CN1793363A - 小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列，属于农业生物基因工程领域。该基因用小麦基因组DNA及同源克隆的方法获得，属于小麦中脱水应答因子CBF4家族中的一个新成员。该基因cDNA序列全长936bp，有一个长130bp的5’UTR和长89bp的3’UTR以及长717bp的开放阅读框，其编码框为第131－847位核苷酸，编码一个长238aa多肽链。该发明利用农杆菌介导的基因转化法，将克隆到的基因编码序列构建到植物表达载体pROK II中，并转化到拟南芥，转化了该基因的拟南芥抗盐性和抗寒性明显提高。本发明从克隆转录因子基因入手，进而实行转基因研究，为提高小麦抗逆性提供了有效的方法和途径。
Description
技术领域：
本发明属于农业生物基因工程领域，涉及栽培小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA编码序列。
技术背景：
DREB(Dehydration Responsive Element Binding)基因元件的发现是近年来植物抗逆研究方面最具突破性的进展。Liu Qiang等(Plant Cell，1998，10：1391~1406)从拟南芥中分离到5个AP2/EREBP类转录因子基因，分属两个亚家族，分别命名为DREB1A、DREB1B、DREB1C和DREB2A、DREB2B。后来发现与Stockinger等(1997)分离到的CBF(C-repeat/DRE-Binding Factor)家族有对应关系，DREB1A即是CBF3，DREB1B即是CBF1，DREB1C即是CBF2。有证据表明CBF1，CBF2，CFB3作为一个基因簇位于拟南芥的第IV号染色体上，CBF2和CBF3分别存在于CBF1基因上游的3Kb和7Kb处。比较CBF1，CBF2，CBF3的核苷酸序列时，可以发现它们的阅读框(ORF)中没有内含子插入(Joaquin Medina等，1999)。我们使用BLAST程序在Genbank数据库中搜索到的目前已知的所有DREB转录因子家族成员，发现与抗逆特性相关的转录因子的研究，主要集中在拟南芥、大麦、黑麦、水稻、油菜等植物上，对小麦转录因子基因的研究则很少，尤其尚未见对小麦DREB家族成员研究的报道。
植物对非生物胁迫逆境抗性性状是一种数量性状，是由多种基因控制的综合反应，通过单基因改良的方式很难提高植物的抗逆性，尤其对基因组来源复杂的栽培小麦的抗逆性研究更为困难。由于一个DREB转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐受性有关的功能基因的表达，从而提高植物对环境胁迫的整体抗性，因此对小麦的抗逆性研究，从克隆转录因子基因入手，进而实行转基因研究，是提高小麦抗逆性更为有效的方法和途径。
发明内容：
一种小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列，属于小麦CBF4基因家族的一个成员，cDNA全长936bp；该基因有一个长130bp的5’UTR和长89bp的3’UTR以及长717bp的开放阅读框，其编码框为第131-847位核苷酸，编码一个长238aa多肽链。该基因的全长cDNA序列为：
5’TGAGCACCGGGGACCCTACATGGGACTGAAGGGGTAGGGAAAAAACACCATCGTTC
AAGGTGCTCAACCCTCTTCACTAGCTTTCGAATCAGATGGACGTCGCCGACGCTGCCT
CCAAGTCCCGGCCAGC
AGCAGGGTCACAGGACGGTGTCGTGGGATCCCCCAAAG
CGGCCGGCGGGGCGGACCAAGTTCCACGAGACGCGCCACCCGCTGTACCGGGGCGTT
CGGCGCCGTGGCCGGGTCGGGCAGTGGGTGTGCGAGGTGCGCGTGCGCGGCACCAAT
GAGACAAGGCTCTGGCTCGGCACCTTCCACACCGCCGAGATGGCGGCGCGAGCGCAC
GACTCCGCCTCGCTCGCTCTCTCCGGAAGCGCCGCCTGCCTCAACTTCGCCGACTCCG
CATGGCGGATGCTGCCCGTGCTTGCGGCCGGATCGTTCGGCTTCGGCAGCGCGCGGGA
GATCAAGCTTGCCGTCGCCGTTGCCGTCGTTGCGTTCCAGCAGCAGCAGATTATTCTTC
CAGTCGCGTGTCCAACGGTGGAGGCGGCCGCCAGCCCGAGCAACTCTCTGTTTTACAT
GTCGTCCGTCGACTTGCTGGAGCTCGACGAGGAGCAGTGGTTTGGCGGCATGGACGC
TGGGTCGTACTACGAGAGCTTGGCGCAGGGGATGCTCGTGGCGCCGCCGGACGACAG
AGCGAGGCGGGAGGACGCCGAGCAGACCGGCGTCGAGACACCGACGCCGTTATGGA
GCTATTTGTTTGACTAATTCAGCACGCAGTGTAAAGTTGTCGATAGTTGCGTTGTGTTCT
TCCCAATTTGGGAACGAACAGAGTAGGCAGTTTTTTTTT AGGTTGTAGTAGGCAG
TTTGAAGTTCCCGGTTTCTACTTTTGTGAGAAATGGACCCTAGATTGCTTATCGCAAAA
AAAAAAAAAAAAAA3’(SEQ ID NO.1)
需要说明的是：
以上序列中的阴影部分，分别为基因的起始密码子和终止密码子，下画线部分为编码区；
717bp长的基因编码区，编码一个长238aa多肽链，多肽链的氨基酸序列为：
MSRVTGRCRGIPQSGRRGGPSSTRRATRCTGAFGAVAGSGSGCARCACAAPMRQGSGSAPSTPPRWRRE
RTTPPRSLSPEAPPASTSPTPHGGCCPCLRPDRSASAARGRSSLPSPLPSLRSSSSRLFFQSRVQRWRR
PPARATPSTCWSSTRSSGLAALCFTCRWTLGRTTRAWRRGCSWRRRTTERGGRTPSRPASRHRRRYGAI
CLTNSARSVKLSIVALCSSQFGNEQSRQFFF(SEQ ID NO.2)
小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列在改善抗逆特性方面的应用，利用农杆菌介导的基因转化法将克隆到的基因编码序列构建到植物表达载体pROKII中，并转化到拟南芥，该基因明显改善了拟南芥的抗盐性和抗寒性。
其具体制备方法如下：
有文献报道(Joaquin Medina，1999)，DREB基因中不含内含子。本发明根据已发表的黑麦DREB基因的保守序列设计相互重叠的两对引物，利用同源克隆的方法，以小麦基因组DNA为模板，经PCR扩增，首先获得292bp(Wheat Jing411292bp，WtJ292)和161bp(Wheat Jing411 161bp，WtJ161)两片段，克隆并测序，BLASTn比对后发现WtJ292与一个大麦DREB基因有90％的同源性。WtJ161与一个大麦DREB基因有85％的同源性。将两片段拼接(Wheat Jing411 426bp，WtJ426)，再根据该拼接片段序列设计引物，以4℃冷胁迫2小时的小麦黄化苗总体RNA为模板，做cDNA3’末端和5’末端快速扩增，获得了该基因的3’端和5’端，该基因全长cDNA长936bp。BLASTn和BLASTx综合分析，发现该基因与大麦、小麦、水稻、黑麦以及拟南芥等多个CBF基因的同源性均在百分之八十以上，同源性最高的为大麦的CBF4D基因，核苷酸(AY785852.1)同源性为89％，氨基酸(AAX23696.1)的同源性为83％。另外还与大麦CBF4A：核苷酸(AY785849.1)同源性为88％，氨基酸(AAX28949.1)的同源性为82％；大麦CBF4B核苷酸(AY785848.1)同源性为88％，氨基酸(AAX28950.1)同源性为82％；与小麦的CBF9(AY785905.1)同源性虽为88％，但氨基酸(AAX28966.1)的同源性较低，为61％。因此，本发明所获得的基因系小麦中脱水应答因子CBF4家族中的一个新成员。为了验证该基因的功能，我们利用农杆菌介导的基因转化法将该基因的编码序列构建到植物表达载体pROKII并转化拟南芥，发现该基因明显改善了拟南芥的抗盐性和抗寒性。
有益效果：
由于一个DREB转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐受性有关的功能基因的表达，从而提高植物整体的抗性。我们将克隆到的基因编码序列构建到植物表达载体pROKII中，转化到拟南芥，发现拟南芥的抗逆特性明显改善，转基因的拟南芥可以在1.5％的NaCl(W/V)中正常生长，而非转基因的拟南芥在1.5％的NaCl(W/V)中生长明显受抑，并很快萎蔫，3天根部开始变褐、变硬、易断，7天出现死苗；转基因的拟南芥在4℃冷胁迫下正常生长，而非转基因的拟南芥在4℃冷胁迫下生长缓慢。转化了该基因的拟南芥抗盐性和抗寒特性明显提高。
附图说明：
图1：本发明的小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列；
图2：本发明的小麦脱水应答转录因子DREB基因编码的氨基酸序列；
图3本发明的小麦脱水应答转录因子基因与大麦CBF4D基因的比对；
图4本发明的小麦脱水应答转录因子基因与大麦CBF4A基因的比对；
图5本发明的小麦脱水应答转录因子基因与大麦CBF4B基因的比对。
具体实施方式：
实施例1：
(一)植物材料及处理：
栽培小麦京411种子经10％安替福民消毒、去离子水浸泡处理后于23℃避光培养6～10天收获叶片用于DNA提取。冷处理样品小麦幼苗提取RNA之前置于4℃冷胁迫2小时。
(二)小麦京411基因组DNA的提取
取0.2g黄化苗于液氮中研磨至粉末状；加入2mlDNA提取缓冲液(500mM NaCl、100mMTris·HCl、50mM EDTA)，65℃水浴15分钟，冰浴10分钟，3,000rpm 4℃离心15分钟，除组织块；取上清，加等体积酚3,000rpm 4℃离心10分钟；取上清，加等体积酚仿3,000rpm 4℃离心10分；取上清，加等体积仿3,000rpm 4℃离心10分钟；取上清，加2倍体积冷无水乙醇-20℃沉淀2小时以上；12,000rpm 4℃离心20分钟，使DNA完全沉淀；弃上清，75％乙醇洗沉淀2～3次，除Tris和EDTA中的盐；晾干，溶于100μl TE(50mM EDTA、100mM Tris·HCl)溶液；加1μl 1mg/ml RNase，37℃水浴保温1小时；加等体积酚仿，3,000rpm 4℃离心10分钟；取上清，加等体积仿3,000rpm 4℃离心10分钟；取上清，加2倍冷无水乙醇-20℃沉淀过夜；12,000rpm4℃离心5分钟，使DNA沉淀；75％乙醇洗沉淀2次，晾干，视样品的多少溶于20～50μlTE中；用紫外分光光度法检测DNA样品的浓度及纯度，并用0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
实施例2：
(一)小麦京411 DREB基因片段(WtJ292)的PCR扩增
1、WtJ292片段的PCR扩增
1)引物的设计
在GenBank上查询到已发表的黑麦的三个DREB基因序列(gi|17148646，gi|17148648，gi|17148650)，并进行多序列对比，利用引物设计软件Primer 5.0在保守序列中查找并合成(以下所有引物均委托上海生工合成)引物如下：
Forward1：5’TGC CTC AAC TTC GCC GAC TCC3’(SEQ ID NO.3)
Reverse1：5’CGA GCA TCC CCT GCG CCA AG3’(SEQ ID NO.4)
2)PCR扩增反应体系：10×Buffer 2.5μl，MgCl2(25mM)1.5μl，dNTP(10mM)0.5μl，Forward1(10μM)0.25μl，Reverse1(10μM)0.25μl，DNA Template 100ng，Taq(5U/μl)0.25μl，ddH2O补齐到25μl。PCR参数：95℃预变性2分钟；95℃变性1分钟，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环；再72℃延伸7分钟。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测扩增片段的大小。用低熔点琼脂糖凝胶纯化回收PCR产物用于克隆。
3)扩增片段的克隆
主要参阅pGEM-T easy Vector System(Promega公司)说明书：按下列顺序在冰上加入以下成分，建立连接反应：2×Buffer 5μl，pGEM-T easy vector(50mg/ml)1μl，加A尾的PCR产物2μl，T4连接酶(3U/μl)1μl，无菌双蒸H2O补齐10μl；轻轻吹吸混匀，4℃连接过夜。将连接产物2μl转化到100μl感受态细胞DH5α中，筛选出阳性克隆子，委托上海生工生物工程公司测序。
4)测序
WtJ292序列：
5’CGAGCATCCCCTGCGCCAAGCTCTCGTAGTACGACCCAGCGTCCATGCCGCCAAACC
ACTGCTCCTCGTCGAGCTCCAGCAAGTCGACGGACGACATGTAAAACAGAGAGTTGC
TCGGGCTGGCGGCCGCCTCCACCGTTGGACACGCGACTGGAAGAATAATCTGCTGCTG
CTGGAACGCAACGACGGCAACGGCGACGGCAAGCTTGATCTCCCGCGCGCTGCCGAA
GCCGAACGATCCGGCCGCAAGCACGGGCAGCATCCGCCATGCGGAGTCGGCGAAGTT
GAGGCA 3’(SEQ ID NO.5)
(二)小麦京411 DREB基因片段(WtJ161)的PCR扩增
1、WtJ161片段的PCR扩增
1)引物设计
在GenBank上查询到已发表的三个黑麦DREB基因序列(gi|17148646，gi|17148648，gi|17148650)，并进行多序列对比，利用引物设计软件Primer 5.0在保守序列中查找并合成引物如下：
Forward2：5’TCG GGC AGT GGG TGT GCG AGG3’(SEQ ID NO.6)
Reverse2：5’CCA GGC GGA GTC GGC GAA GTT3’(SEQ ID NO.7)
2)PCR扩增反应、WtJ161片段的PCR产物纯化回收、克隆、测序同WtJ292
以下为WtJ161序列：
5’TCGGGCAGTGGGTGTGCGAGGTGCGCGTGCGCGGCACCAATGAGACAAGGCTCTGG
CTCGGCACCTTCCACACCGCCGAGATGGCGGCGCGAGCGCACGACTCCGCCTCGCTC
GCTCTCTCCGGAAGCGCCGCCTGCCTCAACTTCGCCGACTCCGCCTGG3’(SEQ ID
NO.8)
(三)WtJ426拼接：由于Forward1/Reverse1与Forward2/Reverse2在引物设计时是相互重叠的，所以可以将WtJ292和WtJ161两片段拼接在一起，为WtJ426：
5’TCGGGCAGTGGGTGTGCGAGGTGCGCGTGCGCGGCACCAATGAGACAAGGCTCTGGCT
CGGCACCTTCCACACCGCCGAGATGGCGGCGCGAGCGCACGACTCCGCCTCGCTCGCTCT
CTCCGGAAGCGCCGCCTGCCTCAACTTCGCCGACTCCGCCTGGCGGATGCTGCCCGTGCT
TGCGGCCGGATCGTTCGGCTTCGGCAGCGCGCGGGAGATCAAGCTTGCCGTCGCCGTTGC
CGTCGTTGCGTTCCAGCAGCAGCAGATTATTCTTCCAGTCGCGTGTCCAACGGTGGAGGCG
GCCGCCAGCCCGAGCAACTCTCTGTTTTACATGTCGTCCGTCGACTTGCTGGAGCTCGACG
AGGAGCAGTGGTTTGGCGGCATGGACGCTGGGTCGTACTACGAGAGCTTGGCGCAGGGGA
TGCTCG3’(SEQ ID NO.9)
实施例3：小麦总体RNA的提取
采取酸性异硫氰酸胍法提取小麦总体RNA：称取0.2克小麦黄化幼苗，灭菌双蒸水洗干净，灭菌滤纸吸干，剪碎入预冷过的研钵；加液氮研磨至粉末状，加入2ml的SolutionD，与粉末研至澄清；(以下各步在冰上操作)倒入7ml离心管中，加入200μl 2mol/L的NaAC(PH4.0)颠倒数次混匀置冰上；加入等体积的水饱和酚，用力振荡混匀；加入400μl氯仿-异戊醇(49∶1)，用力振荡混匀；冰浴30分钟，期间颠倒数次，以不出现分层为宜；11,000rpm 4℃离心15分钟；取上清，加入等体积的酚仿，再抽提一次，11,000rpm 4℃离心15分钟；取上清，加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀1小时以上；12,000rpm 4℃离心15分钟，弃上清；75％乙醇洗2次，除去盐类和其他杂质，离心弃上清，每次12,000rpm 4℃离心8分钟；自然干燥10分钟，加入40μl的DEPC处理过的灭菌ddH2O。4℃保存备用；用紫外分光光度法检测RNA样品的浓度及纯度，并用1％的变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。
实施例4：WtJ426 3’末端的快速扩增
1、引物设计：根据为WtJ426测序结果并利用专业引物设计软件Primer5.0设计引物如下：
3RACE-RT：5’CCA CGC GTC GAC TAG TAC TTT TTT TTT TTT TTT TT3’
(SEQ ID NO.10)
3RACEF1：5’GCT CCA GAA GCA GCA GAT3’(SEQ ID NO.11)
3RACER：5’CCA CGC GTC GAC TAG TAC3’(SEQ ID NO.12)
3RACEF2：5’TCC AGA AGC AGC AGA TTA TT3’(SEQ ID NO.13)
2、反转录：取小麦总体RNA 1μg至无RNA酶的PCR小管中，65℃水浴2分钟后，放到冰上。加入以下组分：5×AMV buffer 2.5μl，dNTP(10mM)0.5μl，3RACE-RT(50μM)1μl，RNASIN(40U/μl)0.5μl，AMV反转录酶(5U/μl)1μl，Nuclease-FreeWater补齐20μl。混匀离心，室温放置10分钟，42℃保温1小时，70℃保温15分钟。反转录产物经1％琼脂糖电泳检测cDNA片段的质量后，放入-20℃冰箱冻存备用。
3、3’RACE产物PCR：反应体系：10×Buffer 2.5μl，MgCl2(25mM)1.5μl，dNTP(10mM)0.5μl，3RACEF1(10μM)0.25μl，3’RACER(10μM)0.25μl，反转录产物1μl，Taq(5U/μl)0.25μl，ddH2O补齐25μl。
PCR参数：95℃预变性2分钟；95℃变性1分钟，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环后，72℃延伸7分钟。3’RACE一次PCR产物稀释100倍后作为模板进行巢式二次PCR。
4、3’RACE巢式PCR：反应体系：10×Buffer 2.5μl，MgCl2(25mM)1.5μl，dNTP(10mM)0.5μl，3RACEF2(10μM)0.25μl，3RACER(10μM)0.25μl，稀释产物1μl，Taq(5U/μl)0.25μl，ddH2O补齐25μl。
PCR参数：95℃预变性2分钟；95℃变性1分钟，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环后，72℃延伸7分钟。
PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测扩增片段的大小，并纯化回收后进行克隆测序，3’RACE序列为：
TCCAGAAGCAGCAGATTATTCTTCCAGTCGCGTGTCCAACGGTGGAGGCGGCCGCCAGC
CCGAGCAACTCTCTGTTTTACATGTCGTCCGTCGACTTGCTGGAGCTCGACGAGGAGCA
GTGGTTTGGCGGCATGGACGCTGGGTCGTACTACGAGAGCTTGGCGCAGGGGATGCTCA
TGGCGCCGCCGGACGACAGAGCGAGGCGGGAGGACGCCGAGCAGACCGGCGTCGAGA
CACCGACGCCGTTATGGAGCTATTTGTTTGACTAATTCAGCACGCAGTGTAAAGTTGTCG
ATAGTTGCGTTGTGTTCTTCCCAATTTGGGAACGAACAGAGTAGGCAGTTTTTTTTTTGA
AGGTTGTAGTAGGCAGTTTGAAGTTCCCGGTTTCTACTTTTGTGAGAAATGGACCCTAGA
TTGCTTATCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTACTAGTCGACGCGTG(SEQ ID NO.14)
实施例5：WtJ426片段的5’末端快速扩增
主要参阅5’-Full RACE Core Set试剂盒(TaKaRa公司)说明书。
1、引物的设计
根据WtJ426测序结果并利用专业引物设计软件Primer 5.0设计引物如下：
5RACEF：5’CAT GCG GAG TCG GCG AAG T3’(SEQ ID NO.15)
5RACER：5’GAC GAG GAG CAG TGG TTT GG3’(SEQ ID NO.16)
5RACERT：5’p GAG CAT CCC CTG CGC3’(SEQ ID NO.17)
2、第一链cDNA的合成、Hybrid RNA的分解、单链cDNA环化严格按照试剂盒说明进行。
PCR扩增反应体系：10×Buffer 2.5μl，MgCl2(25mM)1.5μl，dNTP(10mM)0.5μl，5RACEF(10μM)0.25μl，5RACER(10μM)0.25μl，连接反应产物1μl，Taq(5U/μl)0.25μl，ddH2O补齐25μl。PCR参数：95℃预变性2分钟；95℃变性1分钟，60℃退火30秒，72℃延伸45秒，30个循环，72℃延伸7分钟。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测扩增片段的大小，并纯化回收后进行克隆测序。5’RACE测序结果为：
5’TGAGCACCGGGGACCCTACATGGGACTGAAGGGGTAGGGAAAAAACAC
CATCGTTCAAGGTGCTCAACCCTCTTCACTAGCTTTCGAATCAGATGGACG
TCGCCGACGCTGCCTCCAAGTCCCGGCCAGCATGAGCAGGGTCACAGGAC
GGTGTCGTGGGATCCCCCAAAGCGGCCGGCGGGGCGGACCAAGTTCCACG
AGACGCGCCACCCGCTGTACCGGGGCGTTCGGCGCCGTGGCCGGG3’(SEQ
ID NO.18)
用NCBI(www.ncbi.nlm.nig.gov)的Align two sequences对WtJ426及其5’RACE、3’RACE获得的序列进行拼接，获得该基因的全长序列，共936bp，命名为WtJ936。
5’TGAGCACCGGGGACCCTACATGGGACTGAAGGGGTAGGGAAAAAACACCATCGTTC
AAGGTGCTCAACCCTCTTCACTAGCTTTCGAATCAGATGGACGTCGCCGACGCTGCCT
CCAAGTCCCGGCCAGC
AGCAGGGTCACAGGACGGTGTCGTGGGATCCCCCAAAG
CGGCCGGCGGGGCGGACCAAGTTCCACGAGACGCGCCACCCGCTGTACCGGGGCGTT
CGGCGCCGTGGCCGGGTCGGGCAGTGGGTGTGCGAGGTGCGCGTGCGCGGCACCAAT
GAGACAAGGCTCTGGCTCGGCACCTTCCACACCGCCGAGATGGCGGCGCGAGCGCAC
GACTCCGCCTCGCTCGCTCTCTCCGGAAGCGCCGCCTGCCTCAACTTCGCCGACTCCG
CATGGCGGATGCTGCCCGTGCTTGCGGCCGGATCGTTCGGCTTCGGCAGCGCGCGGGA
GATCAAGCTTGCCGTCGCCGTTGCCGTCGTTGCGTTCCAGCAGCAGCAGATTATTCTTC
CAGTCGCGTGTCCAACGGTGGAGGCGGCCGCCAGCCCGAGCAACTCTCTGTTTTACAT
GTCGTCCGTCGACTTGCTGGAGCTCGACGAGGAGCAGTGGTTTGGCGGCATGGACGC
TGGGTCGTACTACGAGAGCTTGGCGCAGGGGATGCTCGTGGCGCCGCCGGACGACAG
AGCGAGGCGGGAGGACGCCGAGCAGACCGGCGTCGAGACACCGACGCCGTTATGGA
GCTATTTGTTTGACTAATTCAGCACGCAGTGTAAAGTTGTCGATAGTTGCGTTGTGTTCT
TCCCAATTTGGGAACGAACAGAGTAGGCAGTTTTTTTTT 
AGGTTGTAGTAGGCAG
TTTGAAGTTCCCGGTTTCTACTTTTGTGAGAAATGGACCCTAGATTGCTTATCGCAAAA
AAAAAAAAAAAAAA3’(SEQ ID NO.1或图1)
(注：阴影部分分别为基因的起始密码子和终止密码子，下画线部分为编码区)
将该全长基因序列进行tBLASTx分析后发现，该基因有一个长130bp的5’UTR和长89bp的3’UTR以及长717bp的开放阅读框，其编码框为第131-847个核苷酸，编码一个长238aa多肽链。
Frame
MSRVTGRCRGIPQSGRRGGPSSTRRATRCTGAFGAVAGSGSGCARCACAAPMRQGSGSA
PSTPPRWRRERTTPPRSLSPEAPPASTSPTPHGGCCPCLRPDRSASAARGRSSLPSPLPSLRS
SSSRLFFQSRVQRWRRPPARATPSTCWSSTRSSGLAALCFTCRWTLGRTTRAWRRGCSW
RRRTTERGGRTPSRPASRHRRRYGAICLTNSARSVKLSIVALCSSQFGNEQSRQFFF(SEQ
ID NO.2或图2)
BLASTn和BLASTx综合分析，发现该基因与大麦、小麦、水稻、黑麦以及拟南芥等多个CBF基因的同源性均在百分之八十以上，同源性最高的为大麦的CBF4D基因，核苷酸(AY785852.1)同源性为89％(图3)，氨基酸(AAX23696.1)的同源性为83％。另外还与大麦CBF4A：核苷酸(AY785849.1)同源性为88％(图4)，氨基酸(AAX28949.1)的同源性为82％；大麦CBF4B核苷酸(AY785848.1)同源性为88％(图5)，氨基酸(AAX28950.1)同源性为82％；与小麦的CBF9(AY785905.1)同源性虽为88％，但氨基酸(AAX28966.1)的同源性较低，为61％。因此，本发明所获得的基因系小麦中脱水应答因子CBF4家族中的一个新成员。
实施例6：基因功能分析
为了验证该基因的功能，我们首先根据WtJ936的编码区域设计引物扩增该基因的编码区，然后将该编码区构建到植物表达载体pROKII中，利用农杆菌介导的基因转化法将该基因的编码序列转化拟南芥，发现该基因明显改善了拟南芥的抗盐性和抗寒性。具体方法为：
根据WtJ936序列设计用于扩增编码区序列的引物为：
Forward 5’ATGAGCAGGGTCACAGGACGGTGTC3’(SEQ ID NO.19)
Reverse 5’TCAAAAAAAAAACTGCCTACT3’(SEQ ID NO.20)
以小麦总体DNA为模板，进行基因编码区的扩增，反应体系为：10×Buffer2.5μl，MgCl2(25mM)1.5μl，dNTP(10mM)0.5μl，Forward(10μM)0.25μl，Reverse(10μM)0.25μl，DNA Template 100ng，Taq(5U/μl)0.25μl，ddH2O补齐到25μl。PCR参数：95℃预变性2分钟；95℃变性1分钟，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环；再72℃延伸7分钟。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测扩增片段的大小。用低熔点琼脂糖凝胶纯化回收PCR产物，用于表达载体的构建。
我们将扩增到的基因编码区构建到植物表达载体pROKII中，利用农杆菌介导的基因转化法转化拟南芥，分别在高盐和低温胁迫下，比较分析转基因拟南芥和非转基因拟南芥的生长情况，发现转基因拟南芥的抗逆特性明显改善：转基因的拟南芥可以在1.5％的NaCl(W/V)中正常生长，而非转基因的拟南芥在1.5％的NaCl(W/V)中生长明显受抑，并很快萎蔫，3天根部开始变褐、变硬、易断，7天出现死苗；转基因的拟南芥在4℃冷胁迫下正常生长，而非转基因的拟南芥在4℃冷胁迫下生长缓慢。转化了该基因的拟南芥抗盐性和抗寒特性明显提高。
SEQUENCE LISTING
<110>天津师范大学
<120>小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列
<130>0510
<160>20
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>936
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>5′UTR
<222>(1)..(130)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(131)..(847)
<223>
<220>
<221>3′UTR
<222>(848)..(936)
<223>
<220>
<221>gene
<222>(1)..(936)
<223>
<400>1
tga gca ccg ggg acc cta cat ggg act gaa ggg gta ggg aaa aaa cac
48
Ala Pro Gly Thr Leu His Gly Thr Glu Gly Val Gly Lys Lys His
1 5 10 15
cat cgt tca agg tgc tca acc ctc ttc act agc ttt cga atc aga tgg
96
His Arg Ser Arg Cys Ser Thr Leu Phe Thr Ser Phe Arg Ile Arg Trp
20 25 30
acg tcg ccg acg ctg cct cca agt ccc ggc cag cat gag cag ggt cac
144
Thr Ser Pro Thr Leu Pro Pro Ser Pro Gly Gln His Glu Gln Gly His
35 40 45
agg acg gtg tcg tgg gat ccc cca aag cgg ccg gcg ggg cgg acc aag
192
Arg Thr Val Ser Trp Asp Pro Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys
50 55 60
ttc cac gag acg cgc cac ccg ctg tac cgg ggc gtt cgg cgc cgt ggc
240
Phe His Glu Thr Arg His Pro Leu Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly
65 70 75
cgg gtc ggg cag tgg gtg tgc gag gtg cgc gtg cgc ggc acc aat gag
288
Arg Val Gly Gln Trp Val Cys Glu Val Arg Val Arg Gly Thr Asn Glu
80 85 90 95
aca agg ctc tgg ctc ggc acc ttc cac acc gcc gag atg gcg gcg cga
336
Thr Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe His Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg
100 105 110
gcg cac gac tcc gcc tcg ctc gct ctc tcc gga agc gcc gcc tgc ctc
384
Ala His Asp Ser Ala Ser Leu Ala Leu Ser Gly Ser Ala Ala Cys Leu
115 120 125
aac ttc gcc gac tcc gca tgg cgg atg ctg ccc gtg ctt gcg gcc gga
432
Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg Met Leu Pro Val Leu Ala Ala Gly
130 135 140
tcg ttc ggc ttc ggc agc gcg cgg gag atc aag ctt gcc gtc gcc gtt
480
Ser Phe Gly Phe Gly Ser Ala Arg Glu Ile Lys Leu Ala Val Ala Val
145 150 155
gcc gtc gtt gcg ttc cag cag cag cag att att ctt cca gtc gcg tgt
528
Ala Val Val Ala Phe Gln Gln Gln Gln Ile Ile Leu Pro Val Ala Cys
160 165 170 175
cca acg gtg gag gcg gcc gcc agc ccg agc aac tct ctg ttt tac atg
576
Pro Thr Val Glu Ala Ala Ala Ser Pro Ser Asn Ser Leu Phe Tyr Met
180 185 190
tcg tcc gtc gac ttg ctg gag ctc gac gag gag cag tgg ttt ggc ggc
624
Ser Ser Val Asp Leu Leu Glu Leu Asp Glu Glu Gln Trp Phe Gly Gly
195 200 205
atg gac gct ggg tcg tac tac gag agc ttg gcg cag ggg atg ctc gtg
672
Met Asp Ala Gly Ser Tyr Tyr Glu Ser Leu Ala Gln Gly Met Leu Val
210 215 220
gcg ccg ccg gac gac aga gcg agg cgg gag gac gcc gag cag acc ggc
720
Ala Pro Pro Asp Asp Arg Ala Arg Arg Glu Asp Ala Glu Gln Thr Gly
225 230 235
gtc gag aca ccg acg ccg tta tgg agc tat ttg ttt gac taa ttc agc
768
Val Glu Thr Pro Thr Pro Leu Trp Ser Tyr Leu Phe Asp Phe Ser
240 245 250
acg cag tgt aaa gtt gtc gat agt tgc gtt gtg ttc ttc cca att tgg
816
Thr Gln Cys Lys Val Val Asp Ser Cys Val Val Phe Phe Pro Ile Trp
255 260 265 270
gaa cga aca gag tag gca gtt ttt ttt ttg aag gtt gta gta ggc agt
864
Glu Arg Thr Glu Ala Val Phe Phe Leu Lys Val Val Val Gly Ser
275 280 285
ttg aag ttc ccg gtt tct act ttt gtg aga aat gga ccc tag att gct
912
Leu Lys Phe Pro Val Ser Thr Phe Val Arg Asn Gly Pro Ile Ala
290 295 300
tat cgc aaa aaa aaa aaa aaa aaa
936
Tyr Arg Lys Lys Lys Lys Lys Lys
305
<210>2
<211>238
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(238)
<223>
<400>2
Met Ser Arg Val Thr Gly Arg Cys Arg Gly Ile Pro Gln Ser Gly Arg
1 5 10 15
Arg Gly Gly Pro Ser Ser Thr Arg Arg Ala Thr Arg Cys Thr Gly Ala
20 25 30
Phe Gly Ala Val Ala Gly Ser Gly Ser Gly Cys Ala Arg Cys Ala Cys
35 40 45
Ala Ala Pro Met Arg Gln Gly Ser Gly Ser Ala Pro Ser Thr Pro Pro
50 55 60
Arg Trp Arg Arg Glu Arg Thr Thr Pro Pro Arg Ser Leu Ser Pro Glu
65 70 75 80
Ala Pro Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Pro His Gly Gly Cys Cys Pro
85 90 95
Cys Leu Arg Pro Asp Arg Ser Ala Ser Ala Ala Arg Gly Arg Ser Ser
100 105 110
Leu Pro Ser Pro Leu Pro Ser Leu Arg Ser Ser Ser Ser Arg Leu Phe
115 120 125
Phe Gln Ser Arg Val Gln Arg Trp Arg Arg Pro Pro Ala Arg Ala Thr
130 135 140
Pro Ser Thr Cys Trp Ser Ser Thr Arg Ser Ser Gly Leu Ala Ala Leu
145 150 155 160
Cys Phe Thr Cys Arg Trp Thr Leu Gly Arg Thr Thr Arg Ala Trp Arg
165 170 175
Arg Gly Cys Ser Trp Arg Arg Arg Thr Thr Glu Arg Gly Gly Arg Thr
180 185 190
Pro Ser Arg Pro Ala Ser Arg His Arg Arg Arg Tyr Gly Ala IleCys
195 200 205
Leu Thr Asn Ser Ala Arg Ser Val Lys Leu Ser Ile Val Ala Leu Cys
210 215 220
Ser Ser Gln Phe Gly Asn Glu Gln Ser Arg Gln Phe Phe Phe
225 230 235
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tgcctcaact tcgccgactc c 21
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cgagcatccc ctgcgccaag 20
<210>5
<211>292
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
cgagcatccc ctgcgccaag ctctcgtagt acgacccagc gtccatgccg ccaaaccact
60
gctcctcgtc gagctccagc aagtcgacgg acgacatgta aaacagagag ttgctcgggc
120
tggcggccgc ctccaccgtt ggacacgcga ctggaagaat aatctgctgc tgctggaacg
180
caacgacggc aacggcgacg gcaagcttga tctcccgcgc gctgccgaag ccgaacgatc
240
cggccgcaag cacgggcagc atccgccatg cggagtcggc gaagttgagg ca
292
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
tcgggcagtg ggtgtgcgag g
21
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ccaggcggag tcggcgaagt t 21
<210>8
<211>161
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
tcgggcagtg ggtgtgcgag gtgcgcgtgc gcggcaccaa tgagacaagg ctctggctcg
60
gcaccttcca caccgccgag atggcggcgc gagcgcacga ctccgcctcg ctcgctctct
120
ccggaagcgc cgcctgcctc aacttcgccg actccgcctg g
161
<210>9
<211>426
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
tcgggcagtg ggtgtgcgag gtgcgcgtgc gcggcaccaa tgagacaagg ctctggctcg
60
gcaccttcca caccgccgag atggcggcgc gagcgcacga ctccgcctcg ctcgctctct
120
ccggaagcgc cgcctgcctc aacttcgccg actccgcctg gcggatgctg cccgtgcttg
180
cggccggatc gttcggcttc ggcagcgcgc gggagatcaa gcttgccgtc gccgttgccg
240
tcgttgcgtt ccagcagcag cagattattc ttccagtcgc gtgtccaacg gtggaggcgg
300
ccgccagccc gagcaactct ctgttttaca tgtcgtccgt cgacttgctg gagctcgacg
360
aggagcagtg gtttggcggc atggacgctg ggtcgtacta cgagagcttg gcgcagggga
420
tgctcg
426
<210>10
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
ccacgcgtcg actagtactt tttttttttt ttttt
35
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
gctccagaag cagcagat
18
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ccacgcgtcg actagtac
18
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
tccagaagca gcagattatt
20
<210>14
<211>460
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
tccagaagca gcagattatt cttccagtcg cgtgtccaac ggtggaggcg gccgccagcc
60
cgagcaactc tctgttttac atgtcgtccg tcgacttgct ggagctcgac gaggagcagt
120
ggtttggcgg catggacgct gggtcgtact acgagagctt ggcgcagggg atgctcatgg
180
cgccgccgga cgacagagcg aggcgggagg acgccgagca gaccggcgtc gagacaccga
240
cgccgttatg gagctatttg tttgactaat tcagcacgca gtgtaaagtt gtcgatagtt
300
gcgttgtgtt cttcccaatt tgggaacgaa cagagtaggc agtttttttt ttgaaggttg
360
tagtaggcag tttgaagttc ccggtttcta cttttgtgag aaatggaccc tagattgctt
420
atcgcaaaaa aaaaaaaaaa aaagtactag tcgacgcgtg
460
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
catgcggagt cggcgaagt
19
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
gacgaggagc agtggtttgg
20
<210>17
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
gagcatcccc tgcgc
15
<210>18
<211>244
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
tgagcaccgg ggaccctaca tgggactgaa ggggtaggga aaaaacacca tcgttcaagg
60
tgctcaaccc tcttcactag ctttcgaatc agatggacgt cgccgacgct gcctccaagt
120
cccggccagc atgagcaggg tcacaggacg gtgtcgtggg atcccccaaa gcggccggcg
180
gggcggacca agttccacga gacgcgccac ccgctgtacc ggggcgttcg gcgccgtggc
240
cggg
244
<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
atgagcaggg tcacaggacg gtgtc
25
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
tcaaaaaaaa aactgcctac t
21
Claims (2)
1、一种小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列，其特征在于属于小麦CBF4基因家族的一个成员，cDNA全长936bp；该基因有一个长130bp的5’UTR和长89bp的3’UTR以及长717bp的开放阅读框，其编码框为第131-847位核苷酸，编码一个长238aa多肽链；DREB基因的全长cDNA序列为：
5’TGAGCACCGGGGACCCTACATGGGACTGAAGGGGTAGGGAAAAAACACCATCGTTC
AAGGTGCTCAACCCTCTTCACTAGCTTTCGAATCAGATGGACGTCGCCGACGCTGCCT
CCAAGTCCCGGCCAGC
AGCAGGGTCACAGGACGGTGTCGTGGGATCCCCCAAAG
CGGCCGGCGGGGCGGACCAAGTTCCACGAGACGCGCCACCCGCTGTACCGGGGCGTT
CGGCGCCGTGGCCGGGTCGGGCAGTGGGTGTGCGAGGTGCGCGTGCGCGGCACCAAT
GAGACAAGGCTCTGGCTCGGCACCTTCCACACCGCCGAGATGGCGGCGCGAGCGCAC
GACTCCGCCTCGCTCGCTCTCTCCGGAAGCGCCGCCTGCCTCAACTTCGCCGACTCCG
CATGGCGGATGCTGCCCGTGCTTGCGGCCGGATCGTTCGGCTTCGGCAGCGCGCGGGA
GATCAAGCTTGCCGTCGCCGTTGCCGTCGTTGCGTTCCAGCAGCAGCAGATTATTCTTC
CAGTCGCGTGTCCAACGGTGGAGGCGGCCGCCAGCCCGAGCAACTCTCTGTTTTACAT
GTCGTCCGTCGACTTGCTGGAGCTCGACGAGGAGCAGTGGTTTGGCGGCATGGACGC
TGGGTCGTACTACGAGAGCTTGGCGCAGGGGATGCTCGTGGCGCCGCCGGACGACAG
AGCGAGGCGGGAGGACGCCGAGCAGACCGGCGTCGAGACACCGACGCCGTTATGGA
GCTATTTGTTTGACTAATTCAGCACGCAGTGTAAAGTTGTCGATAGTTGCGTTGTGTTCT
TCCCAATTTGGGAACGAACAGAGTAGGCAGTTTTTTTTT 
AGGTTGTAGTAGGCAG
TTTGAAGTTCCCGGTTTCTACTTTTGTGAGAAATGGACCCTAGATTGCTTATCGCAAAA
AAAAAAAAAAAAAA3’
以上序列中的阴影部分，分别为基因的起始密码子和终止密码子，下画线部分为编码区；
2、根据权利要求1所述的小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列，其特征在于该基因的编码区长717bp，编码多肽链的氨基酸序列为：
MSRVTGRCRGIPQSGRRGGPSSTRRATRCTGAFGAVAGSGSGCARCACAAPMRQGSGSAPSTPPRWRRE
RTTPPRSLSPEAPPASTSPTPHGGCCPCLRPDRSASAARGRSSLPSPLPSLRSSSSRLFFQSRVQRWRR
PPARATPSTCWSSTRSSGLAALCFTCRWTLGRTTRAWRRGCSWRRRTTERGGRTPSRPASRHRRRYGAI
CLTNSARSVKLSIVALCSSQFGNEQSRQFFF
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113718054A (zh) * | 2021-10-13 | 2021-11-30 | 湖北省农业科学院粮食作物研究所 | 一种大麦CBF4基因的Indel分子标记及其应用 |
| CN114634937A (zh) * | 2022-01-14 | 2022-06-17 | 安徽农业大学 | 一种促进不结球白菜开花的基因及其载体、重组菌和应用 |
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|---|---|---|---|---|
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| CN1472222A (zh) * | 2002-07-29 | 2004-02-04 | 清华大学 | 玉米dreb类转录因子及其编码基因与应用 |
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-
2005
- 2005-11-08 CN CNB2005100159536A patent/CN100344759C/zh not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| CN113718054A (zh) * | 2021-10-13 | 2021-11-30 | 湖北省农业科学院粮食作物研究所 | 一种大麦CBF4基因的Indel分子标记及其应用 |
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| CN114634937A (zh) * | 2022-01-14 | 2022-06-17 | 安徽农业大学 | 一种促进不结球白菜开花的基因及其载体、重组菌和应用 |
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