones en una célula hospedadora específica.
Se dice que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o restos de aminoácidos, respectivamente, en las dos secuencias es la misma cuando se alinea para la máxima correspondencia como se describe a continuación. El "porcentaje de identidad de secuencia" se determina al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de una ventana de comparación, en donde la parte de la
secuencia polinucleotídica o polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales se encuentran la base de ácido nucleico o el resto de aminoácido idénticos en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Cuando se utiliza el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a proteínas o péptidos, se reconoce que las posiciones de restos que no son idénticos a menudo difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas, donde se sustituyen los restos de aminoácido por otros restos de aminoácido con propiedades químicas similares (p. ej., carga o hidrofobia) y por lo tanto, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, puede ajustarse por exceso el porcentaje de identidad de secuencia para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los expertos en la materia. Normalmente, esto implica puntuar una sustitución conservativa como un emparejamiento erróneo parcial en lugar de completo, aumentando de este modo el porcentaje de identidad de secuencia. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se asigna a un aminoácido idéntico una puntuación de 1 y se asigna a una sustitución no conservativa una puntuación de cero, se asigna a una sustitución conservativa una puntuación entre cero y 1. La puntuación de sustituciones conservativas se calcula de acuerdo con, p. ej., el algoritmo de Meyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17 (1988) p. ej., como se implementa en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, EE.UU.).
La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", como se usa en el contexto de secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, hace referencia a una secuencia que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con una secuencia de referencia. Como alternativa, el porcentaje de identidad puede ser cualquier número entero del 60 % al 100 %. Los aspectos ilustrativos de la divulgación incluyen al menos: 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, en comparación con una secuencia de referencia usando los programas descritos en el presente documento; preferentemente BLAST usando parámetros estándar, como se describe a continuación. Un experto reconocerá que estos valores pueden ajustarse adecuadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos, teniendo en cuenta la degeneración de codones, similitud de aminoácidos y posicionamiento del marco de lectura.
Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Se pueden usar los parámetros predeterminados del programa o se pueden designar parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de prueba respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.
Una "ventana de comparación", tal como se usa en el presente documento, incluye la referencia a un segmento de una cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en de 20 a 600, habitualmente, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente, de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en el que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas una vez alineadas las dos secuencias de manera óptima. Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Add. APL. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FAST A, y TFASTA en el paquete informático Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineación manual e inspección visual.
Algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 y Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. El programa informático para realizar análisis BLAST está disponible públicamente en el sitio web del National Center for Biotechnology Information (NCBI). El algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencias de alta valoración (HSP, por sus siglas en inglés) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen algún valor umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere al umbral de la puntuación de palabra vecina (Altschul et al, supra). Estos aciertos de palabra próxima iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que los contengan. Los aciertos de palabra entonces se prolongan en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia todo el tiempo que pueda aumentarse el valor de alineamiento acumulativo. Los valores acumulativos se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (valor de recompensa para un par de restos coincidentes; siempre >0) y N (valor de penalización para restos no coincidentes; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de valores para calcular el valor acumulativo. La prolongación de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa queda fuera por la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa
llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos con puntuación negativa; o se alcanza el final de una de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto un tamaño de palabra (W) de 28, una expectativa (E) de 10, M=1, N=-2 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto un tamaño de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: l0915 (1989)).
El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p. ej., Karlin y Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que sucedería una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,01, más preferentemente menor de aproximadamente 10-5, y lo más preferentemente menor de aproximadamente 10-20.
La expresión "complementaria a" se usa en el presente documento para indicar que la secuencia de polinucleótidos es complementaria a toda o una parte de una secuencia de polinucleótidos de referencia. En algunos aspectos de la divulgación, una secuencia de polinucleótidos es complementaria a al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, al menos 200 o más nucleótidos contiguos de una secuencia polinucleotídica de referencia. En algunos aspectos de la divulgación, una secuencia de polinucleótidos es "sustancialmente complementaria" a una secuencia de polinucleótidos de referencia si es al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % de la secuencia de polinucleótidos es complementaria a la secuencia de polinucleótidos de referencia.
Una secuencia de polinucleótidos es "heteróloga" para un organismo o una segunda secuencia de polinucleótidos si se origina a partir de una especie extraña, o, si es de la misma especie, se modifica de su forma original. Por ejemplo, cuando se dice que un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante heteróloga, significa que la secuencia codificante deriva de una especie mientras que la secuencia promotora deriva de otra especie diferente; o, si ambas derivan de la misma especie, la secuencia codificante no está asociada naturalmente con el promotor (p. ej., es una secuencia codificante modificada genéticamente, p. ej., de un gen diferente en la misma especie, o un alelo de un ecotipo o variedad diferente).
Un "casete de expresión" se refiere a una construcción de ácido nucleico, que cuando se introduce en una célula hospedadora, tiene como resultado la transcripción y/o traducción de un ARN o polipéptido, respectivamente. Las construcciones antisentido o las construcciones con sentido que no son o no pueden ser traducidas están expresamente incluidas en esta definición. Un experto reconocerá que la secuencia de polinucleótidos insertada no necesita ser idéntica, sino que puede ser solo sustancialmente similar a una secuencia del gen del que se deriva.
El término "promotor", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de polinucleótidos capaz de impulsar la transcripción de una secuencia codificante en una célula. Por lo tanto, los promotores usados en las construcciones polinucleotídicas de la divulgación incluyen elementos de control transcripcional que actúan en cis y secuencias reguladoras que están involucradas en la regulación o modulación del tiempo y/o velocidad de transcripción de un gen. Por ejemplo, un promotor puede ser un elemento de control transcripcional que actúa en cis, incluyendo un potenciador, un promotor, un terminador de la transcripción, un origen de replicación, una secuencia de integración cromosómica, regiones no traducidas 5' y 3', o una secuencia intrónica, que intervienen en la regulación transcripcional. Estas secuencias que actúan en cis normalmente interactúan con proteínas u otras biomoléculas para llevar a cabo (activar/desactivar, regular, modular, etc.) la transcripción de genes. Un "promotor de plantas" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en las células vegetales. Un "promotor constitutivo" es aquel que es capaz de iniciar la transcripción en casi todos los tipos de tejido, mientras que un "promotor específico de tejido" inicia la transcripción solo en uno o unos pocos tipos de tejido particulares. Un "promotor inducible" es aquel que inicia la transcripción solo en condiciones ambientales particulares o condiciones de desarrollo.
El término "planta" incluye plantas enteras, órganos y/o estructuras vegetativos de brote (p. ej., hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos florales (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras), óvulos (incluyendo óvulos y células centrales), semilla (incluyendo cigoto, embrión, endospermo y cubierta de la semilla), fruto (p. ej., el ovario maduro), plántulas, tejidos vegetales (p. ej., tejido vascular y tejido fundamental), células (p. ej., células de guarda, óvulos y tricomas), y la progenie de los mismos. La clase de plantas que puede usarse en el método de la invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores e inferiores susceptibles a las técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), gimnospermas, helechos y algas multicelulares. Incluye plantas de una variedad de niveles de ploidía, incluyendo aneuploide, poliploide, diploide, haploide y hemicigoto.
I. Introducción
Se ha descubierto que los patógenos fúngicos eucariotas agresivos, como Botrytis y Verticillium, han desarrollado un nuevo mecanismo de virulencia mediante el empleo de pequeños ARN como moléculas efectoras para suprimir las respuestas inmunitarias del hospedador para lograr una infección exitosa. También se ha descubierto que la mayoría de los pequeños efectores de a Rn se generan a partir de regiones de transposones, principalmente el retrotransposón del tipo repeticiones terminales largas (LTR). Como se ha descrito en los estudios del genoma de otros patógenos fúngicos y oomicetos, las regiones de transposones pueden contener también muchos genes efectores de proteínas fúngicas, incluidas las LTR. Estos pequeños ARN derivados de LTR, incluyendo la mayoría de los pequeños efectores de ARN, son generados por proteínas fúngicas de tipo Dicer (DCL).
Como se muestra en el presente documento, los genes DCL son esenciales para la patogenicidad de los patógenos eucariotas, como los patógenos fúngicos Botrytis y Verticillium, con efectores de ARN pequeño. Por lo tanto, los genes DCL son excelentes dianas para controlar aquellos patógenos eucariotas que utilizan ARN pequeños como efectores. Por ejemplo, Botrytis es un patógeno importante no solo en el campo, sino también en las etapas posteriores a la cosecha, y puede infectar muchas frutas, hortalizas y plantas con flores diferentes.
Por lo tanto, un aspecto de la presente divulgación se refiere al control de las enfermedades causadas por patógenos fúngicos y oomicetos agresivos silenciando sus genes DCL y LTR (p. ej., usando un mecanismo de silenciamiento génico inducido por el hospedador (HIGS)). En algunas realizaciones, el silenciamiento se logra mediante la generación de plantas transgénicas que expresan construcciones antisentido (p. ej., ARNi) que se dirigen a los DCL fúngicos o de oomicetos. En algunas realizaciones, el silenciamiento se consigue poniendo en contacto (p. ej., rociando) plantas con dúplex de ARN pequeños o ARN de doble cadena que se dirigen a los DCL del patógeno. Los DCL de Botrytis y Verticillium son ejemplos de genes que pueden servir de diana.
II. Genes DCL y regiones LTR de patógenos fúngicos
En un aspecto de la divulgación, se proporcionan métodos para inhibir o silenciar la expresión de genes de tipo Dicer (DCL) o regiones de repetición terminal larga (LTR) de patógenos fúngicos. En algunos aspectos de la divulgación, el método comprende expresar en una planta un casete de expresión que comprende un promotor unido operativamente a un polinucleótido que inhibe la expresión de un gen DCL de un patógeno fúngico o un casete de expresión que comprende un promotor unido operativamente a un polinucleótido que inhibe la expresión de una región LTR de un patógeno fúngico. En algunos aspectos de la divulgación, el método comprende poner en contacto la planta con una construcción que comprende un promotor unido operativamente a un polinucleótido que inhibe la expresión de un gen DCL de un patógeno fúngico o una construcción que comprende un promotor unido operativamente a un polinucleótido que inhibe la expresión de una región LTR de un patógeno fúngico. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende un ácido nucleico antisentido que es complementario al gen DCL o un fragmento del mismo. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende un dúplex de ARN pequeños o un ARN de doble cadena que se dirigen al gen DCL o un fragmento del mismo. En algunos aspectos de la divulgación, la secuencia de polinucleótidos comprende una repetición invertida de una secuencia dirigida al gen DCL, opcionalmente con un espaciador presente entre las secuencias repetidas invertidas. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende un ácido nucleico antisentido que es complementario a la región LTR o un fragmento de la misma. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende un dúplex de ARN pequeños o un ARN de doble cadena que se dirigen a la región LTR o un fragmento de la misma. En algunos aspectos de la divulgación, la secuencia de polinucleótidos comprende una repetición invertida de una secuencia dirigida a la región LTR, opcionalmente con un espaciador presente entre las secuencias repetidas invertidas. En algunos aspectos de la divulgación, el promotor es un promotor inducible. En algunos aspectos de la divulgación, el promotor es un promotor constitutivamente activo.
En otro aspecto de la divulgación, se proporcionan plantas que tienen expresión inhibida o silenciada de genes DCL o región lTr del patógeno. En algunos aspectos de la divulgación, la planta se pone en contacto con un polinucleótido que inhibe la expresión de un gen DCL del patógeno o una región LTR del patógeno, en donde la planta tiene una mayor resistencia a los patógenos respecto a una planta de control que no se ha puesto en contacto con el polinucleótido. En algunos aspectos de la divulgación, la planta comprende un casete de expresión heteróloga, comprendiendo el casete de expresión un polinucleótido que inhibe la expresión de DCL o región LTR del patógeno, en donde la planta tiene una mayor resistencia a los patógenos respecto a una planta de control que carece del casete de expresión. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende un ácido nucleico antisentido que es complementario al gen DCL o la región LTR o un fragmento del mismo. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende un ácido nucleico de doble cadena que se dirige al gen DCL o la región LTR o un fragmento del mismo.
En otro aspecto más de la divulgación, se proporcionan casetes de expresión que comprenden un promotor unido operativamente a un polinucleótido que inhibe la expresión de un gen DCL del patógeno, o ácidos nucleicos aislados que comprenden dichos casetes de expresión. En algunos aspectos de la divulgación, el casete de expresión comprende un promotor unido operativamente a un polinucleótido que comprende un ácido nucleico antisentido que es complementario al gen DCL o un fragmento del mismo. En algunos aspectos de la divulgación, el casete de expresión comprende un promotor unido operativamente a un polinucleótido que comprende un ácido nucleico de doble cadena que se dirige al gen DCL o un fragmento del mismo. En algunos aspectos de la divulgación, una planta en la que se introduce el casete de expresión tiene mayor resistencia al patógeno en comparación con una planta de
control que carece del casete de expresión.
Genes DCL del patógeno y polinucleótidos dirigidos a genes DCL del patógeno
En algunos aspectos de la divulgación, el gen DCL o el promotor DCL del patógeno que se va a atacar o silenciar es un patógeno viral, bacteriano, fúngico, nematodo, oomiceto o insecto. En algunos aspectos de la divulgación, el gen DCL es de un patógeno fúngico. Los ejemplos de patógenos fúngicos de plantas incluyen, pero no se limitan a, Botrytis, Verticillium, Magnaporthe, Sclerotinia, Puccinia, Fusarium, Mycosphaerella, Blumeria, Colletotrichum, Ustilago, y Melampsora. Véase, p. ej., Dean et al., Mol Plant Pathol 13: 804 (2012). En algunas realizaciones, el patógeno es Botrytis. En algunas realizaciones, el patógeno es Botrytis cinerea. En algunas realizaciones, el patógeno es Verticillium. En algunas realizaciones, el patógeno es V. dahilae.
En algunos aspectos de la divulgación, se selecciona como diana, se silencia o se inhibe uno o más genes DCL del patógeno con el fin de aumentar la resistencia al patógeno en una planta expresando en la planta o poniendo en contacto con la planta, un polinucleótido que inhibe la expresión del gen DCL del patógeno o que es complementario al gen DCL o un fragmento del mismo. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende un ácido nucleico antisentido que es complementario al gen DCL o un fragmento del mismo. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende un ácido nucleico de doble cadena que se dirige al gen DCL, o su promotor, o un fragmento del mismo. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende un ácido nucleico de doble cadena que tiene una secuencia que es idéntica o sustancialmente similar (al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica) al gen DCL o un fragmento del mismo. En algunos aspectos de la divulgación, un "fragmento" de un gen o promotor DCL comprende una secuencia de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o más nucleótidos contiguos del gen o promotor DCL (p. ej., comprende al menos (p. ej., al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o más nucleótidos contiguos de cualquiera de la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31. En algunos aspectos de la divulgación, el ácido nucleico de doble cadena es un dúplex de ARN pequeños o un ARN de doble cadena.
En algunas realizaciones, el polinucleótido inhibe la expresión de un gen DCL del patógeno fúngico que codifica una proteína DCL de Botrytis o Verticillium. En algunas realizaciones, el polinucleótido inhibe la expresión de un gen DCL fúngico que codifica una proteína DCL de Botrytis que es idéntica o sustancialmente idéntica (p. ej., al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica) a la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:4, o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el polinucleótido inhibe la expresión de un gen DCL fúngico que codifica una proteína DCL de Verticillium que es idéntica o sustancialmente idéntica (p. ej., al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica) a la SEQ ID NO:6 o la SEQ ID NO:8, o un fragmento de la misma.
En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica) a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma, o un complemento de la misma. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica) a la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7 o un fragmento de la misma, o un complemento de la misma. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, o un fragmento de la misma, o un complemento de la misma.
En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende una repetición invertida de una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica (p. ej., al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica) a cualquiera de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, o un fragmento de la misma, o un complemento de la misma. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende un espaciador entre las secuencias repetidas invertidas.
En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido se dirige a una región promotora de un gen DCL del patógeno fúngico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el polinucleótido se dirige a una región promotora dentro de la secuencia de cualquiera de la SEQ ID NO: 28, SEQ iD NO: 29, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31.
En algunos aspectos de la divulgación, la diana son dos o más genes o promotores DCL del patógeno fúngico (p. ej., dos, tres, cuatro o más genes o promotores DCL del mismo patógeno fúngico o de dos o más patógenos fúngicos). En algunos aspectos de la divulgación, la diana son dos o más genes o promotores DCL de Botrytis. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, la diana son dos o más de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 29, o un fragmento de cualquiera de ellas, para inhibir la expresión. En algunos aspectos de la divulgación, la
diana son dos o más genes o promotores DCL de Verticillium. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, la diana son dos o más de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:30 o SEQ ID NO:31, o un fragmento de cualquiera de las mismas, para inhibir la expresión.
Regiones LTR del patógeno y polinucleótidos dirigidos a regiones LTR del patógeno
Las regiones LTR que generan la mayoría de los efectores de ARN pequeño pueden ser la diana para el silenciamiento. En algunos aspectos de la divulgación, como en el caso de B. cinerea, los efectores de ARNp derivan de regiones de retrotransposones LTR. Asimismo, las regiones promotoras de las LTR también pueden ser diana para el silenciamiento. El direccionamiento a las regiones promotoras de LTR puede desencadenar el silenciamiento de genes transcripcionales, lo que evitaría el silenciamiento aleatorio de los genes del hospedador por parte de los ARN pequeños de LTR.
En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido se dirige o inhibe la expresión de una región LTR del patógeno o de una región promotora de una LTR del patógeno, en donde el patógeno es un patógeno fúngico. En algunos aspectos de la divulgación, el patógeno es Botrytis. En algunos aspectos de la divulgación, el patógeno es Botrytis cinerea. En algunos aspectos de la divulgación, el patógeno es Verticillium. En algunos aspectos de la divulgación, el patógeno es V. dahilae.
En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido se dirige a una secuencia de cualquiera de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 27 o un fragmento de la misma, o un complemento de la misma. En algunos aspectos de la divulgación, un "fragmento" de una región LTR o un promotor LTR comprende una secuencia de al menos 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o más nucleótidos contiguos de la región LTR o del promotor LTR (por ejemplo, comprende al menos 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o más nucleótidos contiguos de cualquiera de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 27.
En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende un ácido nucleico antisentido que es complementario a cualquiera de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:27 o un fragmento de la misma. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende un ácido nucleico de doble cadena que tiene una secuencia que es idéntica o sustancialmente similar (al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica) a cualquiera de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 27 o un fragmento de la misma. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido comprende una repetición invertida de un fragmento de cualquiera de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 27, y además comprende una región espaciadora que separa las secuencias de nucleótidos repetidas invertidas.
En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido se dirige a una región promotora de una LTR fúngica. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido se dirige a una región promotora dentro de la secuencia de SEQ ID NO: 27.
Silenciamiento de genes inducido por el hospedador
En algunos aspectos de la divulgación, los métodos de inhibición o silenciamiento de la expresión de genes DCL o regiones LTR de patógenos fúngicos utilizan un mecanismo de silenciamiento génico inducido por el hospedador (HIGS) para producir en una planta hospedadora ARN inhibidor que posteriormente se traslada al patógeno para inhibir la expresión de un gen o una región del patógeno. En algunos aspectos de la divulgación, se usa HIGS para producir en una planta ARN inhibidores (p. ej., ARNp) que se dirigen a uno o más DCL o LTR de patógenos. En algunos aspectos de la divulgación, en donde un patógeno tiene más de un DCL, se usa HIGS para producir ARN inhibitorios (p. ej., ARNp) que se dirigen a cada uno de los DCL del patógeno (p. ej., en el caso de Botrytis, se dirigen a DCL1 y DCL2). En algunos aspectos de la divulgación, se usa HIGS para producir ARN inhibitorios (p. ej., ARNp) contra DCL o LTR de múltiples patógenos.
Se describe el uso de HIGS para silenciar la expresión de genes patógenos en plantas, p. ej., en Nowara et al. (Plant Cell (2010) 22: 3130-3141); Nunes et al. (Mol Plant Pathol (2012) 13: 519-529); y Govindarajulu et al. (Plant Biotechnology Journal (2014) 1-9). Se describen ARNp de patógenos, por ejemplo, en el documento US 2015/0203865.
Tecnología antisentido
En algunos aspectos de la divulgación, la tecnología antisentido se utiliza para silenciar o inactivar el gen DCL o LTR del patógeno. La secuencia de ácido nucleico antisentido transformada en plantas será sustancialmente idéntica a al menos un fragmento del gen a silenciar. En algunos aspectos de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico antisentido que se transforma en plantas es idéntica o sustancialmente idéntica a la secuencia de DCL o a la secuencia de LTR del patógeno a bloquear. En algunos aspectos de la divulgación, la secuencia de polinucleótidos antisentido es complementaria a la secuencia de DCL o a la secuencia de LTR del patógeno a bloquear. Sin embargo, la secuencia no tiene que ser perfectamente idéntica para inhibir la expresión. Por lo tanto, en algunos aspectos de la divulgación, una secuencia de polinucleótidos antisentido que es sustancialmente complementaria (p. ej., al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o al menos 95 % complementaria) a la secuencia DCL o la secuencia LTR del patógeno que se va a bloquear (p. ej., en un casete de expresión bajo el control de un promotor heterólogo, que luego se transforma en plantas de manera que se produce el ácido nucleico antisentido).
En algunos aspectos de la divulgación, una molécula de ácido nucleico antisentido o con sentido que comprende o es complementaria solo con un fragmento de la secuencia del gen DCL o la secuencia LTR del patógeno puede ser útil para producir una planta en la que se silencia la expresión del gen del patógeno. Por ejemplo, puede usarse una secuencia de aproximadamente 15, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 nucleótidos.
También se pueden usar moléculas de ARN catalítico o ribozimas para inhibir la expresión de un gen DCL o LTR del patógeno. Es posible diseñar ribozimas que se emparejan específicamente con prácticamente cualquier ARN diana y escinden el esqueleto de fosfodiéster en una ubicación específica, inactivando de esta manera funcionalmente el ARN diana. Cuando lleva a cabo esta escisión, la propia ribozima no se altera y, por tanto, es capaz de reciclarse y escindir otras moléculas, convirtiéndola en una verdadera enzima. La inclusión de secuencias de ribozima dentro de los ARN antisentido confiere actividad de escisión del ARN, aumentando de esta forma la actividad de las construcciones.
Se han identificado varias clases de ribozimas. Una clase de ribozimas se deriva de varios ARN circulares pequeños que son capaces de autoescindirse y replicarse en las plantas. Los ARN se replican solos (ARN de viroide) o con un virus auxiliar (ARN satélite). Los ejemplos incluyen los ARN del viroide de la mancha solar del aguacate y los ARN satélite del virus de la mancha anular del tabaco, virus de la raya transitoria de lucerna, virus del moteado del tabaco de terciopelo, virus del moteado de Solanum nodiflorum y virus del moteado del trébol subterráneo. El diseño y uso de ribozimas específicas de ARN diana se describe en Haseloff et al. Nature, 334: 585-591 (1988).
Otro método de supresión es la supresión con sentido (también conocida como co-supresión). Se ha demostrado que la introducción de casetes de expresión en los que un ácido nucleico está configurado en la orientación con sentido con respecto al promotor ha demostrado ser un medio eficaz para bloquear la transcripción de genes diana. En general, donde se desea la inhibición de la expresión, se produce alguna transcripción de la secuencia introducida. El efecto puede ocurrir cuando la secuencia introducida no contiene una secuencia codificante per se, sino solo intrones o secuencias no traducidas homólogas a las secuencias presentes en el transcrito primario de la secuencia endógena. La secuencia introducida generalmente será sustancialmente idéntica a la secuencia que se pretende reprimir. Esta identidad mínima normalmente será superior al 65 % con respecto a la secuencia génica diana (p. ej., secuencia DCL o LTR), pero una mayor identidad puede ejercer una represión más eficaz de la expresión de las secuencias endógenas. En algunos aspectos de la divulgación, se utilizan secuencias con una identidad sustancialmente mayor, p. ej., se usan al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % de identidad. Al igual que con la regulación antisentido, el efecto puede diseñarse y probarse para que no afecte significativamente a la expresión de otras proteínas dentro de una familia similar de genes que muestren homología u homología sustancial.
Para la supresión con sentido, la secuencia introducida en el casete de expresión, que no necesita una identidad absoluta, tampoco es necesario que sea de longitud completa, respecto al producto de transcripción primario o el ARNm completamente procesado. Esto puede preferirse para evitar la producción simultánea de algunas plantas que son sobreexpresadoras. Una mayor identidad en una secuencia más corta que la de longitud completa compensa una secuencia más larga, menos idéntica. Además, la secuencia introducida no necesita tener el mismo patrón de intrones o exones, y la identidad de los segmentos no codificantes será igualmente efectiva. En algunos aspectos de la divulgación, se utiliza una secuencia de los intervalos de tamaño indicados anteriormente para la regulación antisentido, p. ej., al menos aproximadamente 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, o más nucleótidos.
La expresión génica también puede suprimirse mediante ARN de interferencia (ARNi) (y, de hecho, la cosupresión puede considerarse un tipo de ARNi), que utiliza un ARN de doble cadena que tiene una secuencia idéntica o similar a la secuencia del gen diana. El ARNi es el fenómeno en el que cuando un ARN de doble cadena que tiene una secuencia idéntica o similar a la del gen diana se introduce en una célula, se suprimen las expresiones tanto del gen exógeno insertado como del gen endógeno diana. El ARN de doble cadena se puede formar a partir de dos ARN complementarios separados o puede ser un solo ARN con secuencias internamente complementarias que forman un ARN de doble cadena. Aunque todavía se desconocen los detalles completos del mecanismo del ARNi, se considera que el ARN de doble cadena introducido se escinde inicialmente en pequeños fragmentos, que luego sirven como referencias del gen diana de alguna manera, degradando de este modo el gen diana. También se sabe que el ARNi es efectivo en las plantas (véase, p. ej., Chuang, CF & Meyerowitz, E. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 4985 (2000);
Waterhouse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959-13964 (1998); Tabara et al. Science 282: 430-431 (1998); Matthew, Comp Funct. Genom. 5: 240-244 (2004); Lu, et al., Nucleic Acids Research 32(21):e171 (2004)). Por ejemplo, para lograr la supresión de la expresión de DCL del patógeno usando ARNi, un fragmento de gen (p. ej., de un gen DCL) en una orientación de repetición invertida con un espaciador podría expresarse en plantas para generar ARN de doble cadena que tenga la secuencia de un ARNm que codifica la proteína DCL, o una secuencia sustancialmente similar del mismo (incluidos aquellos diseñados para no traducir la proteína) o fragmento de la misma, se introduce en una planta u otro organismo de interés. A continuación, las plantas/organismos resultantes pueden examinarse en busca de un fenotipo asociado con la proteína diana y/o mediante el control de los niveles de ARN en estado estacionario en busca de transcritos que codifiquen la proteína. Aunque los genes utilizados para el ARNi no necesitan ser completamente idénticos al gen diana, pueden ser al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más idénticos a la secuencia del gen objetivo. Véase, p. ej., en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2004/0029283 un ejemplo de una secuencia de ARNip no idéntica utilizada para suprimir la expresión génica. Las construcciones que codifican una molécula de ARN con una estructura de bucle-tallo que no está relacionada con el gen diana y que se coloca distalmente a una secuencia específica para el gen de interés también pueden usarse para inhibir la expresión del gen diana. Véase, p. ej., la publicación de patente de EE. UU. n.° 2003/0221211. También se describe el silenciamiento génico en plantas mediante la expresión de dúplex de ARN pequeño, p. ej., en Lu et al., Nucleic Acids Res. 32(21): e171 (2004).
Los polinucleótidos de ARNi pueden abarcar el ARN diana de longitud completa o pueden corresponder a un fragmento del Ar N diana. En algunos casos, el fragmento tendrá menos de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 nucleótidos correspondientes a la secuencia diana. Además, en algunos aspectos de la divulgación, estos fragmentos son al menos, p. ej., 10, 15, 20, 50, 100, 150, 200, o más nucleótidos de longitud. En algunos casos, los fragmentos para usar en el ARNi serán al menos sustancialmente similares a las regiones de una proteína diana que no se encuentran en otras proteínas en el organismo o pueden seleccionarse para que tengan la menor similitud posible con los transcritos de otros organismos, p. ej., seleccionados por comparación con secuencias en el análisis de bases de datos de secuencias disponibles públicamente.
Los vectores de expresión que expresan continuamente ARNip en células transfectadas de forma transitoria y estable se han diseñado para expresar ARN de horquilla pequeña, que se procesan in vivo en moléculas de ARNip capaces de llevar a cabo un silenciamiento específico de genes (Brummelkamp et al., Science 296:550-553 (2002) y Paddison, et al., Genes & Dev. 16: 948-958 (2002)). El silenciamiento génico postranscripcional mediante ARN de doble cadena se analiza con más detalle en Hammond et al., Nature Rev Gen 2: 110-119 (2001), Fire et al., Nature 391: 806-811 (1998) y Timmons y Fire, Nature 395: 854 (1998).
Otra forma más de suprimir la expresión de un gen en una planta es mediante la expresión recombinante de un microARN que suprime el gen diana. Los microARN artificiales son ARN monocatenarios (por ejemplo, entre 18 y 25 nucleótidos, generalmente 21 nucleótidos), que normalmente no se encuentran en las plantas y que se procesan a partir de precursores de miARN endógenos. Sus secuencias están diseñadas de acuerdo con los determinantes de la selección de dianas de miARN de plantas, de tal manera que el microARN artificial silencia específicamente su(s) gen(es) dianas(s) previsto(s) y generalmente se describen en Schwab et al., The Plant Cell 18: 1121-1133 (2006), así como los métodos basados en Internet para diseñar tales microARN como se describe en el presente documento. Véase también, la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2008/0313773.
Otra forma de suprimir la expresión de un gen en una planta es mediante la aplicación de un ARNdc a la superficie de una planta o parte de una planta (p. ej., sobre una hoja, flor, fruta u hortaliza), por ejemplo, rociando el ARNdc sobre la superficie o aplicando con brocha el ARNdc sobre la superficie. Se describen métodos para aplicar ARNdc en partes externas de la planta, por ejemplo, en el documento WO 2013/02560 y en Gan et al., Plant Cell Reports 29: 1261-1268 (2010).
En algunos aspectos de la divulgación, se pueden sintetizar secuencias antisentido como ARNdc o ARNpin planta y extraerse de la planta para su uso posterior en una planta diana. Como un ejemplo no limitante, las construcciones para producir una o más secuencias de interés de ARNdc o ARNp pueden introducirse transitoriamente en una planta (p. ej., N. benthamiana), mediante infiltración con Agrobacterium. Las secuencias de ARNdc o ARNp son producidas por la planta y a continuación se extrae el ARN de uno o más tejidos de la planta para extraer las secuencias de ARNdc o ARNp de interés. Un método ilustrativo de expresión y extracción de secuencias antisentido de N. benthamiana se describe en la sección Ejemplos a continuación.
III. Métodos para producir plantas que tengan una mayor resistencia a los patógenos
En otro aspecto de la divulgación, se proporcionan métodos para producir plantas que tengan mayor resistencia a los patógenos. En algunos aspectos de la divulgación, el método comprende:
introducir en una planta un casete de expresión heteróloga que comprende un promotor unido operativamente a un polinucleótido que inhibe la expresión fúngica de un gen DCL del patógeno; y
seleccionar una planta que comprenda el casete de expresión.
En algunos aspectos de la divulgación, el método comprende además introducir en la planta un segundo casete de expresión heteróloga que comprende un segundo promotor unido operativamente a un segundo polinucleótido que inhibe la expresión fúngica de un segundo gen DCL del patógeno; y seleccionar una planta que comprenda el segundo casete de expresión.
En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que inhibe la expresión fúngica del gen DCL del patógeno se describe en el presente documento (p. ej., en la Sección II anterior, p. ej., un polinucleótido antisentido, como un ARN en horquilla o un precursor de microARN). Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido inhibe la expresión de uno, dos, tres, cuatro o más genes DCL de Botrytis o Verticillium. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido inhibe la expresión de uno, dos, tres, cuatro o más de la SEQ ID NO: 1, s Eq ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31.
En algunas realizaciones, una planta en la que se ha introducido el o los casetes de expresión tiene una mayor resistencia a los patógenos respecto a una planta de control que carece de el o los casetes de expresión. En algunas realizaciones, una planta en la que se ha introducido el casete de expresión tiene una mayor resistencia a un patógeno fúngico (p. ej., Botrytis o Verticillium) con respecto a una planta de control que carece del casete de expresión.
En algunas realizaciones, el promotor es heterólogo respecto al polinucleótido. En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica la diana resistente a ARNp está unido operativamente a un promotor inducible. En algunas realizaciones, el promotor es inducible por patógenos (p. ej., un promotor inducible por Botrytis). En algunas realizaciones, el promotor es inducible por estrés (p. ej., un promotor inducible por estrés abiótico).
En algunos aspectos de la divulgación, el método comprende:
poner en contacto una pluralidad de plantas con una construcción que comprende un promotor unido operativamente a un polinucleótido que inhibe la expresión fúngica de un gen DCL del patógeno o una región LTR del patógeno, en donde la planta tiene mayor resistencia a un patógeno en comparación con una planta de control que no se ha puesto en contacto con la construcción.
En algunas realizaciones, el método comprende además seleccionar una planta que tenga una mayor resistencia a los patógenos.
En algunos aspectos de la divulgación, el método comprende:
poner en contacto una planta o una parte de una planta con un ARN de doble cadena, un dúplex de ARN pequeños, o un ARN pequeño (ARNp) que se dirigen a un gen DCL del patógeno o una región LTR del patógeno, en donde la planta o parte de la planta tiene mayor resistencia al patógeno en comparación con una planta de control que no se ha puesto en contacto con el ARN de doble cadena o el dúplex de ARN pequeños.
En algunos aspectos de la divulgación, el ARN de doble cadena o dúplex de ARN pequeños (p. ej., ARNip) o ARNp se dirige a DCL de Botrytis o DCL de Verticillium. En algunos aspectos de la divulgación, el a Rn de doble cadena o dúplex de ARN pequeños o ARNp se dirige a cualquiera de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 o un fragmento de la misma. En algunos aspectos de la divulgación, el ARN de doble cadena es un ARNip. En algunos aspectos de la divulgación, el ARNip comprende una secuencia que es idéntica a cualquiera de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, o un fragmento de la misma (por ejemplo, un fragmento de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más nucleótidos contiguos) o un complemento de la misma.
En algunos aspectos de la divulgación, el método comprende poner en contacto la planta o la parte de la planta con dos, tres, cuatro, cinco o más ARN de doble cadena o dúplex de ARN pequeños (p. ej., ARNip) o ARNp para dirigirse a dos, tres, cuatro, cinco o más genes DCL del patógeno o regiones LTR del patógeno de uno, dos, tres o más patógenos diferentes. Como un ejemplo no limitante, en algunos aspectos de la divulgación, la planta se pone en contacto con un ARN de doble cadena o dúplex de ARN pequeños (p. ej., ARNip) o ARNp que se dirigen a Botrytis DCL1 y un ARN de doble cadena o dúplex de ARN pequeños (p. ej., ARNip) o ARNp que se dirigen a Botrytis DCL2. Como otro ejemplo no limitante, en algunos aspectos de la divulgación, la planta se pone en contacto con un ARN de doble cadena o dúplex de ARN pequeños (p. ej., ARNip) o ARNp que se dirigen a Verticillium DCL1 y un ARN de doble cadena o dúplex de ARN pequeños (p. ej., ARNip) o ARNp que se dirigen a Verticillium DCL2. Como otro ejemplo no limitante más, en algunos aspectos de la divulgación, la planta se pone en contacto con un ARN de doble cadena o dúplex de ARN pequeños (p. ej., ARNip) o ARNp que se dirigen a uno o más DCL de Botrytis (p. ej., Botrytis DCL1 y/o Botrytis DCL2) y con un a Rn de doble cadena o dúplex de ARN pequeños (p. ej., ARNip) o ARNp que se dirigen a uno o más DCL de Verticillium (p. ej., Verticillium DCL1 y Verticillium DCL2).
En algunas realizaciones, el ARN de doble cadena o el dúplex de ARN pequeños (por ejemplo, ARNip) o ARNp se rocía o se aplica con brocha sobre la planta o parte de la planta (p. ej., sobre una hoja, un fruto, hortaliza o flor). En algunas realizaciones, el ARN de doble cadena o dúplex de ARN pequeños (p. ej., ARNip) o ARNp se pone en contacto con (p. ej., se rocía o se aplica con brocha sobre) una parte de una planta que se ha extraído de la planta. Como un
ejemplo no limitante, el ARN de doble cadena o dúplex de ARN pequeños (p. ej., ARNip) o ARNp se puede poner en contacto con p. ej., se rocía o se aplica con brocha sobre) una fruta, hortaliza o flor que ya ha sido cortada de una planta. En algunas realizaciones, el ARN de doble cadena o dúplex de ARN pequeños (p. ej., ARNip) o ARNp se pone en contacto con (p. ej., se rocía o se aplica con brocha sobre) una parte de una planta (p. ej., un fruto, hortaliza o flor) mientras la parte aún está unida a la planta.
IV. Polinucleótidos y vectores de expresión recombinantes
El aislamiento de los polinucleótidos de la divulgación puede lograrse mediante varias técnicas. Por ejemplo, las sondas de oligonucleótidos basadas en las secuencias descritas aquí se pueden usar para identificar el polinucleótido deseado en una biblioteca de ADNc o ADN genómico de una especie de planta deseada. Para construir bibliotecas genómicas, se generan grandes segmentos de ADN genómico por fragmentación aleatoria, p. ej., usando endonucleasas de restricción, y se ligan con el ADN del vector para formar concatémeros que se pueden empaquetar en el vector apropiado. Como alternativa, pueden construirse bibliotecas de ADNc de plantas o partes de plantas (p. ej., flores).
La biblioteca de ADNc o genómica se puede rastrear a continuación usando una sonda basada en una secuencia descrita aquí. Las sondas pueden usar para hibridarse con secuencias de ADN o ADNc genómicas para aislar genes homólogos en la misma o en diferentes especies de planta. Como alternativa, los anticuerpos generados contra un polipéptido se pueden usar para seleccionar una biblioteca de expresión de ARNm.
Como alternativa, los ácidos nucleicos de interés también pueden amplificarse de muestras de ácido nucleico usando técnicas de amplificación. Por ejemplo, la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias de los genes directamente del ARNm, del ADNc, del ADN genómico, de bibliotecas genómicas o bibliotecas de ADNc. La PCR y otros métodos de amplificación in vitro también ser útiles, por ejemplo, para clonar secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que se van a expresar, para hacer que los ácidos nucleicos sean usados como sondas para la detección de la presencia del ARNm deseado en muestras, para secuenciación de ácido nucleico, o para otros fines. Para obtener una descripción general de la PCR, véase PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. (Innis, M, Gelfand, D., Sninsky, J. and White, T., eds.), Academic Press, San Diego (1990).
Los polinucleótidos también se pueden sintetizar mediante técnicas bien conocidas, como se describe en la bibliografía técnica. Véase, p. ej., Carruthers et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418 (1982) y Adams et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 661 (1983). A continuación, se pueden obtener fragmentos de ADN de doble cadena sintetizando la cadena complementaria e hibridando las cadenas en condiciones apropiadas, o agregando la cadena complementaria usando ADN polimerasa con una secuencia de cebador apropiada.
Una vez que se obtiene una secuencia de polinucleótidos que inhibe la expresión de un gen de tipo Dicer (DCL) o una región LTR fúngico, o que es complementaria a un gen DCL o una región LTR de un patógeno fúngico o un fragmento del mismo, se puede usar para preparar un casete de expresión para la expresión en una planta. En algunas realizaciones, la expresión del polinucleótido está dirigida por un promotor heterólogo.
Puede usarse cualquiera de varios medios bien conocidos en la técnica para dirigir la expresión de la secuencia de polinucleótidos de interés en las plantas. Cualquier órgano puede ser la diana, tales como órganos/estructuras vegetativos de brote (p. ej., hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos/estructuras florales (p. ej., brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos), semilla (incluido el embrión, endospermo y cubierta de la semilla) y fruto. Como alternativa, la expresión puede condicionarse para que solo ocurra en ciertas condiciones (p. ej., utilizando un promotor inducible).
Por ejemplo, se puede emplear un fragmento de promotor vegetal para dirigir la expresión de la secuencia de polinucleótidos de interés en todos los tejidos de una planta regenerada. Dichos promotores se denominan en el presente documento promotores "constitutivos" y son activos en la mayoría de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen la región de inicio de la transcripción 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor 1' o 2' derivado del ADN-T de Agrobacterium tumefaciens y otras regiones de iniciación de la transcripción de varios genes vegetales conocidos por los expertos.
Como alternativa, el promotor de la planta puede dirigir la expresión de la secuencia de polinucleótidos de interés en un tejido específico (promotores específicos de tejido) o puede estar bajo un control ambiental más preciso (promotores inducibles). Los ejemplos de promotores específicos de tejido bajo control del desarrollo incluyen promotores que inician la transcripción solo en ciertos tejidos, como hojas o células de guarda (incluyendo pero sin limitarse a los descritos en el documento WO/2005/085449; Patente U.S. n.° 6.653.535; Li et al., Sci China C Life Sci. 2005 Apr; 48(2): 181-6; Husebye, et al., Plant Physiol, abril de 2002, Vol. 128, págs. 1180-1188; y Plesch, et al., Gene, Volumen 249, Número 1, 16 de mayo de 2000, págs. 83-89 (7)). Ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar a la transcripción por parte de promotores inducibles incluyen la presencia de un patógeno, condiciones anaerobias, temperatura elevada, o la presencia de luz.
En algunas realizaciones, el promotor es un promotor constitutivo. En algunas realizaciones, el promotor es un
promotor inducible. En algunas realizaciones, el promotor es inducible por estrés (p. ej., inducible por estrés abiótico). En algunas realizaciones, el promotor es inducible por patógenos. En algunas realizaciones, el promotor es inducido tras la infección por Botrytis. Los ejemplos no limitativos de promotores inducibles por patógenos incluyen la cinasa 1 inducida por Botrytis (BIK1) y el gen de defensa de plantas PDF1.2. Véase, p. ej., Penninckx et al., Plant Cell 10: 2103 2113 (1998); véase también Veronese et al., Plant Cell 18: 257-273 (2006).
En algunas realizaciones, se puede incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de la región codificante. La región de poliadenilación se puede derivar de un gen NH3, de una variedad de otros genes de plantas, o de ADN-T.
El vector que comprende las secuencias normalmente comprenderá un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable en células vegetales. Por ejemplo, el marcador puede codificar resistencia a biocidas, particularmente resistencia a los antibióticos, como la resistencia a kanamicina, G418, bleomicina, higromicina, o resistencia a herbicidas, como la resistencia a clorsulfurón o Basta.
V. Producción de plantas transgénicas
Tal como se detalla en el presente documento, los aspectos de la presente divulgación proporcionan plantas transgénicas que comprenden casetes de expresión recombinantes para expresar una secuencia de polinucleótidos como se describe en el presente documento (p. ej. un polinucleótido que inhibe la expresión de un gen de tipo Dicer (DCL) del patógeno fúngico o un polinucleótido que inhibe la expresión de una región LTR del patógeno fúngico, como un polinucleótido que expresa un ARN en horquilla o un precursor de microARN). En algunos aspectos de la divulgación, se genera una planta transgénica que contiene una secuencia completa o parcial de un polinucleótido que se deriva de una especie distinta de la especie de la planta transgénica. Debe reconocerse que las plantas transgénicas abarcan la planta o célula vegetal en la que se introduce el casete de expresión, así como la progenie de dichas plantas o células vegetales que contienen el casete de expresión, incluyendo la progenie que tiene el casete de expresión integrado de manera estable en un cromosoma.
En algunos aspectos de la divulgación, las plantas transgénicas que comprenden casetes de expresión recombinante para expresar una secuencia de polinucleótidos como se describe en el presente documento tienen una resistencia a patógenos aumentada o mejorada en comparación con una planta que carece del casete de expresión recombinante, en donde las plantas transgénicas que comprenden casetes de expresión recombinante para expresar la secuencia de polinucleótidos tienen aproximadamente el mismo crecimiento que una planta que carece del casete de expresión recombinante. Se describen métodos para determinar el aumento de la resistencia a patógenos, p. ej., en la Sección VI a continuación.
Un vector de expresión recombinante como se describe en el presente documento puede introducirse en el genoma de la planta hospedadora deseada mediante una variedad de técnicas convencionales. Por ejemplo, la construcción de a Dn puede introducirse directamente en el ADN genómico de la célula vegetal utilizando técnicas como la electroporación y la microinyección de protoplastos de células vegetales, o la construcción de ADN puede introducirse directamente en el tejido vegetal utilizando métodos balísticos, como el bombardeo de partículas de ADN. Como alternativa, las construcciones de ADN pueden combinarse con regiones flanqueantes de ADN-T adecuadas e introducirse en un vector del hospedador Agrobacterium tumefaciens convencional. Las funciones de virulencia del hospedador Agrobacterium tumefaciens dirigirá la inserción de la construcción y el marcador adyacente en el ADN de la célula vegetal cuando la célula se infecte por la bacteria. Si bien la invención abarca la expresión transitoria de la secuencia de polinucleótidos de interés, en general, la expresión de la construcción de la invención será a partir de la inserción de casetes de expresión en el genoma de la planta, p. ej., de modo que al menos algunos de los descendientes de la planta también contengan el casete de expresión integrado.
Las técnicas de microinyección también son útiles para este propósito. Estas técnicas son bien conocidas en la técnica y se describen detalladamente en la bibliografía. La introducción de construcciones de ADN mediante precipitación con polietilenglicol se describe en Paszkowski et al. EMBO J. 3:2717-2722 (1984). Las técnicas de electroporación se describen en Fromm et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824 (1985). Las técnicas de transformación balística se describen en Klein et al. Nature 327: 70-73 (1987).
Las técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluyendo el desarmado y el uso de vectores binarios, están bien descritas en la bibliografía científica. Véase, por ejemplo, Horsch et al. Science 233: 496 498 (1984), and Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803 (1983).
Las células vegetales transformadas derivadas mediante cualquiera de las técnicas de transformación anteriores pueden cultivarse para regenerar una planta completa que posea el genotipo transformado y, por lo tanto, el fenotipo deseado, como una mayor resistencia a patógenos. Tales técnicas de regeneración se basan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejidos, que se basan normalmente en un marcador de biocida y/o herbicida que se ha introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, págs. 124-176, MacMillilan Publishing Company, Nueva York, 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, págs. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. La regeneración también se puede obtener a
partir de callos, explantes, órganos de la planta o partes de la misma. Tales técnicas de regeneración se describen generalmente en Klee et al. Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486 (1987).
VI. Selección de plantas con mayor resistencia a patógenos
Los casetes de expresión y las construcciones antisentido (p. ej., ARN de doble cadena o dúplex de ARN pequeños, p. ej., ARNip) de la divulgación se pueden usar para conferir resistencia a patógenos aumentada o potenciada esencialmente a cualquier planta o parte de una planta. Por lo tanto, la invención tiene uso en una amplia gama de plantas, incluyendo pero sin limitarse a especies de los géneros Allium, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucumis, Cucúrbita, Daucus, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Oryza, Panieum, Pannesetum, Persea, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Rosa, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Trigonella, Triticum, Vitis, Vigna y Zea. En algunas realizaciones, la planta es una planta de guía, p. ej., una especie del género Vitis. En algunas realizaciones, la planta es una planta ornamental, p. ej., una especie del género Rosa. En algunas realizaciones, la planta es una planta productora de hortalizas o frutas, p. ej., una planta de tomate o una planta de fresa. En algunas realizaciones, la planta es una monocotiledónea. En algunas realizaciones, la planta es una dicotiledónea.
Las plantas (o partes de plantas) con mayor resistencia a patógenos pueden seleccionarse de muchas maneras. Un experto en la materia reconocerá que los siguientes métodos son solo algunas de las posibilidades. Un método para seleccionar plantas o partes de plantas (p. ej., frutos, hortalizas, hojas y flores) con mayor resistencia a patógenos es determinar la resistencia de una planta a un patógeno vegetal específico. Los posibles patógenos incluyen, pero no se limitan a, virus, bacterias, nematodos, hongos o insectos (véase, p. ej., Agrios, Plant Pathology (Academic Press, San Diego, CA) (1988)). Un experto en la técnica reconocerá que las respuestas de resistencia de las plantas varían dependiendo de muchos factores, incluyendo qué patógeno, compuesto o planta se utiliza. En general, el aumento de la resistencia se mide por la reducción o eliminación de los síntomas de la enfermedad (p. ej., reducción del número o tamaño de las lesiones o reducción de la cantidad de biomasa fúngica en la planta o en una parte de la planta) en comparación con una planta de control. En algunas realizaciones, la resistencia aumenta cuando el número o el tamaño de las lesiones o la cantidad de biomasa fúngica en la planta o en una parte de la planta disminuye en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más respecto a un control (p. ej., respecto a una planta en la que no se ha expresado un polinucleótido heterólogo dirigido a DCL o LTR de un patógeno fúngico).
En algunos casos, el aumento de la resistencia también se puede medir por la producción de la respuesta de hipersensibilidad (RH) de la planta (véase, p. ej., Staskawicz et al. (1995) Science 268(5211): 661-7). Las plantas con mayor resistencia a los patógenos pueden producir una respuesta de hipersensibilidad mejorada respecto a las plantas de control.
La resistencia incrementada a patógenos también puede determinarse midiendo la expresión incrementada de un gen unido operativamente a un promotor relacionado con la defensa. La medición de dicha expresión se puede medir cuantificando la acumulación de ARN o el producto proteico posterior (p. ej., usando técnicas de transferencias Northern o Western, respectivamente (véase, p. ej., Sambrook et al. y Ausubel et al.).
VII. Ejemplos
Ejemplo 1: Direccionamiento a los genes DCL para atenuar la virulencia fúngica
Los ARN pequeños (ARNp) eucariotas son ARN no codificantes reguladores cortos que inducen el silenciamiento de genes diana a niveles transcripcionales y postranscripcionales. La endoribonucleasa Dicer o proteínas de tipo Dicer (DCL) procesan ARN de doble cadena (ARNdc) o ARN con estructuras de horquilla, dando lugar a la mayoría de los ARNp de 20-30 nt de longitud, que se cargan en proteínas Argonauta (AGO) para inducir el silenciamiento génico de sus dianas complementarias al guiar la escisión o degradación del ARNm, inhibición de la traducción, metilación del ADN y modificación de histonas. El papel de los ARNp en las interacciones planta-patógeno, incluido el papel de los ARNp no codificantes de patógenos de plantas bacterianos y eucariotas en la patogenicidad, se describe en Weiberg et al., Annu. Rev. Phytopathol. 2014, 52: 22,1-22,22.
efectores de ARNp, como los que se encuentran en B. cinerea, se transcriben a partir de elementos transponibles (ET) y suprimen los genes relacionados con la inmunidad del hospedador. Los genes de resistencia de la planta hospedadora a menudo se agrupan en loci genómicos con gran cantidad de ET. De modo similar, los genes efectores de proteínas a menudo se encuentran en grupos y se intercalan con ET. Véase, p. ej., Weiberg en la figura 2.
Debido a que la mayoría de los efectores de ARN pequeño de Botrytis se generan a partir de regiones LTR, existen múltiples copias para cada LTR, lo que hace que las inactivaciones de Bc-ARNp sean poco prácticas, si no imposibles. Por consiguiente, para resolver este problema, se generaron mutantes con inactivación de DCL de Botrytis.
Como se muestra en la figura 1, el genoma de B. cinerea tiene dos DCL (dcl-1 y dcl-2). Se generaron cepas de mutante simple y doble mutante (dcl1, dcl2, y dcl1 dcl2). Como se muestra en la figura 2, todas las cepas mutantes de B.
cinerea dcll, dcl2, y dcll dcl2 mostraron retraso en el crecimiento y retraso en el desarrollo de conidiosporas (Fig. 2A), pero solo la cepa doble mutante (dcll dcl2) no pudo producir efectores Bc-ARNp (Fig. 2B).
Los DCL de B. cinerea son esenciales para la patogenicidad de B. cinerea. Como se muestra en la figura 3, los dobles mutantes dcll dcl2, pero no los mutantes simples dcll o dcl2, produjeron síntomas de enfermedad mucho más débiles que el tipo silvestre tanto en Arabidopsis como en S. lycopersicum y atenuaron en gran medida la virulencia de B. cinerea. De modo similar, la Figura 4 muestra que los mutantes dobles B. cinerea dcl1 dcl 2 son mucho menos virulentos en la fruta, hortalizas y flores.
Un análisis de ARNp comparativo de todo el genoma en una cepa mutante dcl1 dcl2 y de tipo silvestre reveló que los DCL de Botrytis son responsables de generar ARNp derivados de LTR, muchos de los cuales son ARNp efectores. Véase, Fig. 5A-B, Fig. 6 y Fig. 7A-D.
B. cinerea libera ARN pequeños en las células hospedadoras (p. ej., células vegetales) para suprimir el sistema inmunitario del hospedador. Véase, p. ej., Weiberg en la figura 2. Otro patógeno vegetal fúngico, Verticillium dahliae, también depende de la función AGO1 para su patogenicidad. Véase, p. ej., Ellendorf et al., J. ExpBot 2009; 60: 591 602. Esto sugiere que es probable que Verticillium tenga un mecanismo de virulencia de ARNi similar al de B. cinerea. Dado que Verticillium infecta las plantas a través de las raíces, utilizamos el cultivo de raíces para obtener más material para la inmunoprecipitación del ARN pequeño asociado con AGO1 de Arabidopsis. Los ARNp que están asociados con AGO1 de Arabidopsis se extrajeron y se sometieron a una secuenciación profunda. Descubrimos que después de la infección se observaba una gran cantidad de ARN pequeños de Verticillium. Descubrimos que 41 Vd-ARNp tenían como diana A. thaliana (At) (utilizando 100 rpm y un enriquecimiento de 10 veces como punto de corte). La Tabla 1 a continuación muestra ejemplos del aumento de ARN pequeños de Verticillium tras la infección que tienen posibles hospedadores diana.
Estos resultados sugieren que las construcciones de ARNi, que se dirigen a genes de proteínas de tipo Dicer fúngicas para atenuar la virulencia fúngica, pueden expresarse en plantas hospederas (incluyendo, pero sin limitarse a, tomate, uva y otros cultivos comercialmente importantes). Como alternativa, las construcciones de ARNi se pueden poner en contacto con la planta, como rociando sobre una superficie de la planta (p. ej., sobre la superficie de una hoja) para promover la resistencia a los hongos. Como se muestra en la figura 9, el silenciamiento génico inducido por el hospedador (HIGS) contra B. cinerea dcl1 dcl2 (inoculación por goteo) aumentó la tolerancia de la planta contra B. cinerea. Asimismo, como se muestra en la figura 10, el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) contra B. cinerea dcl1dcl2 (inoculación por rociado) aumentó la tolerancia de las plantas contra B. cinerea.
Ejemplo 2: Aumento de la resistencia o tolerancia fúngica en frutas y hortalizas mediante el silenciamiento in vitro de DCL de patógenos fúngicos
Se observó una mayor resistencia a los hongos cuando las frutas, las hojas y las hortalizas se trataron con ARNp dirigidos a los genes DCL del patógeno fúngico. El siguiente protocolo se usó para el tratamiento de frutas, hojas u hortalizas con ARN extraídos de N. benthamiana que expresan ARNp dirigidos a Bc-DCL.
Protocolo
1. Construcción de plásmidos. El fragmento de ARNi B. cinerea DCL1 (BcDCL1) se amplificó usando ADNc de B. cinerea como molde, cebador directo primer BcDCL1RNAi-F: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGCGGAAGAACTTGAAGGTTTGCTACA-3' y cebador inverso BcDCL1RNAi-R: 5-GTCCAGATCTGGTCAACACACCAAG-3', 252pb. El fragmento de ARNi BcDCL2 fue amplificado con el cebador directo BcDCL2RNAi-F: 5'-CTTGGTGTGTTGACCAGATCTGGACGGATGCCATTTGCTGCACGC-3' y cebador inverso BcDCL2RNAi-R: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACTCTTGAGTACTTTCGC CAGCTCAC-3', 238pb. Estos dos fragmentos de ARNi se integraron juntos mediante PCR de superposición como BcDCL-ARNi, que fue clonado en pDONR207 por reacciones BP (Life Technologies), y finalmente al vector de destino pHELLSGATE 8.0 por reacciones LR (Life Technologies) como pHELLSGATE-BcDCL-ARNi. Este vector, así como un vector vacío pHELLSGATE 8.0 de control negativo, se transformaron en A. tumefaciens cepa GV3101.
2. Generación de ARNp dirigidos a DCL en N. benthamiana. La cepa GV3101 de A. tumefaciens portadora de pHELLSGATE-BcDCL-ARNi (cepa ARNi) y el vector vacío pHELLSGATE 8.0 (cepa EV) se cultivaron en LB líquido con antibióticos (100 μg/μl de espectinomicina, 50 μg/μl de gentamicina y 50 μg/μl de rifampicina) durante la noche en un agitador a 28 °C. Los cultivos EV y ARNi de A. tumefaciens se centrifugaron a 4000 rpm durante 15 min a temperatura ambiente y los sedimentos bacterianos se resuspendieron con 5 ml de tampón de infiltración (MgCl2 10 mM, MES 10 mM y acetosiringona 0,2 mM). La DO600 de las soluciones de las cepas EV y ARNi se ajustó a 1,0 y se mantuvo a temperatura ambiente durante 4 horas. Ambas soluciones se diluyeron a DO600 = 0,5 mediante tampón de infiltración justo antes de la infiltración. A continuación, las soluciones de las cepas EV y ARNi se usaron para infiltrar las hojas de 4 semanas de N. benthamiana y se permitió que durante 2 días de la infección sobreexpresara los ARNp dirigidos a DCL en tejidos tratados con la cepa ARNi.
3. Extracción de los ARNp de N. benthamiana. Los tejidos de las hojas de N. benthamiana infiltradas se recolectaron por separado según la cepa (EV o ARNi) infiltrada y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Se molieron 10 g de cada tejido hasta obtener un polvo fino en nitrógeno líquido con morteros y almirezes y se extrajeron los ARN totales usando el reactivo TRIzol (Life Technologies). Se resolvieron los gránulos de ARN en 500 μl de DEPC tratado con H2O, y la concentración de ARN total de EV y ARNi se examinó en un NanoDrop. La concentración final de estas dos muestras de ARN se ajustó a 50 ng/μl para su uso posterior. Los ARNp dirigidos a Bc-DCL solo estaban presentes en el grupo ARNi, pero no en el grupo EV, que se usó como control negativo.
4. Tratamiento de las hortalizas o frutas con los extractos de ARN. Dos conjuntos de hortalizas o frutas en condiciones similares, (p. ej., frescura, madurez, tamaño, forma similares, etc.) se lavaron suavemente y se colocaron en una caja de plástico con un papel de filtro humedecido en el fondo para mantener la humedad. El primer conjunto se trató uniformemente con extractos de ARN de tejidos infiltrados con cepa EV, el otro conjunto se trató uniformemente con extractos de ARN de tejidos infiltrados con cepa ARNi. Los extractos de ARN se aplicaron por rociado o por inoculación por goteo.
5. Infección por B. cinerea . La infección por B. cinerea se llevó a cabo después del rociado de extractos de ARN. Las esporas de B. cinerea de 10 días cultivadas en medio de agar de extracto de malta se eluyeron en H2O estéril y los micelios fúngicos se filtraron de las esporas con tela de nailon. La concentración de esporas de B. cinerea se calculó mediante un hemocitómetro y se diluyó en medio B5 (sacarosa 10 mM, KH2PO410 mM, Tween-20 0,025 %). Se rociaron 15 μl de solución de esporas de Botrytis (2 X 10‘5) sobre la superficie de las frutas o vegetales rociadas, y se dejó 2-4 días de inoculación con B. cinerea. Diferentes hortalizas o frutas tardaron un tiempo diferente en presentar síntomas evidentes de la enfermedad.
Como alternativa, se usó un método de "mezcla" para administrar una mezcla 1:1 de ARN total como se describió anteriormente y solución de esporas de Botrytis (4 x 10‘5). Se dejaron gotear 15 ul de la solución mezclada directamente sobre la superficie de 2 conjuntos de frutas u hortalizas en condiciones similares.
Resultados
Como se muestra en la figura 11, el tomate fue más resistente contra B. cinerea cuando se rociaba con ARN que contiene siRBcDCL. Asimismo, las figuras 12-14 muestran que B. cinerea era menos virulento cuando se mezclaba con ARN total de N. benthamiana que contenía siRBcDCL y se aplicaba a tomate (Figura 12), fresa (Figura 13) o pepino (Figura 14).
En otro experimento, el pretratamiento de hojas y frutos de tomate, frutos de fresa y frutos de uva con el ARN total de N. benthamiana infiltrado con pHELLSGATE-BcDCLs y pHELLSGATE-EV por rociado durante 24 horas, seguido por inoculación por goteo de B. cinerea en el área rociada de las frutas, redujo los síntomas de la enfermedad del moho gris causados por B. cinerea. Véase, Figura 15A-B.
En otro experimento más, el rociado de hojas y frutos de tomate con ARNdc transcrito in vitro contra BcDCLs redujo la enfermedad del moho gris causada por B. cinerea en tomate y fresa. Se pretrataron hojas y frutos de tomate y frutos de fresa con agua o ARNdc largo transcrito in vitro contra BcDCLs durante 24 horas, seguido por inoculación por goteo de B. cinerea directamente en el área pretratada de las hojas o frutos. Véase, Figura 16.
Ejemplo 3: Aumento de la tolerancia de las plantas a múltiples patógenos
Se utilizó el silenciamiento génico inducido por el hospedador (HIGS) para silenciar los genes de la proteína de tipo Dicer (DCL) de dos patógenos fúngicos en las plantas. Se utilizó un enfoque de ARNi para dirigirse a dos DCL de Botrytis y dos DCL de Verticillium en Arabidopsis, dando como resultado la generación de líneas "HIGS-4DCL". Las líneas HIGS-4DCL, así como plantas de Arabidopsis de tipo silvestre, fueron infectadas con B. cinerea por inoculación por goteo en las hojas y se infectaron con V. dahilae por inoculación de raíces. Tres semanas después de la infección, las líneas HIGS-4DCL mostraron una mayor tolerancia a ambos patógenos respecto a las plantas de tipo silvestre. Véase, Figura 17. Por lo tanto, los enfoques de direccionamiento de genes descritos en el presente documento pueden utilizarse para dirigirse a múltiples patógenos al mismo tiempo.
Ejemplo 4: Protección de plantas mediada por ARN pequeño dirigido a Dicer contra Botrytis cinerea y otros patógenos que utilizan efectores de ARN pequeño
Los patógenos eucariotas, como hongos y oomicetos, causan miles de millones de dólares en pérdidas de cultivos en todo el mundo anualmente. B. cinerea representa una seria amenaza para más de 200 especies de plantas, incluyendo casi todas las hortalizas y frutas, así como muchas flores, en sus etapas previas y posteriores a la cosecha al causar la enfermedad del moho gris. Williamson et al., Mol Plant Pathol 8, 561-580 (2007); van Kan, Trends in Plant Science 11: 247-253 (2006)). El control actual de la enfermedad se logra principalmente mediante la aplicación de fungicidas, lo que es costoso y peligroso para el medioambiente. HIGS es una solución eficaz contra una variedad de patógenos fúngicos y oomicetos, como Blumeria graminis (Nowara et al., Plant Cell 22, 3130-3141 (2010); Pliego et al., Molecular Plant Microbe Interactions 26, 633-642 (2013); Whigham et al., Molecular Plant Microbe Interactions 28, 968-983 (2015)), Puccinia tritici (Panwar et al, Plant Molecular Biology 81, 595-608 (2013)), Fusarium spp. (Koch et al., PNAS 110, 19324-19329 (2013); Ghag et al., Plant Biotechnology Journal 12: 541-553 (2014); Cheng et al., Plant Biotechnology Journal, doi: 10.1111/pbi. 12352 (2015)), Phytophthora infestans (Jahan et al., Journal of Experimental Botany 66: 2785-2794 (2015); Sanju et al., Functional & Integrative Genomics 15: 697-706 (2015), and Phytophthora capsici (Vega-Arreguin et al., Molecular Plant Microbe Interactions 27, 770-780 (2014). Sin embargo, el éxito de HIGS depende en gran medida de la tecnología de transformación de plantas que no está disponible para muchos cultivos y, además, la seguridad de los organismos genéticamente modificados (OGM) sigue siendo una gran preocupación para el público.
Resultados
Como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, solo el doble mutante dcl1 dcl2 de B. cinerea, pero no los mutantes simples dcl1 o dcl2, no logró producir efectores Bc-ARNp, lo que sugiere que estos efectores Bc-ARNp dependen de ambos Bc-DCL1 y Bc-DCL2. Para evaluar completamente la contribución de los efectores Bc-ARNp dependientes de Bc-DCL a la patogenicidad de B. cinerea en una amplia gama de cultivos económicamente importantes, varias frutas (tomate-Solanum lycopersicum 'Roma', fresa-Fragaria x ananasa y uva-Vitis labrusa 'Concord'), hortalizas (lechuga iceberg-Lactuca sativa y cebolla-Allium cepa L.) y pétalos de flores (rosa-Rosa hybrida L.) fueron inoculados con el doble mutante dcl1 dcl2. Se usaron como controles el mutante simple dcl2 y las cepas de tipo silvestre (WT). El doble mutante dcl1 dcl2 mostró una patogenicidad mucho más débil y produjo lesiones significativamente más pequeñas que la cepa WT en todas las muestras (Fig. 18A-B, P < 0.01), mientras que el mutante simple dcl2 generó lesiones más pequeñas que la cepa WT en tomate, pero creó lesiones comparables a la cepa WT en fresa, uva, lechuga, cebolla y pétalo de rosa (Fig. 18A-B). Estos resultados indican que los efectores de ARNp juegan un papel decisivo en la patogenicidad de B. cinerea, porque aunque la cepa dcl2 mostró una clara reducción del crecimiento fúngico, aún era capaz de producir efectores Bc-ARNp y causar síntomas obvios de la enfermedad.
Para evaluar la población de Bc-ARNp dependiente de DCL1 y DCL2 a nivel mundial, perfilamos los ARNp totales aislados del doble mutante dcl1 dcl2, así como de la cepa WT. En la cepa WT, los Bc-ARNp oscilaban entre 20 y 35 nucleótidos (nt) de longitud (datos no mostrados), con una mayor concentración de especies de 24-27 nt. La abundancia de especies de ARNp de 20-27 nt se redujo claramente pero no se eliminó por completo en el doble mutante dcl1 dcl2 (datos no mostrados), lo que apunta a la existencia de vías de biogénesis de ARNp independientes de DCL en B. cinerea, como se describió en Neurospora crasa (Sotavento et al., Molecular Cell 38: 803-814 (2010); Jin et al., Molecular Cell 38: 775-777 (2010)). Lo más sorprendente, los ARNp derivados de los retrotransposones (que van de 20 a 26 nt y alcanzan un máximo de 21 a 22 nt) se eliminaron casi por completo en el doble mutante dcl1 dcl2 (datos no mostrados), lo que indica que Bc-DCL1/2 son los principales responsables de generar ARNp a partir de
retrotransposones. Los ARNp de las regiones intergénicas no codificantes (IGN) (principalmente los ARNp de 21, 22 y 24 nt) y antisentido para marcos de lectura abiertos (ORF-antisentido, principalmente los ARNp de 21-22 nt) también se redujeron en gran medida en dell dcl2, aunque los ARNp de los transcritos con sentido de ORF (ORF con sentido) no cambiaron significativamente. Como se ha descrito anteriormente (Weiberg et al.) y como se ha descrito en el Ejemplo 1, la mayoría de los efectores de ARNp predichos provienen de retrotransposones de tipo repeticiones terminales largas (LTR); por lo tanto, Bc-DCL1/2 son en gran parte responsables de generar efectores de ARNp y contribuyen significativamente a la patogenicidad de B. cinerea. Esto convierte a Bc-DCL1/2 en dianas ideales para probar si el silenciamiento mediado por ARNp sería una estrategia eficiente para controlar la enfermedad del moho gris.
Para probar si los ARNp generados por el hospedador pueden pasar de las células vegetales a B. cinerea y si el silenciamiento de Bc-DCL1/2 suprimiría eficientemente los síntomas de la enfermedad de B. cinerea en las plantas, generamos plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan ARNp que se dirigen a ambos Bc-DCL. Un fragmento de ADN que contiene 252 pares de bases (pb) y segmentos de 238 pb de las regiones no conservadas de Bc-DCL1 y Bc-DCL2, respectivamente, fue clonado en el sistema de vector pHELLSGATE (Helliwell et al., Methods in Enzymology 392: 24-35 (2005)). Se utilizaron dos segmentos de ADN, uno de cada uno de Bc-DCL1 y Bc-DCL2, porque no hay una región de ADN fuera de los dominios conservados con suficiente homología entre los dos DCL para silenciar ambos DCL. Se evitaron las regiones de ADN en los dominios funcionales conservados para eliminar cualquier efecto fuera de la diana en los genes DCL de otras especies. Estas regiones de ADN Bc-DCL seleccionadas tienen solo del 3,5 % al 4,8 % de identidad de secuencia con los DCL de Arabidopsis DCL y, de hecho, no se silenció ningún gen DCL del hospedador (datos no mostrados). Los productos de ARN en horquilla transcritos a partir de la construcción pHELLSGATE en las plantas transgénicas fueron procesados en ARNp por DCL de plantas para dirigirse a Bc-DCL1 y Bc-DCL2 (Figura 19A). Estas plantas mostraron lesiones mucho más pequeñas y menos crecimiento fúngico después de la infección con B. cinerea en comparación con las plantas WT (Fig. 19B-C). La expresión relativa de Bc-DCL1 y Bc-DCL2 fue claramente reprimida en B. cinerea recogida de las plantas transgénicas en comparación con los de las plantas WT (Fig. 19D). Estos resultados sugieren que los ARNp dirigidos a Bc-DCL1/2 (Bc-DCL1/2-ARNp) producidos en células vegetales se trasladaron a las células fúngicas y silenciaron de manera eficiente Bc-DCL1 y Bc-DCL2, lo que condujo a la supresión de la virulencia y el crecimiento fúngico y a la inhibición de la enfermedad.
Para determinar si esta estrategia de ARNi dirigida a Bc-DCL1/2 también podría controlar de manera eficiente la enfermedad del moho gris en las plantas de tomate, introdujimos el mismo fragmento Bc-DCL1/2 en el sistema de silenciamiento del virus del cascabel del tabaco (TRV) (Liu et al., Plant Journal 31: 777-786 (2002), lo que desencadenó la expresión de Bc-DCL1/2-ARNp en tomate. Tres semanas después de la agroinfiltración, las plantas de tomate se infectaron con B. cinerea usando inoculación por rociado. Las hojas de tomate que expresan Bc-DCL1/2-ARNp mostraron síntomas de enfermedad muy leves o casi nulos 3 dpi (Fig. 19E-G), mientras que las hojas de control, que expresaban ARNp dirigidos a un gen de resistencia al tizón tardío de la patata RB que no está presente en el tomate (Song et al., PNAS 100: 9128-9133 (2003), mostraban lesiones de enfermedad empapadas de agua muy graves (Fig. 19F-G). El crecimiento de B. cinerea también se redujo significativamente en las hojas que expresan BC-DCL1/2-ARNp en comparación con el control, y la expresión de Bc-DCL1 y Bc-DCL2 se redujo considerablemente en B. cinerea cultivado en estas hojas también (Fig. 19H). Estos datos respaldan aún más que los ARNp pueden pasar de las células vegetales a las células fúngicas, y pueden silenciar de manera eficiente los genes DCL fúngicos y suprimir la virulencia del patógeno.
B. cinerea también infecta a muchas otras especies de plantas, además de Arabidopsis y tomate. La enfermedad del moho gris es un problema muy serio en el manejo poscosecha, ya que destruye millones de frutas, hortalizas y flores durante los procesos de envasado, transporte y almacenamiento cada año. Desafortunadamente, la transformación estable y las tecnologías de silenciamiento de genes inducido por virus no se han desarrollado en muchas especies de hospedador. La captación de ARN del entorno, un fenómeno llamado ARNi ambiental, fue observado en C. elegans y otros insectos. Véase, p. ej., Winston et al., PNAS 104:10565-10570 (2007); Ivashuta et al., RNA 21:840-850 (2015). El rociado de ARNdc dirigidos al gen actina del escarabajo de la patata Leptinotarsa decemlineata en hojas de patata podría inhibir el crecimiento de larvas (San Miguel et al., Pest Management Science, doi: 10.1002/ps.4056 (2015)). Por consiguiente, intentamos aplicar externamente Bc-DCL1/2-ARNp sintéticos o sus precursores de ARN de doble cadena (Bc-DCL1/2-ARNdc) en la superficie de las frutas, hortalizas y flores, para probar si B. cinerea es capaz de captar ARNdc y/o ARNp del entorno e inducir el silenciamiento de sus propios genes. El mismo fragmento Bc-DCL1/2 fue transcrito in vitro de ambos extremos y dio lugar a Bc-DCL1/2-ARNdc. Los Bc-DCL1/2-ARNdc se sometieron a tratamiento con ARNasa III para generar Bc-DCL1/2-ARNp in vitro. Los Bc-DCL1/2-ARNp y los ARNdc precursores (20 ng/μl) se aplicaron externamente en frutos (tomate, fresa y uva), hortalizas (lechuga y cebolla) y pétalos de flores (rosa), seguido de la infección con B. cinerea. Todas las plantas tratadas con Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc desarrollaron síntomas de enfermedad mucho más débiles (Fig. 20A-B) y soportaron un crecimiento significativamente menor de B. cinerea (Fig. 20B) en comparación con los controles tratados con YFP-ARNdc, lo que sugiere que los Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc aplicados externamente pueden inhibir la virulencia del patógeno, probablemente a través de la supresión tanto del crecimiento fúngico como de la biogénesis del efector Bc-ARNp. Los Bc-DCL1/2-ARNp tuvieron efectos ligeramente más fuertes que los Bc-DCL1/2-ARNdc.
Aunque el tratamiento externo de Bc-DCL1/2-ARNp y el precursor Bc-DCL1/2-ARNdc puede inhibir la enfermedad fúngica, la síntesis de ARN in vitro es demasiado costosa. Para obtener una gran cantidad de Bc-DCL1/2-ARNp y ARNdc a un coste mucho menor, expresamos transitoriamente el vector pHELLSGATE-Bc-DCL1/2 en N. benthamiana, lo que produjo una gran cantidad de Bc-DCL1/2-ARNp y precursores Bc-DCL1/2-ARNdc dos o tres días después de la inoculación agrobacteriana (Fig. 21A). El vector vacío pHELLSGATE (EV) se utilizó como control. Los ARN totales purificados se aplicaron sobre la superficie de las frutas, vegetales y pétalos de rosa seguido por la infección con B. cinerea. Todas las plantas tratadas con los extractos de ARN que contenían Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc desarrollaron síntomas de enfermedad menos graves y mostraron un menor crecimiento fúngico que las tratadas con ARN extraídos de plantas EV (Fig. 21B-C). Este resultado demuestra que los Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc, pero no el ARN total de N. benthamiana, puede proteger a las plantas de la infección por B. cinerea.
El efecto de las moléculas Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc aplicadas externamente sobre la virulencia y el crecimiento de B. cinerea podrían ser el resultado de la captación directa de ARNdc y ARNp del entorno ambiental por B. cinerea o un proceso indirecto que involucre la captación y el procesamiento de la planta antes del transporte a las células de B. cinerea. Para probar si el ARNp y el ARNdc pueden entrar directamente en las células de B. cinerea o requieren un paso intermedio que involucre hospedadores vegetales, eliminamos las plantas de la imagen y aplicamos directamente los Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc en las esporas de B. cinerea y las germinamos en medio de extracto sólido de malta (ME). Para visualizar los ARN, marcamos los ARN con fluoresceína-12-UTP mediante transcripción in vitro. La inspección microscópica de las conidiosporas en germinación después de 12 horas reveló señales de ARN fluorescentes que se acumulaban en las células fúngicas (Fig. 22A). Para eliminar la posibilidad de que los ARN fluorescentes observados se adhieran a la pared celular exterior, tratamos las hifas fúngicas con nucleasa microcócica (MNasa), y la señal de fluorescencia aún permanecía, indicando que el ARN de hecho fue absorbido en las células de B. cinerea. Para confirmar aún más esta conclusión, los ARN fluorescentes se agregaron a un cultivo líquido de esporas de B. cinerea en germinación y B. cinerea cultivado se sometió a preparación de protoplastos. La señal de fluorescencia se detectó claramente en los protoplastos de B. cinerea incluso después del tratamiento con MNasa (Fig. 22B). Bc-DCL1l2 fueron silenciados por Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc, y solo Bc-DCL2, pero no Bc-DCL1, fue silenciado por Bc-DCL2-ARNp y -ARNdc (Fig. 22C). El crecimiento de B. cinerea se redujo con el tratamiento con Bc-DCL1/2-ARNp en comparación con el tratamiento con agua, y se redujo en menor medida con el tratamiento con Bc-DCL1/2-ARNdc, Bc-DCL2-ARNAp y -ARNdc (datos no mostrados). Estos datos respaldan que los Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc se translocaron en las células fúngicas y que silenciaron de manera eficiente los genes DCL fúngicos. Este mecanismo de captación de ARN hace posible desarrollar una nueva generación de "fungicidas" basados en ARN que no dañan el medio ambiente.
Tal método de control de enfermedades basado en ARNi podría ser poderoso si es efectivo contra múltiples patógenos. Por ejemplo, podríamos diseñar ARNdc o ARNp dirigidos a DCL para silenciar genes DCL de múltiples patógenos que utilizan efectores ARNp. El patógeno fúngico transmitido por el suelo Verticillium dahilae es otro patógeno fúngico económicamente importante, que causa el marchitamiento por Verticillium en una amplia gama de especies de plantas, incluidas las herbáceas anuales, perennes y especies leñosas (Fradin et al., Mol Plant Pathol. 7:71-86 (2006); Klosterman et al., Annual Review of Phytopathology 47: 39-62 (2009). Hasta la fecha, no existe un método de control efectivo que no sea la aplicación de fungicidas tóxicos. Como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, V. dahilae también utiliza AGO1 del hospedador para sus funciones efectoras de ARNp; por lo tanto, el direccionamiento a los genes Vd-DCL también podría ser una posible estrategia para controlar la enfermedad del marchitamiento por Verticillium.
Para probar si el método basado en ARNi puede controlar simultáneamente V. dahilae y B. cinerea, generamos plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan ARN en horquilla dirigidos a genes DCL de ambos hongos. V. dahilae también tiene dos genes DCL. De nuevo, no pudimos encontrar una región de ADN fuera de los dominios conservados que tuviera suficiente homología entre Vd-DCL1 y Vd-DCL2 (Vd-DCL1/2), o entre los DCL de V. dahilae y B. cinerea para silenciar dos o múltiples DCL. Por lo tanto, se tuvo que seleccionar dos segmentos de ADN, cada uno de Vd-DCL1 (156 pb) y Vd-DCL2 (156 pb), que tenían 2,2 % a 3,1 % de identidad con los cuatro At-DCL (datos no mostrados) y se fusionaron con un fragmento de 164 pb de Bc-DCL1 y un fragmento de 151 pb de Bc-DCL2, ambos derivados del fragmento de ADN Bc-DCL1/2 ARNi. Este producto ligado se clonó a continuación en el vector pHELLSGATE. Estas plantas transgénicas expresaron altos niveles tanto de Bc-DCL1/2-ARNp como de Vd-DCL1/2-ARNp (Fig. 23A). Como era de esperar, la expresión de los genes DCL de Arabidopsis no se vio afectada en estas líneas transgénicas (datos no mostrados). Los ensayos de infección de patógenos revelaron que estas plantas transgénicas son de hecho más resistentes tanto a B. cinerea como a V. dahilae (Fig. 23C y 23E). Los niveles de expresión de Bc-DCL1/2 y Vd-DCL1/2 se redujeron significativamente en B. cinerea y V. dahilae cultivados en estas plantas transgénicas que en los de las plantas WT (Fig. 23B y 23D). Por lo tanto, esta estrategia de manejo de enfermedades basada en ARNi que se dirigen a genes DCL de patógenos es eficiente en el control de múltiples patógenos fúngicos que utilizan efectores de ARNp.
Análisis
Hemos proporcionado el primer ejemplo de tráfico de ARNp bidireccional entre un patógeno fúngico y los hospedadores que interactúan con él. Los ARNp dirigidos a Bc-DCL de la planta generados por el hospedador pueden ser transportados a B. cinerea para silenciar los genes Bc-DCL para el control de enfermedades. En C. elegans, la captación de ARNdc del entorno requiere ARNdc de más de 50 pb, en lugar de ARNdc más cortos o ARNp maduros. Véase, p. ej., Winston et al., PNAS 104:10565-10570 (2007); McEwan et al., Molecular Cell 47: 746-754 (2012). Algunos insectos herbívoros también son capaces de captar ARNdc de más de 50-60 pb, pero no ARNp (Ivashuta et
al., RNA 21:840-850 (2015). En este caso, se demostró que B. cinerea puede captar tanto ARNp como ARNdc directamente, y ambos pueden inducir el silenciamiento de los genes de B. cinerea de manera eficiente, lo que sugiere que los canales o vías de captación de ARN pueden diferir en diferentes organismos.
Los patógenos eucariotas, incluyendo hongos y oomicetos, causan graves pérdidas de cosechas anualmente. En la actualidad, el rociado de fungicidas y sustancias químicas siguen siendo la estrategia de control de enfermedades más común, sin embargo, plantean serias amenazas para la salud humana y el medio ambiente. En los últimos años, se ha demostrado que el sistema HIGS basado en la transformación estable de plantas controla de manera eficiente una variedad de plagas, nematodos, patógenos filamentosos y plantas parásitas en varios modelos de plantas y especies de cultivos. Véase, p. ej., Baum et al., Nat Biotechnol 25: 1322-1326 (2007); Huang et al., PNAS 103: 14302 14306 (2006); Nowara et al. (Plant Cell 22: 3130-3141 (2010). Sin embargo, estos exitosos estudios HIGS se basaron en un sistema de transformación de plantas que no está disponible para muchos cultivos. Algunos genes diana de patógenos comúnmente seleccionados que son importantes para la propagación e infección de patógenos incluyen genes de parasitismo, genes codificadores de efectores, o genes relacionados con la biosíntesis de ergosterol fúngico. Observamos que los genes DCL B. cinerea son esenciales para la biogénesis de los efectores de ARNp, así como para el crecimiento y desarrollo de hongos. Son las dianas ideales para el control de patógenos que utilizan efectores de ARNp. En este caso, hemos descubierto que B. cinerea puede captar ARNdc o ARNp del entorno e inducir ARNi ambiental, haciendo posible el uso directo de dichos ARNdc y ARNp para el tratamiento de enfermedades. Demostramos que el rociado de BcDCLI /2-ARNp y -ARNdc en la superficie de varias frutas, hortalizas y flores puede controlar eficazmente la enfermedad del moho gris. Esta nueva generación de "fungicidas de ARN" basados en ARNi podría eludir la limitación técnica de la transformación y la preocupación pública sobre los OMG y proporcionar una herramienta de control de enfermedades fácil de usar y respetuosa con el medio ambiente para productos de cultivo antes y después de la cosecha. Además, tales estrategias basadas en ARN podrían diseñarse fácilmente para dirigirse a múltiples patógenos.
Materiales y métodos
Construcción de plásmidos: Los plásmidos pHELLSGATE-Bc-DCL1/2 y pHELLSGATE-Bc+Vd-DCL se construyeron siguiendo los métodos descritos para el sistema Hellsgate8.0 (Helliwell et al., Methods in Enzymology 392: 24-35 (2005)). El fragmento de ARNi Bc-DCL1/2 se obtuvo integrando los fragmentos Bc-DCL1 (252 pb) y Bc-DCL2 (238 pb) mediante PCR de superposición. El fragmento de ARNi Bc+Vd-DCL se obtuvo integrando el fragmento de ARNi Bc-DCL1/2 de 315 pb (164 pb de Bc-DCL1 y 151 pb de Bc-DCL2) y fragmentos de ARNi de Vd-DCL1 (156 pb) y Vd-DCL2 (156 pb) mediante PCR de superposición. Los fragmentos de ARNi se clonaron por separado en pDONR207 utilizando Gateway® BP clonase (Life Technologies, Carlsbad, CA), a continuación en el vector de destino pHELLSGATE8.0 utilizando Gateway® LR clonase (Life Technologies, Carlsbad, CA). Para el plásmido pTRV2-Bc-DCL1/2, se clonó el vector pDONR207-Bc-DCL1/2 en pTRV2 EV para obtener pTRV2-Bc-DCL1/2 usando LR clonase (Life Technologies, Carlsbad, CA) (Weiberg et al., Science 342: 118-123 (2013)).
Síntesis in vitro de YFP-ARNdc, Bc-DCL1/2-ARNdc y -ARNp: Siguiendo las instrucciones del MEGAscript® RNAi Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA), la secuencia del promotor T7 se introdujo en los extremos 5' y 3' de los fragmentos de ARNi YFP y Bc-DCL1/2 por PCR, respectivamente. Después de la purificación, los fragmentos de ADN que contienen promotores T7 en ambos extremos se usaron para la transcripción in vitro. Para obtener los Bc-DCL1/2-ARNp, los Bc-DCL1/2-ARNdc sintetizados se digirieron en ARNp con Shortcut® RNase III (NEB Ipswich, MA).
Marcado con fluorescencia de ARN in vitro y examen de microscopía confocal: Los Bc-DCL-ARNdc se marcaron con fluorescencia siguiendo las instrucciones del kit Fluorescein RNA Labeling Mix (Sigma, St. Louis, MO). Los Bc-DCL-ARNp fluorescentes se obtuvieron a partir de la digestión de los Bc-DCL-ARNdc fluorescentes con Shortcut® RNase III (NEB Ipswich, MA). Para el examen confocal de B. cinerea tratado con ARN fluorescente cultivado en los portaobjetos microscópicos, se mezclaron 4 μl de una solución de 105 esporas/ml y 4 μl de 100 ng/μl de Bc-DCL-ARNp o -ARNdc fluorescentes y se dejaron gotear sobre el medio ME sólido preparado en los portaobjetos microscópicos. Después de 12 horas de incubación en la oscuridad, la fluorescencia se examinó usando un microscopio confocal SP5. Para detectar el tráfico de ARN fluorescente en el protoplasto de B. cinerea, se cultivaron 107 esporas de B. cinerea en 10 ml de YEPD y se añadieron 2 μg de Bc-DCL-ARNp o -ARNdc fluorescentes. Los protoplastos se aislaron como se ha descrito anteriormente (Gronover et al., Molecular Plant Microbe Interactions 14:1293-1302 (2001)) después de 40 horas, seguido de tratamiento con tampón KCl o 75 U de nucleasa microcócica (Thermo Scientific, Waltham, MA) a 37 °C durante 30 min. La fluorescencia se examinó usando un microscopio confocal SP5.
Preparación del ARN total de N. benthamiana con o sin Bc-DCL1/2-ARNp y -ARNdc: Se infiltraron plantas de N. benthamiana de cuatro semanas con una cepa de A. tumefaciens portadora de pHellsgate-Bc-DCL1/2 o pHellsgate-EV. El tejido de la hoja se cosechó 2 dpi y se usó para la extracción de ARN total.
Aplicación externa de los ARN sobre la superficie de materiales vegetales: Todos los ARN se ajustaron a una concentración de 20 ng/μl con agua libre de ARNasa antes de su uso. Para los YFP-ARNdc, Bc-DCL1/2-ARNp y Bc-DCL1/2-ARNdc sintetizados in vitro, se dejaron gotear o se rociaron 20 μl de ARN (20 ng/μl) sobre las superficies de los materiales vegetales. Para los extractos de ARN total deN. benthamiana, las superficies de los materiales vegetales se rociaron uniformemente con 20 ng/μl de ARN.
Ensayo de patógenos fúngicos y cuantificación de enfermedades: La cepa B05.10 de B. cinerea y la cepa JR2 de V. dahilae se cultivaron en agar de extracto de malta (2 % de extracto de malta, 1 % de peptona Bacto) y agar de dextrosa de patata (PDA), respectivamente. Las esporas de B. cinerea se diluyeron en tampón de caldo de maltosa Sabouraud al 1 % hasta una concentración final de 104 esporas/ml para inoculación por rociado en hoja de tomate y 105 esporas/ml para el goteo o rociado de otros materiales vegetales (Mengiste et al., Plant Cell 14: 2551-2565 (2003); Se usaron 10 |j¡ de suspensión de esporas en el área de goteo o rociado de todos los materiales vegetales, excepto en los frutos de tomate en los que se aplicaron por goteo 20 jl. El ensayo de inoculación en el suelo de V. dahilae se realizó como se ha descrito anteriormente.
Cultivo e infección de raíces de Arabidopsis: Para la inoculación del cultivo líquido de raíces de Arabidopsis, se cultivaron Arabidopsis de 2 semanas en un cultivo de raíces (0,32 % de sal MS, 2 % de sacarosa, 0,1 % de MES, pH 5,8 por KOH) y se añadieron esporas de V. dahilae al cultivo hasta la concentración final de 106 esporas/ml. Después de 5 min de inoculación, el cultivo de raíces se reemplazó con una solución estéril fresca. La cuantificación de la biomasa fúngica se realizó como se ha descrito anteriormente (Gachon et al., Plant Physiol Bioch 42: 367-371 (2004)).
Clonación y análisis de datos de ARNp asociados con AGO1 y AGO2 de Arabidopsis: Se recogieron Arabidopsis infectadas con V. dahilae preparadas en cultivo líquido de raíces a los 2 y 4 dpi. Las inmunoprecipitaciones At-AGO1 y At-AGO2 se realizaron usando anticuerpos antipéptido anti-AGO1 y anti-AGO2 (Zhang et al., Mol Cell 42: 356-366 (2011)). Los ARN asociados a At-AGO1 y At-AGO2 se extrajeron y utilizaron para la construcción de bibliotecas de ARNp y la secuenciación profunda con Illumina HiSeq 2000 (Weiberg et al., Science 342: 118-123 (2013)). El número de lecturas de Vd-ARNp en las bibliotecas IP At-AGo1 y At-AGO2 se normalizó con el ARNp total de V. dahilae después de eliminar el ARNt, ARNr, ARNpno, ARNpn, etc. Se seleccionaron los Vd-ARNp que tenían más de 100 RPM después de la normalización y que también tenían genes diana del hospedador en Arabidopsis. Los efectores de Vd-ARNp asociados con At-AGO1 se definieron como los Vd-ARNp seleccionados con un número de lectura 10 veces mayor en la biblioteca IP At-AGO1 en comparación con la biblioteca IP At-AGO2. Los efectores de Vd-ARNp asociados con At-AGO2 se definieron como los Vd-ARNp seleccionados con un número de lectura 10 veces mayor en la biblioteca IP At-AGO2 en comparación con la biblioteca IP At-AGO1.
Ejemplo 5: Ejemplos de secuencias de proteínas y genes DCL
SEQ ID NO: 1 - Secuencia de ADN genómico de DCL1 de Botrytis cinerea (fragmento de ARNi seleccionado marcado con texto en negrita)
SEQ ID NO: 2 - Secuencia de proteína DCL1 de Botrytis cinerea
SEQ ID NO: 3 - Secuencia de ADN genómico de DCL2 de Botrytis cinerea (fragmento de ARNi seleccionado marcado con texto en negrita)
SEQ ID NO: 4 - Secuencia de proteína DCL2 de Botrytis cinerea
SEQ ID NO: 5 - Secuencia de ADN genómico de DCL de Verticillium dahilae (VAD_00471.1) (fragmento de ARNi seleccionado marcado con texto en negrita)
SEQ ID NO: 6 - Secuencia de proteína DCL de Verticillium dahilae (VAD_00471.1)
SEQ ID NO: 7 - Secuencia de ADN genómico de DCL de Verticillium dahilae (VAD_06945.1) (fragmento de ARNi seleccionado marcado con texto en negrita)
SEQ ID NO: 8 - Secuencia de proteína DCL de Verticillium dahilae (VAD)_06945.1)
SEQ ID NO:9 - Fragmento de ARNi de ADNc de DCL1 de B. cinerea
SEQ ID NO:10 - Fragmento de ARNi de ADNc de DCL2 de B. cinerea
SEQ ID NO:11 - Fragmento de ARNi de ADNc de DCL de V. dahliae (VDAG_00471)
SEQ ID NO:12 - Fragmento de ARNi de ADNc de DCL de V. dahliae (VDAG 06945.1)
SEQ ID NO:13 - LTR para siR3
>B. cinerea (B05.10) Botrytis cinerea supercontig 1.56 [ADN] 218751-219771
SEQ ID NO:14 - LTR para siR5
> BC1G_08572.1 elemento retrotransponible Tf2 1 proteína tipo 1 (Transcrito: BC1T_08572)
SEQ ID NO:15 - LTR para siR5
> BC1G_15284.1 - poliproteína enzimática
SEQ ID NO:16 - LTR para siR5
>BC1G 04408.1 elemento retrotransponible Tf21 proteína tipo 1
SEQ ID NO:17 - LTR para siR5
>BC1G_12842.1 elemento retrotransponible Tf2 1 proteína tipo 1 (Transcrito:BC1T_12842)
SEQ ID NO:18 - LTR para siR5
>BC1G_07532 - elemento retrotransponible Tf2 1 proteína tipo 1
SEQ ID NO:19 - LTR para siR5
>BC1G 09712 - poliproteína enzimática
SEQ ID NO:20 - LTR para siRS
>BC1G 15972 - poliproteína enzimática
SEQ ID NO:21 - LTR para siRS
>BC1G 13999 elemento retrotransponible Tf2 1 proteína tipo 1
SEQ ID NO:22 - LTR para siRS
>BC1G_04888.1 elemento retrotransponible Tf2 1 proteína tipo 1 (Transcrito:BC1T_04888)
SEQ ID NO:23 - LTR para siRS
>BC1G_16375.1 proteína hipotética similar a Pol truncada (Transcrito:BC1T_16375)
SEQ ID NO:24 - LTR para siRS
>BC1G_06254.1 elemento retrotransponible Tf2 1 proteína tipo 1 (Transcrito:BC1T_06254)
SEQ ID NO:25 - LTR para siR5
>BC1G_08449.1 elemento retrotransponible Tf2 1 proteína tipo 1 (Transcrito:BC1T_08449)
SEQ ID NO:26 - LTR para siRS
>BC1G_16170.1 proteína hipotética similar a la integrasa (Transcrito:BC1T_16170)
SEQ ID NO:27 - Secuencia de ADN genómico de LTR de Botrytis
>B. cinerea (B05.10) Botrytis cinerea supercontig 1.56 [ADN] 215700-227000
SEQ ID NO:28 - Secuencia del promotor de DCL1 de Botrytis
>B. cinerea (B05.10) Botrytis cinerea supercontig 1.69 [ADN] 45790-46725 -
SEQ ID NO:29 - Secuencia del promotor de DCL2 de Botrytis
>B. cinerea (B05.10) Botrytis cinerea supercontig 1.78 [ADN] 26792-27461
SEQ ID NO:30 - Secuencia promotora de DCL1 de VerticiMium
>V. dahliae Vdls.17 supercontl.1 de VerticiMium dahliae (Vdls.17) [ADN] 1574620-1574964 -
SEQ ID NO:31 - Secuencia promotora de DCL2 de VerticiMium
>V. dahliae Vdls.17 supercont1.15 de VerticiMium dahliae (Vdls.17) [ADN] 194566-195565
Claims (15)
1. Un método para aumentar la resistencia a patógenos en una planta o una parte de una planta, comprendiendo el método:
poner en contacto la planta o la parte de la planta con un primer ARN de doble cadena, ARN pequeños, o dúplex de ARN pequeños que se dirigen a un primer gen o promotor de tipo Dicer (DCL) del patógeno fúngico y poner en contacto las plantas o parte de la planta con un segundo ARN de doble cadena, ARN pequeños, o dúplex de ARN pequeños que se dirigen a un segundo gen o promotor DCL del patógeno fúngico, en donde
(a) el primer ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a Botrytis DCL1 y el segundo ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a Botrytis DCL2; en donde el primer y segundo gen o promotor DCL comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29, o un fragmento de la misma que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos, o
(b) el primer ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a Verticillium DCL1 y el segundo ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a Verticillium DCL2; en donde el primer y segundo gen o promotor DCL comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos,
en donde la planta es una especie de los géneros Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Oryza, Panieum, Pannesetum, Persea, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Rosa, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Trigonella, Triticum, Vitis, Vigna o Zea, y en donde la planta o la parte de la planta tiene una mayor resistencia al patógeno fúngico en comparación con una planta de control o una parte de la planta de control que no se ha puesto en contacto con el ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños.
2. El método de la reivindicación 1, en donde
los ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños, se rocían sobre la planta o la parte de la planta.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la planta es una planta ornamental.
4. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde
(i) la planta es una planta productora de frutas u hortalizas; y/o
(ii) la parte de la planta es una fruta, una hortaliza o una flor.
5. Un método para aumentar la resistencia a patógenos en una fruta, una hortaliza o una flor, comprendiendo el método:
poner en contacto la fruta, hortaliza o flor con un primer ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños que se dirigen a un primer gen o promotor de tipo Dicer (DCL) del patógeno fúngico y poner en contacto la fruta, hortaliza o flor con un segundo ARN de doble cadena, ARN pequeños, o dúplex de ARN pequeños que se dirigen a un segundo gen o promotor DCL del patógeno fúngico, en donde
(a) el primer ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a Botrytis DCL1 y el segundo ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a Botrytis DCL2; en donde el primer y segundo gen o promotor DCL comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, s Eq ID NO:28 o Se Q ID NO:29, o un fragmento de la misma que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos; o
(b) el primer ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a Verticillium DCL1 y el segundo ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a Verticillium DCL2; en donde el primer y segundo gen o promotor DCL comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos, y
en donde la fruta, la hortaliza o la flor tienen una mayor resistencia al patógeno fúngico en comparación con una fruta, hortaliza o flor de control que no ha estado en contacto con el ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños.
6. El método de la reivindicación 4(ii) o 5, en donde la fruta, hortaliza, o flor es una fruta, hortaliza o flor postcosecha.
7. El método de la reivindicación 5 o 6, en donde los ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños, se rocían sobre la fruta, hortaliza o flor postcosecha.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde
el ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños se dirigen a cualquiera de las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños comprenden una repetición invertida de una secuencia que es al menos un 70 % idéntica a cualquiera de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, o un fragmento de la misma que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos, o un complemento de la misma, en donde opcionalmente el ARN de doble cadena es ARNip.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende el uso de dos o más ARN de doble cadena o dúplex de ARN pequeños.
11. El método de la reivindicación 1, que comprende aumentar la resistencia a patógenos a una primera y una segunda especie de patógenos fúngicos, en donde el método comprende:
poner en contacto la planta o la parte de la planta con
(i) un primer ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños que se dirigen a un gen o promotor DCL1 de Botrytis y un segundo ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños que se dirigen a un gen o promotor DCL2 deBotrytis; en donde el gen o promotor DCL1 y DCL2 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29, o un fragmento de la misma que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos; y
(ii) un primer ARN de doble cadena, ARN pequeños, o dúplex de ARN pequeños que se dirigen al gen o promotor DCL1 de Verticillium y un segundo A r N de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños que se dirigen al gen o promotor DCL2 de Verticillium; en donde el gen o promotor DCL1 y DCL2 comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos;
en donde la planta o la parte de la planta tiene una mayor resistencia a la primera especie de patógeno y a la segunda especie de patógeno en comparación con una planta de control o parte de una planta de control que no se ha puesto en contacto con el primer y segundo ARN de doble cadena, ARN pequeños, o dúplex de ARN pequeños de (i) y (ii).
12. El método de la reivindicación 11, en donde:
(i) el primer y segundo ARN de doble cadena, ARN pequeños o dúplex de ARN pequeños de (i) y (ii) se rocían sobre la planta o la parte de la planta; y/o
(ii) la parte de la planta es una fruta, una hortaliza o una flor.
13. Un método para producir una planta que tenga una mayor resistencia a patógenos a una primera especie y una segunda especie de patógenos, en donde la primera especie de patógeno es una especie de Botrytis y la segunda especie de patógeno es una especie de Verticillium, comprendiendo el método:
introducir en la planta por transformación
(1) un casete de expresión heteróloga que comprende un promotor unido operativamente a un primer polinucleótido que inhibe la expresión de un promotor o gen Botrytis DCL1 y un casete de expresión heteróloga que comprende un promotor unido operativamente a un segundo polinucleótido que inhibe la expresión de un gen o promotor Botrytis DCL2; en donde el gen o promotor DCL1 y DCL2 comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29, o un fragmento de la misma que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos;
(2) un casete de expresión heteróloga que comprende un promotor unido operativamente a un primer polinucleótido que inhibe la expresión de un gen o promotor Verticillium DCL1 y un casete de expresión heteróloga que comprende un promotor unido operativamente a un segundo polinucleótido que inhibe la expresión de un gen o promotor Verticillium DCL2; en donde el gen o promotor DCL1 y DCL2 comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos; y
seleccionar una planta que comprenda los casetes de expresión.
14. El método de la reivindicación 13, en donde los polinucleótidos primero y segundo de (1) y (2) codifican ácidos nucleicos antisentido o ARN inhibidor (ARNi) que se dirigen al gen o promotor DCL o un fragmento del mismo.
15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en donde:
(i) la planta es una especie de los géneros Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Oryza, Panieum, Pannesetum, Persea, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Rosa, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Trigonella, Triticum, Vitis, Vigna o Zea; y/o
(ii) la planta es una planta ornamental o una planta productora de hortalizas o frutas.
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