ES2714504T3 - Miembros de la familia il-1 modificados dirigidos - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un constructo de direccionamiento, que comprende: (1) una IL-1ß mutada caracterizada por una afinidad reducida por su receptor en comparación con la IL-1ß de tipo salvaje, en donde la IL-1ß mutada comprende una o más mutaciones seleccionadas de R120X, Q131G, L145G, H146X, Q148X, F162A, y K208E, donde X es un cambio no conservador, y (2) un resto dirigido que comprende un dominio variable de anticuerpos de cadena pesada de camélido (VHH) o un dominio variable de nuevos receptores de antígeno (VNAR).

Description

DESCRIPCION

Miembros de la familia il-1 modificados dirigidos

La presente invencion se refiere a una IL-1 p modificada, con actividad reducida a traves de su receptor de citoquina, en el que dicha IL-1p se administra espedficamente a las celulas diana. La IL-1p es una mutante con afinidad reducida por el receptor de IL-1, en el que dicha IL-1p mutante se administra espedficamente a las celulas diana. El direccionamiento se realiza mediante la fusion de la IL-1p modificada con un resto diana, que es un VHH o VNAR. La invencion se refiere ademas a dicha IL-1 p modificada dirigida para uso en el tratamiento de enfermedades.

La familia de Interleuquinas-1 (IL-1) consiste en 11 miembros de la familia relacionados estructuralmente (IL-1a, IL-1-p, IL-1Ra, IL-18, IL-33 e IL-1F5 a IL-1F10), que se encuentran entre las moleculas de senalizacion del sistema inmunitario mas potentes, que actuan a traves de un grupo de receptores estrechamente relacionados. Todos los receptores de la IL-1 tienen un modo de activacion similar: tras la union del ligando a la subunidad del receptor primario (es decir, IL-1R1 para IL-1a y p, IL-18R para IL-18 y ST2 para IL-33), una segunda subunidad del receptor es reclutada (es decir, IL-1RAP para IL-1 a y p, IL-18RAP para IL-18 e IL-1RAP para IL-33) y la senalizacion se inicia mediante la yuxtaposicion de los dominios del receptor citoplasmico Toll/IL-1 de las subunidades del receptor (TIR). Los dominios TIR dimerizados proporcionan una plataforma de acoplamiento para la protema adaptadora MYD88 que, a traves del reclutamiento de otros intermedios, conduce a la activacion de las rutas del factor nuclear proinflamatorio ^kB (NF-^kB) y de la protema quinasa activada por mitogenos (MAPK). Los miembros de la familia IL-1 son producidos principalmente por celulas inmunes innatas y actuan sobre una variedad de tipos de celulas durante la respuesta inmune (para una revision, ver Sims y Smith, 2010).

Los linfocitos T son una de las principales celulas diana de la familia IL-1 y los efectos potenciadores de la IL-1a e IL-1p en particular en la expansion y diferenciacion de diferentes subconjuntos de celulas T, en particular las celulas T CD8+ (Ben-Sasson, 2011; Ben-Sasson, 2013) y las celulas Th17 (Sutton et al., 2006; Acosta-Rodnguez et al., 2007; Dunne et al., 2010; Shaw et al., 2012) se han establecido firmemente. Las celulas Th17 se caracterizan por la produccion de IL-17 y desempenan un papel importante en la enfermedad autoinmune y la inflamacion cronica (revisado en Wilke et al., 2011). Entre los subconjuntos de linfocitos T, las celulas Th17 expresan los niveles mas altos de IL-1R e IL-1 juega un papel importante en el cebado de Th17.

La IL-18 es mejor conocida como una citoquina que induce IFN^y con una potente accion sobre las celulas Th1 y las celulas natural killer (NK) (en Okamura et al., 1995; Takeda et al., 1998). Ademas, la IL-18 mejora la funcion de los neutrofilos (Leung et al., 2001). Varios informes demuestran la accion antitumoral de IL-18 en modelos animales (Micallef et al., 1997; Loeffler et al., 2008; Wigginton et al., 2002; Zaki et al., 2010) y la terapia con IL-18 humana recombinante recientemente ingresaron en ensayos clmicos para evaluar su eficacia para el tratamiento del cancer avanzado (Robertson et al., 2008). A diferencia de la IL-18, la IL-33 actua principalmente sobre las celulas Th2 (Schmitz et al., 2005) y en los mastocitos (Allakhverdi et al., 2007), y recientemente se demostro que actua sobre las celulas T CD8 para dirigir las respuestas antivirales (Bonilla et al., 2012).

Los otros miembros de la familia de IL-1 estan menos caracterizados, pero, en resumen, diferentes miembros de la familia de IL-1 tienen especificidades para distintos subconjuntos de celulas T u otros tipos de celulas y, por lo tanto, diferentes aplicaciones terapeuticas.

Ademas de tener actividad antitumoral indirecta, a traves de la activacion de celulas T y NK, se demostro que los miembros de la familia IL-1 tienen propiedades citostaticas directas, que se demostraron de manera mas convincente en celulas de melanoma humano (Morinaga et al., 1990; Usui et al., 1991; Rangnekar et al., 1992).

En vista de la contribucion de varios miembros de la familia de IL-1 a los procesos inflamatorios, el interes clmico se ha orientado principalmente hacia el desarrollo de estrategias de antagonizacion de IL-1 (Dinarello et al., 2012). La actividad de IL-1 agonista controlada puede tener por tanto aplicaciones en diferentes procesos fisiologicos/patologicos, donde los efectos inmunoestimuladores senan deseables. Sin embargo, una de las preocupaciones principales respecto al uso de IL-1 en los tratamientos inmunoestimuladores es la grave toxicidad cuando se administra de forma sistemica. Sin embargo, cuando la accion de IL-1 podna limitarse a una poblacion celular seleccionada, el problema de toxicidad podna resolverse, lo que abre perspectivas terapeuticas.

Por ejemplo, aunque ha habido mucho interes en bloquear las respuestas de Th17 en vista de su papel patogeno en condiciones autoinmunes como la esclerosis multiple, la artritis reumatoide y la enfermedad inflamatoria del intestino (Wilke et al., 2011), la funcion normal de Th17 es indispensable para la inmunidad protectora contra una variedad de patogenos, como Mycobacterium tuberculosis (Khader et al., 2007), Klebsiella pneumoniae (Ye et al., 2001) y Bordetella pertussis (Higgins et al., 2006). A medida que la IL-1p estimula la funcion de Th17, se ha planteado la idea de utilizar la IL-1p como un adyuvante de celulas T para mejorar la respuesta a vacunas debiles (Ben-Sasson et al., 2011). Otras aplicaciones podnan ser el direccionamiento de la IL-1p o la IL-33 a la poblacion de celulas T CD8+ para mejorar las respuestas antivirales o dirigir la IL-18 a celulas Th1 o celulas NK para promover la actividad antitumoral.

Los documentos WO 2011/029870, WO 2010/036918, US 5.914.254, WO 2011/020783, WO 2009/003145, y Rovero et al. (Gene Therapy 2001, 8:447-452) describe diferentes constructos de fusion de IL-1 p.

Sorprendentemente, encontramos que es posible disenar modificaciones de la familia de IL-1 que son defectuosas en la activacion de su receptor, pero, cuando se fusionan con un resto dirigido, recuperan su actividad en tipos celulares seleccionados mediante un efecto de concentracion en la superficie celular. Las mutantes de IL-1 tienen una afinidad reducida por sus receptores cognados y, por lo tanto, son incapaces de unir y activar eficientemente sus receptores. Sin embargo, al fusionarlos con un resto dirigido (como un nanocuerpo), la actividad del miembro de la familia IL-1 mutante se restaura en las celulas que expresan el objetivo de la superficie celular, reconocido por el resto dirigido. Debido a que la activacion se limita solo a los tipos de celulas seleccionadas, no se produce ninguna toxicidad sistemica importante.

La invencion se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Un primer aspecto de la invencion es una composicion que comprende un constructo de direccionamiento, que comprende una IL-1p modificada, caracterizada por una afinidad reducida por su receptor de citoquina, y un resto de direccionamiento. Una IL-1p modificada significa que la IL-1p se ha cambiado para alterar la afinidad a su receptor, con el resultado final de que la IL-1p modificada tiene una afinidad reducida por el receptor y una consiguiente actividad biologica reducida, en comparacion con la citoquina de tipo salvaje endogena que se une normalmente al receptor. Una afinidad reducida y una actividad biologica reducida consecuente como se usa aqrn significa que la citoquina de la familia IL-1 modificada tiene una actividad biologica de menos del 70 % de la actividad biologica de la citoquina de la familia IL-1, incluso mas preferiblemente menos del 60 % de la actividad biologica de la citoquina de la familia IL-1, mas preferiblemente menos del 50 % de la actividad biologica de la citoquina de la familia IL-1, mas preferiblemente menos del 40 % de la actividad biologica de la citoquina de la familia IL-1, mas preferiblemente menos del 30 % de la actividad biologica de la citoquina de la familia IL-1, mas preferiblemente menos del 20 % de la actividad biologica de la citoquina de la familia IL-1, mas preferiblemente menos del 10 % de la actividad biologica de la citoquina de la familia IL-1, lo mas preferiblemente menos del 1 % de la actividad biologica de la citoquina de la familia IL-1 en comparacion con la citoquina de la familia IL-1 que normalmente se une al receptor. Preferiblemente, la citoquina de la familia de IL-1 modificada es una mutante de la citoquina de la familia de IL-1 de tipo salvaje y la actividad se compara con la citoquina de la familia de IL-1 de tipo salvaje. La afinidad y/o la actividad pueden medirse por cualquier procedimiento conocido por el experto en la tecnica.

Una realizacion preferida de la invencion es un constructo de direccionamiento, que comprende una IL-1p mutante caracterizada por una afinidad reducida por el receptor de interleuquina-1 de tipo I (IL-1RI) y/o el receptor de la protema accesoria del receptor de interleuquina-1 (IL- 1RAcP), y un resto de direccionamiento. La afinidad de la IL-1p mutante por el receptor, en comparacion con la afinidad de la IL-1p de tipo salvaje por el receptor, se puede medir mediante el analisis de trazado de Scatchard y el ajuste por computadora de los datos de union (por ejemplo, Scatchard, 1949) o por espectroscopia de interferencia reflectometrica en condiciones de flujo, segun lo descrito por Brecht et al. (1993). La actividad de la IL-1p mutante se mide tfpicamente usando un bioensayo (por ejemplo, mediante la induccion de la muerte celular) o midiendo los eventos de senalizacion corriente abajo del receptor. Dichos eventos de senalizacion pueden ser la modificacion o la translocacion nuclear de NF-kB, o la induccion de un gen informante seleccionado. Preferiblemente, dicha IL-1 p mutante tiene una actividad biologica de menos del 70 % de la actividad biologica de la IL-1p de tipo salvaje, incluso mas preferiblemente menos del 60 % de la actividad biologica de la IL-1 p de tipo salvaje, mas preferiblemente menos mas del 50 % de la actividad biologica de la IL-1p de tipo salvaje, mas preferiblemente menos del 40 % de la actividad biologica de la IL-1p de tipo salvaje, mas preferiblemente menos del 30 % de la actividad biologica de la IL-1 p de tipo salvaje, mas preferiblemente menos del 20 % de la actividad biologica de la IL-1p de tipo salvaje, mas preferiblemente menos del 10 % de la actividad biologica del tipo salvaje, mas preferiblemente menos del 1 % del tipo salvaje del cual se deduce (es decir, la IL-1p de tipo salvaje de la cual la secuencia codificante ha sido mutada para obtener la IL-1 p mutante). Dicha mutante comprende una mutacion seleccionada del grupo que consiste en R120X, Q131G, L145G, H146X, Q148X, F162A, K208E (en donde X puede ser cualquier cambio en el aminoacido, preferiblemente un cambio no conservativo). Incluso mas preferiblemente, dicha mutacion se selecciona del grupo que consiste en R120A, R120G, H146A, H146G, H146E, H146N, H146R, Q148E, Q148G y Q148L. Mas preferiblemente, dicha mutacion se selecciona del grupo que consiste en R120G, H146N, H146R, Q148E y Q148G. (base de numeracion en la secuencia de IL-1p humana, numero de acceso a Genbank NP_000567, version NP-000567.1, GI:10835145).

Preferiblemente, dicho resto de direccionamiento esta dirigido a un marcador expresado en una celula que expresa el receptor de IL-1p, preferiblemente una celula que expresa IL1-RI. En una realizacion preferida, dicho resto dirigido se dirige a un marcador espedfico de tejido.

La IL-1p modificada esta unida a un resto de direccionamiento. “Ligado" como se usa aqu puede ser por una union covalente, o puede ser por una union por afinidad. Un "resto de direccionamiento" como se usa aqu es una molecula de union que puede dirigir la protema de fusion hacia un sitio de union en una celula que expresa un receptor para la IL-1p, por interaccion espedfica entre el sitio de union y la molecula de union. Dicha molecula de union es un dominio variable de anticuerpos de cadena pesada de camelido (VHH) o un dominio variable de nuevos receptores de antigeno (VNAR). Preferiblemente, dicho resto de direccionamiento consiste en una cadena polipeptfdica simple y no se modifica despues de la traduccion. Aun mas preferiblemente, dicho resto de direccionamiento es un nanocuerpo. En un ejemplo no limitativo, dicho resto de direccionamiento puede ser un anticuerpo biespedfico, dirigido a un sitio de union en la celula diana para una especificidad, y a la citoquina objetivo, o a una marca fusionada a dicha citoquina para la otra especificidad. Como un ejemplo no limitante, el resto de direccionamiento puede unirse químicamente a la interleuquina-lp mutante, o puede ser una protema de fusion recombinante. Preferiblemente, dicho constructo de direccionamiento es una protema de fusion recombinante. El resto dirigido se puede fusionar directamente con la IL-1p mutante o se puede fusionar con la ayuda de un fragmento enlazador, preferiblemente un enlazador GGS. El resto de direccionamiento se puede fusionar en el extremo aminoterminal o en el extremo carboxiterminal de la IL-1 p mutada; preferiblemente, dicho resto de direccionamiento se fusiona en el extremo aminoterminal de la molecula de IL-1p mutada. El constructo de direccionamiento puede comprender, ademas, otros dominios tales como, pero sin limitacion, una secuencia marcadora, una secuencia senal, otra citoquina o un anticuerpo.

Otro aspecto de la invencion es una composicion de acuerdo con la invencion para uso como un medicamento. Una realizacion preferida es una composicion de acuerdo con la invencion para uso en la estimulacion de la respuesta inmune. De hecho, se sabe que el tratamiento con IL-1 puede inducir la expresion de antfgenos en celulas B (Killar et al., 1989); del mismo modo, el tratamiento con IL-18 consiste en aumentar las inmunidades celular y humoral (Kinoshita et al., 2011). De manera similar, se ha demostrado que la IL-1 actua sobre las celulas T para aumentar la magnitud de las respuestas inmunes in vivo (Ben-Sasson et al., 2011; Ben Sasson et al., 2013). Por lo tanto, un aspecto preferido de la invencion es la composicion de acuerdo con la invencion para uso como adyuvante en la vacunacion. El constructo de direccionamiento de acuerdo con la invencion es especialmente interesante a este respecto, ya que el efecto proinflamatorio de la IL-1 de tipo salvaje normal hace que la aplicacion de IL-1 como tal sea imposible.

Otro aspecto mas de la invencion es una composicion de acuerdo con la invencion para uso en el tratamiento del cancer. De hecho, Morinaga et al., 1990, Usui et al., 1991 y Rangnekar et al., 1992 han demostrado que los miembros de la familia IL-1 tienen propiedades citostaticas directas, que se demostraron de manera mas convincente en celulas de melanoma humano.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1: Representacion esquematica de las protemas de fusion de IL-1p-nanocuerpo

Figura 2: Dependencia de la concentracion de la induccion de la actividad NF^kB por mutaciones de tipo salvaje y Q148G IL-1 Her2 mutante (A) y otras mutantes seleccionadas (B), en celulas transfectadas simuladas, o celulas transfectadas con deficiencia de senalizacion Her2.

Figura 3: Efecto de las fusiones de IL-1 Her2 nanocuerpo de tipo salvaje y mutante (Q148G, L145A/L147A, F162A/Q164E) en la translocacion nuclear de NF-kB p65 endogeno en celulas transfectadas simuladas, o celulas transfectadas con una deficiente senalizacion de Her2.

Figura 4: Induccion de la actividad de NFkB por tipo salvaje y 5 mutantes de IL-1 diferentes, fusionados con un receptor de leptina anti-murino, en celulas que expresan el receptor de leptina murino (mLR) o no (no mLR).

Figura 5: La dependencia de la concentracion de la induccion de la actividad NF^kB por los mutantes dobles de IL1 fusionados con el nanocuerpo Her2 en celulas transfectadas de forma simulada, o celulas transfectadas con Her2 deficiente en senalizacion.

EJEMPLOS.

Los ejemplos que caen fuera del alcance de las reivindicaciones se proporcionan solo con fines ilustrativos.

Materiales y metodos para los ejemplos

Clonacion de proteinas de fusion de IL-1-nanocuerpo.

El nanocuerpo 4-10 dirigido contra el receptor de leptina murino se describe en Zabeau et al. (2012) y en la patente WO 2006/053883. El nanocuerpo anti-Her2 1R59B se describe en Vaneycken et al. (2011). Ambos nanocuerpos se clonaron con una marca His C-terminal en el vector de expresion eucariotico pMET7. Una secuencia optimizada de codon que codifica la protema IL-1p madura, precedida por el peptido lfder SigK y equipada con una marca HA N-terminal se genero a traves de la smtesis genica (Invitrogen Gene Art). Para generar las proteinas de fusion de IL-1pnanocuerpo, la secuencia de IL-1p se clono 5' a la secuencia de nanocuerpos en pMet7, con un enlazador 13 x GGS que separa las fracciones de citoquina y nanocuerpo. (Fig. 1)

IL-1p mutantes.

Se seleccionaron IL-13 mutantes de las que se espera que tengan una disminucion en la afinidad de union por IL-1R segun la bibliograffa y el analisis de las estructuras de cristal publicadas de IL-1p humana complejada con su receptor. Se crearon mutaciones en el resto hIL-1B mediante mutagenesis dirigida a sitio (QuickChange, Stratagene) utilizando los cebadores de mutagenesis tal como se indica en la tabla I:

Production de proteinas de fusion de IL-1p.

Se produjeron protemas de fusion de IL-1p en celulas HEK293T. Para una produccion en pequena escala, se sembraron las celulas HEK293T en placas de 6 pocillos con 400000 celulas/pocillo en DMEM complementado con FCS al 10 %. Luego de 24 horas, se remplazo el medio de cultivo con medio con poco suero (DMEM/FCS al 5 %) y se transfectaron celulas utilizando PEI lineal. Brevemente, la mezcla de transfeccion de PEI se preparo combinando 1 pg de vector de expresion con 5 pg de PEI en 160 pl de DMEM, se incubo durante 10 minutos a TA y se anadio a los pocillos gota a gota. Luego de 24 horas, se lavaron las celulas transfectadas con DMEM y se separaron en capas con 1,5 ml de OptiMem/pocillo para la produccion de protemas. Los medios acondicionados se recuperaron despues de 48 horas, se filtraron a traves de filtros de 0,45 micrones y se almacenaron a -20 °C; el contenido de IL-1p se determino por Elisa en los medios acondicionados de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D Systems).

Ensayo del gen informante de NF- kB.

Para evaluar la activacion de IL-1R, utilizamos HEK-Blue™ celulas de IL-1p que expresan en forma estable la IL-1R (Invivogen) y las transfectamos en forma transitoria con un gen informante de luciferasa NF-kB. Brevemente, HEK-Blue™ las celulas de IL-1p se sembraron en medio de cultivo (DMEM/FCS al 10 %) en placas de 96 pocillos (10000 celulas/pocillo) y se transfectaron al dfa siguiente utilizando el metodo de precipitacion con fosfato de calcio con las cantidades indicadas de plasmidos de expresion y 5 ng/pocillo del plasmido de gen informante 3^kB-L^uc (Vanden Berghe et al., 1998). 24 horas despues de la transfeccion, se remplazo el medio de cultivo con medio de privacion (DMEM) y 48 horas despues de la transfeccion, se indujeron las celulas durante 6 horas con protemas de fusion. Despues de la induccion, se lisaron las celulas y se determino la actividad de la luciferasa en lisados utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Promega Firefly en un luminometro Berthold centro LB960.

Analisis de la translocacidn nuclear NF- ^k B a traves de microscopia confocal.

Para la formacion de imagenes confocales, se sembraron 105 celulas HEK293-T/pocillo (en una placa de 6 pocillos) sobre cubreobjetos de vidrio (Zeiss), recubiertos con poli-L-lisina (Sigma). Al dfa siguiente, las celulas se transfectaron con 200 ng/pocillo de vector vado o plasmido de expresion HER2Acyt utilizando el metodo de precipitacion con fosfato de calcio. Despues de 48 horas, las celulas se trataron durante 30 minutos con vehmulo (medio) o protema de fusion de IL1-Her2-nanocuerpo (10 ng/ml). A continuacion, las celulas se enjuagaron 1 vez con PBS y se fijaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en paraformaldehndo al 4 %. Despues de tres lavados con 1xPBS, las celulas se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1 % en 1xPBS durante 10 minutos y se bloquearon en BSA al 1 % en 1xPBS durante otros 10 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se incubaron luego durante 1 hora a 37 °C con anticuerpo de conejo anti-p65 (Santa Cruz C20, diluido 1:800) y anticuerpo anti-Flag de raton (Sigma M2, 1: 2000). Despues de cuatro lavados en 1x PBS, las celulas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios anti-conejo Alexa 488 y anti-raton Alexa 594 conjugados con fluorocromo (ambos diluidos 1:800). Despues de la incubacion del anticuerpo secundario, las celulas se lavaron cuatro veces en 1xPBS y los nucleos se tineron con DAPI (2 pg/ml). Despues de una etapa de lavado final en 1xPBS, los cubreobjetos se montaron utilizando galato de propilo. Las imagenes se adquirieron utilizando un objetivo NA 60x 1.35 en un microscopio confocal de barrido laser Olympus IX-81 y se analizaron con el software Fluoview 1000.

Ejemplo 1: IL-ip-ligando y proteinas de fusion de IL-ip-nanocuerpo.

La Fig. 1 muestra un esquema de las protemas de fusion IL-1p-nanocuerpo construidas con WT hIL-1p o mutantes de hIL1p descritos en la tabla I.

Ejemplo 2: La actividad de IL-ip de las fusiones mutantes seleccionadas de IL-ip-nanocuerpo se restaura en las celulas que expresan los objetivos de Nb.

Los mutantes de IL-1p de tipo natural y 45 de IL-1p (Tabla I) se fusionaron con un nanocuerpo bien caracterizado que reconoce Her2 (1R59B). Las protemas de fusion de IL-1p-nanocuerpo se probaron en HEK-Blue™ celulas IL-1p, transfectadas transitoriamente con un plasmido informante NF-kB (5 ng/pocillo) y un plasmido de expresion de Her2Acyt (deficiente en la senalizacion) (2 ng/pocillo). Las celulas se trataron durante 6 horas con fusiones de nanocuerpos IL-1p-Her2 (respuesta a la dosis que oscila entre 0,4 y 250 ng/ml). Como se demuestra en la Fig. 2A, la fusion de nanocuerpos de IL-1p-Q148G-Her2 mostro una capacidad reducida para activar NF-kB en comparacion con la fusion de IL1-p-Her2-nanocuerpo de tipo salvaje. Es importante destacar que el direccionamiento de la mutante Q148G a las celulas que expresan Her2Acyt restablecio su actividad y produjo una curva de dosis-respuesta para la activacion de NF-KB que es perfectamente paralela a la de la IL-1p de tipo salvaje en celulas transfectadas en forma simulada. Tambien es evidente a partir de esta figura un fuerte efecto de direccionamiento para la fusion de IL-1 p Her2-nanocuerpo de tipo salvaje. Se observaron efectos similares de "activacion dirigida" para otras seis mutantes de IL-ip (R120G, Q131G, H146A, H145A/L147A, F162A/Q164E y K208E) fusionados con el nanocuerpo Her2 (Fig. 2B). Para obtener una prueba adicional del concepto de "activacion por direccionamiento", a continuacion, exploramos si pudieramos visualizar la activacion selectiva de NF-kB en celulas que expresan Her2 mediante las fusiones de IL-1p-Her2-nanocuerpo mediante microscopia confocal. Medimos la activacion de NF-^kB endogeno mediante el ensayo de su translocacion nuclear. Como se observa en la Fig. 3, solo la fusion de IL-1p-Her2 nanocuerpo de tipo salvaje promovio la translocacion de NF-kB endogeno en las celulas que no expresan Her2. Mientras que no promovieron la translocacion detectable de NF-kB en celulas transfectadas de forma simulada, las tres fusiones de IL1-p-Her2 nanocuerpo mutante probadas activaron la translocacion nuclear de NF-kB en celulas que tambien se tineron en forma positiva para Her2, lo que indica que solo actuan sobre las celulas dirigidas.

Para evaluar si el concepto de "activacion por orientacion" tambien funciona utilizando un nanocuerpo a una protema de membrana no relacionada, fusionamos WT IL-1p y cinco de las mutantes de IL-1p deshabilitadas (R120G, Q131G, H146A, Q148G, K209A) a un nanocuerpo previamente caracterizado que reconoce mLR (4-10). Se realizo un experimento similar al descrito para la fusion de IL-1p-Her2 nanocuerpo (Fig. 2) utilizando HEK-Blue™ celulas IL-1p, transfectadas transitoriamente con un plasmido de expresion de mLR (10 ng/pocillo). En forma similar a los resultados obtenidos con las protemas de fusion de nanocuerpo Her2, todas las fusiones de IL-1 p nanocuerpo mutantes investigadas (evaluadas a 12,5 ng/ml) mostraron una capacidad reducida, en comparacion con la fusion Wt , para activar NF-kB en celulas que no expresan mLRs. Sin embargo, el direccionamiento por el resto de nanocuerpo mLR restablecio parcialmente la actividad de las mutantes seleccionadas (Fig. 4).

Debido a que las mutantes de IL-1p descritas anteriormente retuvieron una actividad biologica residual significativa, combinamos diferentes mutaciones para obtener mutantes dobles/triples con una actividad basal reducida. Se probaron nueve mutantes dobles/triples (veanse las mutantes 46 a 54 de la tabla I) y de estas, seis protemas mutantes (Q131G/Q148G, Q148G/K208E, R120G/Q131G, R120G/Q131G, R120G/H146A, R120G/K208E, R120G/F162A/Q164E) no mostraron actividad residual (usando el mismo ensayo para medir NF-^kB que en la Fig. 2) en celulas Her2-negativas, mientras que la actividad parcialmente restaurada fue evidente en las celulas que sobreexpresan Her2Acyt (Fig. 5).

Estos datos indican en conjunto que dirigirse a IL-1 p mutante parcialmente inactiva, al fusionarla con un nanocuerpo que reconoce un receptor de la superficie celular, puede restaurar su actividad en las celulas diana de nanocuerpo, probablemente mediante la interaccion forzada del receptor a traves del efecto de concentracion de membrana. El hecho de que la activacion mediante direccionamiento puede lograrse utilizando nanocuerpos que reconocen diferentes clases de protemas de membrana indica una amplia aplicabilidad del concepto de "activacion mediante direccionamiento".

Debido a que estos datos proporcionan una prueba de concepto de la capacidad de dirigir miembros de la familia de IL-1 mutantes a tipos de celulas seleccionados, restaurando su actividad solo en estas celulas diana, se producen nanocuerpos que permiten dirigir a miembros de la familia de IL-1 a celulas diana de IL-1 p fisiologicamente relevantes. En vista del importante papel de los miembros de la familia IL-1 como activadores de celulas T y NK, los nanocuerpos estan disenados para dirigir espedficamente los subconjuntos de celulas IL-1 a celulas T y NK. Mas espedficamente, se desarrollan nanocuerpos que se dirigen a CCR6, que se expresan predominantemente en celulas Th17, asf como nanocuerpos que se dirigen a CD8 en celulas T citotoxicas y se fusionan con los miembros de la familia IL1, preferiblemente IL-1p.

Ejemplo 3: Efecto de las fusiones de lL-ip-nanocuerpo en la produccion de IL-17 por parte de celulas T humanas primarias.

Las celulas T humanas primarias se aislaron a partir de capas leucocitarias. Primero, las PBMC se aislaron mediante centrifugacion en gradiente de densidad de linfoprep y se incubaron O/N con 0,5 ng/ml de rhlL-2 para la recuperacion. A continuacion, las celulas T se aislaron utilizando el kit de aislamiento de celulas pan-T (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las celulas T se resuspendieron (1 x 106/ml) en RPMI-1640 suplementado con FCS al 10 % y microperlas activadoras de CD3/CD28 (Miltenyi Biotec). A continuacion, las celulas (100 pl/pocillo) se colocaron en placas de 96 pocillos con fondo en U y se estimularon durante 96 horas con las concentraciones indicadas de variantes de IL-1 p. Despues de 6 horas adicionales de estimulacion con PMA/ionomicina (ambos a 100 nM), se recuperaron los sobrenadantes y los niveles de IL-17 se determinaron mediante Elisa (R&D Systems). Citoquinas adicionales son evaluadas a traves de la tecnologfa Luminex.

Para las fusiones mutantes seleccionadas de IL-1p-nanocuerpo (por ejemplo, con un nanocuerpo dirigido a CCR6), se evalua la produccion de IL-17 e IFNy espedfica de la celula diana mediante tincion intracelular utilizando un enfoque de citometna de flujo.

Ademas, para corroborar la selectividad para la poblacion Th17, la union a subpoblaciones de PBMC se mide mediante doble tincion usando la marca Flag y los marcadores de CD seleccionados, seguido de un analisis de citometna de flujo.

Finalmente, en un modelo clmicamente relevante in vitro de la funcion de las celulas Th17 humanas, se evalua la actividad adyuvante de las fusiones de IL-1p-nanocuerpo. En vista de la necesidad de vacunas mas eficaces contra Bordetella pertussis (o adyuvantes para las vacunas existentes), determinamos si las protemas de fusion seleccionadas mejoran la respuesta Th17 humana en un modelo de cocimiento de celulas T naffs con celulas dendnticas derivadas de monocitos tratados con B. pertussis (MDDC). Las MDDC humanas se afslan de las capas leucocitarias (utilizando el kit de aislamiento de monocitos II, Miltenyi Biotec), se tratan con diferentes proporciones de B. pertussis durante 48 horas y luego se cocultivan con celulas T alogenicas naffs durante 12 dfas. Despues de la reestimulacion con anti-CD3/anti-CD28, los perfiles de citoquinas en sobrenadantes se determinan utilizando la tecnologfa Elisa/Luminex (cfr. supra).

Ejemplo 4: Efecto de las fusiones de IL-ip-nanocuerpo en CTLs

Para evaluar si las fusiones de IL-1p-CD8 nanocuerpo pueden mejorar espedficamente la funcion de las celulas T CD8+, las PBMC humanas se afsian mediante centrifugacion de gradiente de densidad de linfoprep de capas leucocitarias y se estimulan durante 24 horas con microperlas activadoras de CD3/CD28 (Miltenyi Biotec) en combinacion con fusiones de IL1p-CD8 Nb de tipo salvaje o mutantes. El efecto de estas protemas de fusion en la activacion de celulas T CD8+ se evalua realizando una tincion intracelular para NF-kB activo (fosforilado) e IFNy. Ademas, para investigar si las fusiones de IL-1p-nanocuerpo afectan a la desgranulacion de CTL, las PBMC (2 x106 celulas/ml) se diferencian durante 48 horas en presencia de fitohemaglutinina (PHA, 1 pg/ml) e IL-2 (100 Ul/ml) en combinacion con dosis crecientes de las protemas de fusion de IL-1 p. A continuacion, para inducir la desgranulacion, las celulas se estimulan durante 3 horas con dynabeads CD3/CD28 y se analizan mediante citometna de flujo. La desgranulacion se mide a traves de la deteccion de CD107a de superficie celular, un marcador bien establecido para la actividad natural killer. En todos los analisis de citometna de flujo en los grupos de leucocitos, se incluye la tincion anti-CD8 para permitir el monitoreo de la especificidad de tipo celular de los efectos de IL-1p-CD8 Nb.

Finalmente, para evaluar si las fusiones de IL-1p-CD8 nanocuerpo promueven la actividad antitumoral in vivo, a los ratones C57BL/6 se les inyectan por via subcutanea celulas tumorales TC1, que producen las oncoprotemas antigenicas E6 y E7 de HPV16. Este modelo se uso previamente para demostrar que la IL-1p promueve respuestas antitumorales mediadas por celulas T CD8+, espedficas de antfgeno (Ben-Sasson, 2013). Brevemente, los ratones se inmunizan cuatro dfas despues de la inyeccion del tumor con una vacuna que contiene el peptido HPV16E749-57, combinado con DOTAP y LPS, y con nuestro sin WT o fusiones IL-1p-CD8 Nb mutantes o fusiones Nb IL-1p-GFP. El tamano del tumor se controla durante 18 dfas despues de la inmunizacion.

Ejemplo 5: Experimentos in vivo - Efecto adyuvante de vacunas.

En una primera serie de experimentos, los ratones C57BL/6 se tratan iv/ip con diferentes dosis de fusiones de IL-1pnanocuerpo de tipo salvaje y mutantes e IL-1p no fusionada, para controlar la toxicidad aguda. La sangre venosa se recolecta en diferentes momentos despues del tratamiento mediante la venopuncion de la cola y el perfil de citoquinas en suero se determina mediante el ensayo Luminex. Ademas, mediante analisis de citometna de flujo, los niveles de citoquinas intracelulares (IL-17, IFN^y) y la activacion de IL-1R (segun se evalua mediante la medicion de los niveles de fosfo-NF-KB) se determinan en subconjuntos de leucocitos seleccionados.

Cuando se han establecido dosis optimas, su actividad adyuvante se evalua en un protocolo de vacunacion murino. En resumen, los ratones C57BL/6 se inmunizan ip con la vacuna contra la tos ferina acelular (Pa). La vacuna Pa esta compuesta por 5 pg/raton de toxina pertussis detoxificada recombinante purificada (PT9K/129G) hemaglutinina filamentosa (FHA) (composicion segun Brereton et al., 2011). 24 horas despues de la inmunizacion, IL1p-Nb o PBS mutantes seleccionadas se administran por via ip o iv. Los animales son reforzados despues de 28 dfas. Un grupo de animales se sacrifica 14 dfas despues de la segunda inmunizacion y los esplenocitos se afslan y se reestimulan in vitro con medio o FHA durante 3 dfas. Los niveles de citoquinas en sobrenadantes de cultivo (IL-17, IFN^y, IL-2, IL-10, IL-5, IL-4, etc.) se determinan mediante la tecnologfa Luminex. Un segundo grupo de ratones se estimulo con B. pertussis el dfa 14 despues del refuerzo y se sacrifico 2 horas y 5 y 10 dfas despues de la estimulacion. Los pulmones se afslan y las CFU en homogeneizados de pulmon se cuantificaran en placas de agar Bordet-Gengou. Los niveles de citoquinas en los homogeneizados de pulmon se determinan como en los sobrenadantes de esplenocitos.

Ademas, se toma una muestra de sangre (de la cola) antes de la inmunizacion y luego cada 14 d^as para la determinacion de los niveles de IgG espedficos de B. pertussis en suero.

Ejemplo 6: Efecto antitumoral directo de las fusiones de IL-ip-nanocuerpo

Para investigar la actividad antitumoral directa de las fusiones seleccionadas de ILI-nanocuerpo, usamos celulas de melanoma A375 humanas, que demostraron ser altamente susceptibles a los efectos citostaticos inducidos por IL-1 (Morinaga et al., 1990). Para permitir el direccionamiento de miembros de la familia de IL-1 mutantes a las celulas A375, se genera un clon de A375 estable que expresa un marcador de superficie celular para el que ya estan disponibles los nanocuerpos de alta afinidad (es decir, CD20). La sensibilidad de esta lmea celular, en comparacion con las celulas A375 progenitoras, al efecto antiproliferativo de la fusion de IL1-nanocuerpo mutante, se investiga in vitro utilizando el ensayo de proliferacion de XTT. La actividad antitumoral in vivo de las fusiones de IL-1-nanocuerpo mutante se investiga utilizando un modelo de xenotrasplante A375. Brevemente, los ratones atfmicos desnudos se inoculan por via subcutanea con celulas A375 (progenitoras o que expresan un marcador de superficie para el direccionamiento) y el crecimiento del tumor se controla durante cuatro semanas en animales tratados con PBS o fusiones de IL1-nanocuerpo mutante.

Ejemplo 7: Extension del principio a IL18: aplicacion en modelos tumorales.

Para evaluar la actividad antitumoral indirecta de los miembros de la familia IL1, se realizan experimentos para abordar la eficacia de las fusiones de IL-18-nanocuerpo mutante seleccionadas utilizando el modelo de sarcoma de raton singenico Meth A de acuerdo con el protocolo que se uso previamente para demostrar actividad antitumoral de IL-18 (Micallef et al., 1997). Las variantes de IL18 utilizadas en estos experimentos consisten en IL-18 mutantes fusionadas con nanocuerpos que se dirigen a las celulas inmunes con propiedades tumoricidas (es decir, CTL, celulas NK). Los ratones se tratan con el constructo, y se observa una reduccion significativa del tumor cuando se compara con el control tratado en forma simulada.

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Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una composicion que comprende un constructo de direccionamiento, que comprende:

(1) una IL-1p mutada caracterizada por una afinidad reducida por su receptor en comparacion con la IL-1p de tipo salvaje, en donde la IL-1p mutada comprende una o mas mutaciones seleccionadas de R120X, Q131G, L145G, H146X, Q148X, F162A, y K208E, donde X es un cambio no conservador, y

(2) un resto dirigido que comprende un dominio variable de anticuerpos de cadena pesada de camelido (VHH) o un dominio variable de nuevos receptores de antfgeno (VNAR).

2. La composicion, de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicha IL-1 p mutante comprende una o mas mutaciones seleccionadas de R120G, Q131G, L145G, H146A, Q148G, F162A y K208E.

3. La composicion, de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicho resto de direccionamiento esta dirigido a un marcador expresado en una celula que expresa IL-1 R1 y/o IL-1 RacP.

4. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho resto de direccionamiento se dirige a un marcador espedfico de tejido.

5. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho resto de direccionamiento se dirige a Her2 o al receptor de leptina.

6. La composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la IL-1p mutada comprende uno o mas de:

(i) Q131G y Q148G,

(ii) Q148G y K208E,

(iii) R120G y Q131G,

(iv) R120G y H146A,

(v) R120G y K208E,

(vi) R120G, F162A y Q164E,

(vii) F162A y Q164E,

(viii) Q164E y E167K, y

(ix) L145A y L147A.

7. Una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para usar como medicamento.

8. La composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para usar en la estimulacion de la respuesta inmune.

9. La composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para usar en el tratamiento del cancer.

10. Una composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en la que una celula debe ponerse en contacto con dicha composicion.

11. La composicion para el uso de la reivindicacion 10, en la que

la IL-1p mutada comprende uno o mas de:

(i) Q131G y Q148G,

(ii) Q148G y K208E,

(iii) R120G y Q131G,

(iv) R120G y H146A,

(v) R120G y K208E,

(vi) R120G, F162A y Q164E,

(vii) F162A y Q164E,

(viii) Q164E y E167K, y

(ix) L145A y L147A.

12. La composicion para el uso de la reivindicacion 10 u 11, en la que el resto de direccionamiento comprende un dominio variable de un anticuerpo de cadena pesada de camelido (VHH) contra HER2.

13. La composicion para el uso de la reivindicacion 10 u 11, en la que el resto de direccionamiento comprende un dominio variable de un anticuerpo de cadena pesada de camelido (VHH) contra el receptor de leptina.