KR20080074887A - 무기 인산을 고축적하는 식물 및 그 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자를 발현시키도록 형질전환된 인산 고축적 식물체, 그 생산 방법, 생산에 사용하는 재조합 발현 벡터, 및 이용법을 제공한다.

Description

무기 인산을 고축적하는 식물 및 그 이용{PLANT CAPABLE OF ACCUMULATING INORGANIC PHOSPHATE AT HIGH LEVEL AND USE OF THE PLANT}
본 발명은, 무기 인산을 고축적하는 식물체 (예를 들어, 피튜니아, 토레니아 등) 및 그 이용에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자를 식물체에 도입하는 것을 특징으로 하는 인산을 고축적하는 식물체의 생산 방법, 그 생산 방법을 이용하여 얻어지는 식물체, 및 수질 정화에 있어서의 그 식물체의 이용에 관한 것이다.
최근, 환경 의식의 고양과 함께 수질 오염이 큰 문제가 되고 있고, 하천이나 호수와 늪 등의 수권 (水圈) 에 있어서의 수질 정화의 필요성이 증가되고 있다. 수질 오염의 주된 원인으로서는, 다이옥신이나 중금속 등의 독성 물질의 혼입이나 인이나 질소 등의 과잉한 유입 등을 들 수 있다.
과잉량의 인이나 질소는 농지로부터의 배수, 가축의 분뇨, 생활 배수나 공업 배수 등에 의해 초래되고, 수권의 부영양화를 촉진시켜, 녹조나 적조 등의 발생의 직접적 원인이 되는 조류 (藻類), 미생물류 등의 1 차 생산자의 증식을 초래한다. 통상, 1 차 생산자의 제한 요소가 되는 원소는 질소나 인인데, 수중에서는 질소 고정 조류는 보통으로 존재하고, 또 육상으로부터의 유출수로 인해 질산 이온은 풍부 한 경우가 많다. 이로 인해, 1 차 생산자의 성장에 대해 일반적으로 제약적인 원소는 인이 된다. 인은 대기로부터 공급되지 않고, 또한 다가의 부(負) 전하를 가진 인산 이온은 토양 중의 광물 입자에 강하게 결합되어 있어, 시비(施肥)하지 않은 토지로부터의 유출수에 인이 들어있는 경우는 적다 (지구 환경의 화학, T.G.Spiro 외 저, 학회 출판 센터, 2000년). 바꿔 말하면, 수중으로부터 인을 제거함으로써 효과적으로 1 차 생산자의 증식을 억제할 수 있게 된다.
인간의 일상 생산 활동에 의한 호수와 늪, 하천, 해양의 부영양화가 문제가 된지 오래인데, 하수 처리장 등에서 통상 실시되고 있는 활성 오니법에 의한 하수 처리로는 인이나 질소 등의 무기 이온이 거의 제거되지 않아, 부영양화를 개선할 수 없는 것이 현상이다.
인이나 질소를 수역으로부터 제거하는 것은 수질 오염을 해결하기 위해 유효한 수단이며, 물리적인 방법, 화학적인 방법, 생물학적인 방법 등의 여러가지 수법으로, 인이나 질소의 제거를 목적으로 한 수질 정화가 실시되고 있어, 저비용이고 효율적인 방법이 요구되고 있다 (수질 정화 매뉴얼, 모토하시 케이노스케 저, 해문당 출판, 2001년).
물리적 및 화학적인 방법 (전해법, 정석법, 응집 분리법 등) 은, 제거 효율면에서는 우위성이 높지만, 방대한 설비를 필요로 하고, 약품을 계속 사용하는 등의 이유로 비용도 높아지는 것이 문제점이 되고 있다. 또, 생물학적 방법에 대해서는, 활성 오니법, 포스트립법 (활성 오니법에 응집제 첨가를 조합시킨 수법) 등도 널리 이용되고 있는데, 최근에는 정화 능력의 향상과 함께 비용 상승이 문제 가 되고 있다.
한편, 파이트레메디에이션 (phytoremediation) 으로 불리는 식물을 사용한 환경 정화법이, 일반적으로 이용되게 되어, 수질 정화에 관해서도 식물을 이용하는 시도가 활발히 실시되고 있다. 수질 오염의 원인이 되는 인이나 질소는 식물에 필수적인 영양소이므로, 식물은 이들의 물질을 적극적으로 뿌리로부터 흡수한다. 그래서, 인이나 질소 등의 흡수력이 비교적 높아 생육이 왕성한 부레옥잠이나 갈대 등의 수생 식물을 이용하여 파이트레메디에이션을 시도한 예가 많이 보고되어 있다 (수질 정화 매뉴얼, 모토하시 케이노스케 저, 해문당 출판, 2001년). 그러나, 부레옥잠 등의 수생 식물은 회수에 비용이 들고 관리가 어려운 점과 생태계에 영향을 미치는 점 등이 문제시되고 있다 (수질 정화 매뉴얼, 모토하시 케이노스케 저, 해문당 출판, 2001년). 또, 회수된 식물 바이오매스를 유효하게 이용하는 것은 거의 불가능하여, 바이오매스를 폐기하기 위해 여분의 비용이 드는 점도 큰 문제이다. 회수된 바이오매스를 직접 비료로서 이용할 수 있으면 저비용의 처리법이 될 수 있지만, 정화에 이용되는 기존의 식물 흡수 능력에는 한계가 있어, 인이나 질소의 함유량이 낮으므로 비료 용도로 사용할 수 없는 것이 현상이다.
미관과 정화를 양립시키기 위해 육생 화훼 식물을 사용한 수상 재배 장치 등도 개발되고 있지만 (예를 들어, 일본 공개특허공보 평9-56278), 개화 후의 식물 바이오매스의 처리법에 대해서는 현재로서는 유효한 수단은 없다.
또, 식용 야채 등을 수질 정화에 사용하고, 회수된 식물의 유효 이용을 목표로 한 예도 알려져 있는데, 일반 소비자에게 수질이 오염되어 있는 수권에서 기른 야채가 용이하게 받아들여질 수 있다고는 생각하기 어렵다.
인이 식물에 어떻게 흡수·축적되어, 이용되는지에 대한 연구는 현재에 이르기까지 실시되어 오고 있다. 인은 식물에 필수적인 영양소이고, 인산은 먼저 뿌리로부터 도입되어 도관으로 수송된 후, 지상부에 공급되어 이용된다. 인산은 많은 생명 현상에 관련되어 있어, 인 지질, 뉴클레오티드, 인산화 단백질 등으로 형태를 바꿔 이용되는 것 외에, 세포 내에서는 액포에 축적되어, 필요에 따라 세포질 내에 공급된다. 또, 종자 중에서는 보다 안정적인 이노시톨 6 인산 (피틴산) 의 형태로 축적되어 있다.
식물이 도입할 수 있는 인의 형태는, 무기 인산 (이하, 「인산」이라고 부른다) 뿐이고, 그 밖의 불용성 유기 인산 등은 도입할 수 없다. 일반적으로, 토양 중의 인산 농도는 낮아 식물에 있어서 결핍 상태이므로, 식물은 적극적으로 인산을 도입하는 시스템을 발달시키고 있다. 인산을 뿌리로부터 식물 내로 도입하기 위해 필요해지는 단백질은 세포막 상에 존재하는 인산 트랜스포터이다. 애기장대에서는, 고친화성 트랜스포터 9 종류와 엽록체 국재성의 트랜스포터 1 종류가 알려져 있다. 고친화성이고 세포막 국재성이 있는 인산 트랜스포터 PHT1 을 담배의 배양 세포에서 과잉 발현시킴으로써, 인산의 도입이 상승되어, 세포의 생장 속도가 증가된 것이 보고되어 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 7098-7102, 1997). 그러나, 보리의 식물체에서 인산 트랜스포터를 과잉 발현시킨 경우에는, 인산 도입의 증가는 확인되지 않았다는 보고가 있고 (Func. Plant Biol. 31, 141-148, 2004), 단순히 인산 트랜스포터 수가 증가된 것 만으로는, 인산 도입 량의 증가로 이어지지 않는다고 생각된다. 또, 9 종류인 고친화성 인산 트랜스포터 중, 뿌리에서 강하게 발현되고 있는 것은 2 종류이며, 그 밖의 트랜스포터는 꽃기관 등에서 발현이 확인되고 있고, 식물 내에서의 수송에도 인산 트랜스포터는 기능하고 있다고 생각되고 있다 (Plant Physiol. 130, 221-233, 2002). 식물 내에서는 인산을 유효하게 이용하기 위해 오래된 잎으로부터 새로운 잎으로 인산의 수수가 실시되는데, 이러한 현상에도 트랜스포터가 관련되어 있다고 생각된다.
트랜스포터 이외에도, 애기장대를 사용한 돌연변이체의 해석으로부터, 몇가지 인산 관련 유전자가 동정되어 있다 (Trends Plant Sci. 9, 548-555, 2004). 뿌리로부터 흡수된 인산의 대부분은 지상부로 도관을 경유하여 수송되어 이용되는데, PHO1 돌연변이체에서는 지상부로의 수송이 저해된다. 이것은 흡수된 인산을 뿌리의 세포로부터 도관으로 수송하기 위해 PHO1 단백질이 기능하고 있는 것을 나타내고 있다. 또, pho2 돌연변이체는 인산이 지상부에 과잉하게 축적되는 돌연변이체이고, PHO2 유전자는 뿌리부터 지상부로의 수송을 제어하는 단백질을 코드한다고 생각되고 있다. 이와 같이 인산의 식물 내에서의 수송에 관한 유전자의 몇가지는 명백해져 있지만, 식물의 인산 도입 분자 레벨의 상세는 불명확한 점도 많다.
또, 식물은 인산 결핍에 대해 여러가지 전략으로, 보다 많은 인산을 외계로부터 도입하려고 한다 (Annals Botany, 94323-332, 2004). 인산이 결핍된 상태를 감지한 식물은, 시트르산 등의 유기산이나 산성 포스파타아제를 뿌리로부터 토양으로 방출하고, 불용성의 유기 인산을 가용성의 무기 인산으로 변환시켜 흡수하 려고 한다. 인산이 결핍되면 뿌리의 형태도 변화되어, 측근이 증가되고 근모가 신장되어, 보다 광범위한 인산을 흡수할 수 있게 된다. 또, 인산의 결핍은 식물 내의 대사계에도 영향을 미쳐, 광합성계의 유전자 발현이 억제되거나, 안토시아닌의 축적이 증가되거나 하는 것 등이 알려져 있다. 세포 내의 뉴클레아제나 포스파타아제 활성도 상승되어, 세포 내에 존재하는 인의 재이용도 실시된다.
이와 같은 인산 결핍에 대한 식물의 반응은, 인산이 결핍된 상태를 식물이 감지하여 일어나는 일련의 반응이며, 이 반응의 제어 인자 및 제어 기구의 해명을 기다리고 있지만, 그 지견은 아직도 한정되어 있다. 많은 인산 관련 유전자가 동정되어 있지만 (Trends Plant Sci. 9, 548-555, 2004), 식물에 도입함으로써 인산의 흡수력이 상승되었다는 보고는 알려지지 않았다.
발명의 개시
상기 서술한 바와 같은 상황 하에서, 저비용이고, 고효율인 수질 정화 방법이 요구되고 있다. 특히, 정화에 사용되는 식물의 인 축적 능력을 증대시키는 방법, 및 인 축적 능력이 증대된 식물이 요구되고 있다.
본 발명자들은, 상기의 과제를 감안하여 예의 검토한 결과, 애기장대 유래의 Myb 형 전사 인자 PHR1 유전자를 구성적 발현 프로모터의 하류에 연결하고, 또한 터미네이터를 부가하여, 동일한 벡터 상에 배치된 재조합 발현 벡터를 제조하고, 이것을 피튜니아, 및 토레니아에 도입함으로써, 인산을 고축적하는 식물을 제조하는 것에 성공하여, 본 발명을 완성시켰다. 따라서, 본 발명은, 다음과 같은 식물체, 그 식물체의 생산 방법, 그 식물체의 생산에 사용되는 재조합 발현 벡터, 및 그 식물체의 이용법을 제공한다.
(1) 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자를 발현시키도록 형질전환된 식물체.
(2) 상기 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자가, 애기장대 유래의 Myb 형 전사 인자 PHR1 인, 상기 (1) 에 기재된 식물체.
(3) 상기 Myb 형 전사 인자 PHR1 이,
(a) 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질, 또는
(b) 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서, 1 개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실(缺失), 삽입, 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어지고, 인산 기아 응답 유전자를 활성화시키는 기능을 갖는 단백질인, 상기 (2) 에 기재된 식물체.
(4) 상기 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자가,
(c) 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 유전자, 또는
(d) 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열 또는 그 오픈 리딩 프레임의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한, 인산 기아 응답 유전자를 활성화시키는 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자인, 상기 (1) 에 기재된 식물체.
(5) 피튜니아, 토레니아, 버베나, 담배, 장미, 임파첸스, 베고니아, 또는 푸른종지꽃인, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 1 항에 기재된 식물체.
(6) 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자를 발현시키도록 식물체를 형질전환하는 공정을 포함하는 식물체의 생산 방법.
(7) 상기 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터를 상기 식물체에 도입함으로써, 상기 식물체를 형질전환하는, 상기 (6) 에 기재된 방법.
(8) 상기 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자가, 애기장대 유래의 Myb 형 전사 인자 PHR1 인, 상기 (6) 또는 (7) 에 기재된 방법.
(9) 상기 Myb 형 전사 인자 PHR1 이,
(a) 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질, 또는
(b) 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서, 1 개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어지고, 인산 기아 응답 유전자를 활성화시키는 기능을 갖는 단백질인, 상기 (8) 에 기재된 방법.
(10) 상기 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자가,
(c) 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 유전자, 또는
(d) 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열 또는 그 오픈 리딩 프레임의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한, 인산 기아 응답 유전자를 활성화시키는 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자인, 상기 (6) 또는 (7) 에 기재된 방법.
(11) 상기 식물체가 피튜니아인, 상기 (6) ∼ (10) 중 어느 1 항에 기재된 방법.
(12) 상기 식물체가 토레니아인, 상기 (6) ∼ (10) 중 어느 1 항에 기재된 방법.
(13) 상기 (6) ∼ (12) 중 어느 1 항에 기재된 방법에 따라 생산되는 식물체.
(14) 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터로서, 식물체에 도입했을 때에, 상기 전사 인자를 코드하는 유전자를 발현시킬 수 있도록 구성된 벡터.
(15) 상기 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자가, 애기장대 유래의 Myb 형 전사 인자 PHR1 인, 상기 (14) 에 기재된 벡터.
(16) 상기 Myb 형 전사 인자 PHR1 이,
(a) 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질, 또는
(b) 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서, 1 개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어지고, 인산 기아 응답 유전자를 활성화시키는 기능을 갖는 단백질인, 상기 (15) 에 기재된 벡터.
(17) 상기 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자가,
(c) 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 유전자, 또는
(d) 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열 또는 그 오픈 리딩 프레임의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한, 인산 기아 응답 유전자를 활성화시키는 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자인, 상기 (14) 에 기재된 벡터.
(18) 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나, 또는 상기 (13) 에 기재된 식물체의 번식 재료.
(19) 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나, 또는 상기 (13) 에 기재된 식물체를 이용하여 수권의 과잉된 인을 제거하는 공정을 포함하는 수질 정화법.
(20) 상기 (14) ∼ (17) 의 벡터가 도입되어 형질전환된 식물체로 재생할 수 있는 식물 세포.
본 발명에 의해, 저비용이고, 고효율인 수질 정화 방법이 제공된다.
본 발명의 방법에 따라, 유전자 재조합 기술을 이용하여 식물의 인 축적량을 증가시킬 수 있다. 본 발명에 의해, 실용화에 유리한 수질 정화 식물, 및 그 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 인 축적량이 증대된 식물을 사용함으로써 수질의 정화 능력과 인산의 재이용성의 향상이 실현될 수 있다.
또, 본 발명의 방법에 따라, 유전자 도입에 의해 원예 화훼 식물의 인산 축적능을 높이고, 미관과 고정화능을 겸비한 식물에 의한 수질 정화도 실현할 수 있게 된다.
인은, 현재 수입량의 80% 이상이 비료로서 사용되고 있는데, 식물이 흡수한 인은 비료로서 환원되는 것이 가장 이치에 맞는다. 본 발명에 의해 식물당 인 축적량이 증가되면, 식물 그 자체를 인 비료로서 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 인산 고축적 식물체에 의해, 회수 후의 바이오매스를 비료화, 또는 인 추출에 유효하게 이용할 수 있다. 본 발명의 인산 고축적 식물체의 생산 방법을 이용하여, 기존의 인산 축적능이 높은 식물에 유전자 도입시킴으로써, 보다 많은 인산을 축적할 수 있는 식물의 제조도 가능해진다.
도 1 은 본 발명의 형질전환 토레니아 잎에서의 인산 축적량을 나타내는 그래프이다. 그래프의 세로축은 인산량 (mg/gFW) 을 나타낸다.
도 2 는 본 발명의 형질전환 피튜니아 잎에서의 인산 축적량을 나타내는 그래프이다. 그래프의 세로축은 인산량 (mg/gFW) 을 나타낸다.
도 3 은 본 발명의 수경재배한 형질전환 토레니아 잎에서의 인산 축적량을 나타내는 그래프이다. 그래프의 세로축은 인산량 (mg/gFW) 을 나타낸다.
도 4 는 본 발명의 수경재배한 형질전환 토레니아에서의 지상부의 건조 중량당 인산 축적량을 나타내는 그래프이다. 그래프의 세로축은 인산량 (mg/gDW) 을 나타낸다.
도 5 는 본 발명의 형질전환 토레니아를 배양한 수경액의 인산 농도 변화를 경일적으로 나타내는 그래프이다. 그래프의 세로축은 인산 농도 (mg/ℓ), 가로 축은 수경액 교환으로부터의 일수를 나타낸다.
도 6 은 본 발명의 수경재배한 형질전환 토레니아 잎에서의 인산 축적량을 나타내는 그래프이다. 그래프의 세로축은 인산량 (mg/gFW) 을 나타낸다.
도 7 은 본 발명의 수경재배한 형질전환 토레니아의 지상부의 신선중(新鮮重)을 나타내는 그래프이다. 그래프의 세로축은 무게 (g) 를 나타낸다.
도 8 은 본 발명의 형질전환 담배 잎에서의 인산 축적량을 나타내는 그래프이다. 그래프의 세로축은 인산량 (mg/gFW) 을 나타낸다.
도 9 는 본 발명의 형질전환 버베나 잎에서의 인산 축적량을 나타내는 그래프이다. 그래프의 세로축은 인산량 (mg/gFW) 을 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
식물이 인산 결핍 상태에 빠졌을 때의 제어 인자 중 하나로서 알려진 것이, 애기장대의 PHR1 유전자이다. PHR1 유전자는 인산이 결핍된 상태에 응답하여 인산 관련 유전자의 전사를 활성화시킨다고 생각되는 전사 인자를 코드하고 있다 (Gene Dev. 15, 2122-2133, 2001). phr1 돌연변이체는 안토시아닌의 축적 등의 인산 기아 반응을 나타내지 않게 되어, 복수의 인산 관련 유전자의 전사가 저하되고 있다. 따라서, PHR1 유전자는 인산 기아 반응의 상류부에 위치하여, 몇가지 유전자의 전사 활성을 높임으로써, 식물의 인산 도입능을 상승시킨다고 생각된다. 본 발명자들은, 이와 같은 인산 기아 반응의 제어 인자를 식물에 도입시켜, 식물의 인산 기아 상태를 유지할 수 있으면, 인산을 보다 효율적으로 흡수하는 식물을 제 조할 수 있다고 생각하였다. 그리고 실제로 식물에 도입시킨 결과, 인산의 고축적을 확인하여, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자를 발현시키도록 형질전환된, 인산 고축적 식물체를 제공한다.
본 명세서 중, 「인산 기아 반응」이란, 식물에 있어서 인산이 결핍된 상태에 놓여졌을 때에 그 식물이 나타내는, 인산을 필요량 획득하기 위한 일련의 적응 반응을 가리킨다. 그러한 적응 반응의 예로서는, 예를 들어, 인산이 결핍된 상태를 감지한 식물이, 시트르산 등의 유기산이나 산성 포스파타아제를 뿌리로부터 토양으로 방출시켜, 불용성의 유기 인산을 가용성의 무기 인산으로 변환시켜 흡수하고자 하는 반응이 포함된다. 인산이 결핍되면 뿌리의 형태도 변화되어, 측근이 증가되고 근모가 신장되어, 보다 광범위한 인산을 흡수할 수 있게 된다. 또, 인산의 결핍은 식물 내의 대사계에도 영향을 미쳐, 광합성계의 유전자 발현이 억제되거나 안토시아닌의 축적이 증가되거나 하는 것 등도 알려져 있다. 세포 내의 뉴클레아제나 포스파타아제 활성도 상승되고, 세포 내에 존재하는 인의 재이용도 실시된다. 「인산 기아 반응」에는, 이와 같은 인산의 기아 상태를 식물이 감지했을 때에 일어나는 일련의 반응이 포함되는 것으로 한다.
본 명세서 중, 「인산 기아 반응에 관여하는 유전자」란, 인산이 결핍된 상태에서 식물이 인산을 체내에 도입시켜, 축적되는 기구에 관여하는 단백질을 코드하는 유전자인 것을 말하고, 예를 들어, 식물의 세포막 상에 존재하는 인산 트랜스포터를 코드하는 유전자가 「인산 기아 반응에 관여하는 유전자」에 포함된다. 예를 들어, 애기장대에서의 9 종류의 고친화성 트랜스포터 (예를 들어, PHT1) 및 1 종류의 엽록체 국재성 트랜스포터 등을 대표예로서 들 수 있다. 그러나, 「인산 기아 반응에 관여하는 유전자」는 이들에 한정되지 않아, 인산이 결핍된 상태에서 유전자 발현의 증대 또는 감소가 확인되는 유전자는 모두, 본 발명에 있어서의 「인산 기아 반응에 관여하는 유전자」에 포함된다. 또한, 본 명세서 중, 구 (phrase) 「인산 기아 응답 유전자」는, 구「인산 기아 반응에 관여하는 유전자」와 동의한 것으로서 사용된다.
본 명세서 중, 「인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자」란, 상기 「인산 기아 반응에 관여하는 유전자」의 식물체 내에서의 전사를 제어하는 인자를 가리킨다. 「전사를 제어하는 인자」에는, 전사를 억제 또는 활성화시키는 인자가 포함되는데, 본 발명에 있어서는, 주로 전사를 활성화시키는 인자를 가리키는 것으로 한다. 그러나, 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사를 억제함으로써, 결과적으로 인산 기아 반응을 진행시키도록 기능하는 경우에는, 전사를 억제하는 인자도 본 명세서 중에서 사용하는 「인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자」에 포함되는 것으로 한다. 일반적으로 「전사 인자」는 단백질 복합체를 형성하여 기능하고 있는데, 본 발명에 있어서는, 주로, 단백질 복합체의 구성 요소인 단백질 또는 펩티드를 가리키는 것으로 한다. 「인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자」의 대표적인 예로는, 애기장대 유래의 Myb 형 전사 인자 PHR1 (배열 번호 2) 이 포함되는데, 이것에 한정되지 않고, 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서, 1 개 또는 복수개 (예를 들어, 1 ∼ 20 개, 1 ∼ 10 개, 1 ∼ 수 개 (예를 들어, 6 개)) 의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어지고, 인산 기아 응답 유전자를 활성화 혹은 억제시키는 기능을 갖는 단백질 등도 또한, 본 명세서 중에서 사용하는 「인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자」에 포함된다.
본 명세서 중, 「인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자」란, 상기 「인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자」를 코드하는 유전자를 가리킨다. 「인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자」의 대표적인 예로서는, 애기장대 유래의 Myb 형 전사 인자 PHR1 유전자 (Genbank Accession No.AJ310799：배열 번호 1) 를 들 수 있는데, 이것에 한정되지 않고, 상기 PHR1 유전자의 유도체, 예를 들어, (a) 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열의 오픈 리딩 프레임 (또는 CDS) 을 함유하는 유전자, 또는 (b) 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열 혹은 그 오픈 리딩 프레임의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한, 인산 기아 응답 유전자를 활성화 혹은 억제시키는 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자도 또한, 「인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자」에 포함되는 것으로 한다.
하이브리다이제이션은, 공지된 방법 혹은 그것에 준하는 방법, 예를 들어, 모레큘러 클로닝 (Molecular Cloning Third Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001) 에 기재된 방법 등에 따라 실시할 수 있다. 또, 시판의 라이브러리를 사용하는 경우, 첨부된 사용 설명서에 기재된 방법에 따 라 실시할 수 있다. 「스트린젠트한 조건」이란, 예를 들어, 나트륨 농도가 약 19 ∼ 40mM, 바람직하게는 약 19 ∼ 20mM 이고, 온도가 약 50 ∼ 70℃, 바람직하게는 약 60 ∼ 65℃ 의 조건을 나타낸다. 특히, 나트륨 농도가 약 19mM 이고 온도가 약 65℃ 인 경우가 가장 바람직하다.
본 명세서 중, 「유전자를 발현시키도록 형질전환되었다」란, 유전자를 일과성 또는 안정적으로 발현시키도록 형질전환된 것을 의미하는데, 바람직하게는, 안정적으로 발현시키도록 형질전환되는 것을 의미한다.
식물의 형질전환은, 통상, 원하는 유전자를 담지한 발현용 벡터를 식물에 도입함으로써 유전자 공학적으로 실시된다. 따라서, 본 발명은 또한, 별도의 양태에서, 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 벡터는, 통상, 그들을 도입해야 하는 숙주의 종류 등에 의존한 적절한 프로모터 및 터미네이터 등의 발현 제어 영역 및 복제 기점 등을 함유한다. 예를 들어, 유전자를 식물 세포 내에서 발현시키기 위해서는, (1) 식물 세포 내에서 기능할 수 있는 프로모터, (2) 유전자, 및 (3) 식물 세포 내에서 기능할 수 있는 터미네이터를 기능할 수 있는 형태로 갖는 DNA 분자 (발현 카세트) 를 제조하여 식물 세포에 도입한다. 이와 같은 DNA 분자는, 프로모터에 첨가하여, 전사를 더욱 증강시키기 위한 DNA 배열, 예를 들어, 인핸서 배열을 포함하고 있어도 된다. 사용되는 프로모터로서는, 식물 세포 내에서 기능하는 것이면 특별히 제한은 없는데, 예를 들어, 35S (Shcell, J.S., 1987, Science, 237：1176-1183), Nos (Schell, J.S., 1987, Science, 237：1176-1183), rbcS (Benefy, P.N. 및 N-H.Chua, 1989, Science, 244：174-181), PR1a (Ohshima, M.등, 1990, Plant Cell, 2：95-106), ADH (Benefy, P.N. 및 N-H.Chua, 1989, Science, 244：174-181), patatin (Benefy, P.N. 및 N-H.Chua, 1989, Science, 244：174-181), Cab (Benefy, P.N. 및 N-H.Chua, 1989, Science, 244：174-181),), 및 PAL (Lian, X.등, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：9284-9288) 등을 들 수 있다.
상기와 같은 벡터의 구축은, 공지된 제한 효소 등을 이용하여, 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 아그로박테리움을 사용하는 경우에는, pBI121 등의 바이너리 벡터를, 파티클검을 사용하는 경우에는, pUC19 등의 대장균 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 당해 벡터로 형질전환된 식물 세포를, 예를 들어, 항생 물질 내성 유전자 등의 마커 유전자를 이용하여 선발하고, 적절한 식물 호르몬 등의 조건을 이용하여 재분화시켜, 목적의 유전자로 형질전환된 식물체를 얻을 수 있다. 또한, 본 명세서 중, 용어 「식물」과「식물체」란, 동일한 의미의 것으로서 사용된다.
식물 세포에 대한 벡터의 도입은, 당업자에게 주지된 여러 가지 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스나 아그로박테리움 리조게네스를 이용한 간접 도입법 (Heiei, Y. 등, Plant J., 6, 271-282, 1994, Takaiwa, F. 등, Plant Sci.111, 39-49, 1995) 이나, 일렉트로포레이션법 (Tada, Y. 등, Theor. Appl. Genet, 80, 475, 1990), 폴리에틸렌글리콜법 (Datta, S.K. 등, Plant Mol Biol., 20, 619-629, 1992), 파티클검법 (Christou, P. 등, Plant J. 2, 275-281, 1992, Fromm, M.E., Bio/Technology, 8, 833-839, 1990) 등으로 대표되는 직접 도입법을 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 유전자 도입을 실시하는 식물 세포로서는, 식물체에 재생할 수 있으면 특별히 제한이 없고, 예를 들어, 현탁 배양 세포, 캘러스, 프로토플래스트, 잎의 절편 등을 구성하는 세포 등이 함유된다. 따라서, 본 발명은 또한, 1 개의 양태에 있어서, 본 발명의 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자를 발현시키도록 형질전환되고, 또한 식물체에 재생할 수 있는 식물 세포를 제공한다.
형질전환된 식물 세포는, 재생시킴으로써 식물체를 작출할 수 있다. 이와 같이 하여, 형질전환된 트랜스제닉 식물이 제조될 수 있다. 본 발명의 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자를 발현시키도록 형질전환된 인산 고축적 식물체도 동일하게 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한, 별도의 양태에 있어서, 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자를 발현시키도록 식물체를 형질전환시키는 공정을 포함하는, 인산 고축적 식물체의 생산 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터를 상기 식물체에 도입함으로써, 상기 식물체가 형질전환된다.
본 발명의 벡터로 형질전환시키는데 바람직한 식물종으로서는, 형질전환체를 취득할 수 있는 식물종을 들 수 있다. 이와 같은 식물종으로서는, 예를 들어, 피튜니아, 토레니아, 버베나, 담배, 장미, 임파첸스, 베고니아, 푸른종지꽃, 국화, 카네이션, 미어초, 시클라멘, 난초, 꽃도라지, 프리지어, 거베라, 글라디올러스, 안개꽃, 카랑코에, 백합, 펠라르고늄, 제라늄, 튤립 등을 들 수 있다. 특히, 피튜니아, 토레니아, 버베나, 담배, 장미, 임파첸스, 베고니아, 푸른종지꽃이 바람직하다. 이 중, 식물의 성장 속도가 빠르고, 체내 중의 인 농도가 높아, 수중의 폭넓은 인산 농도에 적응하여 생육하는 식물종이 바람직한데, 그것에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 벡터를 식물체에 도입 및 발현시킴으로써, 인산이 고축적된 식물체에 첨가하여, 그 번식 재료 (예를 들어, 종자, 후대, 절화, 괴근, 괴경, 절수 등) 로부터 얻은 식물체도 또한, 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
본 발명은, 또 다른 양태에 있어서, 상기 식물체를 이용하여 수권의 잉여한 인을 제거하는 공정을 포함하는 수질 정화법을 제공한다.
본 명세서 중에서, 「수권의 잉여한 인」이란, 1 차 생산자와 2 차 생산자의 밸런스를 유지할 수 있는 농도 이상의 인을 가리키고, 구체적으로는, 녹조·적조의 발생이 억제되는 농도 이상의 인을 가리킨다. 예를 들어, 경제 협력 개발 기구 (OECD) 의 환경 기준에서는 전체 인 농도에 따라 호수의 영양 상태가 분류되어 있고, 0.01mg/ℓ 이하가 빈영양 호수, 0.035mg/ℓ 이상이 부영양 호수이다. 인 이외의 요인도 관계되므로 일률적으로는 말할 수 없지만 부영양 호수에서는 녹조 등이 발생되기 쉬운 조건으로 되어 있다. 또, 본 명세서 중, 「수권」이란, 담수역을 의미하고, 대표적인 예로서는, 호수와 늪, 연못, 하천 등이 본 명세서 중에서 말하는 「수권」에 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 식물체는 오수가 흘러드는 저수지, 농업용 저수지, 공원의 연못과 같은 잉여한 인의 제거에 의한 수질 정화를 필요로 하는 장소에 이식, 재배되고, 그 곳에서 수중에 함유되는 잉여한 인을 흡수함으로써 환경 (예를 들어, 수권, 토양 등) 으로부터의 인의 제거를 실시한다. 인을 고축적시킨 식물의 바이오매스는, 그 후 회수되어 바람직하게는 비료로서 사용된다. 비료로서 사용하려면, 회수된 바이오매스는, 바람직하게는 건조, 분쇄에 의한 분상화 등의 처리가 가해진다. 또, 식물 자체가 높은 인산 축적을 나타내면, 가공하지 않고 농지나 밭에 뿌려 직접 비료화시킬 수도 있다. 이와 같이 하여, 본 발명의 식물체에 의하면, 수질 정화 식물의 큰 과제인 회수 후의 바이오매스를 비료화시키고, 또는 추출된 인이라는 형태로 유효하게 재이용할 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명의 범위는 이들의 실시예에 한정되지 않는다.
이하의 실시예에 있어서, 분자 생물학적 수법은 특별히 언급하지 않는 한 WO96/25500 혹은 Molecular Cloning (Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) 에 기재되어 있는 방법에 따랐다.
실시예 1. PHR1 발현 벡터의 구축
PHR1 유전자는, TOPO―TA 클로닝 키트 (인비트로젠 주식회사) 를 이용하고, 해설서에 따라 pCR2.1 벡터에 서브클로닝하였다. 프라이머 PHRf (5＇-ATGGAGGCTCGTCCAGTTCAT-3＇(배열 번호 3)) 와 PHRr (5＇-TCAATTATCGATTTTGGGACGC-3 ＇(배열 번호 4)) 을 사용한 PCR 반응에서 증폭된 산물을 서브클로닝하고, pSPB1892 로 하였다. 인핸서 배열을 반복한 콜리 플라워 모자이크 바이러스 35 S (El235S) 프로모터와 노파린신타아제 (nos) 터미네이터를 갖는 바이너리 벡터 pSPB176 을 BamHI 와 SalI 로 절단하여 pSPB176A 를 얻었다. pSPB1892 를 BamHI 와 XhoI 로 절단하여 얻어진 PHR1 유전자 단편을 pSPB176A 에 삽입하여 pSPB1898 을 얻었다.
35S 프로모터의 인핸서 배열과 마노핀신타아제 프로모터를 연결한 (Mac) 프로모터와 마노핀신타아제 (mas) 터미네이터를 갖는 바이너리 벡터 pSPB2311 을 SmaI 로 절단시켜 pSPB2311A 를 얻었다. pSPB1892 를 EcoRI 로 절단시켜 평활화된 단편을 pSPB2311A 에 삽입하여 pSPB2314 를 얻었다.
PHR1 의 전사 활성화능을 증강시키기 위해, 단순 인간 헤르페스 바이러스의 VP16 단백질의 전사 활성화 영역과 PHR1 유전자를 연결한 키메라 단백질 발현용의 벡터도 제조하였다. 프라이머 BamPHRf(5＇-AGCTGGATCCATGGAGGCTCGTCCAG-3＇(배열 번호 5)) 와 SpePHRr(5＇-CAGTACTAGTATTATCGATTTTGGGA-3＇(배열 번호 6)) 을 사용한 PCR 반응에서 증폭된 산물을 BamHI 와 SpeI 로 절단시킨 DNA 단편 A 와, 프라이머 SpeVP16f(5＇-AGCTACTAGTGCCCCCCCGACCGATG-3＇(배열 번호 7)) 과 KpnVP16r(5＇-CAGTGGTACCTTACCCACCGTACTCG-3＇(배열 번호 8)) 을 사용한 PCR 반응으로 증폭시킨 산물을 SpeI 와 KpnI 로 절단시킨 DNA 단편 B 를 얻었다. BamHI 및 KpnI 로 절단시킨 pSPB2311, DNA 단편 A 및 DNA 단편 B 에서 3 점 라이게이션을 실시하여 PHR1 단백질의 C 말단측에 79 아미노산 잔기로 이루어지는 VP16 유래의 펩티드가 연결된 키메라 단백질을 발현시키기 위한 벡터 pSPB2377 을 제조하였다. pSPB1898, pSPB2314 및 pSPB2377 상의 PHR1 유전자는, 구성적 프로모터의 제어 하에 있다.
실시예 2. 형질전환 체의 제조
이어서, 공지된 방법 (Plant J. 5, 81, 1994) 에 기초하여, pSPB1898 혹은 pSPB2314 혹은 pSPB2377 을 이용하여 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens AglO 주) 을 형질전환시켜, 이 pSPB1898 혹은 pSPB2314 혹은 pSPB2377 을 갖는 형질전환 아그로박테리움을 피튜니아 (Petunia hybrida), 토레니아 (Torenia hybrida) 에 감염시켰다. 얻어진 재조합 식물의 잎으로부터, RNeasyPlantminiKit (키아겐) 을 이용하여 RNA 를 추출하고, 정법에 따라 RT-PCR 에 의해 도입된 유전자가 발현되어 있는 계통을 선택하였다.
실시예 3. 형질전환 체의 인산 축적량
(1) 인산 농도 측정법
인산 농도의 측정은 Ames 의 방법 (Methods Enzymol. 8, 115-118, 1966) 을 일부 개변시켜 실시하였다. 잎을 약 100mg 씩 계량하면서 샘플링하고, 진탕 파쇄용의 2㎖ 튜브에 직경 4㎜ 의 지르코니아 비즈와 함께 봉입하여, -80℃ 에서 동결시켰다. 동결된 샘플을 실온 중에 취출하고, 튜브 중에 1% (V/V) 아세트산을 500㎕ 넣어, 진탕 파쇄기 (키아겐) 에서 6 분간 진탕 파쇄하였다. 파쇄 후, 탁상 원심기에서 15000rpm 으로 5 분간 원심시켜, 상청 500㎕ 를 얻어 인산 추출액으 로 하였다. 이 인산 추출액을 10-100 배 희석하여 종량 800㎕ 가 되도록, 증류수로 조제하였다. 이 용액에 인산 측정용 시약 (조성은 후술) 을 160㎕ 첨가하고 잘 교반하여 10 분간 방치하였다. 분광 광도계로 Abs880 을 측정하고, 표준 용액을 이용하여 그린 검량선과 비교함으로써 인산 농도를 구하였다. 얻어진 인산 농도와 계량된 샘플의 무게로부터 1g 의 잎에 함유되는 인산량을 산출하였다.
(인산 측정 시약의 조성)
2.5M 황산 10㎖
0.1M 아스코르브산 6㎖
0.27g/100㎖ 타르타르산 안티모닐칼륨 3㎖
8g/100㎖ 몰리브덴산 암모늄 6㎖
를 혼합하여 20㎖ 의 용액으로 한다. 아스코르브산은 필요시 조제.
(2) 형질전환 토레니아, 피튜니아에서의 인산량
얻어진 형질전환체의 잎으로부터 상기의 방법에 따라 인산 농도를 측정하여 신선중(新鮮重) 당 인산 함유량을 결정하였다. 표 1 및 도 1 에 나타내는 바와 같이, 형질전환 토레니아에서는 35S 프로모터를 사용한 pSPB1898 과 Mac 프로모터를 사용한 pSPB2314 모두, 야생형에 비해 약 5 배 많은 인산의 축적을 나타냈다.
Figure 112008034717699-PCT00001
토레니아와 동일하게 피튜니아 형질전환체에 있어서도 PHR1 유전자 도입주는 야생형에 비해 높은 인산 축적을 나타냈다 (표 2 및 도 2). 피튜니아에서는 VP16 의 전사 활성화 부위를 연결한 PHR1 을 발현시키는 pSPB2377 을 도입한 형질전환체가 가장 높은 인산의 축적을 나타내고, VP16 의 전사 활성화 부위가 피튜니아에서는 유효하게 기능한다고 생각되었다.
Figure 112008034717699-PCT00002
실시예 4：수경재배에 있어서의 형질전환 체의 인산량
(1) 수경 토레니아 신선중 당 인산량
또, 토레니아의 pSPB1898 형질전환체를 이용하여 수경재배를 실시하고, 수경재배에 있어서도 인산 흡수 능력의 상승을 볼 수 있는지의 여부를 확인하였다. 인산 농도 5mg/ℓ 의 수경 용액 중에서 약 1 개월간 수경재배한 토레니아의 잎을 샘플링하여 인산 농도를 측정하였다. 표 3 및 도 3 에서 볼 수 있는 바와 같이 형질전환체는 야생형에 비해 약 3 배의 인산 축적량을 나타내고 있고, 수경재배에 이용해도 PHR1 유전자에 의한 흡수 능력의 증가는 확인할 수 있었다.
Figure 112008034717699-PCT00003
수경재배한 pSPB1898 형질전환체의 형태는 야생형과 차이는 발견할 수 없고, 일정 기간 배양 후의 식물 중량도 야생형과의 차이는 발견할 수 없었던 점에서, 과잉하게 흡수된 인산은 식물의 생장에는 사용되지 않고, 인산인 상태로 식물체 내에 축적되어 있는 것이 시사되었다. 또, PHR1 의 구성적 발현이 식물의 생장에 영향을 미치지 않는 것도 시사되었다.
(2) 수경 토레니아의 건조 중량당 인산량
식물체 전체에서 인산 축적량이 증가되고 있는지의 여부를 확인하기 위해, 인산 농도 5mg/ℓ 로 약 2 개월간 수경재배를 실시한 토레니아의 pSPB1898 의 지상부 모두를 회수하고, 80℃ 에서 약 2 일간에 걸쳐 건조시켜, 건조 중량당 인산 축적량을 측정하였다 (표 4 및 도 4). 야생형과 형질전환체 각 3 개체씩을 건조시키고 인산 농도를 측정하여 그 평균치를 구하였다. 이 결과, 건조시킨 토레니아에 관해서도 형질전환체는 야생형에 비해 약 2.5 배로 높은 인산 축적량을 나타내는 것을 알 수 있어, 식물체 전체에서 인산의 축적량이 증가되고 있는 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112008034717699-PCT00004
이상과 같이 PHR1 유전자를 식물에 도입하여 과잉 발현시킴으로써, 식물의 인산 축적능을 증강시킬 수 있는 것이 명백해졌다.
실시예 5： 수경액으로부터의 인산 흡수량
수경액으로부터의 인산 흡수량의 차이를 명확하게 하기 위해, 이하의 비교 실험을 실시하였다. 야생형 토레니아 혹은 PHR1 도입 형질전환 토레니아를, 플라스틱제 컨테이너 (23×23×11.5cm) 내에서 발포 스티롤에 구멍을 뚫은 것을 지지체로서 띄우고, 탈이온수에 각종 염류를 녹인 수경 용액 5 리터를 이용하여 생육시켰다. 수경 용액의 인 농도는 5mg/ℓ 로 설정하였다. 각 컨테이너에는 4 주의 식물을 이용하여 경일적으로 수경 용액의 샘플링을 실시하고, 상기 서술한 방법에 따라 인산 농도를 측정하였다. 또, 잎으로부터의 증산이나 수면으로부터의 증발에 의해 수경 용액의 액량이 감소되므로, 3 일 간격으로 탈이온수를 보충하였다.
(수경 용액의 조정)
10 리터 중 (인 농도 5mg/ℓ)
1M KNO3 5㎖
1M MgSO4 2㎖
1M Ca(NO3)2 2㎖
20mM Fe-EDTA 2.5㎖
미량 원소 1㎖
1M KPO4 버퍼 (pH5.5) 1.61㎖
미량 원소액 조성 (50㎖ 중)
350mM H3BO3 10㎖
140mM MnCl2 5㎖
50mM CuSO4 500㎕
100mM ZnSO4 500㎕
20mM Na2MoO4 500㎕
5M NaCl 100㎕
10mM CoCl2 50㎕
측정 결과, PHR1 형질전환체는 야생형에 비해, 우수한 인 흡수 능력을 갖는 것이 나타났다 (표 5 및 도 5). pSPB1898, pSPB2314 중 어느 쪽의 형질전환체도 배양 개시 후 14 일 이내에 용액 중의 거의 모든 인산을 흡수하여, 높은 흡수능을 나타냈다. 또, 거의 모든 인산을 흡수하고 있었으므로, 저농도역에 있어서도 적극적으로 인산을 흡수하고 있다고 생각되었다.
Figure 112008034717699-PCT00005
4 주간 (2 주간의 시험 2 회분) 배양한 식물의 잎의 인산량을 분석한 결과는, 실시예 3 및 4 에서의 토레니아나 피튜니아의 결과와 동일한 경향을 나타내고, 형질전환체가 인산을 많이 축적하고 있었다 (표 6 및 도 6). 또, 도 7 은 4 주간 수경재배 후의 토레니아의 지상부를 각 주마다 신선중을 측정하여, 평균을 구하여 비교한 것으로, 형질전환체가 야생형에 비해 조금 작지만, 큰 차이가 아닌 것을 알 수 있다. 이로써, 형질전환체에서는 흡수된 인산을 자체적인 생장에 이용하는 것이 아니라, 축적시켜 유지하고 있다고 생각되었다.
Figure 112008034717699-PCT00006
이상의 결과로부터, PHR1 유전자를 도입한 형질전환 식물은, 인산 흡수능이 증강되고, 식물을 사용한 수질 정화에 적절한 형질을 획득한 것이 나타났다.
실시예 6：다른 식물로의 PHR1 유전자 도입
PHR1 유전자에 의한 인산 흡수능의 증대가 다른 식물에서도 볼 수 있는지를 확인하기 위해, 임파첸스, 베고니아, 담배, 버베나, 푸른종지꽃, 장미에 PHR1 유전자를 도입하였다.
(임파첸스 및 베고니아로의 PHR1 유전자 도입)
임파첸스 (Impatiens walleriana) 의 형질전환은 기본적으로 US Patent 6, 121, 511 에 따라, 품종 글리터 레드 (사카타노 타네) 와 템포 핑크 (타키이 종묘) 를 이용하여 실시하였다. 비트로묘로부터 잘라낸 경정, 마디, 엽병, 엽편을 전 배양 액체 배지 (1mg/ℓ TDZ 첨가 MS 배지) 에서 5 일간 전 배양 후, 전 배양 고형 배지 (0.05mg/ℓ NAA, 6mg/ℓ Zeatin, 0.3% 겔랑검 첨가 MS 배지) 에 48 시간 정치(靜置)시켰다. 그 후, pSPB2314 를 도입한 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens AglO 주) 을 감염시켜, 선택 배지 상 (0.05mg/ℓ NAA, 6mg/ℓ Zeatin, 100mg/ℓ Kanamycin, 500mg/ℓ Carbenicillin, 100mg/ℓ Cefotaxime, 0.3% 겔랑검 첨가 MS 배지) 에서 4 - 8 주간 배양하여 슈트(shoot)를 얻었다 (표 7). 엽편은 용이하게 갈변되어 슈트는 얻어지지 않았다. 경정 및 마디에서는 1 개의 외식편보다 많은 슈트를 얻을 수 있었는데, 위양성도 다수 포함된다고 생각되었다. 엽병으로부터의 슈트는 출현에 시간이 걸려서 수도 적지만, 가장 확실한 듯하다.
Figure 112008034717699-PCT00007
베고니아 (Begonia Semperflorens) 의 형질전환은 품종 앰베서더 화이트와 앰베서더 스칼렛 (사카타노 타네) 을 이용하여 실시하였다. 비트로묘로부터 엽편과 엽병을 잘라내고, pSPB2314 를 도입한 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens AglO 주) 을 감염시켜, 공존 배양 배지 (0.5mg/ℓ IAA, 0.1mg/ℓ TDZ, 0.5% PVP, 2mg/ℓ AgNO3, 200μM Acetosyringone, 0.3% 겔랑검 첨가 MS 배지) 상에서 암흑 하 3 일간 배양시켰다. 그 후, 전 선택 배지 (1mg/ℓ BAP, 1mg/ℓ Zeatin, 0.1mg/ℓ IAA, 500mg/ℓ Timentin, 50μM Acetosyringone, 0.25% 겔랑검 첨가 MS 배지) 에서 3 - 5 일간, 선택 배지 1 (2mg/ℓ TDZ, 0.1mg/ℓ NAA, 100mg/ℓ Kanamycin, 500mg/ℓ Timentin, 0.4% 한천 첨가 MS 배지) 에서 2 주간, 선택 배지 2 (0.2mg/ℓ BAP, 0.1mg/ℓ NAA, 100mg/ℓ Kanamycin, 500mg/ℓ Timentin, 0.4% 한천 첨가 MS 배지) 에서 2 주간, 선택 배지 3 (100mg/ℓ Kanamycin, 500mg/ℓ Timentin, 0.4% 한천 첨가 MS 배지) 에서 3 주간 연속해서 배양시켰다. 그 사이에 형성된 슈트는 직경 5㎜ 이상으로 성장된 시점에서, 주위의 조직을 절삭하여, 선택 배지 4 (150mg/ℓ Kanamycin, 500mg/ℓ Timentin, 0.4% 한천 첨가 MS 배지) 로 옮겨, 추가로 2 - 3 주간 배양 후, 발근 배지 (100mg/ℓ Kanamycin, 500mg/ℓ Timentin, 0.4% 한천 첨가 MS 배지) 로 옮겨 발근 슈트를 얻었다 (표 8).
Figure 112008034717699-PCT00008
(담배, 버베나, 푸른종지꽃으로의 PHR1 유전자 도입)
담배 (Nicotiana tabacum), 버베나 (Verbena hybrida), 푸른종지꽃 (Nierembergia sp.) 의 형질전환은 각각 공지된 방법 (Science 227, 1229, 1985；
Plant Cell Rep. 21, 459, 2003；Plant Biotech. 23, 19, 2006) 에 기초하여 실시하였다. 얻어진 식물체의 유전자 도입에 대해서는, 각 식물체의 잎으로부터 DNA 를 추출하여, PHR1 유전자를 템플릿으로 한 PCR 에 의해 확인하였다. 담배에서 11 개체, 버베나에서 16 개체, 푸른종지꽃에서 1 개체의 PHR1 형질전환 식물을 취득하였다.
(장미로의 PHR1 유전자 도입)
pSPB2314 를 갖는 형질전환 아그로박테리움의 균액 중에 무균묘의 잎으로부터 유도된 장미 (Rosa hybrida) 의 캘러스를 5 분간 담그고, 멸균 여과지로 여분의 균액을 닦아낸 후, 계대용 배지에 이식시켜, 2 일간 어두운 곳에서 공존 배양시켰다. 그 후, 카르베니실린을 400mg/ℓ 첨가한 MS 액체 배지로 세정하고, 계대용 배지에 카나마이신 50mg/ℓ 와 카르베니실린 200mg/ℓ 를 첨가한 선발·제균용 배지로 이식시켜, 선발 배지 상에서 생육 저해를 받지 않아, 정상적으로 증식하는 부분의 이식과 배양을 반복하여, 카나마이신 내성 캘러스를 선발하였다. 카나마이신 내성을 나타낸 형질전환 캘러스를, 카나마이신 50mg/ℓ, 카르베니실린 200mg/ℓ 를 첨가한 재분화용의 배지로 배양시킴으로써 카나마이신 내성의 슈트 원기를 얻을 수 있어, 장미에서도 PHR1 형질전환 식물이 얻어질 전망이 높다.
(형질전환 담배, 형질전환 버베나의 인산 흡수 시험)
MS 배지에서 생육되고 있는 PHR1 형질전환 담배의 무균묘로부터 잎을 샘플링하여, PHR1 의 발현량을 RT-PCR 에 의해 확인하였다. 그 결과 발현량이 많은 계통을 선발 계통으로 하고, 그 계통의 무균묘를 MS 배지로 육묘한 후, 잎 일부의 샘플링을 실시하여, 잎 중의 인산 농도를 기술한 방법에 따라 측정하였다. 또, PHR1 형질전환 버베나의 이식 개체로부터도 담배의 경우와 동일하게 잎을 샘플링하여, PHR1 의 발현량을 RT-PCR 에 의해 확인하였다. 그 결과 발현량이 많은 계통을 선발 계통으로 하고, 그 계통의 잎을 샘플링한 후 잎 중의 인산 농도를 기술한 방법에 따라 측정하였다.
그 결과, 형질전환 담배, 형질전환 버베나 중 어느 식물에서도, 야생형과 비교하여 1.5 배 정도의 인산의 축적을 볼 수 있었다 (도 8 및 도 9).
이상으로부터, 8 식물종으로부터 PHR1 유전자를 도입한 형질전환 식물을 취득할 수 있고, 또 4 식물종의 PHR1 도입 형질전환 식물에 있어서, 인산의 축적 능력이 향상되는 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 것은, PHR1 형질전환 식물을 여러가지 식물종으로 취득할 수 있고, 또 PHR1 유전자는 도입 식물종에 상관없이, 인산의 축적에 기여할 수 있는 것을 나타내고 있다.
이상과 같이, 본 발명에 의한 인산의 고축적능을 부여한 형질전환 식물을 수질 정화에 사용함으로써, 수질 정화 식물의 큰 과제인 회수 후의 바이오매스를 비료화, 또는 추출된 인이라는 형태로 유효하게 재이용할 수 있게 된다. 또 이 기술을 이용하면, 기존의 인산 축적능이 높은 식물에 유전자 도입됨으로써, 보다 많은 인산을 축적할 수 있는 식물의 제조도 가능해져, 수질의 정화라는 과제에 대해 유효하고 또한 2 차 오염이 적은 수법을 제공할 수 있다. 또, 화훼 원예 식 물을 유전자 재조합의 호스트에 사용함으로써, 미관면에서도 다른 수질 정화 수법에는 없는 메리트를 제공할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Suntory Limited <120> A plant capable of accumulating a high level of an inorganic phosphate and the use thereof <130> PCT06-0152 <150> JP 2005-313225 <151> 2005-10-27 <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1529 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (99)..(1328) <400> 1 ctccgattat ccccaagagg agaatcctca taatcatttt ctccgattcg attcgtcttc 60 cttggtcctg gattgcttca tgaatttcta ggacaaca atg gag gct cgt cca gtt 116 Met Glu Ala Arg Pro Val 1 5 cat aga tca ggt tcg aga gac ctc aca cgc act tct tca atc cca tct 164 His Arg Ser Gly Ser Arg Asp Leu Thr Arg Thr Ser Ser Ile Pro Ser 10 15 20 aca caa aaa cct tca cca gta gaa gat agt ttc atg aga tca gat aac 212 Thr Gln Lys Pro Ser Pro Val Glu Asp Ser Phe Met Arg Ser Asp Asn 25 30 35 aac agt cag tta atg tct aga cca tta gga caa acc tac cat tta ctt 260 Asn Ser Gln Leu Met Ser Arg Pro Leu Gly Gln Thr Tyr His Leu Leu 40 45 50 tca tct agt aac ggt gga gct gtt gga cat ata tgt tct tct tca tca 308 Ser Ser Ser Asn Gly Gly Ala Val Gly His Ile Cys Ser Ser Ser Ser 55 60 65 70 tct ggt ttt gca acc aat ctc cat tac tca act atg gta tct cat gag 356 Ser Gly Phe Ala Thr Asn Leu His Tyr Ser Thr Met Val Ser His Glu 75 80 85 aaa caa caa cac tac aca gga agc agc agt aat aat gct gtg cag aca 404 Lys Gln Gln His Tyr Thr Gly Ser Ser Ser Asn Asn Ala Val Gln Thr 90 95 100 cca agc aac aac gat agt gct tgg tgt cat gat tca ttg cca gga ggg 452 Pro Ser Asn Asn Asp Ser Ala Trp Cys His Asp Ser Leu Pro Gly Gly 105 110 115 ttt ctt gac ttc cat gaa acc aac ccg gcg att caa aac aac tgt cag 500 Phe Leu Asp Phe His Glu Thr Asn Pro Ala Ile Gln Asn Asn Cys Gln 120 125 130 att gag gat ggt ggc att gcg gct gct ttt gat gac att caa aaa cga 548 Ile Glu Asp Gly Gly Ile Ala Ala Ala Phe Asp Asp Ile Gln Lys Arg 135 140 145 150 agt gat tgg cat gaa tgg gct gac cat ttg atc act gat gat gat cct 596 Ser Asp Trp His Glu Trp Ala Asp His Leu Ile Thr Asp Asp Asp Pro 155 160 165 ttg atg tct act aac tgg aat gat ctc ttg ctt gaa aca aat tcc aat 644 Leu Met Ser Thr Asn Trp Asn Asp Leu Leu Leu Glu Thr Asn Ser Asn 170 175 180 tca gat tca aag gac cag aag aca ctg caa att ccg caa cct cag att 692 Ser Asp Ser Lys Asp Gln Lys Thr Leu Gln Ile Pro Gln Pro Gln Ile 185 190 195 gtt cag cag caa cct tct ccg tct gtg gaa ttg cga cct gtt agc aca 740 Val Gln Gln Gln Pro Ser Pro Ser Val Glu Leu Arg Pro Val Ser Thr 200 205 210 aca tct tca aac agc aat aac gga acg ggc aag gca cga atg cgt tgg 788 Thr Ser Ser Asn Ser Asn Asn Gly Thr Gly Lys Ala Arg Met Arg Trp 215 220 225 230 acg cca gag ctt cac gag gct ttt gtt gag gct gtc aac agt ctt ggc 836 Thr Pro Glu Leu His Glu Ala Phe Val Glu Ala Val Asn Ser Leu Gly 235 240 245 ggt agt gaa aga gct act cct aaa ggg gta ctg aag att atg aaa gtt 884 Gly Ser Glu Arg Ala Thr Pro Lys Gly Val Leu Lys Ile Met Lys Val 250 255 260 gaa ggc ttg act ata tat cat gtt aaa agc cat tta cag aaa tat agg 932 Glu Gly Leu Thr Ile Tyr His Val Lys Ser His Leu Gln Lys Tyr Arg 265 270 275 aca gct aga tat cgg cca gaa cca tca gaa act ggt tcg cca gaa agg 980 Thr Ala Arg Tyr Arg Pro Glu Pro Ser Glu Thr Gly Ser Pro Glu Arg 280 285 290 aag ttg aca ccg ctt gaa cat ata aca tct ctt gat ttg aaa ggt ggg 1028 Lys Leu Thr Pro Leu Glu His Ile Thr Ser Leu Asp Leu Lys Gly Gly 295 300 305 310 ata ggt att aca gag gct cta cga ctt cag atg gaa gta cag aag caa 1076 Ile Gly Ile Thr Glu Ala Leu Arg Leu Gln Met Glu Val Gln Lys Gln 315 320 325 ctc cat gag cag ctc gag att caa aga aac ctg caa ctc cga ata gaa 1124 Leu His Glu Gln Leu Glu Ile Gln Arg Asn Leu Gln Leu Arg Ile Glu 330 335 340 gaa caa ggc aag tac ctg caa atg atg ttc gag aag caa aac tct ggt 1172 Glu Gln Gly Lys Tyr Leu Gln Met Met Phe Glu Lys Gln Asn Ser Gly 345 350 355 ctt acc aaa ggg aca gcc tca aca tca gat tcc gca gcc aaa tct gaa 1220 Leu Thr Lys Gly Thr Ala Ser Thr Ser Asp Ser Ala Ala Lys Ser Glu 360 365 370 caa gaa gac aag aag act gct gat tcg aag gag gtt cca gaa gaa gaa 1268 Gln Glu Asp Lys Lys Thr Ala Asp Ser Lys Glu Val Pro Glu Glu Glu 375 380 385 390 acc agg aaa tgt gag gaa cta gaa tct cca cag cca aag cgt ccc aaa 1316 Thr Arg Lys Cys Glu Glu Leu Glu Ser Pro Gln Pro Lys Arg Pro Lys 395 400 405 atc gat aat tga aagtattggt cttttgctgg ataatctcgg agtttcagag 1368 Ile Asp Asn ttaacagtga tagagagaac gagctcttat cttgaggttc ttcaggactt ctctctttac 1428 tgtttaacta tttttctgat ggaagactct caactcagct gtgtagacaa acaacagatc 1488 cccaaggaag aaacaaaaca aaaataaaaa gttagtttgg g 1529 <210> 2 <211> 409 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Glu Ala Arg Pro Val His Arg Ser Gly Ser Arg Asp Leu Thr Arg 1 5 10 15 Thr Ser Ser Ile Pro Ser Thr Gln Lys Pro Ser Pro Val Glu Asp Ser 20 25 30 Phe Met Arg Ser Asp Asn Asn Ser Gln Leu Met Ser Arg Pro Leu Gly 35 40 45 Gln Thr Tyr His Leu Leu Ser Ser Ser Asn Gly Gly Ala Val Gly His 50 55 60 Ile Cys Ser Ser Ser Ser Ser Gly Phe Ala Thr Asn Leu His Tyr Ser 65 70 75 80 Thr Met Val Ser His Glu Lys Gln Gln His Tyr Thr Gly Ser Ser Ser 85 90 95 Asn Asn Ala Val Gln Thr Pro Ser Asn Asn Asp Ser Ala Trp Cys His 100 105 110 Asp Ser Leu Pro Gly Gly Phe Leu Asp Phe His Glu Thr Asn Pro Ala 115 120 125 Ile Gln Asn Asn Cys Gln Ile Glu Asp Gly Gly Ile Ala Ala Ala Phe 130 135 140 Asp Asp Ile Gln Lys Arg Ser Asp Trp His Glu Trp Ala Asp His Leu 145 150 155 160 Ile Thr Asp Asp Asp Pro Leu Met Ser Thr Asn Trp Asn Asp Leu Leu 165 170 175 Leu Glu Thr Asn Ser Asn Ser Asp Ser Lys Asp Gln Lys Thr Leu Gln 180 185 190 Ile Pro Gln Pro Gln Ile Val Gln Gln Gln Pro Ser Pro Ser Val Glu 195 200 205 Leu Arg Pro Val Ser Thr Thr Ser Ser Asn Ser Asn Asn Gly Thr Gly 210 215 220 Lys Ala Arg Met Arg Trp Thr Pro Glu Leu His Glu Ala Phe Val Glu 225 230 235 240 Ala Val Asn Ser Leu Gly Gly Ser Glu Arg Ala Thr Pro Lys Gly Val 245 250 255 Leu Lys Ile Met Lys Val Glu Gly Leu Thr Ile Tyr His Val Lys Ser 260 265 270 His Leu Gln Lys Tyr Arg Thr Ala Arg Tyr Arg Pro Glu Pro Ser Glu 275 280 285 Thr Gly Ser Pro Glu Arg Lys Leu Thr Pro Leu Glu His Ile Thr Ser 290 295 300 Leu Asp Leu Lys Gly Gly Ile Gly Ile Thr Glu Ala Leu Arg Leu Gln 305 310 315 320 Met Glu Val Gln Lys Gln Leu His Glu Gln Leu Glu Ile Gln Arg Asn 325 330 335 Leu Gln Leu Arg Ile Glu Glu Gln Gly Lys Tyr Leu Gln Met Met Phe 340 345 350 Glu Lys Gln Asn Ser Gly Leu Thr Lys Gly Thr Ala Ser Thr Ser Asp 355 360 365 Ser Ala Ala Lys Ser Glu Gln Glu Asp Lys Lys Thr Ala Asp Ser Lys 370 375 380 Glu Val Pro Glu Glu Glu Thr Arg Lys Cys Glu Glu Leu Glu Ser Pro 385 390 395 400 Gln Pro Lys Arg Pro Lys Ile Asp Asn 405 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer PHRf <400> 3 atggaggctc gtccagttca t 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer PHRr <400> 4 tcaattatcg attttgggac gc 22 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer BamPHRf <400> 5 agctggatcc atggaggctc gtccag 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer SpePHRr <400> 6 cagtactagt attatcgatt ttggga 26 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer SpeVP16f <400> 7 agctactagt gcccccccga ccgatg 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer KpnVP16r <400> 8 cagtggtacc ttacccaccg tactcg 26

Claims (20)

  1. 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자를 발현시키도록 형질전환된 식물체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자가, 애기장대 유래의 Myb 형 전사 인자 PHR1 인 식물체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 Myb 형 전사 인자 PHR1 이,
    (a) 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질, 또는
    (b) 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서, 1 개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어지고, 인산 기아 응답 유전자를 활성화시키는 기능을 갖는 단백질인 식물체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자가,
    (c) 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 유전자, 또는
    (d) 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열 또는 그 오픈 리딩 프레임의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한, 인산 기아 응답 유전자를 활성화시키는 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자인 식물체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    피튜니아, 토레니아, 버베나, 담배, 장미, 임파첸스, 베고니아, 또는 푸른종지꽃인 식물체.
  6. 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자를 발현시키도록 식물체를 형질전환하는 공정을 포함하는 식물체의 생산 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터를 상기 식물체에 도입함으로써, 상기 식물체를 형질전환하는 방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    상기 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자가, 애기장대 유래의 Myb 형 전사 인자 PHR1 인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 Myb 형 전사 인자 PHR1 이,
    (a) 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질, 또는
    (b) 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서, 1 개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어지고, 인산 기아 응답 유전자를 활성화시키는 기능을 갖는 단백질인 방법.
  10. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    상기 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자가,
    (c) 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 유전자, 또는
    (d) 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열 또는 그 오픈 리딩 프레임의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한, 인산 기아 응답 유전자를 활성화시키는 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자인 방법.
  11. 제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물체가 피튜니아인 방법.
  12. 제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물체가 토레니아인 방법.
  13. 제 6 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 생산되는 식물체.
  14. 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터로서, 식물체에 도입했을 때에, 상기 전사 인자를 코드하는 유전자를 발현시킬 수 있도록 구성된 벡터.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자가, 애기장대 유래의 Myb 형 전사 인자 PHR1 인 벡터.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 Myb 형 전사 인자 PHR1 이,
    (a) 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질, 또는
    (b) 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서, 1 개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어지고, 인산 기아 응답 유전자를 활성화시키는 기능을 갖는 단백질인 벡터.
  17. 제 14 항에 있어서,
    상기 인산 기아 반응에 관여하는 유전자의 전사 인자를 코드하는 유전자가,
    (c) 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 유전자, 또는
    (d) 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열 또는 그 오픈 리딩 프레임의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한, 인산 기아 응답 유전자를 활성화시키는 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자인 벡터.
  18. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항, 또는 제 13 항에 기재된 식물체의 번식 재료.
  19. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항, 또는 제 13 항에 기재된 식물체를 이용하여 수권의 과잉된 인을 제거하는 공정을 포함하는 수질 정화법.
  20. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 벡터가 도입되어 형질전환된 식물체로 재생할 수 있는 식물 세포.
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