JP2016506361A - Il−23に特異的に結合するポリペプチド - Google Patents
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Abstract
本出願は、IL−23に特異的に結合するアルファボディー、およびかかるアルファボディーを含有するかまたはかかるアルファボディーから本質的になるポリペプチドを提供する。かかるアルファボディーをコードする核酸;かかるアルファボディーおよびポリペプチドの調製方法;ならびに特に、かかるアルファボディー、ポリペプチド、核酸および/または宿主細胞を含有する医薬組成物も本明細書において提供される。
Description
本出願は、インターロイキン−23(IL−23)を対象とする結合剤、ならびに予防目的、治療目的または診断目的およびスクリーニングおよび検出におけるその使用に関する。
サイトカインの十分に特徴付けられたファミリーは、IL−12、IL−23、IL−27、CLC−sCNTFR、CLC−CLF−1、IL−35などのヘテロ二量体サイトカインのスーパーファミリーであり、これらのすべてがヘテロ二量体受容体と結合する。ヘテロ二量体サイトカインは、2個の異なるサブユニットからなる。これらのサブユニットの1つは、4へリックスバンドルドメインを含む。IL−23は、サイトカインIL−12と共有されているp40サブユニットと、p19または4へリックスバンドル構造を有するIL−23アルファサブユニットとからなる。
IL−23は、感染症に対する炎症応答において重要な役割を果たす。IL−23は、マトリックスメタロプロテアーゼMMP9のアップレギュレーションを促進し、血管新生を増加させ、CD8+T細胞の浸潤を減少させる。近年、IL−23は癌性腫瘍の発生に関係づけられた。IL−6およびTGF−β1と併せて、IL−23は、ナイーブCD4+T細胞を刺激し、古典的なTh1およびTh2細胞とは異なるTh17細胞と称される細胞の新規なサブセットに分化させる。Th17細胞は、T細胞のプライミングを増強し、例えば、IL−1、IL−6、TNF−アルファ、NOS−2および炎症をもたらすケモカインなどの炎症促進性分子の産生を刺激する炎症促進性サイトカインであるIL−17を産生する。
IL−23が、臓器特異的自己免疫疾患の重要なメディエーターであることが示されている〔エン(Yen)ら、2006〕。p40もしくはp19のいずれか、またはIL−23受容体のサブユニット(IL−23RおよびIL12R−β1)のいずれかを欠損したノックアウトマウスは、多発性硬化症および炎症性腸疾患のそれほど重症ではない症状を発症する。また、抗IL−23(p19)特異的抗体が、ヒトMSの前臨床モデルであるEAEを阻害できることが実証されている〔チェン(Chen)ら、2006〕。
治療抗体のウステキヌマブ(Ustekinumab)(CNTO1275の実験用名称でも以前から知られ、現在尋常性乾癬の治療用に承認されている)およびブリアキヌマブ(Briakinumab)(尋常性乾癬の治療のために第III相臨床試験およびMSのために第II相臨床試験中)は、IL−12およびIL−23の両方を中和するヒトモノクローナル抗体である。IL23/IL−12交差反応性によりもたらされる有害事象、より具体的には感染症の危険性が懸念される。リマ(Lima)ら、(2009)は、ウステキヌマブを使用した臨床研究において結核または他の日和見感染症の症例の報告はまったくないことを示しており、STELARA(商標)に関する医薬ガイドは、「STELARA(商標)を服用したにもかかわらず、結核(TB)および細菌、真菌またはウイルスにより引き起こされる感染症を含む、重症の感染症を発症する人もいる。それらの感染症の治療のために入院させなければならない人もいる」ことを述べている。また、ドラッグ・ドット・コム(Drug.com)ウェブサイト(ドラッグ・インフォメーション・オンライン(Drug Information Online))においてウステキヌマブに関して報告された副作用は、最大5%の上気道感染症を示す。
国際公開第2010/066740号は、単鎖で、三重のα−ヘリックスのコイルドコイル骨格である、アルファボディー骨格について記載している。また、国際公開第2012/093172号は、IL−23を含むサイトカインおよび成長因子を対象とするアルファボディーについて記載している。
インターロイキン−23(IL−23)に対する改善された結合剤が本明細書において開示される。アルファボディー骨格を使用して、高い親和性および特異性でIL−23に結合し、さらにIL−23活性を中和することができる結合剤を作製することができることが見出された。より具体的には、これらの特性をアルファボディーポリペプチドに付与するアルファボディモチーフが同定された。かかる結合剤は、当該技術分野において公知の従来の(免疫グロブリンおよび非免疫グロブリン)結合剤を上回るいくつかの利点を有する。利点は、限定されるものではないが、それらはサイズが小型で小さく(10および14kDaの間であり、これは抗体よりも10倍小さい)、それらは極めて安定であり(100℃を超える融解温度を有する)、それらは種々のプロテアーゼに対して抵抗性にすることができるという事実を含む。また、本結合剤は、商業的なIL−23抗体と比較して、ヒトにおける免疫原性が低下していることが示された。
IL−23に特異的に結合するアミノ酸配列を含有するポリペプチド、および予防目的、治療目的または診断目的のためのかかるポリペプチドの使用が本明細書において提供される。より具体的には、本明細書において想定されるポリペプチドは、IL−23を対象とする1個以上のアルファボディーであって、公知のIL−23結合剤およびIL−23を対象とする公知のアルファボディーよりも改善された特性を確保する配列モチーフを特徴とする1個以上のアルファボディーを含有する。実際、特定の配列モチーフの存在は、IL−23の生物学的活性を有効に中和する能力などの改善された特性を確保することが見出された。
一態様において、一般式HRS1−L1−HRS2−L2−HRS3を有するアミノ酸配列を含有し、アルファボディーの特徴に特徴づけられる、IL−23に特異的に結合するポリペプチドが提供される。より具体的には、一般式HRS1−L1−HRS2−L2−HRS3を有するアミノ酸配列は、
−HRS1、HRS2およびHRS3は、それぞれ独立して、2〜7個の連続するが必ずしも同一ではないヘプタッド反復単位を含有するかまたはこれからなるヘプタッド反復配列(HRS)を含有し、
−ヘプタッド反復単位は、「abcdefg」または「defgabc」(式中、「a」から「g」の記号は、通常のヘプタッドの位置を表わす)として表される7残基の(ポリ)ペプチドであり、
−すべてのヘプタッドのa位およびd位の少なくとも50%は、イソロイシン残基によって占められており、
−各HRSは、ヘプタッドのa位または「d」位に位置する脂肪族アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基で開始しており、
−L1およびL2は、それぞれ独立して、HRS1とHRS2とを共有結合的に連結し、HRS2とHRS3とを共有結合的に連結するリンカー断片であることを特徴とする。
−HRS1、HRS2およびHRS3は、それぞれ独立して、2〜7個の連続するが必ずしも同一ではないヘプタッド反復単位を含有するかまたはこれからなるヘプタッド反復配列(HRS)を含有し、
−ヘプタッド反復単位は、「abcdefg」または「defgabc」(式中、「a」から「g」の記号は、通常のヘプタッドの位置を表わす)として表される7残基の(ポリ)ペプチドであり、
−すべてのヘプタッドのa位およびd位の少なくとも50%は、イソロイシン残基によって占められており、
−各HRSは、ヘプタッドのa位または「d」位に位置する脂肪族アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基で開始しており、
−L1およびL2は、それぞれ独立して、HRS1とHRS2とを共有結合的に連結し、HRS2とHRS3とを共有結合的に連結するリンカー断片であることを特徴とする。
本明細書において想定されるポリペプチドは、HRS1−L1−HRS2−L2−HRS3モチーフのHRS1およびHRS3が特定の配列モチーフをさらに含有することをさらに特徴とする。より具体的には、本明細書において想定されるアミノ酸配列は、
−HRS1において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、グルタミン酸またはアラニンによって占められており、
(ii)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、バリンによって占められており、
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのc位が、アラニンまたはグリシンによって占められており、および
(iv)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、チロシンまたはトリプトファンによって占められており、ならびに
−HRS3において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、グルタミンまたはリジンによって占められており、
(ii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、ロイシンまたはイソロイシンまたはバリンによって占められており、
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、チロシンによって占められており、および
(iv)HRS3が、第3のヘプタッド反復の後に部分(a−f)ヘプタッド反復単位を含有し、その中のヘプタッドのb位が、メチオニンによって占められていること
を特徴とする。
−HRS1において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、グルタミン酸またはアラニンによって占められており、
(ii)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、バリンによって占められており、
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのc位が、アラニンまたはグリシンによって占められており、および
(iv)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、チロシンまたはトリプトファンによって占められており、ならびに
−HRS3において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、グルタミンまたはリジンによって占められており、
(ii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、ロイシンまたはイソロイシンまたはバリンによって占められており、
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、チロシンによって占められており、および
(iv)HRS3が、第3のヘプタッド反復の後に部分(a−f)ヘプタッド反復単位を含有し、その中のヘプタッドのb位が、メチオニンによって占められていること
を特徴とする。
特定の実施形態においては、本明細書において想定されるポリペプチドは、HRS1において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、グルタミン酸によって占められており、および/または
(ii)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、バリンによって占められており、および/または
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのc位が、アラニンによって占められており、および/または
(iv)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、チロシンによって占められていること
を特徴とする。
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、グルタミン酸によって占められており、および/または
(ii)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、バリンによって占められており、および/または
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのc位が、アラニンによって占められており、および/または
(iv)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、チロシンによって占められていること
を特徴とする。
さらに特定の実施形態においては、本明細書において想定されるポリペプチドは、HRS3において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、グルタミンによって占められており、および/または
(ii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、バリンによって占められており、および/または
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、チロシンによって占められており、および/または
(iv)HRS3が、第3のヘプタッド反復の後に部分(a−f)ヘプタッド反復単位を含有し、その中のヘプタッドのb位が、メチオニンによって占められていること
を特徴とする。
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、グルタミンによって占められており、および/または
(ii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、バリンによって占められており、および/または
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、チロシンによって占められており、および/または
(iv)HRS3が、第3のヘプタッド反復の後に部分(a−f)ヘプタッド反復単位を含有し、その中のヘプタッドのb位が、メチオニンによって占められていること
を特徴とする。
さらに特定の実施形態においては、本明細書において想定されるポリペプチドは、HRS1において、
(i)第1のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、グルタミン酸によって占められており、および/または
(ii)第1のヘプタッド反復単位のヘプタッドのc位が、グルタミンによって占められており、および/または
(iii)第1のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、リジンによって占められており、および/または
(iv)第1のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、グルタミン酸によって占められており、および/または
(v)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、スレオニンによって占められており、および/または
(vi)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのc位が、スレオニンによって占められており、および/または
(vii)HRS1が、第3のヘプタッド反復の後に部分(a−c)ヘプタッド反復単位を含有し、その中のヘプタッドのc位が、スレオニンによって占められていることを特徴とする。
(i)第1のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、グルタミン酸によって占められており、および/または
(ii)第1のヘプタッド反復単位のヘプタッドのc位が、グルタミンによって占められており、および/または
(iii)第1のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、リジンによって占められており、および/または
(iv)第1のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、グルタミン酸によって占められており、および/または
(v)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、スレオニンによって占められており、および/または
(vi)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのc位が、スレオニンによって占められており、および/または
(vii)HRS1が、第3のヘプタッド反復の後に部分(a−c)ヘプタッド反復単位を含有し、その中のヘプタッドのc位が、スレオニンによって占められていることを特徴とする。
さらに特定の実施形態においては、ポリペプチドは、HRS3において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、アラニンによって占められており、および/または
(ii)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、グルタミン酸によって占められており、および/または
(iv)第4のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、バリンによって占められており、および/または
(v)HRS3が、第3のヘプタッド反復の後に部分(a−f)ヘプタッド反復単位を含有し、その中のヘプタッドのf位が、セリンによって占められていることを特徴とする。
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、アラニンによって占められており、および/または
(ii)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、グルタミン酸によって占められており、および/または
(iv)第4のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、バリンによって占められており、および/または
(v)HRS3が、第3のヘプタッド反復の後に部分(a−f)ヘプタッド反復単位を含有し、その中のヘプタッドのf位が、セリンによって占められていることを特徴とする。
本明細書において想定されるポリペプチドの特定の実施形態は、HRS1が、配列番号(SEQ ID NO):1に定義されたアミノ酸配列を有し、および/またはHRS3が、配列番号:2に定義されたアミノ酸配列を有することを特徴とする。
本明細書において想定されるポリペプチドはまた、一般に、HRS1−L1−HRS2−L2−HRS3モチーフのHRS1およびHRS3が、以下を含むことを特徴とし得る:
−HRS1において、
(i)第1のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、スレオニンまたはリジンによって占められており、
(ii)第1のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、グルタミンまたはグルタミン酸によって占められており、
(iii)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、グルタミン酸またはアラニンによって占められており、
(iv)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、バリンによって占められており、
(v)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのc位が、アラニンまたはグリシンによって占められており、および
(vi)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、チロシンまたはトリプトファンによって占められている。
−HRS1において、
(i)第1のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、スレオニンまたはリジンによって占められており、
(ii)第1のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、グルタミンまたはグルタミン酸によって占められており、
(iii)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、グルタミン酸またはアラニンによって占められており、
(iv)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、バリンによって占められており、
(v)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのc位が、アラニンまたはグリシンによって占められており、および
(vi)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、チロシンまたはトリプトファンによって占められている。
また、アミノ酸配列は、
−HRS3において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、アラニンまたはスレオニンによって占められており、
(ii)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、グルタミンまたはリジンによって占められており、
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、チロシンによって占められており、
(iv)HRS3が、第3のヘプタッド反復の後に部分(a−f)ヘプタッド反復単位を含有し、その中のヘプタッドのb位が、メチオニンによって占められていることを特徴とする。
−HRS3において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、アラニンまたはスレオニンによって占められており、
(ii)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、グルタミンまたはリジンによって占められており、
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、チロシンによって占められており、
(iv)HRS3が、第3のヘプタッド反復の後に部分(a−f)ヘプタッド反復単位を含有し、その中のヘプタッドのb位が、メチオニンによって占められていることを特徴とする。
またさらに特定の実施形態においては、本明細書において想定されるポリペプチドは、それらがそれぞれ、配列番号:3〜22のいずれか1つに対応する配列を含有することを特徴とする。
ある特定の実施形態においては、本明細書において想定されるポリペプチドは、配列番号:3または配列番号:28と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する。特定の実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号:3に定義されたアミノ酸配列を含有する。
さらなる態様において、本出願は、医薬として使用するための本明細書において想定されるポリペプチドを提供する。特に、本明細書において想定されるポリペプチドは、炎症または炎症性障害、例えば、腸疾患(大腸炎、クローン病、IBD)、感染性疾患、乾癬、癌、自己免疫性疾患(例えば、MS)、サルコイドーシス(carcoidis)、移植拒絶、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、ウイルス感染症および一般的な分類不能型免疫不全からなる群より選ばれたIL−23媒介性疾患の治療方法および/または予防方法に使用するためのものである。
さらなる態様において、本出願は、診断薬として使用するための本明細書において想定されるポリペプチドを提供する。特に、本明細書において想定されるポリペプチドは、IL−23の異常発現または機能を検出するための方法に使用するためのものである。
またさらなる態様において、本出願は、本明細書において想定されるポリペプチドおよび薬学的に許容され得る担体を含有してなる医薬組成物を提供する。
さらなる態様において、本出願は、本明細書において想定されるポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
次に、以下の限定されない実施例および図面によって、本発明をさらに説明する。図面にある図は、以下を示す:
[定義]
本明細書において、単数形「a」、「an」および「the」は、特に明記しない限り、単数形および複数形の両方の指示対象を含む。
本明細書において、単数形「a」、「an」および「the」は、特に明記しない限り、単数形および複数形の両方の指示対象を含む。
本明細書において、「含有している(含んでいる)(comprising)」、「含有する(含む)(comprises)」および「から構成されている(comprised of)」という用語は、「含んでいる(including)」「含む(includes)」または「含有している(含んでいる)(containing)」、「含有する(含む)(contains)」と同じ意味であり、包括的または非限定的であり、追加の記載されていないメンバー、エレメントまたは方法のステップを排除するものではない。
端点による数値範囲の記載は、各範囲内に包含されたすべての数および有理数、ならびに記載されている端点を含む。
本明細書において、「約」という用語は、測定可能な値、例えば、パラメータ、量、持続時間などについて言及する場合、特定の値の、および特定の値から+/−10%以下、好ましくは+/−5%以下、より好ましくは+/−1%以下、さらにより好ましくは+/−0.1%以下の変動を、かかる変動が開示の本発明を実施するうえで適切である限り、包含することを意味する。修飾語句「約」が言及する値は、それ自体も明確に好ましく開示されていることが理解されるべきである。
本明細書において、「アルファボディー(Alphabody)」または「アルファボディー(Alphabodies)」は、単鎖で、三重の主にα−ヘリックスのコイルドコイルのアミノ酸配列のアミノ酸の配列として、全般に定義され得る。より具体的には、本発明との関連において使用する場合、アルファボディー構造は、一般式HRS1−L1−HRS2−L2−HRS3(式中、
−HRS1、HRS2およびHRS3は、それぞれ独立して、2〜7個の連続するが必ずしも同一ではないヘプタッド反復単位を含有するかまたはこれからなるヘプタッド反復配列(HRS)であり、すべてのヘプタッドのa位およびd位の少なくとも50%は、イソロイシン残基によって占められており、各HRSは、ヘプタッドの「a」位に位置する脂肪族アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基、特にイソロイシンで開始しており
−L1およびL2は、それぞれ独立して、HRS1とHRS2とを共有結合的に連結し、HRS2とHRS3とを共有結合的に連結する、以下でさらに定義されるリンカー断片である)を有するアミノ酸配列として定義することができる。
−HRS1、HRS2およびHRS3は、それぞれ独立して、2〜7個の連続するが必ずしも同一ではないヘプタッド反復単位を含有するかまたはこれからなるヘプタッド反復配列(HRS)であり、すべてのヘプタッドのa位およびd位の少なくとも50%は、イソロイシン残基によって占められており、各HRSは、ヘプタッドの「a」位に位置する脂肪族アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基、特にイソロイシンで開始しており
−L1およびL2は、それぞれ独立して、HRS1とHRS2とを共有結合的に連結し、HRS2とHRS3とを共有結合的に連結する、以下でさらに定義されるリンカー断片である)を有するアミノ酸配列として定義することができる。
上記の定義のアルファボディーまたはアルファボディー構造において、HRS1、HRS2およびHRS3は、ともに三重α−ヘリックスコイルドコイル構造を形成するであろう。
本明細書において、「平行アルファボディー」は、三重α−ヘリックスコイルドコイル構造のα−ヘリックスが、平行コイルドコイル構造、すなわち、3個のα−ヘリックスのすべてが平行方向にあるコイルドコイルをともに形成することをさらに特徴とする上記の定義のアルファボディーを指す。
本明細書において、「逆平行アルファボディー」は、三重α−ヘリックスコイルドコイル構造のα−ヘリックスが、逆平行コイルドコイル構造、すなわち、2個のα−ヘリックスが平行であり、かつ第3のα−ヘリックスがこれらの2個のヘリックスに対して逆平行であるコイルドコイルをともに形成することをさらに特徴とする上記の定義のアルファボディーを指す。
本明細書におけるさらなる説明から明らかになるように、本出願は、一般式HRS1−L1−HRS2−L2−HRS3を有するアミノ酸配列を含有する複数のポリペプチドを想定するが、ある特定の実施形態においては、これらポリペプチドは、さらなる残基、部分および/または基を含有し得、これらは式HRS1−L1−HRS2−L2−HRS3を有する基本アルファボディー配列構造に共有結合的に連結され、より具体的には、N末端および/またはC末端が共有結合的に連結される。したがって、本明細書において、さらなる配列に共有結合的に連結され得る上記の定義のアルファボディーを含有するかまたはこれからなる「(アルファボディー)ポリペプチド」について全般に言及される。本明細書において、アルファボディーに関して記載される結合特性は、前記アルファボディーを含有しているポリペプチドに全般に適用することもできる。
「ヘプタッド」、「ヘプタッド単位」または「ヘプタッド反復単位」という用語は、本明細書において互換的に使用され、本明細書においては、アルファボディー構造の各ヘプタッド反復配列内で2回以上反復される7残基の(ポリ)ペプチドモチーフの意味を有するものとし、「abcdefg」または「defgabc」(式中、「a」から「g」の記号は、通常のヘプタッドの位置を表わす)として表わされる。当業者によって理解されているように、これは、反復内の連続するヘプタッド単位が同じアミノ酸を含有する必要はないが、同じ位置に同じ種類のアミノ酸(以下に詳述するように、疎水性対極性)を含有するであろうことを意味する。通常のヘプタッド位置は、例えば、ルパス(Lupas)ら(サイエンス(Science)、1991、252:1162−1164;http://www.russell.embl−heidelberg.de/cgi−bin/coils−svr.pl)のCOILS法などの専門のソフトウェアを使用することによって、本明細書において想定されるアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物中に存在するヘプタッド、ヘプタッド単位またはヘプタッド反復単位内の特異的アミノ酸残基に割り当てられている。しかしながら、アルファボディー構造中に存在するヘプタッドまたはヘプタッド単位が、本明細書のさらなる説明により明らかになるように、厳密には、上記表記(すなわち、「abcdefg」または「defgabc」)に限定されるものではなく、それらのもっとも広い意味において、少なくとも割り当て可能なヘプタッドのa位およびd位を含有する7残基(ポリ)ペプチド断片それ自体を構築することに留意すべきである。
「ヘプタッドのa位」、「ヘプタッドのb位」、「ヘプタッドのc位」、「ヘプタッドのd位」、「ヘプタッドのe位」、「ヘプタッドのf位」および「ヘプタッドのg位」という用語は、それぞれ、ヘプタッド、ヘプタッド反復またはヘプタッド反復単位における通常の「a」、「b」、「c」、「d」、「e」、「f」および「g」のアミノ酸位置を指す。
「abcdefg」型の(本明細書において定義される)ヘプタッドモチーフは、一般的に、「HPPHPPP」として表わされ、一方、「defgabc」型の「ヘプタッドモチーフ」は、一般的に、「HPPPHPP」で表わされ、式中、記号「H」は、非極性アミノ酸残基または疎水性アミノ酸残基を表わし、記号「P」は、極性アミノ酸残基または親水性アミノ酸残基を表わす。a位またはd位に位置する典型的な疎水性残基としては、脂肪族アミノ酸残基(例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン)または芳香族アミノ酸残基(例えば、フェニルアラニン)が挙げられる。コイルドコイル配列内のヘプタッドは、極性残基が時として「H」位に位置し、疎水性残基が「P」位に位置することもあるので、必ずしも疎水性残基および極性残基の理想的なパターンに従うものではない。したがって、パターン「HPPHPPP」および「HPPPHPP」は、理想的なパターンおよび特徴的な参照モチーフとして考えるべきである。特徴的ヘプタッドモチーフは、「HPPHCPC」または「HxxHCxC」として表わされ、式中「H」および「P」は上記と同じ意味を有し、「C」は荷電残基(リジン、アルギニン、グルタミン酸またはアスパラギン酸)を表わし、「x」は任意の(非特定)天然アミノ酸残基を表わすこともある。ヘプタッドは、同様に良好にd位から開始してもよく、後者のモチーフは、「HCPCHPP」または「HCxCHxx」として書くこともできる。単鎖アルファボディーは、ヘプタッドのe位およびg位の荷電(「C」)残基の間のイオン相互作用の助けを必要としないほど、本来安定であることに留意すべきである。
本明細書において使用される「ヘプタッド反復配列」(「HRS」)は、n個の連続するヘプタッド(式中、nは、2以上の数字である)を含有するかまたは当該ヘプタッドからなるアミノ酸配列または配列断片の意味を有するものとする。
したがって、ヘプタッド反復配列(HRS)は、a)a〜g位またはH位およびP位のアミノ酸が、異なるヘプタッドにおける同一のアミノ酸である必要はなく、b)HRSにおけるすべてのアミノ酸残基が、疎水性残基および極性残基の理想的なパターンに厳密に従うとは限らず、c)HRSが、不完全または部分的なヘプタッドモチーフで終了し得るという条件で、通常のヘプタッドの位置を指す表記法において(abcdefg)nもしくは(defgabc)nまたはヘプタッドモチーフを指す表記法において(HPPHPPP)nもしくは(HPPPHPP)nにより一般に表すことができる。後者に関しては、特定の実施形態においては、c末端の(abcdefg)n配列の後にさらなる配列「abc」、「abcd」、「abcde」または「abcdef」を含有してもよい。しかしながら、本明細書において想定されるアルファボディー構造の特定の実施形態においては、「ヘプタッド反復配列」(「HRS」)は、abcdefgまたはdefgabcによって一般に表されるn個の連続する(しかし、必ずしも同一ではない)ヘプタッドを含有するアミノ酸配列または配列断片であり、nは、2以上の数字であり、すべてのヘプタッドのa位およびd位の少なくとも50%は、イソロイシン残基によって占められており、各HRSが、ヘプタッドのa位またはd位のいずれかに位置する脂肪族アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基で開始および終了するように、各HRSは、完全ヘプタッド配列abcdefgまたはdefgabcで開始し、部分ヘプタッド配列abcdまたはdefgaで終了する。
ヘプタッド反復配列および/またはそれらの境界、コンセンサスモチーフから逸脱したアミノ酸またはアミノ酸配列を含有するこれらのヘプタッド反復配列を同定するために、アミノ酸配列の情報のみが手元にある場合、ルパス(Lupas)ら(サイエンス(Science)、1991,252:1162−1164〕のCOILS法が、ヘプタッド反復配列およびそれらの境界、ならびにヘプタッドの位置の割り当ての決定または予測のための適切な方法である。さらに、ヘプタッド反復配列は、一次構造(すなわち、アミノ酸配列)より高レベルでの知見に基づき解明され得る。実際、ヘプタッド反復配列は、二次構造情報(すなわち、α−ヘリックス性)または三次構造(すなわち、タンパク質のフォールディング)情報に基づき同定および描写することができる。推定HRSの典型的な特徴は、α−ヘリックス構造である。別の(強力な)基準は、コイルドコイル構造中の配列または断片の意味である。規則的なコイルドコイル構造、すなわち、ブラウン(Brown)ら、Proteins 1996,26:134−145に記載されたようなスタッター(stutters)またはスタマー(stammers)を含まないコイルドコイル構造を形成することが公知である任意の配列または断片が、本明細書においてHRSと考えられる。さらに、より具体的には、HRS断片の同定は、高解像度の3−D構造情報(X線またはNMR構造)に基づくことができる。最終的に、特定の実施形態においては、HRS断片の境界は、(バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンの群より選ばれる)標準の疎水性アミノ酸残基が位置する第1のa位またはd位として定義することができる。特定の実施形態においては、HRS断片の境界は、イソロイシンアミノ酸残基の存在によって定義することができる。
(本明細書において定義される)アルファボディーの単鎖構造との関連において、「リンカー」、「リンカー断片」または「リンカー配列」という用語は、本明細書において互換的に使用され、単鎖アルファボディーの連続するアミノ酸配列の一部であるアミノ酸配列断片であって、そのアルファボディー構造のHRS配列を共有結合的に相互に連結させるアミノ酸配列断片を指す。
したがって、(本明細書において定義される)アルファボディーの単鎖構造内のリンカーは、HRS配列、より具体的には、アルファボディー構造における第1のHRSと第2のHRSとを相互に連結させ、かつ第2のHRSと第3のHRSとを相互に連結させている。アルファボディー構造における各リンカー配列は、先行するHRSの最後のヘプタッド残基に続いて開始し、次のHRSの最初のヘプタッド残基に先行する残基で終了する。HRS断片間のジスルフィド架橋もしくは化学的架橋を介した、または一般の、(鎖内結合に対する)鎖間結合の任意の手段を介した連結は、単鎖アルファボディーの定義と矛盾するので、リンカー断片の定義から(少なくともアルファボディーに関連して)明白に除外される。アルファボディー構造におけるリンカー断片は、好ましくは立体構造において柔軟であり、α−ヘリックスコイルドコイル構造としての3個のヘプタッド反復配列の緩んだ(妨害されない)会合を確保する。さらに、アルファボディーとの関連において、「L1」は、リンカー断片1、すなわち、HRS1とHRS2との間のリンカーを表わし、一方、「L2」は、リンカー断片2、すなわち、HRS2とHRS3との間のリンカーを表わすものとする。本明細書において想定されるポリペプチドにおける使用に適切なリンカーは、当業者には明らかであろうし、アルファボディーの特徴的な三次元コイルドコイル構造に影響を与えないという意味で、リンカーが構造的に柔軟であれば、一般にアミノ酸配列を連結する当該技術分野において使用される任意のリンカーであってよい。特定のアルファボディー構造における2個のリンカーL1およびL2は、同じであってもよく、異なっていてもよい。本明細書のさらなる開示に基づいて、当業者は、任意に、限られた数の日常的実験の実施後に、最適なリンカーを決定することができるであろう。特定の実施形態においては、リンカーL1およびL2は、少なくとも4個のアミノ酸残基、具体的には、少なくとも8個のアミノ酸残基、さらに具体的には少なくとも12個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、利便性の理由から選ばれた重要性の低い上限は、約30個のアミノ酸残基である。具体的には、限定されない実施形態においては、好ましくは、リンカー配列の少なくとも50%のアミノ酸残基は、プロリン、グリシンおよびセリンの群より選ばれる。さらなる限定されない実施形態においては、好ましくは、リンカー配列の少なくとも60%、例えば、少なくとも70%、例えば、80%など、より具体的には、90%のアミノ酸残基は、プロリン、グリシンおよびセリンの群より選ばれる。他の特定の実施形態においては、リンカー配列は、極性アミノ酸残基から本質的になり、かかる特定の実施形態においては、好ましくはリンカー配列の少なくとも50%、例えば、少なくとも60%、例えば、70%または80%など、より具体的には90%または最大100%のアミノ酸残基はグリシン、セリン、スレオニン、アラニン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、リジンおよびアルギニンからなる群より選ばれる。
本出願において、「コイルドコイル」または「コイルドコイル構造」への言及は、本明細書において互換的に使用され、当業者には、共通の一般知識ならびに本明細書に引用した説明およびさらなる参考文献に基づき明らかであろう。これに関する具体的な参考文献は、コイルドコイル構造に関する総説、例えば、コヘン(Cohen)およびパリー(Parry)、Proteins 1990,7:1−15;コーン(Kohn)およびホッジ(Hodges)、Trends Biotechnol 1998,16:379−389;シュナイダー(Schneider)ら、Fold Des 1998,3:R29−R40;ハーブリー(Harbury)ら、Science 1998,282:1462−1467;メーソン(Mason)およびアーント(Arndt)、ChemBioChem 2004,5:170−176;ルパス(Lupas)およびグリューバー(Gruber)、Adv Protein Chem 2005,70:37−78;ウールフソン(Woolfson)、Adv Protein Chem 2005,70:79−112;パリー(Parry)ら、J Struct Biol 2008,163:258−269;マクファーレン(McFarlane)ら、Eur J Pharmacol 2009:625:101−107などを特に参照されたい。
アルファボディー構造のα−ヘリックスの「溶媒配向(solvent−oriented)」または「溶媒曝露」領域は、本明細書において、それが存在する溶媒、環境、周囲または周辺(milieu)に直接曝露されるか、または直接接触するアルファボディー構造の部分の意味を有するものである。溶媒配向領域は、b残基、c残基およびf残基によって大部分が形成される。1個の単鎖アルファボディーあたり3個、すなわち、各α−へリックス中1個のかかる領域が存在する。かかる溶媒配向領域の任意の部分が、溶媒配向領域であるとも考えられる。例えば、アルファボディーのα−へリックスにおける3個の連続するヘプタッド由来のb残基、c残基およびf残基によって構成されるサブ領域も、溶媒配向表面領域を形成するものである。
「アルファボディーの溝」という用語は、本明細書において、アルファボディー内の空間的に隣接したα−ヘリックスの任意の対によって形成される、くぼんだ溝様の局所的形状に対応する本明細書において想定されるポリペプチドのアルファボディーの部分の意味を有するものとする。アルファボディーにおける隣接する2個のα−ヘリックスの間の溝(の表面)の形成に関係する残基は、一般に、ヘプタッドのe位およびg位に位置するが、より曝露されたb位およびc位のいくつか、ならびに大部分が埋もれたコアのa位およびd位のいくつかも、溝表面に寄与することができ、このことは、これらの位置に置かれたアミノ酸側鎖のサイズに基本的に依存するものであろう。空間的に隣接する前記α−ヘリックスが平行に延びている場合、ついで、溝の半分は、第1のヘリックス由来のb残基およびe残基により形成され、他の半分は第2のヘリックスのc残基およびg残基により形成される。前記空間的に隣接するα−ヘリックスが逆平行である場合、そのとき、2つの可能性が存在する。第1の可能性において、溝の両方の半分がb残基およびe残基により形成される。第2の可能性において、溝の両方の半分がc残基およびg残基により形成される。3タイプの溝候補が、本明細書においてそれらの主要な溝形成(eおよびgの)残基により表わされ、ヘリックスが平行である場合、その時は、溝はe/g溝と称され、ヘリックスが逆平行である場合、そのとき、溝は、e/e溝またはg/g溝のいずれかと称される。平行アルファボディーは、3個のe/g溝を有し、一方、逆平行アルファボディーは、1個のe/g溝、1個のe/e溝および1個のg/g溝を有する。また、アルファボディー溝の任意の部分も溝領域と考えられる。
本明細書において、アミノ酸残基は、それらの正式名称によって示されるか、または標準的な3文字もしくは1文字のアミノ酸コードにしたがって示されるであろう。
本明細書において、「相同性」という用語は、同じ分類群または異なる分類群に由来する2個の高分子間、具体的には、2個のポリペプチド間または2個のポリヌクレオチド間の少なくとも二次構造の類似性を表わし、前記類似性は、共通の祖先に起因する。したがって、「ホモログ」という用語は、前記二次構造の類似性、および任意に、三次構造の類似性を有する非常に関連性のある高分子を表わす。2個以上のヌクレオチド配列を比較するために、第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列との間の「配列同一性(のパーセンテージ)」は、当業者に公知の方法を使用することによって、例えば、第1のヌクレオチド中のヌクレオチドであって、第2のヌクレオチド配列における対応する位置のヌクレオチドと同一のヌクレオチドの数を、第1のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数で割り、100%を乗じることによって、またはシーケンスアライメントのための公知のコンピュータアルゴリズム、例えば、NCBI Blastなどを使用することによって計算され得る。2個のアルファボディー間の配列同一性の程度を決定する際、当業者であれば、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮することができ、保存的アミノ酸置換は、一般に、あるアミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換であって、ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性に対してほとんど影響を及ぼさないか、または本質的にまったく影響を及ぼさないアミノ酸置換として説明され得る。可能な保存的アミノ酸置換は、当業者には明らかであろう。アルファボディーおよび核酸配列は、これらが、それらの全長にわたって100%の配列同一性を有する場合、「まったく同じもの」であると言われる。
ポリペプチドが、その標的(またはこれらの少なくとも一部もしくは断片)に対する親和性、特異性を有する、および/またはその標的を特異的に対象とする場合、ポリペプチドまたは(それに含まれるアルファボディー構造)は、特定の標的「に特異的に結合する」と言われる。
本明細書において、抗IL23ポリペプチドの「特異性」は、親和性および/またはアビディティに基づいて決定され得る。ポリペプチドの「親和性」は、ポリペプチドとIL−23との解離に関する平衡定数により表わされる。KD値が低いほど、ポリペプチドとIL−23との間の結合力がより強くなる。代替的には、親和性は、1/KDに対応する親和定数(KA)としても表わされ得る。抗IL23ポリペプチドの結合親和性は、具体的な目的の標的タンパク質に応じて、当業者に公知の方法で決定され得る。KDが、kOff(秒−1またはs−1で表わされる)で示される複合体の解離速度定数のkOn(モル−1秒−1またはM−1s−1で表わされる)で示されるその結合速度定数に対する比として表わされ得ることが、当該技術分野において一般的に公知である。約1ミリモルより大きいKD値は、一般に、非結合または非特異的結合を示すとみなされる。
抗IL23ポリペプチドの「アビディティ」は、前記ポリペプチドとIL−23との間の結合力の大きさの尺度である。アビディティは、IL−23における結合部位と、ポリペプチド内のアルファボディーにおける結合部位との間の親和性、およびアルファボディーに存在する関連結合部位の数の両方に関係するものである。
本明細書において想定される抗IL23ポリペプチドは、ポリペプチドが目的の第2の標的タンパク質に結合する親和性に対し、少なくとも5倍、例えば、少なくとも10倍、例えば、少なくとも100倍、好ましくは少なくとも1000倍高い親和性で目的の第1のタンパク質に結合する場合、「目的の第2の標的タンパク質に対してではなく目的の第1の標的タンパク質に対して特異的」であると言われる。したがって、ある実施形態においては、ポリペプチドが目的の第2の標的タンパク質に対してではなく目的の第1の標的タンパク質に対して特異的であると言われる場合、ポリペプチドは、目的の第1の標的タンパク質に(本明細書において定義したように)特異的に結合するが、目的の第2の標的タンパク質とは結合しないであろう。
抗IL23ポリペプチドの「半減期」は、一般に、ポリペプチドのイン・ビボの血清濃度または血漿濃度が50%減少するまでに必要な時間として定義することができる。抗IL23ポリペプチドのイン・ビボ半減期は、当業者に公知の任意の方法、例えば、薬物動態分析によって決定され得る。当業者に明らかであるように、半減期は、t1/2−α、t1/2−β、曲線下面積(AUC)などのパラメータを使用して表わされ得る。イン・ビボの半減期の増加は、一般に、t1/2−アルファ、t1/2−ベータおよび曲線下面積(AUC)の1個以上のパラメータの増加、好ましくは3つすべてのパラメータの増加によって特徴付けられる。
本明細書において、「阻害」、「低減」および/または「抑制」という用語は、IL−23に特異的に結合し、IL−23とその受容体との間の相互作用を阻害、低減および/または抑制する抗IL23ポリペプチド(の使用)を指し得る。
抗IL23ポリペプチドは、異なる目的標的タンパク質の両方に(本明細書において定義したように)特異的である場合、2個の異なる目的標的タンパク質に対して「交差反応性」を示すと言われる。
本明細書において、「予防および/または治療」という用語は、特定の疾患および/または障害を予防および/または治療すること、特定の疾患および/または障害の発症を予防すること、特定の疾患および/または障害の進行を遅延または回復させること、特定の疾患および/または障害に伴う1つ以上の症状の発症を予防または遅延させること、特定の疾患および/または障害に伴う1つ以上の症状を軽減および/または緩和すること、特定の疾患および/または障害の重症度および/または持続期間を軽減すること、ならびに一般には、治療されている対象(subject)または患者(patient)にとって有益な本発明のアルファボディーの任意の予防効果または治療効果を含む。
本明細書に引用されたすべての文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。特に定義されない限り、専門用語および科学用語などの本発明の開示に使用されるすべての用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。さらなるガイダンスによって、用語の定義は、本発明の教示をより理解するために包含される。
[発明に関する説明]
本発明者らは、IL−23に特異的に結合するポリペプチドを同定した。より具体的には、本出願は、IL−23、より具体的にはIL−23のp19サブユニットに特異的に結合する少なくとも1個のアルファボディー配列を含有するポリペプチドを提供する。また、IL−23結合ポリペプチドは、ナノモル以下の範囲内にある親和性でIL−23に結合するだけではなく、IL−23の生物学的活性を中和することができることが見出された。
本発明者らは、IL−23に特異的に結合するポリペプチドを同定した。より具体的には、本出願は、IL−23、より具体的にはIL−23のp19サブユニットに特異的に結合する少なくとも1個のアルファボディー配列を含有するポリペプチドを提供する。また、IL−23結合ポリペプチドは、ナノモル以下の範囲内にある親和性でIL−23に結合するだけではなく、IL−23の生物学的活性を中和することができることが見出された。
また、少なくとも1個のアルファボディーのアミノ酸配列を含有する本明細書において想定されるIL−23結合ポリペプチドは、アルファボディー骨格について同定された利点を維持する。アルファボディーは、特有の構造を有するだけではなく、当該技術分野において公知の従来の(免疫グロブリンおよび非免疫グロブリン)骨格を上回るいくつかの利点を有する。これらの利点は、限定されるものではないが、それらはサイズが小型で小さく(10および14kDaの間であり、これは抗体よりも10倍小さい)、それらは極めて熱安定性であり(すなわち、これらは全般に100℃を超える融解温度を有する)、それらは種々のプロテアーゼに対して抵抗性にすることができ、これらは(多重置換が、それらの正確および安定なフォールディングを通常破壊しないであろうという意味で)高度に操作可能であり、タンパク質工学技術を介して再設計されている天然のモチーフに基づく構造を有するという事実を含む。最後に、本明細書において想定されるポリペプチドは、公知の抗体IL−23結合剤(例えば、ウステキヌマブ)と比較して減少した免疫原性を有することが観察された。
したがって、本出願は、ヘテロ二量体サイトカインIL−23に特異的に結合することができ、本明細書において記載されるアッセイで決定された場合にその生物学的活性を中和することができるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを提供する。本明細書において想定されるポリペプチドは、アルファボディーの構造モチーフに対応するアミノ酸配列を含有する。したがって、本明細書において想定されるポリペプチドは、一般式
HRS1−L1−HRS2−L2−HRS3
(式中、−HRS1、HRS2およびHRS3は、それぞれ独立して、2〜7個の連続するヘプタッド反復単位を含有するかまたは当該ヘプタッド反復単位からなるヘプタッド反復配列(HRS)であり、
−前記ヘプタッド反復単位は、「abcdefg」または「defgabc」(式中、「a」〜「g」の記号は、通常のヘプタッドの位置を表わす)として表される7残基の(ポリ)ペプチド断片であり、
−すべてのヘプタッドのa位およびd位の少なくとも50%は、イソロイシン残基によって占められており、
−各HRSは、ヘプタッドのa位に位置する脂肪族アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基で開始しており、
−L1およびL2は、それぞれ独立して、HRS1とHRS2とを共有結合的に連結し、HRS2とHRS3とを共有結合的に連結するリンカー断片である)
を有するアミノ酸配列を含有する。
HRS1−L1−HRS2−L2−HRS3
(式中、−HRS1、HRS2およびHRS3は、それぞれ独立して、2〜7個の連続するヘプタッド反復単位を含有するかまたは当該ヘプタッド反復単位からなるヘプタッド反復配列(HRS)であり、
−前記ヘプタッド反復単位は、「abcdefg」または「defgabc」(式中、「a」〜「g」の記号は、通常のヘプタッドの位置を表わす)として表される7残基の(ポリ)ペプチド断片であり、
−すべてのヘプタッドのa位およびd位の少なくとも50%は、イソロイシン残基によって占められており、
−各HRSは、ヘプタッドのa位に位置する脂肪族アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基で開始しており、
−L1およびL2は、それぞれ独立して、HRS1とHRS2とを共有結合的に連結し、HRS2とHRS3とを共有結合的に連結するリンカー断片である)
を有するアミノ酸配列を含有する。
アルファボディー構造内、より具体的にはそのHRS1およびHRS3内の特定の配列モチーフは、標的IL−23の活性を中和することができることが見出された。この配列モチーフの存在は、IL−23に対する結合を確保し、これが、以前に記載されているIL−23ターゲティングアルファボディー(例えば、国際公開第2012/093172号に記載されているもの)では観察されない中和効果を確保する。
アルファボディーの改善された特性は、アルファボディーのHRS1および/またはHRS3における特定の位置の特定のアミノ酸の存在に起因し得る。より具体的には、
−HRS1において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、グルタミン酸またはアラニンによって占められており、
(ii)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、バリンによって占められており、
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのc位が、アラニンまたはグリシンによって占められており、および
(iv)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、チロシンまたはトリプトファンによって占められており、ならびに
−HRS3において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、グルタミンまたはリジンによって占められており、
(ii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、ロイシンまたはイソロイシンまたはバリンによって占められており、
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、チロシンによって占められており、および
(iv)HRS3が、第3のヘプタッド反復の後に部分(a−f)ヘプタッド反復単位を含有し、その中のヘプタッドのb位が、メチオニンによって占められていることが見出された。
−HRS1において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、グルタミン酸またはアラニンによって占められており、
(ii)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、バリンによって占められており、
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのc位が、アラニンまたはグリシンによって占められており、および
(iv)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、チロシンまたはトリプトファンによって占められており、ならびに
−HRS3において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、グルタミンまたはリジンによって占められており、
(ii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、ロイシンまたはイソロイシンまたはバリンによって占められており、
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、チロシンによって占められており、および
(iv)HRS3が、第3のヘプタッド反復の後に部分(a−f)ヘプタッド反復単位を含有し、その中のヘプタッドのb位が、メチオニンによって占められていることが見出された。
実際、驚くべきことに、比較的限られた数のアミノ酸位置が、IL−23に対する結合に有意に寄与することが見出された。
同定されたモチーフにおけるアミノ酸の位置は、アルファボディー構造のHRS1またはHRS3内の関連(部分)ヘプタッド(1−2−…)における位置(a−b−c−d−e−f−g)を示すことによって参照することができる。したがって、HRS1が、位置1a1b1c1d1e1f1g、2a2b2c2d2e2f2gおよび3a3b3c3d3e3f3gを有する少なくとも3個のヘプタッドの存在を特徴とする場合、HRS1の同定されたモチーフは、
HRS1について、
(i)2f位は、グルタミン酸またはアラニンによって占められており、
(ii)2g位は、バリンによって占められており、
(iii)3c位は、アラニンまたはグリシンによって占められており、および
(iv)3g位は、チロシンまたはトリプトファンによって占められているとも示され得る。
HRS1について、
(i)2f位は、グルタミン酸またはアラニンによって占められており、
(ii)2g位は、バリンによって占められており、
(iii)3c位は、アラニンまたはグリシンによって占められており、および
(iv)3g位は、チロシンまたはトリプトファンによって占められているとも示され得る。
同様に、HRS3が、位置1a1b1c1d1e1f1g、2a2b2c2d2e2f2gおよび3a3b3c3d3e3f3gを有する少なくとも3個のヘプタッドの存在を特徴とする場合、HRS3の同定されたモチーフは、
HRS3について、
(i)2e位は、グルタミンまたはリジンによって占められており、
(ii)3b位は、ロイシンまたはイソロイシンまたはバリンによって占められており、
(iii)3e位は、チロシンによって占められており、および
(iv)また、HRS3が、第3のヘプタッドの後に部分ヘプタッド(a−f)を含有し、その中のヘプタッドの4b位が、メチオニンによって占められているとも示され得る。
HRS3について、
(i)2e位は、グルタミンまたはリジンによって占められており、
(ii)3b位は、ロイシンまたはイソロイシンまたはバリンによって占められており、
(iii)3e位は、チロシンによって占められており、および
(iv)また、HRS3が、第3のヘプタッドの後に部分ヘプタッド(a−f)を含有し、その中のヘプタッドの4b位が、メチオニンによって占められているとも示され得る。
上記のように、特定の位置において、得られるポリペプチドの特性に対する影響がごく限られた限定的な変化が可能であることが、得られた種々のアルファボディーに基づいて決定された。しかしながら、改善された特性を有するポリペプチドは、HRS1において、
(i)2f位が、グルタミン酸によって占められており、および/または
(ii)2g位が、バリンによって占められており、および/または
(iii)3c位が、アラニンによって占められており、および/または
(iv)3g位が、チロシンによって占められている場合に得られることが立証された。
(i)2f位が、グルタミン酸によって占められており、および/または
(ii)2g位が、バリンによって占められており、および/または
(iii)3c位が、アラニンによって占められており、および/または
(iv)3g位が、チロシンによって占められている場合に得られることが立証された。
同様に、改善された特性を有するポリペプチドは、第3のヘプタッドの後に部分(a−f)ヘプタッドを含有するHRS3において、
(i)2e位が、グルタミンによって占められており、および/または
(ii)3b位が、バリンによって占められており、および/または
(ii)3e位が、チロシンによって占められており、および/または
(iii)4b位が、メチオニンによって占められている場合に得られることが観察された。
(i)2e位が、グルタミンによって占められており、および/または
(ii)3b位が、バリンによって占められており、および/または
(ii)3e位が、チロシンによって占められており、および/または
(iii)4b位が、メチオニンによって占められている場合に得られることが観察された。
本明細書において想定されるポリペプチドのアルファボディー構造内の残りの位置は、あまり重要ではないと考えられるが、特定の実施形態においては、本明細書において想定されるポリペプチドは、HRS1において、
(i)1b位が、グルタミン、グルタミン酸またはリジンによって占められており、および/または
(ii)1c位が、グルタミン、グルタミン酸またはリジンによって占められており、および/または
(iii)1f位が、スレオニンまたはリジンによって占められており、および/または
(iv)1g位が、グルタミンまたはグルタミン酸によって占められており、および/または
(v)2b位が、スレオニン、アラニンまたはリジンによって占められており、および/または
(vi)2c位が、スレオニン、グルタミン、アスパラギンまたはセリンによって占められており、および/または
(vii)HRS1が、第3のヘプタッドの後に部分ヘプタッド(a−c)を含有し、その中の4c位が、スレオニン、アルギニン、グリシン、セリン、ロイシンまたはメチオニンによって占められており、
および/または、第3のヘプタッドの後に部分(a−f)ヘプタッドを含有するHRS3において、
(i)2b位が、アラニンまたはスレオニンによって占められており、および/または
(ii)2f位が、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸、アラニン、アスパラギンまたはアルギニンによって占められており、および/または
(iii)4e位が、アラニン、バリン、セリン、プロリン、グリシン、リジンまたはスレオニンによって占められており、および/または
(iv)4f位が、セリン、スレオニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、イソロイシン、グリシン、ロイシンまたはプロリンによって占められていることをさらに特徴とすることに留意することができる。
(i)1b位が、グルタミン、グルタミン酸またはリジンによって占められており、および/または
(ii)1c位が、グルタミン、グルタミン酸またはリジンによって占められており、および/または
(iii)1f位が、スレオニンまたはリジンによって占められており、および/または
(iv)1g位が、グルタミンまたはグルタミン酸によって占められており、および/または
(v)2b位が、スレオニン、アラニンまたはリジンによって占められており、および/または
(vi)2c位が、スレオニン、グルタミン、アスパラギンまたはセリンによって占められており、および/または
(vii)HRS1が、第3のヘプタッドの後に部分ヘプタッド(a−c)を含有し、その中の4c位が、スレオニン、アルギニン、グリシン、セリン、ロイシンまたはメチオニンによって占められており、
および/または、第3のヘプタッドの後に部分(a−f)ヘプタッドを含有するHRS3において、
(i)2b位が、アラニンまたはスレオニンによって占められており、および/または
(ii)2f位が、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸、アラニン、アスパラギンまたはアルギニンによって占められており、および/または
(iii)4e位が、アラニン、バリン、セリン、プロリン、グリシン、リジンまたはスレオニンによって占められており、および/または
(iv)4f位が、セリン、スレオニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、イソロイシン、グリシン、ロイシンまたはプロリンによって占められていることをさらに特徴とすることに留意することができる。
ポリペプチドのアルファボディー構造の残りの位置は、あまり重要ではないことが決定された。より具体的には、本明細書において想定される改善された特性を有するポリペプチドにおいて、HRS2ヘプタッド反復の配列は、限定的な重要性のものであることが見出された、HRS2の単に例示的な配列は、図1のポリペプチド1〜20中に存在する配列番号:27に示されているHRS2配列に対応する。
特定の実施形態においては、HRS1が、配列番号:1に定義されたアミノ酸配列(IEQIQKEITT IQEVIAAIQK YIYTM)を有するポリペプチドが提供される。さらに特定の実施形態においては、HRS3は、配列番号:2に定義されたアミノ酸配列(IEEIQKQIAA IQEQIVAIYK QIMAM)を有する。さらに特定の実施形態においては、配列番号:3〜22から選ばれた配列を含有するポリペプチドが提供される(図1)。
本明細書において想定されるポリペプチドは、後のヘプタッド反復配列HRS1、HRS2、HRS3を連結するリンカーを含有する。本明細書において想定されるポリペプチドの結合特性に関して、リンカーの性質は、重要ではないと想定される。特定の実施形態においては、リンカー配列は、最小約8アミノ酸長のグリシンおよびセリンリッチ配列である。特定の実施形態においては、リンカーは、GGSGGSGG(配列番号:23)またはGSGGGGSG(配列番号:24)などの「グリシン/セリンリッチ」配列の1個または2個の反復を含有する。HRS1とHRS2とを連結するリンカー(「リンカー1」とも称される)は、HRS2とHRS3とを連結するリンカー(「リンカー2」とも称される)と同じものであってもよく、異なるものであってもよい。特定の実施形態においては、リンカー1は、(GGSGGSGG)n(式中、n=1または2)であり、リンカー2は、(GSGGGGSG)n(式中、n=1または2)である。かかるリンカーは、Gly/Ser残基のみから構成される必要はなく、また、通常は、そのN末端および/またはC末端に1個以上のアミノ酸を含有する。かかるリンカーとしては、限定されるものではないが、MTGGSGGSGGMS(配列番号:25)およびMTGGSGGSGGGGSGGSGGMS(配列番号:26)が挙げられる。特定の実施形態においては、本明細書において想定されるポリペプチドは、配列番号:28に示されているポリペプチド配列(MSIEQIQKEITTIQEVIAAIQKYIYTMTGGSGGSGGMSIEEIQKQIAAIQEQIAAIQKQIYAMTGSGGGGSGMSIEEIQKQIAAIQEQIVAIYKQIMAMASAAAHHHHHH)に由来し、細菌系における発現を増加させるために、c末端テイル(3Ala−6His)を除去するために、溶解性を最適化するために、および/または結合親和性を最適化するために、1個以上のアミノ酸位置においてこれが改変されている。特定の実施形態においては、本明細書において想定されるポリペプチドは、配列番号:28と少なくとも85%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、アルファボディー構造のヘプタッド反復配列の一部であるアミノ酸のみを考慮して決定される配列同一性は、配列番号:28と比較して少なくとも85%、より好ましくは少なくとも85%または少なくとも90%である。特定の実施形態においては、HRSレベルにおける配列番号:28との配列同一性は、少なくとも95%である。
本明細書において想定されるポリペプチドは、アルファボディー構造を含有する少なくとも1個の配列および任意に、1個以上のリンカーを介して任意に連結された1個以上のさらなる基、部分、残基を含有してもよい。
特定の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチドの生物学的または血漿中の半減期が増加するように、結合する基または血清タンパク質(血清アルブミンなど)である基の付加を用いて、または一般に本発明のアルファボディーの半減期を増加させる部分へのアルファボディー配列の連結により、化学的に改変されたアルファボディーを含有する。例として、ポリペプチド、より具体的にはそれに含まれるアルファボディー配列は、溶媒曝露システインにおいて、マレイミドmPEG 40kD PEG(Jenkem Technology)または他の異なる分子量のPEG部分を使用して、PEG化することができる。アルファボディーのPEG化は、国際公開第2012/093172号にも記載されている。
特定の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチドの生物学的または血漿中の半減期が増加するように、タンパク質ドメインまたはペプチド、例えば、結合ドメインまたは血清タンパク質(血清アルブミンまたは免疫グロブリンのFc部分など)であるドメインと融合されたアルファボディーを含有する。前記タンパク質ドメインは、血清タンパク質と結合するアルファボディーであってよい。
特定の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、それらの標的結合(すなわち、目的のサイトカインもしくは成長因子またはサイトカインもしくは成長因子の受容体に対する結合)に加えて、血清タンパク質に(血清アルブミンまたは免疫グロブリンのFc部分などに)、前記アルファボディーの生物学的または血漿中の半減期を増加するように結合するアルファボディーを含有する。
したがって、特定の実施形態においては、本明細書において想定されるポリペプチドは、目的の他の標的または標的タンパク質に結合するための1個以上のさらなる基、部分、残基を任意に含有してもよい。かかるさらなる基、残基、部分、結合部位は、本明細書において想定されるアルファボディー(および/または、それが存在するポリペプチドまたは組成物)にさらなる機能性を提供してもよく、提供しなくてもよく、本明細書において想定されるアルファボディーの特性を改変してもよく、改変しなくてもよいことが明らかなはずである。また、かかる基、残基、部分または結合単位は、例えば、生物学的および/または薬理学的に活性であり得る化学基であってもよい。
特定の実施形態においては、これらの基、部分または残基は、アルファボディーにN末端またはC末端で連結されている。しかしながら、特定の実施形態においては、1個以上の基、部分または残基は、アルファボディーの本体(例えば、α−ヘリックス内の遊離システイン)に連結されている。
本明細書において想定されるポリペプチドは、HRS1−L1−HRS2−L2−HRS3に対応する配列に共有結合されたさらなるアミノ酸または部分をさらに含有してもよい。特定の実施形態においては、ポリペプチドは、HRS1の第1のヘプタッド反復またはHRS3の最後のヘプタッド反復にN末端および/またはC末端で結合された1〜5個のアミノ酸を含有してもよい。特定の実施形態においては、ポリペプチドは、アルファボディー構造にN末端およびC末端で連結された2個のアミノ酸を含有する。
加えてまたは代替的には、上に詳述したように、「HRS」がヘプタッド反復単位のみからなると考えられる場合、本明細書において想定されるポリペプチドは、典型的には、HRS3の最後のヘプタッド反復にC末端で結合されたヘプタッド反復(a−d)のさらなる部分配列を含有してもよい。
さらなるアミノ酸を含有する例示的なポリペプチドとしては、配列番号:3〜22が挙げられる。
加えてまたは代替的には、任意選択のNおよびCの伸長は、例えば、検出もしくは精製用のタグ(例えば、Hisタグ)または別のタンパク質もしくはタンパク質ドメイン(この場合、構築物全体が融合タンパク質として示される)であり得る。明確にするために、任意選択の伸長NおよびCは、本明細書において、一般式「HRS1−L1−HRS2−L2−HRS3」によって定義される単鎖アルファボディー構造の一部を形成しないと考える。
特定の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、化学修飾されたアミノ酸を含有する。例えば、かかる修飾は、1個以上の官能基、残基または部分をアミノ酸配列内にまたはアミノ酸配列上に導入または連結することを含んでもよい。これらの基、残基または部分は、1つ以上の所望の特性または機能をポリペプチドに付与してもよい。かかる官能基の例は、以下に詳述するように当業者には明らかであろう。
例えば、かかる官能基を本明細書において想定されるポリペプチドに導入または連結することにより、ポリペプチドの半減期、溶解性および/もしくは安定性の増加、またはポリペプチドの毒性の減少、またはポリペプチドの任意の望ましくない副作用の排除もしくは減衰、ならびに/または他の有利な特性をもたらすことができる。
一般的に、半減期の増加した本明細書において想定されるポリペプチドは、半減期の延長に対する上記の装備を欠く対応のポリペプチドの半減期と比較して、(ヒトにおいて、またはPK評価に関して使用される動物モデル、例えば、ラット、イヌ、サル、マウス、ウマ、ブタ、ネコなどにおいて)1週間を超える、同様に好ましくは2週間を超える半減期を有する。
本明細書において想定されるポリペプチドの特定の改変は、標識されたポリペプチドの意図される使用に応じて、1個以上の検出可能な標識または他のシグナル発生基もしくは部分の導入を含有してもよい。
さらなる特定の改変は、例えば、1個以上の金属または金属カチオンをキレートする、キレート化基の導入を伴ってもよい。
特定の改変は、例えば、ビオチン−(ストレプト)アビジン結合対などの特異的結合対の一部である官能基の導入を含んでもよい。
いくつかの用途に関して、特に、本明細書において想定されるポリペプチドがIL−23を発現する細胞を殺すことが意図される用途、またはかかる細胞の成長および/または増殖を低減または遅延させることが意図される用途に関して、本明細書において想定されるポリペプチドは、毒素に連結、または毒性の残基もしくは部分に連結されてもよい。
他の可能性のある化学的および酵素的改変は、当業者には明らかであろう。
さらに特定の実施形態においては、本明細書において想定されるポリペプチドは、2個以上の標的特異的アルファボディーに対応するアミノ酸配列を含有する。標的IL−23を対象とする2個のアルファボディー構造の組み合わせは、IL−23に対する結合特性をさらに改善し得る。
かかる特定の実施形態においては、2個以上の標的特異的アルファボディーは、直接または間接的な方法のいずれかで、互いに連結(カップリング、鎖状連結、相互連結、融合)することができる。2個以上のアルファボディーが互いに直接的に連結される実施形態においては、当該2個以上のアルファボディーは、スペーサーまたはリンカーの断片または部分の助けなしで連結される。代替的には、2個以上のアルファボディーが互いに間接的に連結される実施形態においては、当該2個以上のアルファボディーは、適切なスペーサーまたはリンカーの断片または部分を介して連結される。
2個以上のアルファボディーが直接連結される実施形態においては、当該2個以上のアルファボディーは、単鎖融合構築物として(すなわち、2個以上のアルファボディー配列が、単一の連続するアミノ酸配列で互いに直接続いている単鎖タンパク質構築物として)作製されてもよい。代替的には、アルファボディーの直接連結は、2個のアルファボディー間にジスルフィド架橋を形成するシステインを介して達成されてもよい(すなわち、例えば、酸化条件などの適切な条件下で、それぞれが遊離のシステインを含む2個のアルファボディーを互いに反応させて、構成単量体が、ジスルフィド架橋を介して共有結合的に連結される二量体を形成してもよい)。
代替的には、2個以上のアルファボディーが間接的に連結される実施形態においては、当該2個以上のアルファボディーは、適切なスペーサーまたはリンカー断片またはリンカー部分を介して互いに連結されてもよい。かかる実施形態においては、アルファボディーは、単鎖融合構築物として、すなわち、2個以上のアルファボディー配列が、単一の連続するアミノ酸配列で互いに続いているが、アルファボディーはスペーサー断片として作用する適切に選択されたアミノ酸配列断片の存在によって隔てられたままである単鎖タンパク質構築物として作製されてもよい。代替的には、アルファボディーの間接的連結は、アミノ酸側鎖を介して、またはアルファボディーのN末端もしくはC末端を介して達成されてもよい。例えば、適切な選択された条件下で、それぞれが遊離のシステインを含有する2個のアルファボディーをホモ二官能性化合物と反応させ、構成アルファボディーが前記ホモ二官能性化合物を介して共有結合的に架橋されたアルファボディー二量体を得ることができる。類似の方法で、1個以上のアルファボディーが、反応性側鎖または末端およびタンパク質の架橋のための適切に選択されたホモ二官能性化合物もしくはヘテロ二官能性化合物の任意の組み合わせを介して、架橋されてもよい。
連結されたアルファボディーの特定の実施形態においては、2個以上の連結されたアルファボディーは、同じアミノ酸配列を有していてもよく、異なるアミノ酸配列を有していてもよい。また、2個以上の連結されたアルファボディーは、同じ結合特異性を有していてもよく、異なる結合特異性を有していてもよい。また、2個以上の連結されたアルファボディーは、同じ結合親和性を有していてもよく、異なる結合親和性を有していてもよい。
異なるアルファボディーのカップリングに使用するための適切なスペーサーまたはリンカーは、当業者には明らかであると思われ、ペプチドおよび/またはタンパク質の連結に当該技術分野において使用される一般的な任意のリンカーまたはスペーサーであってよい。特に、かかるリンカーまたはスペーサーは、医薬用途が意図されるタンパク質またはポリペプチドの構築に適切である。
単鎖アミノ酸配列のアルファボディーのカップリングに特に適切ないくつかのリンカーまたはスペーサーとしては、例えば、限定されるものではないが、グリシンリンカー、セリンリンカー、混合グリシン/セリンリンカー、グリシンリッチリンカーおよびセリンリッチリンカーまたは主として極性ポリペプチド断片により構成されたリンカーなどのポリペプチドリンカーなどが挙げられる。化学的架橋によるアルファボディーのカップリングに特に適切ないくつかのリンカーまたはスペーサーとしては、例えば、限定されるものではないが、グルタルアルデヒドなどのホモ二官能性化学的架橋化合物、アジプイミド酸ジメチル(DMA)、スベルイミノ酸ジメチル(DMS)およびピメルイミド酸ジメチル(DMP)などのイミドエステルまたはジチオビス(スクシンイミジルプロピオン酸)(DSP)およびジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオン酸)(DTSSP)などのN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルなどが挙げられる。架橋のためのヘテロ二官能性試薬の例としては、限定されるものではないが、一方のアミン反応性末端および他方の末端にスルフヒドリル反応性部分を有する架橋リンカーまたは一方の末端にNHSエステルおよび他方の末端にSH反応性基(例えば、マレイミドまたはピリジルジスルフィド)を有する架橋リンカーなどが挙げられる。
単鎖の鎖状連接された(concatenated)アルファボディー構築物に使用するためのポリペプチドのリンカーまたはスペーサーは、1〜50個のアミノ酸の長さ、例えば、1〜30個、および特に1〜10個のアミノ酸残基の長さを有する、任意の適切な(例えば、グリシン−リッチ)アミノ酸配列であってよい。1もしくは複数のスペーサーの長さ、柔軟性の程度および/または限定されるものではないが、目的のタンパク質または目的の1個以上の他の標的タンパク質に対する親和性、特異性またはアビディティなどの他の特性が、本発明の最終的ポリペプチドの特性にいくらかの影響を与え得ることは明らかであろう。2個以上のスペーサーが本発明のポリペプチドに使用される場合、これらのスペーサーは、同じであってもよく、異なっていてもよいことは明らかであろう。本発明との関連および開示において、当業者は、本発明のアルファボディーをカップリングする目的のための最適なスペーサーを、過度の実験負担なく決定することができる。
本明細書において想定されるポリペプチドは、ヘテロ二量体サイトカインIL−23に特異的に結合することができるアミノ酸配列を含有する。より具体的には、本明細書において想定されるアルファボディーは、IL−23のp19サブユニットに特異的である。かかるポリペプチドは、IL−23のp40サブユニットに特異的に結合する結合剤と比較して、予防、治療および/または診断用途の利点を有する。
本明細書において想定されるポリペプチドは、約1ナノモル(1nM)未満の解離定数(KD)で[すなわち、約1,000,000,000/モル(109M−1、1E9/M)以上の結合定数(KA)で]IL−23に結合するであろう。約1ミリモルより大きいKD値は、一般に、非結合または非特異的結合を示すとみなされる。KDが、kOff(秒−1またはs−1で表わされる)で示される複合体の解離速度定数の、kOn(モル−1秒−1またはM−1s−1で表わされる)で示されるその結合速度定数に対する比として表わされ得ることが、当該技術分野において一般的に公知である。特に、本明細書において想定されるポリペプチドは、0.001〜0.0001s−1の範囲のkOff、および/または100,000および1,000,000M−1s−1の範囲のkOnでIL−23に結合するであろう。結合親和性、kOffおよびkOn速度は、当業者に公知の方法、例えば、ELISA法、等温滴定熱量測定、表面プラズモン共鳴、蛍光活性化セルソーティング分析などによって決定することができる。
IL−23に特異的に結合する本明細書において想定されるポリペプチドは、さらに、IL−23の活性を阻害、抑制もしくは低減することができ、および/またはIL−23が役割を果たすシグナル伝達および生物学的な機構および経路を阻害、抑制もしくは低減することができる。実際、IL−23に結合することによって、本明細書において想定されるポリペプチドは、IL−23とその受容体との間の相互作用を抑制または阻害することができる。したがって、本明細書において想定されるポリペプチド、および前記ポリペプチドを含有する医薬組成物は、免疫系および/または免疫媒介性炎症性障害に影響を与え、これを変化させ、または調節するのに使用することができる。
より具体的には、本明細書において想定されるポリペプチドを使用する「阻害(inhibiting)」、「低減(reducing)」および/または「抑制(preventing)」は、IL−23とその受容体との間の相互作用の阻害、低減および/または抑制、あるいはIL−23が関与する1つ以上の生物学的または生理学的な機構、効果、応答、機能経路もしくは活性の阻害、低減および/または抑制のいずれかを意味してもよく、例えば、適切なイン・ビトロアッセイ、細胞アッセイまたはイン・ビボアッセイを使用して測定した場合、同じアッセイにおいて、同じ条件であるが前記ポリペプチドを使用しない条件下で、IL−23の活性と比較して、例えば、少なくとも10%、しかしながら、好ましくは少なくとも20%、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくはそれ以上を阻害、低減および/または抑制する。
[医薬組成物]
また、本出願は、本明細書において想定される1個以上のポリペプチドおよび/または核酸配列、ならびに任意に、少なくとも1個の薬学的に許容され得る担体を含有する医薬組成物(本明細書では、本発明の医薬組成物とも称される)を提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、任意に、少なくとも1個の他の医薬的活性化合物をさらに含有してもよい。
また、本出願は、本明細書において想定される1個以上のポリペプチドおよび/または核酸配列、ならびに任意に、少なくとも1個の薬学的に許容され得る担体を含有する医薬組成物(本明細書では、本発明の医薬組成物とも称される)を提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、任意に、少なくとも1個の他の医薬的活性化合物をさらに含有してもよい。
医薬は、本明細書において記載されるように、IL−23が関係する疾患および障害の診断、予防および/または治療に使用できる。
特に、本発明は、温血動物、具体的には、哺乳動物における予防用途、治療用途および/または診断用途に適切な、本明細書において想定されるポリペプチドを含有する医薬組成物を提供する。特定の実施形態においては、哺乳動物はヒトであるが、獣医目的も想定される。
一般的に、医薬用途に関して、本明細書において想定されるポリペプチドは、本明細書において想定される少なくとも1個のポリペプチドならびに少なくとも1個の薬学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤および/またはアジュバント、ならびに任意に、1個以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび/または化合物を含有する医薬調製品または医薬組成物として製剤化できる。かかる製剤は、経口、非経口、局所投与または吸入による投与に適切であってよい。したがって、本明細書において想定される組成物は、この場合も使用される特定の医薬製剤または医薬組成物に応じて、例えば、経口で、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、経皮的、局所的、坐薬により、吸入により投与される。
医薬組成物は、適切な結合剤、崩壊剤、甘味料または香味剤をさらに含んでもよい。錠剤、丸薬またはカプセルは、例えば、ゼラチン、ワックスまたは糖などによりコーティングされてもよい。また、組成物は、持続放出性の製剤およびデバイスを使用して製剤化および/または投与してもよい。
本明細書において想定される組成物は、医師により、とりわけ治療される病態および患者の重症度に基づき決定される量で投与される。一般的に、それぞれの疾患の兆候に対して、継続的に(例えば、注入により)、毎日1回の投与として、または1日複数回の分割用量としてのいずれかの投与される量/kg体重/日を規定する最適用量(optical dosage)が決定されるであろう。臨床医は、一般に、本明細書において述べた要因に応じて適切な1日用量を決定できるであろう。特定の症例において、臨床医は、例えば、上述の要因におよび彼の熟練の判断に基づき、これらの量から逸脱させることを選択してもよいことも明らかであろう。
特に、本明細書において想定されるポリペプチドは、本明細書に述べられた疾患および障害の予防および/または治療に使用されるか、または使用できる他の医薬的に活性な化合物または成分と併用でき、その結果として、相乗効果が得られても得られなくてもよい。かかる化合物および成分ならびにそれらの投与の経路、方法および医薬製剤または医薬組成物の例は、臨床医には明らかであろう。
[予防、治療および/または診断用途]
少なくとも1つのIL−23媒介性の疾患および/または障害の予防用および/または治療用医薬の調製のための本明細書において想定されるポリペプチドの使用も想定される。したがって、本発明は、少なくとも1つのIL−23媒介性の疾患および/または障害の予防および/または治療に使用するための、本明細書において想定されるポリペプチドを含有する組成物の使用を提供する。特定の実施形態においては、IL−23媒介性の疾患および/または障害の予防および/または治療のための方法は、薬学上活性な量の本明細書において記載される1個以上のポリペプチドおよび/または医薬組成物を、それらを必要とする対象に投与するステップを含む。
少なくとも1つのIL−23媒介性の疾患および/または障害の予防用および/または治療用医薬の調製のための本明細書において想定されるポリペプチドの使用も想定される。したがって、本発明は、少なくとも1つのIL−23媒介性の疾患および/または障害の予防および/または治療に使用するための、本明細書において想定されるポリペプチドを含有する組成物の使用を提供する。特定の実施形態においては、IL−23媒介性の疾患および/または障害の予防および/または治療のための方法は、薬学上活性な量の本明細書において記載される1個以上のポリペプチドおよび/または医薬組成物を、それらを必要とする対象に投与するステップを含む。
治療される対象または患者は、特に、IL−23媒介性の疾患または障害を患うか、またはその危険性がある哺乳動物、より具体的には、ヒトである。IL−23媒介性の疾患および障害の例としては、免疫系の障害および免疫媒介性の炎症性障害、例えば、乾癬、腸疾患(大腸炎、クローン病、IBD)、感染性疾患、および他の自己免疫性疾患(例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、脊椎関節炎、サルコイドーシス、狼瘡、ベーチェット病)、移植拒絶、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、癌、ウイルス感染症、一般的な分類不能型免疫不全が挙げられる。
本発明のアルファボディーおよびポリペプチドならびにこれらを含有する組成物の有効性は、関連する特定の疾患または障害に応じて、それ自体が公知の任意の適切なイン・ビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、イン・ビボアッセイおよび/または動物モデル、またはこれらの任意の組み合わせを使用して、試験することができる。適切なアッセイおよび動物モデルは、当業者には明らかであろう。例えば、抗IL−23アルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドの有効性は、マウス脾細胞におけるIL−17のIL−23依存性産生を測定するイン・ビトロアッセイにおいて、容易に決定することができる。このアッセイにおいて、balb/cマウスから脾細胞を単離し、IL−23(マウスまたはヒト)を、選択されたアルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドとともに(またはこれは加えずに)、種々の濃度で追加する。次いで、抗IL−23アルファボディーの阻害能を容易に決定し得るELISAを介して、上清中のIL−17Aの出現を検出する。
例えば、抗IL−23ポリペプチドの有効性は、マウス乾癬モデルにおいて、例えば、TNOのウェブ刊行物(http://www.tno.nl/downloads/にある「ヒト化マウスモデル(Humanized_mouse_model_psoriasis)−Pharma19B1.pdf」)に記載された下記ステップを含むTNOの(The Netherlands)の異種移植マウスモデルを使用して決定することができる:(a)患者を選択し、医療倫理委員会(Medical Ethical Committee)の承認を得る、(b)インフォームドコンセントに基づき、患者が生検を提供する、(c)生検を、免疫不全マウスに移植する、(d)末梢血の単核細胞(PBMC)を、患者から単離する、(e)自己移植の活性化PBMCを異種移植片に注射し、乾癬を誘導する、(f)治験薬を用いて治療し、表皮の阻害(表皮肥厚)を、抗IL−23薬によりこのヒト化マウスモデルにおいて決定する。その後、結果を、0.05%ベタメタゾンを用いた局所治療と比較する。この研究は、皮膚の移植から、イン・ビボ治療の終了まで約7週間かかる。
診断用途のための、IL−23を対象とするポリペプチドの使用も本明細書において想定される。本明細書におけるポリペプチドは、IL−23の異常発現および/または機能を決定するための方法に使用することができる。特定の実施形態においては、これは、特定の疾患または障害、例えば、限定されるものではないが、免疫系の障害および免疫媒介性の炎症性障害、例えば、乾癬、腸疾患(大腸炎、クローン病、IBD)、感染性疾患、および他の自己免疫性疾患(例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、脊椎関節炎、サルコイドーシス、狼瘡、ベーチェット病)、移植拒絶、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、癌、ウイルス感染症、一般的な分類不能型免疫不全の診断に関連するものであり得る。
特定の実施形態においては、疾患または障害、例えば、限定されるものではないが、上記疾患および障害を患う患者の特定の治療の適合性を決定するための方法が想定される。
また、本出願は、疾患または障害、例えば、上記のものの治療に適切な組成物をスクリーニングする方法における、本明細書において記載されるポリペプチドの使用を想定する。
したがって、診断方法またはスクリーニング方法に使用するための、本明細書において想定されるポリペプチドを含むキットも本明細書において想定される。
[部分/断片/アナログ/誘導体]
本出願は、本明細書において記載されるポリペプチドの部分、断片、アナログ、変異体、バリアントおよび/または誘導体の1つ以上を含有するかまたはこれらから本質的になるかかる部分、断片、アナログ、変異体、バリアント、誘導体も、これらの部分、断片、アナログ、変異体、バリアント、誘導体が、本明細書において想定される予防目的、治療目的および/または診断目的に適切である限り、想定する。
本出願は、本明細書において記載されるポリペプチドの部分、断片、アナログ、変異体、バリアントおよび/または誘導体の1つ以上を含有するかまたはこれらから本質的になるかかる部分、断片、アナログ、変異体、バリアント、誘導体も、これらの部分、断片、アナログ、変異体、バリアント、誘導体が、本明細書において想定される予防目的、治療目的および/または診断目的に適切である限り、想定する。
かかる部分、断片、アナログ、変異体、バリアント、誘導体は、IL−23に依然として特異的に結合することができる。
[核酸配列]
本発明の方法により得ることが可能な単鎖アルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドをコードする核酸配列(本明細書において「本発明の核酸配列」とも称される)ならびにかかる核酸配列を含有しているベクターおよび宿主細胞も本明細書において提供される。
本発明の方法により得ることが可能な単鎖アルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドをコードする核酸配列(本明細書において「本発明の核酸配列」とも称される)ならびにかかる核酸配列を含有しているベクターおよび宿主細胞も本明細書において提供される。
さらなる態様において、本発明は、本発明のアルファボディーまたはポリペプチド(またはこれらの適切な断片)をコードする核酸配列を提供する。これらの核酸配列もまた、本明細書において本発明の核酸配列と称され、ベクターまたは遺伝子構築物またはポリヌクレオチドの形態であってもよい。本発明の核酸配列は、合成または半合成の配列、ライブラリー(および特に発現ライブラリー)から単離されたヌクレオチド配列、PCRにより重複プライマーを使用して調製されたヌクレオチド配列、またはそれ自体が公知のDNA合成に関する技術を使用して調製されたヌクレオチド配列であってよい。
本発明の遺伝子構築物はDNAまたはRNAであってよく、好ましくは二本鎖DNAである。また、本発明の遺伝子構築物は、意図された宿主細胞もしくは宿主生物の形質転換に適切な形態、意図される宿主細胞のゲノムDNA内への統合に適切な形態、または意図された宿主生物における独立した複製、維持および/または継承に適切な形態であってよい。例えば、本発明の遺伝子構築物は、例えば、プラスミド、コスミド、YAC、ウイルスベクターまたはトランスポゾンなどのベクターの形態であってよい。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわち、(例えば、適切な宿主細胞、宿主生物および/または発現系において)イン・ビトロおよび/またはイン・ビボの発現を提供できるベクターであってよい。本発明の遺伝子構築物は、発現されたアルファボディーを意図される細胞内または細胞外のコンパートメントに向かわせる、適切なリーダー配列を含むことができる。例えば、本発明の遺伝子構築物は、適切なベクター中にpelBリーダー配列部位において挿入し、発現されたアルファボディーを細菌の細胞膜周辺腔に向かわせることができる。さらに、ベクターは、適切なプロモーター系を備え、例えば、アルファボディーの収率を最適化することができる。
また、本出願は、上記核酸を含有するベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明のアルファボディーまたはポリペプチドの発現のための宿主または宿主細胞の適切な例は、当業者には明らかであるものとし、任意の真核細胞または原核細胞(例えば、E.coliなどの細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞および昆虫細胞)を含み、イン・ビトロまたはイン・ビボのいずれであってもよい。
[製造]
本明細書において想定されるポリペプチドの製造は、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切な条件下で宿主生物において発現させて、前記ポリペプチドを製造するステップを含んでもよい。このステップは、当業者に公知の方法によって実施することができる。タンパク質の発現および精製の分野の当業者に公知であるように、適切な発現系を使用して発現ベクターから製造されたポリペプチドは、例えば、ヒスチジンまたは容易な精製のための他の配列タグを用いて(通常はアルファボディーのN末端またはC末端に)タグを付加することができる。
本明細書において想定されるポリペプチドの製造は、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切な条件下で宿主生物において発現させて、前記ポリペプチドを製造するステップを含んでもよい。このステップは、当業者に公知の方法によって実施することができる。タンパク質の発現および精製の分野の当業者に公知であるように、適切な発現系を使用して発現ベクターから製造されたポリペプチドは、例えば、ヒスチジンまたは容易な精製のための他の配列タグを用いて(通常はアルファボディーのN末端またはC末端に)タグを付加することができる。
また、IL−23に対する検出可能な結合親和性、またはIL−23に対する検出可能なイン・ビトロ活性を有する得られるポリペプチド配列は、可溶性タンパク質構築物として合成することができる。
IL−23のp19サブユニットに特異的に結合するポリペプチドの製造
1.ポリペプチドライブラリーの製造
「scLib_AC11」と称される1つのライブラリーにおいて、A−ヘリックスおよびC−ヘリックス内の残基を無作為に抽出した。AC11ライブラリーには、A−ヘリックスおよびC−ヘリックス内に11個の多様な残基位置を有するアルファボディーが含まれており、これらの位置の大部分は、A−ヘリックス内のヘプタッドのc位およびg位ならびにC−ヘリックス内のヘプタッドのb位およびe位に位置している。
1.ポリペプチドライブラリーの製造
「scLib_AC11」と称される1つのライブラリーにおいて、A−ヘリックスおよびC−ヘリックス内の残基を無作為に抽出した。AC11ライブラリーには、A−ヘリックスおよびC−ヘリックス内に11個の多様な残基位置を有するアルファボディーが含まれており、これらの位置の大部分は、A−ヘリックス内のヘプタッドのc位およびg位ならびにC−ヘリックス内のヘプタッドのb位およびe位に位置している。
AC11ライブラリーには、A−ヘリックスおよびC−ヘリックスによって形成された溝中に9個の可変残基位置を有するアルファボディーを含有するポリペプチドが含まれていた。このライブラリーでは、L1リンカーおよびL2リンカーは、16残基のGly/Ser配列を含有する。
これらのライブラリーは、形質転換E.coli細胞(株ER2738、supE株)として、GeneArt AG(Germany)から取り寄せられ、供給された。国際公開第2010/066740号に記載されているように、ファージライブラリーの製造をさらに実施した。
2.IL−23に対するポリペプチドライブラリーのバイオパンニング
ファージライブラリーとインキュベートした後の標的IL−23の捕捉は、サイトカインIL−23のサブユニットp40を認識するビオチン化抗p40 IL−23抗体(Biolegend,508802;クローンC8.6)を使用して実施した。ライブラリーとインキュベートする前に、サイトカインIL−23(eBioscience,34−8239−85,lot E034049)を抗p40抗体とともにインキュベートした。この戦略は、抗体を用いてp40サブユニットを(部分的に)遮断することによって、IL−23のp19サブユニットの結合剤に対する選択を駆動するために、開発された。次いで、この特定の抗体を、洗浄目的のためにIL−23を固体支持体上に固定化するのにも使用した。
ファージライブラリーとインキュベートした後の標的IL−23の捕捉は、サイトカインIL−23のサブユニットp40を認識するビオチン化抗p40 IL−23抗体(Biolegend,508802;クローンC8.6)を使用して実施した。ライブラリーとインキュベートする前に、サイトカインIL−23(eBioscience,34−8239−85,lot E034049)を抗p40抗体とともにインキュベートした。この戦略は、抗体を用いてp40サブユニットを(部分的に)遮断することによって、IL−23のp19サブユニットの結合剤に対する選択を駆動するために、開発された。次いで、この特定の抗体を、洗浄目的のためにIL−23を固体支持体上に固定化するのにも使用した。
具体的には、2%スキムミルク中で、可変濃度のIL−23を2倍濃度のビオチン化抗IL−23 p40抗体でインキュベートした。それぞれ200、200、100、10および1nMのIL−23を使用して、5ラウンドを実施した。対照的に、インプットファージ(すなわち、各選択ラウンドで標的に添加したファージ)の濃度は一定であり、1E12ファージに対応していた。表1は、種々のラウンドのファージミドのアウトプットおよびインプットならびにモック(標的が存在しない以外は同じバイオパニング実験)のアウトプットを示す。選択ストリンジェンシーをR3から増加させた。高いアウト/モック比は、R3およびR4に見られる。
Dynabeadsを添加した。次いで、0.1%のTween20を含有する1mlのPBSでビーズを10回洗浄して、非特異的ファージを排除した。200 lのpH2緩衝液(100mMグリシンHCl)を用いて溶出を実施し、50mlの1M Tris pH8を添加することによって中和した。
中和ファージミド溶液のサンプルを1.75mlのLBに添加した。さらなる滴定用に50ml(−1希釈)を取った後、中間対数期(OD600nm=0.5)まで生育させた18mlのE.coli TG1細胞に残りのファージミド溶液を添加した。37℃で30分間インキュベートした後、溶液を遠心分離し、ペレットを250mlのLB+アンピシリン+グルコースに再懸濁した。インキュベーションを37℃(180rpm)で一晩実施した。
感染培養物をbig 2xTY−AG寒天プレート上に播種した。
OD450が0.3を超える80個のコロニーを選択し、IL−12および抗IL−23p40抗体をコーティングしたプレート上で検査した。IL−12の陽性シグナルは、アルファボディーがIL−23のp40サブユニットを認識していることを意味する。いくつかの陽性は抗p40およびIL−12とも反応することが見出されたことが分かった。これらの最初のバイオパニング実験から得られた最良と思われるクローン(hIL−23陽性およびIL−12陰性)を配列決定した。次いで、AC11ライブラリーからさらに選択した11個の最良クローンを、p19ドメインを対象とする中和Ab(NAb)IgG1クローンB−Z23の非存在下または存在下において、それらのhIL−23結合能をELISAで試験した。AC11由来のクローンのうちの4個が、それによって完全に遮断されたことが見出された。
これらのアルファボディーは、Nabのエピトープと重複するIL−23(p19)上のエピトープに結合する可能性が最も高いので、それらのIL−23中和能についてこれらを試験した(以下を参照されたい)。
3.IL−23に対するポリペプチドの親和性
IL−23に対する結合のKd(解離定数)を決定するために、可溶性ポリペプチドを(動的)Biacore分析またはFriguet(間接ELISA)分析(フリギュート(Friguet)ら、1985,J.Immunol.Methods 77:305−319)に供した。
IL−23に対する結合のKd(解離定数)を決定するために、可溶性ポリペプチドを(動的)Biacore分析またはFriguet(間接ELISA)分析(フリギュート(Friguet)ら、1985,J.Immunol.Methods 77:305−319)に供した。
IL−23に対する結合親和性を有する種々のクローンが同定された。「Cl59」とも称されるクローン59は、ヒトIL−23に対する合理的な親和性を有することが見出された(平衡ELISAではKD=3.8nMおよび動的ELISAでは7.0nM)。
4.中和ポリペプチドの同定
所定濃度のヒトIL−23(R&D systems)の存在下における一定用量範囲のIL−23阻害試験化合物に応じたマウスIL−17産生を決定する周知のマウス脾細胞アッセイによって、生物学的活性を測定した。固定濃度のhIL−23(通常は2.6pM)とともにアルファボディーを種々の濃度(1.7nM〜7.1μMの範囲内)でプレインキュベートした。実験を8組で行った。また、IL−23濃度に応じたmIL−17産生(Quantikine,mIL−17 kit,R&D systems)を測定するための検量線として、阻害剤なしで希釈系列のIL−23(10pM〜0.01pM)を4組でアッセイした。プレインキュベーション後、25ng/mlマウスIL−2(R&D systems)を含有する培地中のマウス脾細胞を添加した。対照として、StelaraおよびIL−23(p19)中和マウス抗体BZ−23を使用した。
所定濃度のヒトIL−23(R&D systems)の存在下における一定用量範囲のIL−23阻害試験化合物に応じたマウスIL−17産生を決定する周知のマウス脾細胞アッセイによって、生物学的活性を測定した。固定濃度のhIL−23(通常は2.6pM)とともにアルファボディーを種々の濃度(1.7nM〜7.1μMの範囲内)でプレインキュベートした。実験を8組で行った。また、IL−23濃度に応じたmIL−17産生(Quantikine,mIL−17 kit,R&D systems)を測定するための検量線として、阻害剤なしで希釈系列のIL−23(10pM〜0.01pM)を4組でアッセイした。プレインキュベーション後、25ng/mlマウスIL−2(R&D systems)を含有する培地中のマウス脾細胞を添加した。対照として、StelaraおよびIL−23(p19)中和マウス抗体BZ−23を使用した。
このアッセイでは、組換え可溶型のクローン59(配列番号:3)は、中程度に機能的なKD(fKD=69nM)でIL−17産生を阻害することが示された。
5.合理的設計技術による最適化
合理的設計技術によってCl59ポリペプチドをさらに最適化したところ、「Cl59m」という名称の構築物(配列番号:20)は、10倍超改善された親和性(ELISA KD=0.3nM)、および脾細胞アッセイでは約5倍機能的な改善(fKD=10〜15nM)を有することが示された。
合理的設計技術によってCl59ポリペプチドをさらに最適化したところ、「Cl59m」という名称の構築物(配列番号:20)は、10倍超改善された親和性(ELISA KD=0.3nM)、および脾細胞アッセイでは約5倍機能的な改善(fKD=10〜15nM)を有することが示された。
6.成熟キャンペーン(campaigns)
平行して、合理的に設計された「専用(dedicated)ライブラリー」を使用して、2回の成熟キャンペーンを実施した。これらの結果、改善された親和性を有するバリアントの大きなパネルが得られた。このパネルから、14個のバリアントをさらなる体系的な特性決定のために選択した。また、2個のコンセンサス配列(各成熟キャンペーンからのもの:それぞれMAconsおよびMBcons)および3個の設計バリアント(Cl59m(配列番号:20)、59m_C2eQ(配列番号:21)および59m_A3cA_A4cS_C2eQ(配列番号:22))を特性決定試験に含めた。図2は、可変残基、リンカーの長さおよびB−ヘリックスの改変に関するバリアントの比較を示す。ある特定の配列が他のものよりも疎水性であることが分かる。
平行して、合理的に設計された「専用(dedicated)ライブラリー」を使用して、2回の成熟キャンペーンを実施した。これらの結果、改善された親和性を有するバリアントの大きなパネルが得られた。このパネルから、14個のバリアントをさらなる体系的な特性決定のために選択した。また、2個のコンセンサス配列(各成熟キャンペーンからのもの:それぞれMAconsおよびMBcons)および3個の設計バリアント(Cl59m(配列番号:20)、59m_C2eQ(配列番号:21)および59m_A3cA_A4cS_C2eQ(配列番号:22))を特性決定試験に含めた。図2は、可変残基、リンカーの長さおよびB−ヘリックスの改変に関するバリアントの比較を示す。ある特定の配列が他のものよりも疎水性であることが分かる。
7.MB23アルファボディーの選択パネルの特性決定
7.1 結合特性
図3は、20個の試験ポリペプチドに関する種々の結合データを示す。最後の列を除いて、すべてのデータは、可溶型で発現させたポリペプチドについて得られた;右の値は、pIIIに対する融合構築物としてファージ上に依然として提示された成熟クローンに関するものである。
7.1 結合特性
図3は、20個の試験ポリペプチドに関する種々の結合データを示す。最後の列を除いて、すべてのデータは、可溶型で発現させたポリペプチドについて得られた;右の値は、pIIIに対する融合構築物としてファージ上に依然として提示された成熟クローンに関するものである。
成熟クローン(#1〜14)の大部分は期待に十分に沿っており、(MA14およびMB76を除き)ナノモル以下の親和性を示したことが見出された。標準的な平衡ELISAにおける最高の親和性は、MA12およびMA5で測定されたが(KD=0.1nM)、これは、非成熟バリアントCl59よりも38倍優れている。ナノモル以下の親和性とナノモル以上の親和性との間の整合性から推測されるように、動的ELISAおよび平衡ELISAのデータは、全体的によく一致していた。驚くべき発見は、親和性の主な改善が、成熟バリアントのオン速度の改善に起因すると思われるという事実であった。オン速度定数とKD値それ自体との間の相関係数R2は、0.92であった;実際、ナノモル以上の結合剤は、通常は約105M−1s−1のオン速度定数konを有するのに対して、最も強いナノモル以下の結合剤は、106M−1s−1に近いかまたはこれを超えるkon値を有する。
ファージコーティングELISAのKDも、可溶性構築物(MB76を除く)について得られたKDと非常によく一致していた。これは、ファージディスプレイの初期段階(すなわち、クローンのスクリーニング段階)で測定したKD値が、可溶性構築物の親和性の非常に優れた予測因子であることを意味する。
7.2.阻害データ
上記脾細胞アッセイにおいて、可溶性アルファボディーの阻害力をルーチンに測定した。続いて、より手間がかかるDBアッセイにおいて、下位選択した最も有望なバリアントを試験した。図4は、それらの効力、および各ポリペプチドを独立して試験した回数を示す。
上記脾細胞アッセイにおいて、可溶性アルファボディーの阻害力をルーチンに測定した。続いて、より手間がかかるDBアッセイにおいて、下位選択した最も有望なバリアントを試験した。図4は、それらの効力、および各ポリペプチドを独立して試験した回数を示す。
図5は、IL−23による刺激時の脾細胞によるIL−17産生の応答曲線を示す。応答は、IL−23濃度の対数関数として線形曲線に従うことが見出され、すなわち、IL−17応答は、非常に広範囲のIL−23濃度にわたって対数的であった。
Quantikine kitによって、IL−17産生を定量した。IL−17シグナル(OD)とIL−23濃度(x軸)との間の対数関係が見出された。
8.MB23−PEGの製造
全タンパク質の95%超を単量体MB23にする(活性化マレイミドPEGにコンジュゲートするのに必要なMB23上の単一の遊離チオール基が、二量体化および宿主細胞タンパク質への結合の原因に確実にならないようにするための)還元条件下において、2段階のクロマトグラフィー法を開発した。
全タンパク質の95%超を単量体MB23にする(活性化マレイミドPEGにコンジュゲートするのに必要なMB23上の単一の遊離チオール基が、二量体化および宿主細胞タンパク質への結合の原因に確実にならないようにするための)還元条件下において、2段階のクロマトグラフィー法を開発した。
PEG化の前に、プールしたHIC画分を約5mg/mLに濃縮し、DTTを含まない50mM MES、0.5M塩化ナトリウム、pH6.0に緩衝液交換した。濃度に基づいて生成物のモルを計算し、40kDaの活性化PEGと10kDaのMB23タンパク質とのモル比が1.5に等しくなるのに必要なPEGのグラム数を決定した。予め計量した固体の活性化PEGをタンパク質溶液に直接混合し、PEG化反応を室温で一晩進行させた。PEG化反応の完了後、SECによってPEG化効率を測定した。サイズ排除クロマトグラフィーによって、非PEG化タンパク質からPEG化タンパク質を分離し、2つの種の相対割合を定量した。
9.ポリペプチドMB23のホモコンカテマー
ホモコンカテマーを作製することによって、効力増強の増大を達成することができるかを調べた(2個の連結アルファボディーは、それぞれが異なるP19ドメインに結合し、各P40ドメインは異なるIL12RB1受容体に結合しているようにする)。具体的には、長い48残基のGly/Serリンカーを介してMB23_B2fSバリアントをホモコンカテマー化し(MB23_B2fS_L48_MB23_B2fSという名称の構築物)、その効力を非コンカテマー化形態と比較した。(MB23_B2fK_L48_MB23_B2fKと名付けられた)第2の変異型ホモコンカテマーも製造した。
ホモコンカテマーを作製することによって、効力増強の増大を達成することができるかを調べた(2個の連結アルファボディーは、それぞれが異なるP19ドメインに結合し、各P40ドメインは異なるIL12RB1受容体に結合しているようにする)。具体的には、長い48残基のGly/Serリンカーを介してMB23_B2fSバリアントをホモコンカテマー化し(MB23_B2fS_L48_MB23_B2fSという名称の構築物)、その効力を非コンカテマー化形態と比較した。(MB23_B2fK_L48_MB23_B2fKと名付けられた)第2の変異型ホモコンカテマーも製造した。
脾細胞アッセイによって決定したfKDは、以下のとおりであった:(i)MB23_B2fS:0.55nM、(ii)MB23_B2fS_L48_MB23_B2fS:0.14nM、MB23_B2fK_L48_MB23_B2fK:0.06nM。ホモコンカテマー化は、効力の増大をもたらし得ると結論した。
10.ヒトリンパ腫細胞における抗IL23アルファボディーのイン・ビトロ有効性
漸増濃度のPEG化IL23特異アルファボディーMB23−PEG(実施例8に記載されているように製造したもの)を固定濃度のヒトIL23とともにプレインキュベートすると、Stat3リン酸化の用量依存的な阻害が測定されたことが見出された(PathScan Phospho−Stat3 Sandwich ELISA kit)。特に、図6Bに示されているように、ヒトIL23(35pM)をMB23−PEG(0.01nM〜500nM)とともにプレインキュベートすることにより、Stat3リン酸化が用量依存的に阻害された。Stat3リン酸化をヒトIL23濃度(0.01〜10000pM)に応じて測定した図6Aに示されている同時測定した検量線に基づいて、0.42nMの機能KDを計算することができた。別の実験では、同じStat3リン酸化アッセイにおいて、非PEG化MB23アルファボディーの機能KDは0.31nMであると決定された(データは示さず)。これらの結果は、PEG化および非PEG化MB23アルファボディー両方が、ほぼ同じ効力でヒトIL23を阻害することができることを示している。
漸増濃度のPEG化IL23特異アルファボディーMB23−PEG(実施例8に記載されているように製造したもの)を固定濃度のヒトIL23とともにプレインキュベートすると、Stat3リン酸化の用量依存的な阻害が測定されたことが見出された(PathScan Phospho−Stat3 Sandwich ELISA kit)。特に、図6Bに示されているように、ヒトIL23(35pM)をMB23−PEG(0.01nM〜500nM)とともにプレインキュベートすることにより、Stat3リン酸化が用量依存的に阻害された。Stat3リン酸化をヒトIL23濃度(0.01〜10000pM)に応じて測定した図6Aに示されている同時測定した検量線に基づいて、0.42nMの機能KDを計算することができた。別の実験では、同じStat3リン酸化アッセイにおいて、非PEG化MB23アルファボディーの機能KDは0.31nMであると決定された(データは示さず)。これらの結果は、PEG化および非PEG化MB23アルファボディー両方が、ほぼ同じ効力でヒトIL23を阻害することができることを示している。
11.局所IL23誘発性炎症の予防
1〜15日目に隔日でヒトIL−23(1μg)を20匹のマウス(群:対照、A、BおよびC)の右耳介に繰り返し皮内投与することによって、局所耳皮膚炎症を誘発した。対照群(対照)にはPBSを投与した。−1日目、0日目、3日目、6日目、9日目、12日目および15日目に、皮内(10μg;B群)または腹腔内(40mg/kg;C群)投与によって、MB23−PEGを投与した。A群のマウスは、MB23−PEG処置を受けなかった。0日目に、そしてその後は16日目まで隔日に、キャリパーを用いて耳介皮膚の厚さを決定することによって、皮膚腫脹を測定した。結果を図7に示す。対照群は、耳介皮膚のいかなる肥厚も示さなかったが、IL−23のみを注射したマウス(A群)については、皮膚の明らかな肥厚が10日目のように観察された。対照的に、MB23−PEGでも処置したマウス(B群およびC群)は、有意な皮膚肥厚を示さなかった。これは、MB23−PEGによる処置が、ヒトIL−23の炎症効果を阻害することができることを示している。
1〜15日目に隔日でヒトIL−23(1μg)を20匹のマウス(群:対照、A、BおよびC)の右耳介に繰り返し皮内投与することによって、局所耳皮膚炎症を誘発した。対照群(対照)にはPBSを投与した。−1日目、0日目、3日目、6日目、9日目、12日目および15日目に、皮内(10μg;B群)または腹腔内(40mg/kg;C群)投与によって、MB23−PEGを投与した。A群のマウスは、MB23−PEG処置を受けなかった。0日目に、そしてその後は16日目まで隔日に、キャリパーを用いて耳介皮膚の厚さを決定することによって、皮膚腫脹を測定した。結果を図7に示す。対照群は、耳介皮膚のいかなる肥厚も示さなかったが、IL−23のみを注射したマウス(A群)については、皮膚の明らかな肥厚が10日目のように観察された。対照的に、MB23−PEGでも処置したマウス(B群およびC群)は、有意な皮膚肥厚を示さなかった。これは、MB23−PEGによる処置が、ヒトIL−23の炎症効果を阻害することができることを示している。
Claims (11)
- 一般式
HRS1−L1−HRS2−L2−HRS3
(式中、
−HRS1、HRS2およびHRS3は、それぞれ独立して、2〜7個の連続するが必ずしも同一ではないヘプタッド反復単位を含有するヘプタッド反復配列(HRS)であり、
−前記ヘプタッド反復単位は、「abcdefg」または「defgabc」(式中、「a」〜「g」の記号は、通常のヘプタッドの位置を表わす)として表される7残基の(ポリ)ペプチド断片であり、
−すべてのヘプタッドのa位およびd位の少なくとも50%は、イソロイシン残基によって占められており、
−各HRSは、ヘプタッドのa位または「d」位に位置する脂肪族アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基で開始しており、
−L1およびL2は、それぞれ独立して、HRS1とHRS2とを共有結合的に連結し、HRS2とHRS3とを共有結合的に連結するリンカー断片である)
を有するアミノ酸配列を含有しており、
−HRS1において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、グルタミン酸またはアラニンによって占められており、
(ii)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、バリンによって占められており、
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのc位が、アラニンまたはグリシンによって占められており、および
(iv)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、チロシンまたはトリプトファンによって占められており、ならびに
−HRS3において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、グルタミンまたはリジンによって占められており、
(ii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、ロイシンまたはイソロイシンまたはバリンによって占められており、
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、チロシンによって占められており、および
(iv)HRS3が、第3のヘプタッド反復の後に部分(a−f)ヘプタッド反復単位を含有し、その中のヘプタッドのb位が、メチオニンによって占められていること
を特徴とする、インターロイキン−23(IL−23)に特異的に結合するポリペプチド。 - HRS1において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、グルタミン酸によって占められており、および/または
(iii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのc位が、アラニンによって占められており、および/または
(iv)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、チロシンによって占められている、請求項1に記載のポリペプチド。 - HRS3において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、グルタミンによって占められており、および/または
(ii)第3のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、バリンによって占められている、請求項1または2に記載のポリペプチド。 - HRS1において、
(i)第1のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、グルタミン酸によって占められており、および/または
(ii)第1のヘプタッド反復単位のヘプタッドのc位が、グルタミンによって占められており、および/または
(iii)第1のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、リジンによって占められており、および/または
(iv)第1のヘプタッド反復単位のヘプタッドのg位が、グルタミン酸によって占められており、および/または
(v)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、スレオニンによって占められており、および/または
(vi)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのc位が、スレオニンによって占められており、および/または
(vii)HRS1が、第3のヘプタッド反復の後に部分(a−c)ヘプタッド反復単位を含有し、その中のc位が、スレオニンによって占められていること
をさらに特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - HRS3において、
(i)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのb位が、アラニンによって占められており、および/または
(ii)第2のヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、グルタミン酸によって占められており、および/または
(iii)第4のヘプタッド反復単位のヘプタッドのe位が、アラニンによって占められており、および/または
(iv)第3のヘプタッド反復単位の後の部分(a−f)ヘプタッド反復単位のヘプタッドのf位が、セリンによって占められていることをさらに特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - HRS1が、配列番号:1に定義されたアミノ酸配列を有し、および/またはHRS3が、配列番号:2に定義されたアミノ酸配列を有する、請求項1〜5のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が配列番号:3に定義されている、請求項1〜6のいずれかに記載のポリペプチド。
- 医薬として使用するための、請求項1〜7のいずれかに記載のポリペプチド。
- 炎症または炎症性障害、例えば、腸疾患(大腸炎、クローン病、IBD)、感染性疾患、乾癬、癌、自己免疫性疾患(例えば、MS)、サルコイドーシス(carcoidis)、移植拒絶、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、ウイルス感染症および一般的な分類不能型免疫不全からなる群より選ばれたIL−23媒介性疾患の治療方法に使用するための、請求項1〜8のいずれかに記載のポリペプチド。
- 請求項1〜9のいずれかに記載のポリペプチドおよび薬学的に許容され得る担体を含有してなる、医薬組成物。
- 請求項1〜9のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、核酸配列。
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