ES2547121T3 - Proteínas de superhélice antiparalela de una sola cadena - Google Patents
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Abstract
Proteína de una sola cadena aislada que consiste en la fórmula HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3, en la que HRS1, L1, HRS2, L2 y HRS3 representan fragmentos de secuencia de aminoácidos que están interconectados covalentemente, plegándose espontáneamente dicha proteína en disolución acuosa por medio de los fragmentos HRS1, HRS2 y HRS3 que forman una estructura de superhélice alfa-helicoidal, antiparalela, de triple hebra, y en la que cada uno de HRS1, HRS2 y HRS3 es independientemente una secuencia de repetición en héptada que se caracteriza por un patrón de 7 residuos repetido n veces de tipos de aminoácidos, representado como (a-bc- d-e-f-g-)n o (d-e-f-g-a-b-c-)n y una repetición en héptada parcial C-terminal que termina con un residuo de núcleo de héptada ubicado en una posición a o d, en la que los elementos de patrón "a" a "g" indican posiciones de héptada convencionales en las que se ubican dichos tipos de aminoácidos y n es un número igual a o mayor de 2, y al menos el 50%, el 70%, el 90% o el 100% de las posiciones de héptada convencionales "a" y "d" están ocupadas por aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, histidina, glutamina, treonina, serina, alanina o derivados de los mismos, en la que al menos el 50%, el 70%, el 90% o en la que el 100% de las posiciones de héptada convencionales "b", "c", "e", "f" y "g" están ocupadas por aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en glicina, alanina, cisteína, serina, treonina, histidina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutámico, lisina, arginina o derivados de los mismos, permitiendo la distribución resultante de los tipos de aminoácidos la identificación de dichas secuencias de repetición en héptada, y cada uno de L1 y L2 es independientemente un ligador que consiste en de 1 a 30 residuos de aminoácido, incluyendo este ligador cualquier residuo de aminoácido que no puede asignarse de manera inequívoca a una secuencia de repetición en héptada, y L1 y L2 tienen una composición de aminoácidos que comprende al menos el 50% de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en glicina, alanina, serina, treonina, prolina o derivados de los mismos.
Description
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inmunoglobulina. La producción, purificación, pruebas y optimización de ambos tipos de compuestos biotecnológicos generalmente requiere mucho trabajo, es arriesgado y caro. Por consiguiente, existe la necesidad de nuevos compuestos biotecnológicos con actividad biológica específica, así como métodos mejorados para la producción, purificación, pruebas y optimización de tales compuestos.
Las moléculas de proteína de la presente invención pueden ser adecuadas como sondas de detección. Los ejemplos en los que se aplican moléculas de sonda (sondas) específicas para detectar la presencia de un analito de interés (analito diana) en una muestra de interés (muestra de estudio) dada, incluyen, sin limitación, análisis experimentales de muestras de origen humano, animal, vegetal, bacteriano, viral, biotecnológico o sintético. Tales muestras contienen normalmente biomoléculas (por ejemplo, polipéptidos, polinucleótidos, polisacáridos, hormonas, vitaminas
o lípidos, o derivados de los mismos) que pueden interaccionar específicamente con una molécula de sonda seleccionada. Esta última interacción normalmente da lugar a una señal (por ejemplo, espectroscópica o radiactiva) característica, indicativa de la presencia de dicho analito diana en dicha muestra de estudio. Estas aplicaciones pertenecen al cambo de la investigación y el desarrollo analíticos. El número de combinaciones de diferentes tipos de sondas y dianas que se usan eficazmente en aplicaciones médicas y biotecnológicas es prácticamente ilimitado. En vista de la continua evolución en estas áreas, hay una necesidad en curso de nuevas herramientas analíticas (por ejemplo, sondas) con propiedades fisicoquímicas deseadas (por ejemplo, especificidad, afinidad, estabilidad, solubilidad), así como métodos mejorados para la producción, purificación, pruebas y optimización de tales compuestos.
Las moléculas de proteína de la presente invención pueden ser adecuadas para aplicaciones de purificación. Los ejemplos en los que se aplican moléculas de ligando (ligandos) específicas para retener (extraer, aislar, purificar, filtrar) otras moléculas de interés (dianas, analitos diana) en una muestra de interés (muestra en bruto) dada incluyen, sin limitación, muestras de origen humano, animal, vegetal, bacteriano, viral, biotecnológico o sintético que contienen biomoléculas (por ejemplo, polipéptidos, polinucleótidos, polisacáridos, hormonas, vitaminas o lípidos, o derivados de los mismos) que pueden interaccionar (asociarse) con alta especificidad con moléculas de ligando seleccionadas, donde estas últimas se separan, o pueden separarse, de la muestra en bruto (por ejemplo, mediante la unión sobre un soporte sólido o mediante precipitación), con el propósito de separar conjuntamente las moléculas diana de la muestra en bruto. Estas aplicaciones pertenecen al campo de la tecnología de purificación. Los ejemplos más específicos de métodos de purificación incluyen cromatografía de afinidad e inmunoprecipitación. En vista de la continua evolución en estas áreas, hay una necesidad en curso de nuevos ligandos para purificación con propiedades fisicoquímicas deseadas (por ejemplo, especificidad, afinidad, estabilidad, solubilidad), así como métodos mejorados para la producción, purificación, pruebas y optimización de tales compuestos.
Las moléculas de armazón de proteína de la presente invención se pliegan dando lugar a una estructura de superhélice alfa-helicoidal. La superhélice alfa-helicoidal forma un tipo especial de marco estructural (motivo estructural, plegamiento) 3-D. El plegamiento de superhélice se produce en una amplia variedad de proteínas incluyendo proteínas motoras, proteínas de unión a ADN, proteínas extracelulares y proteínas de fusión viral (por ejemplo, Burkhard et al. [Trends Cell Biol 2001, 11:82-88]). Se ha estimado que del 3 al 5%, o más, de todos los aminoácidos en las proteínas naturales forman parte de una estructura de superhélice [Wolf et al., Protein Sci 1997, 6:1179-1189].
Las superhélices se han caracterizado funcionalmente como motivos de plegamiento (ensamblaje, oligomerización), es decir, la formación de una estructura de superhélice conduce en muchos casos a la asociación no covalente de diferentes cadenas de proteína. Las superhélices se han caracterizado estructuralmente como conjuntos de 2, 3, 4 ó 5 hebras de alfa-hélices dispuestas en topologías paralelas, antiparalelas o mixtas (por ejemplo, Lupas [Trends Biochem Sci 1996, 21:375-382]. Las hélices están ligeramente empaquetadas (enroscadas, enrolladas) entre sí hacia la izquierda o hacia la derecha, denominados superenrollamiento. Todas las realizaciones de la presente invención se refieren exclusivamente a estructuras de superhélice de triple hebra (3 hebras, triméricas).
Las superhélices alfa-helicoidales se han caracterizado adicionalmente a nivel de sus secuencias de aminoácidos, en que cada hélice está constituida por una serie de repeticiones en héptada. Una repetición en héptada (unidad de héptada, héptada) es un motivo de secuencia de 7 residuos que puede codificarse como HppHppp, y en la que cada “H” representa un residuo hidrófobo (potencialmente diferente) y cada “p” es un residuo polar (potencialmente diferente). De manera ocasional (infrecuentemente), se observan residuos p en posiciones de H, y viceversa. Una repetición en héptada de la invención se codifica por los patrones a-b-c-d-e-f-g (abcdefg) o d-e-f-g-a-b-c (defgabc), en cuyo caso los índices “a” a “g” se refieren a las posiciones de héptada convencionales en las que se observan tipos de aminoácidos típicos. Por convenio, los índices “a” y “d” indican las posiciones de los residuos de núcleo (residuos centrales, escondidos) en una superhélice. Los tipos de aminoácidos típicos que se observan en las posiciones de núcleo a y d son tipos de residuos de aminoácidos hidrófobos; en el resto de las posiciones (posiciones no de núcleo), se observan tipos de residuos predominantemente polares (hidrófilos). Por tanto, los patrones de héptada convencionales “HppHppp” coinciden con la notación de patrón “abcdefg” (los patrones “HpppHpp” coinciden con la notación de patrón “defgabc”, usándose esta notación para superhélices que comienzan con un residuo hidrófobo en la posición d). Todas las realizaciones de la presente invención incluyen al menos 2, preferiblemente 3 o más repeticiones en héptada consecutivas (ininterrumpidas) en cada alfa-hélice de la estructura de superhélice. Cada serie de repeticiones en héptada consecutivas en una hélice se indica como una “secuencia de
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antiparalelo estable. Esto último es de relevancia específica para la presente invención, porque los inventores han generado y caracterizado estructuras de superhélice de triple hebra de una sola cadena que estaban dotadas de ligadores que eran significativamente demasiado cortos para el plegamiento paralelo, mientras que la molécula todavía se plegaba con conservación completa del contenido alfa-helicoidal y con efectos insignificantes sobre la temperatura de transición en experimentos de desplegamiento térmico (véase el ejemplo 5). Basándose en estos experimentos, se concluyó que estos constructos (y posiblemente también los que tienen ligadores largos) adoptan presumiblemente un plegamiento antiparalelo.
Para someter a prueba si el plegamiento antiparalelo es estructuralmente factible, los inventores han intentado generar modelos 3-D de una superhélice trimérica de una sola cadena en los que la segunda alfa-hélice (“B”) es antiparalela con respecto a la primera (“A”) y la tercera (“C”). Inesperadamente, pudieron generarse modelos creíbles con empaquetamiento de “botones en ojales” regular mediante operaciones de modelado de proteínas convencionales (véase el ejemplo 7). Todas las cadenas laterales de formación de núcleo pudieron colocarse en su conformación rotamérica más relajada. Resulta interesante que las posiciones a de héptada convencionales de la hélice B antiparalela se empaquetan sobre los residuos d de las hélices A y C (capas d). De esta forma, la hélice B interacciona con A y C a lo largo de toda su longitud, lo que sugiere que todas las posiciones de núcleo de héptada contribuyen a la estabilidad del plegamiento. Aunque esto no demuestra que se trata de plegamiento antiparalelo, los resultados del modelado sugieren que es al menos estructuralmente factible, a diferencia de las suposiciones originales.
Lovejoy et al. [Science 1993, 259:1288-1293] realizaron una observación inesperada similar para “Coil-Ser”, un péptido que se diseñó para formar una superhélice paralela de doble hebra, pero realmente ensamblado dando lugar a una superhélice de triple hebra. Esta estructura se estabilizó mediante una superficie de contacto hidrófoba, distintiva, no deliberada que consiste en ocho capas (se encontró que cada capa a dentro de las hélices paralelas estaba asociada con un residuo d de la hélice antiparalela, y cada capa d estaba asociada con un residuo a; las capas se denominaron “a-a-d” y “d-d-a”, respectivamente). En otro estudio realizado por Holton y Alber [Proc Natl Acad Sci USA 2004, 101:1537-1542], un mutante de Ala en la cremallera de leucina de GCN4 también cambió desde la configuración de dímero paralela por defecto a una configuración de trímero antiparalela. Se encontró que este cambio estructural se debía a que se evitaba crear cavidades en el núcleo. Se encontró la misma disposición en capas a-a-d y d-d-a alternas como en el estudio de Holton y Alber. De manera importante, ambos estudios se referían a superhélices que tenían un núcleo formado por residuos de leucina (“cremalleras de Leu”), mientras que los presentes inventores observaron una orientación antiparalela para superhélices que tenían un núcleo formado por residuos de isoleucina (“cremalleras de Ile”); nunca antes se había encontrado que las cremalleras de Ile formaran superhélices de 3 hebras antiparalelas. En segundo lugar, ambos de dichos estudios se referían a superhélice peptídicas, mientras que las moléculas de la presente invención se refieren exclusivamente a superhélices de una sola cadena; nunca antes se habían obtenido superhélices de 3 hebras antiparalelas en forma de moléculas de una sola cadena (formato de una sola cadena). No se sabe si la orientación antiparalela de estas moléculas de proteína se debe a la presencia de los fragmentos de ligador, o a sus secuencias de aminoácidos específicas, o a cualquier otro motivo, o a una combinación de motivos. En cualquier caso, el modelo 3-D de las moléculas de la presente invención, así como las estructuras cristalográficas descritas en los citados estudios de Lovejoy et al. y Holton y Alber [ibídem], son todas ellas estructuras de superhélice verdaderas con residuos de núcleo empaquetados de manera regular en capas separadas de manera regular. Esto las distingue de haces de tres hélices ordinarios.
Las estructuras de superhélice antiparalela de triple hélice no deben confundirse con haces de tres haces ordinarios: hay muchos ejemplos de asociaciones (haces) de tres alfa-hélices que no son superhélices regulares. Pueden observarse haces de alfa-hélices en un gran número de proteínas principalmente alfa-helicoidales, y a menudo pueden discernirse haces de tres hélices que interaccionan mutuamente dentro de tales proteínas. Las superhélices de triple hebra evidentemente también son haces de tres alfa-hélices, pero para que un haz de 3 hélices sea una superhélice es necesario que se cumplan varias condiciones adicionales. En primer lugar, se requiere que las tres hélices interaccionen mutuamente entre sí, lo que excluye topologías en las que sólo dos de los tres pares posibles de hélices están en contacto entre sí (topologías no cohesivas). En segundo lugar, debe haber un grado apropiado de superenrollamiento (es decir, empaquetamiento de las hélices unas alrededor de las otras). El principal determinante de superenrollamiento es el ángulo entre cada par de hélices (ángulo interhelicoidal, ángulo de interacción hélice-hélice, ángulo de cruzamiento). Para alfa-hélices paralelas, este ángulo puede variar desde pequeños valores negativos para superenrollamiento “dextrógiro”, normalmente en el intervalo de aproximadamente -10 grados a 0 grados, hasta valores positivos para superenrollamiento “levógiro”, normalmente en el intervalo de aproximadamente 20 grados a 0 grados. Para alfa-hélices antiparalelas, deben restarse 180 grados de dichos valores. Las topologías con un ángulo demasiado grande, fijado este último a 40 grados en valor absoluto, no se consideran superhélices. En tercer lugar, debe haber repeticiones en héptada discernibles dentro de cada una de las alfa-hélices que interaccionan (tal como se definió anteriormente). Las verdaderas superhélices comprenden al menos 2, preferiblemente al menos 3 repeticiones en héptada en cada alfa-hélice. En cuarto lugar, las alfa-hélices deben estar estrechamente empaquetadas una contra otra por medio de sus cadenas laterales que interaccionan en forma de botones en ojales, tal como se ilustra para superhélices paralelas diméricas, triméricas y tetraméricas en Harbury et al. [Nature 1994, 371:80-83] y para superhélices antiparalelas triméricas en Lovejoy et al. [Science 1993, 259:1288-1293]. Walshaw et al. [J Struct Biol 2003, 144:349-361] describen normas más sofisticadas y un método
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por medio de síntesis química, usando etapas de procedimiento bien conocidas en la técnica.
La presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena en la que al menos el 50%, preferiblemente al menos 70%, al menos 90% o en la que el 100% (todas) las posiciones de héptada convencionales “a” y “d” están ocupadas por aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, histidina, glutamina, treonina, serina, alanina o derivados de los mismos. El porcentaje preferido de dichos aminoácidos en dichas posiciones de héptada convencionales depende del nivel de riesgo que se está dispuesto a correr en el diseño de dicha proteína. Un porcentaje por debajo del 50% se considera que supone un riesgo demasiado alto como para que el plegamiento sea correcto.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena en la que al menos el 50%, el 70%, el 90% o en la que el 100% de las posiciones de héptada convencionales “a” y “d” están ocupadas por aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en valina, isoleucina, leucina, metionina o derivados de los mismos. Puesto que estos últimos aminoácidos corresponden a residuos de núcleo de superhélice más convencionales (más frecuentemente observados), esta realización se prefiere con respecto a la anterior.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena en la que al menos el 50%, el 70%, el 90% o en la que el 100% de las posiciones de héptada convencionales “a” y “d” están ocupadas por isoleucinas. Puesto que el descubrimiento inicial de dicha proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena se realizó con constructos que tienen residuos de isoleucina en posiciones de héptada convencionales “a” y “d”, esta realización se prefiere con respecto a la anterior.
La presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena en la que al menos el 50%, el 70%, el 90% o en la que el 100% de las posiciones de héptada convencionales “b”, “c”, “e”, “f” y “g” están ocupadas por aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en glicina, alanina, cisteína, serina, treonina, histidina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutámico, lisina, arginina o derivados de los mismos. El porcentaje preferido de dichos aminoácidos en dichas posiciones de héptada convencionales depende del nivel de riesgo que se está dispuesto a correr en el diseño de dicha proteína. Un porcentaje por debajo del 50% se considera que supone un riesgo demasiado alto como para que el plegamiento sea correcto y para la solubilidad de la proteína.
La presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena en la que L1 y L2 tienen una composición de aminoácidos que comprende al menos el 50%, el 70%, el 90% o que comprende el 100% de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en glicina, alanina, cisteína, prolina, serina, treonina, histidina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutámico, lisina, arginina o derivados de los mismos. El porcentaje preferido de dichos aminoácidos dentro de los ligadores depende del nivel de riesgo que se está dispuesto a correr en el diseño de dicha proteína. Un porcentaje por debajo del 50% se considera que supone un riesgo demasiado alto como para que el plegamiento sea correcto, para la solubilidad de la proteína y para su posible función (por ejemplo, unión específica a una diana dada).
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena en la que L1 y L2 tienen una composición de aminoácidos que comprende al menos el 50%, el 70%, el 90%
- o que comprende el 100% de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en glicina, alanina, serina, treonina, prolina o derivados de los mismos. Puesto que estos últimos aminoácidos corresponden a residuos de ligador más convencionales (seleccionados más habitualmente), esta realización se prefiere con respecto a la anterior.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena en la que L1 y L2 tienen una composición de aminoácidos que comprende al menos el 50%, el 70%, el 90%
- o que comprende el 100% de aminoácidos glicina y/o serina. Puesto que estos últimos aminoácidos corresponden a los residuos de ligador más convencionales (los más frecuentemente seleccionados), esta realización se prefiere con respecto a la anterior.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena en la que el número de residuos de aminoácido de cada uno de L1 y L2 equivale a menos de la mitad del número de residuos de aminoácido de la secuencia de repetición en héptada que precede al respectivo L1 o L2. Respetar esta norma disminuye considerablemente el riesgo de plegamiento no deliberado (por ejemplo, como una superhélice paralela), tal como se explicó anteriormente.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena en la que residuos de aminoácido cerca de los extremos terminales de L1 y/o L2 estabilizan los extremos alfa-helicoidales de la estructura de superhélice. Las posibilidades de seleccionar tales aminoácidos están bien documentadas en la bibliografía y se conocen generalmente como “aminoácidos de ocupación de extremos de hélice o motivos de ocupación de extremos de hélice”.
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Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena en la que residuos de aminoácido cerca de los extremos terminales de L1 y/o L2 promueven la formación de un giro local en la estructura. Las posibilidades de seleccionar tales aminoácidos incluyen, por ejemplo, la selección de aminoácidos que rompen la hélice tales como glicina y prolina, o aminoácidos que inician la hélice tales como serina o ácido aspártico. Determinados motivos de ocupación de extremos de hélice también se aplican para el mismo propósito. Alternativamente, pueden aplicarse motivos de hélice-bucle-hélice tal como se documenta en la bibliografía o se observa en el banco de datos de proteínas (PDB).
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena en la que posiciones de héptada convencionales “e” y “g” están ocupadas por glutaminas. El modelado por ordenador de moléculas de superhélice antiparalela de la presente invención sugirió que pares de glutamina en dichas posiciones pueden formar interacciones casi ideales (es decir, enlaces de hidrógeno favorables energéticamente) entre hélices antiparalelas, aumentando de ese modo la estabilidad global del plegamiento.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena en la que posiciones de héptada convencionales “b”, “c” y “f” son aminoácidos polares que promueven la solubilidad. Puesto que estas posiciones son las más expuestas al disolvente, la selección exclusiva de aminoácidos polares, y preferiblemente cargados, en estas posiciones puede potenciar considerablemente la solubilidad de dicha proteína.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena, que se pliega en disolución acuosa que tiene un pH de entre 1 y 13, o entre 2 y 12, o entre 3 y 11, o entre 4 y 10, o entre 5 y 9. El intervalo de pH en el que una proteína permanece plegada es un determinante importante de su aplicabilidad. Por ejemplo, la insensibilidad (tolerancia) a condiciones de pH extremas pueden hacerla adecuada para aplicaciones terapéuticas en las que la proteína necesita pasar a través de, o realizar su función en, el tracto gastrointestinal. Además, proteínas insensibles al pH pueden ser resistentes a las condiciones ácidas de la ruta lisosómica tras la endocitosis. Por tanto, las proteínas de la presente invención son preferiblemente estables en el intervalo de pH de 5-9, más preferiblemente 4-10, 3-11, 2-12 y lo más preferiblemente 1-13.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena, que se pliega en disolución acuosa que tiene una temperatura de entre 0ºC y 100ºC, o entre 0ºC y 80ºC, o entre 0ºC y 60ºC. La estabilidad térmica es un determinante importante de la estabilidad global (incluyendo estabilidad proteolítica y estabilidad a largo plazo o “vida útil”) y por tanto de la conservación de la función. Las proteínas de la presente invención son preferiblemente estables a intervalos temperatura de 0-60ºC, más preferiblemente 0-80ºC y lo más preferiblemente 0-100ºC.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena, que se pliega en disolución acuosa que tiene una fuerza iónica de entre 0 y 1,0 molar. Las condiciones fisiológicas requieren plegamiento estable y preservación de la función a fuerzas iónicas (en gran medida correspondientes a concentraciones salinas) de aproximadamente 150 milimolar. Las proteínas de la presente invención son preferiblemente estables (y funcionalmente activas) a intervalos más amplios de fuerza iónica, lo más preferiblemente en el intervalo de 0-1 molar.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena, que se usa como armazón. Las moléculas de proteína de la presente invención son sumamente útiles como armazones, tal como se explicó anteriormente.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una proteína de superhélice antiparalela de una sola cadena, tal como se muestra en la figura 15.
Las proteínas de la presente invención son susceptibles de un gran número de modificaciones, usando el conocimiento de la técnica, incluyendo (múltiples) sustituciones de aminoácidos, introducción de aminoácidos no naturales, unión de restos químicos particulares, extensiones peptídicas, marcaje, potenciación de la avidez a través de autoconcatenación, concatenación en proteínas de fusión, etc., sin comprometer (cambiar, destruir) el plegamiento de superhélice de la proteína. Varias de tales modificaciones pueden formularse en el presente documento para ilustrar el potencial intrínseco de la proteína para someterse a etapas de modificación por ingeniería avanzadas. Concretamente, los presentes inventores contemplan los siguientes productos modificados por ingeniería, que incluyen todos la proteína de la presente invención con todas sus características especificadas:
- •
- cualquier proteína de la presente invención puede modificarse en la secuencia de aminoácidos, creando de ese modo uno o más derivados de la misma;
- •
- cualquier proteína o derivado puede modificarse, por ejemplo, para mejorar su solubilidad;
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- cualquier proteína o derivado puede modificarse, por ejemplo, para mejorar su cinética de plegamiento;
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- •
- cualquier proteína o derivado puede modificarse, por ejemplo, para mejorar la corrección de su estado plegado;
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- cualquier proteína o derivado puede modificarse, por ejemplo, para mejorar su afinidad de unión a un compuesto diana;
- •
- cualquier proteína o derivado puede modificarse, por ejemplo, para mejorar su especificidad de unión por un compuesto diana;
- •
- cualquier proteína o derivado puede modificarse, por ejemplo, para mejorar su solubilidad;
- •
- cualquier proteína o derivado puede unirse covalentemente a cualquier otra proteína o molécula proteínica, o bien por medio de sus extremos N-y/o C-terminales o bien por medio de una o más de sus cadenas laterales;
- •
- cualquier proteína o derivado puede unirse covalentemente a otras copias de la misma proteína o derivado, por ejemplo, para aumentar la avidez;
- •
- cualquier proteína o derivado puede unirse covalentemente a cualquier proteína o derivado con diferentes propiedades de unión, por ejemplo, para proporcionar bi o multiespecificidad;
- •
- cualquier proteína o derivado puede unirse covalentemente a cualquier proteína o dominio proteico o péptido natural o no natural existente que no esté relacionado con la presente invención, incluyendo, sin limitación, dominios Fc, receptor de Fc, albúmina sérica, proteínas fluorescentes, moléculas de proteína de otro tipo, etc.;
- •
- cualquier proteína o derivado puede unirse covalentemente a una o más etiquetas de detección;
- •
- cualquier proteína o derivado puede unirse covalentemente a una o más etiquetas de purificación;
- •
- cualquier proteína o derivado puede unirse covalentemente a compuestos orgánicos por medio de una reacción química con uno o más restos de cadena lateral de la proteína;
- •
- cualquier proteína o derivado puede glicosilarse;
- •
- cualquier proteína o derivado puede pegilarse.
En vista del hecho de que la proteína de la presente invención, y derivados de la misma, forman estructuras estables y compactas, pueden construirse o manipularse, en principio, mediante todas las técnicas aplicables a proteínas.
Las moléculas de proteína de la presente invención pueden prepararse de manera sintética según técnicas bien conocidas en la técnica o pueden producirse por medio de ingeniería genética usando técnicas que también se conocen bien en la técnica. Cuando se preparan con técnicas de ingeniería genética, las moléculas de proteína de la invención se codifican por polinucleótidos (también denominados en el presente documento ácidos nucleicos), preferiblemente ADN o ARN. Las moléculas de proteína de la invención pueden codificarse por cualquier ácido nucleico según la degeneración del código genético del organismo huésped en el que se prepara la molécula de proteína.
Los polinucleótidos (también denominados en el presente documento ácidos nucleicos) de la presente invención pueden incorporarse en un vector recombinante, por ejemplo un vector de clonación o expresión. El término “vector” incluye vectores de expresión, vectores de transformación y vectores lanzadera. El término “vector de expresión” significa un constructo capaz de expresión in vivo o in vitro. El término “vector de transformación” significa un constructo capaz de transferirse desde una entidad a otra entidad, que puede ser de la misma especie o puede ser de una especie diferente. Si el constructo es capaz de transferirse desde una especie hasta otra, tal como desde un vector viral tal como VLMM o VIF a una línea celular o célula primaria humana o de mamífero, entonces el vector de transformación se denomina algunas veces “vector lanzadera”. Puede usarse una gran variedad de sistemas de expresión en diferentes huéspedes. Por ejemplo, sistemas episomales, cromosómicos y derivados de virus (por ejemplo vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófago, papovavirus tal como SV40, virus vaccinia, adenovirus y retrovirus). La secuencia de ADN puede insertarse en el vector mediante una variedad de técnicas. En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio de endonucleasa de restricción apropiado mediante procedimientos conocidos en la técnica y que se considera que están dentro del alcance de los expertos en la técnica. La secuencia de ADN en el vector de expresión está unida operativamente a secuencias de control apropiadas que dirigen la síntesis de ARNm (es decir, el promotor). Los vectores de la presente invención pueden transformarse en una célula huésped adecuada tal como se describe a continuación para proporcionar la expresión de una molécula de proteína de la presente invención. Por tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento para preparar moléculas de proteína según la presente invención que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión tal como se describió anteriormente en condiciones para proporcionar la expresión mediante el vector de una secuencia codificante que codifica para las moléculas de proteína, y recuperar las moléculas de proteína expresadas. Los vectores pueden ser, por ejemplo,
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fermentación de nutrientes convencional. La selección del medio apropiado puede basarse en la elección de huéspedes de expresión y/o basarse en los requisitos regulatorios del constructo de expresión. Tales medios los conocen bien los expertos en la técnica. El medio puede contener, si se desea, componentes adicionales que favorecen a los huéspedes de expresión transformados con respecto a microorganismos potencialmente contaminantes.
Ejemplos
Ejemplo 1. Secuencia de aminoácidos de un péptido sintético con residuos de núcleo y no de núcleo.
Este ejemplo proporciona la secuencia de aminoácidos de un péptido específico que está relacionado con la presente invención. La secuencia de aminoácidos, AIAAIQKQIAAIQKQIAAIQKQIA, se presenta en la notación de una sola letra, en la que A se refiere a alanina, I a isoleucina, Q a glutamina y K a lisina. Los péptidos con esta secuencia de aminoácidos forman complejos de superhélice alfa-helicoidal, de triple hebra por medio de sus residuos de aminoácido de isoleucina y leucina que forman un núcleo hidrófobo (centro, interior) y los otros residuos que se orientan hacia el disolvente. El péptido artificial comprende tres repeticiones en héptada marcadas como “HR1”, “HR2” y “HR3” en la figura 1.
La figura 1 es una representación esquemática de la secuencia de aminoácidos de un péptido artificial que comprende repeticiones en héptada (HRx), residuos de núcleo (recuadros negros), residuos no de núcleo (recuadros grises) y regiones flanqueantes (recuadros blancos). El péptido comprende además un residuo de núcleo de héptada C-terminal marcado como “t”. El péptido comprende además fragmentos flanqueantes N-y C-terminales marcados como “N” y “C”, respectivamente. Cada residuo de repetición en héptada se anota además con índices “a” a “g” y un número correspondiente al número de repetición en héptada. Los residuos de núcleo se ubican en las posiciones en a y d. Los 6 residuos de núcleo de las tres repeticiones en héptada completas son isoleucinas. El residuo de isoleucina marcado como “a4” pertenece a la repetición en héptada parcial “t”. Las repeticiones en héptada HR1, HR2 y HR3 y la repetición en héptada parcial “t” constituyen juntas una secuencia de repetición en héptada, que comienza con el residuo de núcleo a1 y termina con el residuo de núcleo a4.
Ejemplo 2. Principios de un complejo de superhélice alfa-helicoidal, de triple hebra.
Los residuos de núcleo de héptada se protegen del disolvente en complejos de superhélice alfa-helicoidal, de triple hebra, tal como se ilustra en la figura 2. Interacciones no covalentes entre residuos de núcleo en contacto (posiciones A y D en la figura 2) proporcionan la principal fuerza motriz termodinámica para que los péptidos adopten tal plegamiento.
La figura 2 es una representación en rueda helicoidal de estructuras de superhélice alfa-helicoidal, de triple hebra. El panel de la izquierda muestra una vista desde arriba de una superhélice paralela. El panel de la derecha muestra una vista desde arriba de una superhélice antiparalela. El panel del medio muestra la secuencia lineal de posiciones de repeticiones en héptada. Sólo se muestra una repetición en héptada por motivos de claridad. Se usan diferentes tonos para indicar posiciones topológicas específicas.
Los residuos de núcleo (posiciones A y D) están completamente escondidos en el complejo y no son accesibles para el disolvente. Los residuos no de núcleo (posiciones B, C, E, F y G) son accesibles al menos parcialmente para el disolvente (posiciones E, G menos que B, C, y posiciones B, C menos que F) y son susceptibles de sustituciones de aminoácido sin implicaciones (importantes) para la estabilidad del complejo.
Ejemplo 3. Estructura alfa-helicoidal y plegamiento/desplegamiento reversible.
Las superhélices alfa-helicoidales peptídicas no forman el objeto de la presente invención porque no se pliegan dando lugar a una proteína de una sola cadena. Sin embargo, las proteínas de una sola cadena de la presente invención sí comprenden una región de superhélice trimérica. Evidentemente, la conexión de los extremos N-y Cterminales mediante fragmentos de ligador puede influir (influirá) en la cinética de plegamiento, pero se espera que las propiedades físicas esenciales de los péptidos de superhélice “cortados” se conserven generalmente. Por tanto, las superhélices peptídicas pueden servir como sistema de estudio. Para demostrar la formación cuantitativa de estructura secundaria alfa-helicoidal de un péptido artificial de referencia en disolución, los inventores han sintetizado el péptido con la secuencia de aminoácidos Ac-MSIEEIQKQQAAIQKQIAAIQKQIYRMTP-NH2 y han registrado el espectro de dicroísmo circular (DC). La secuencia de aminoácidos se facilita en el código de una sola letra; Ac-y -NH2 significan que el péptido comenzaba por acetilo y terminaba en amida, respectivamente. Este péptido debe considerarse como un derivado del péptido de referencia compuesto por secuencia de repetición en héptada triple (IAAIQKQ)3, con modificaciones en los extremos amino-(N-) y carboxilo-(C-) terminales para mejorar la naturaleza alfa-helicoidal de los extremos terminales (a menudo denominado ocupación de extremos). Más específicamente, los residuos flanqueantes Ac-MS-se unieron al extremo N-terminal, en combinación con la sustitución de dos residuos de alanina (AA) por dos residuos de ácido glutámico (EE) consecutivos en la primera héptada de la secuencia de referencia. Además, los residuos flanqueantes -IYRMTP-NH2 se unieron al extremo Cterminal, de manera que los aminoácidos isoleucina (I) y metionina (M) se ubican en las posiciones a y d de héptada
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