CN104136631A - 使用xpd解旋酶表征多核苷酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的表征目标多核苷酸的方法。所述方法利用孔和XPD解旋酶。所述解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动。

Description

使用XPD解旋酶表征多核苷酸的方法
技术领域
本发明涉及一种新的表征目标多核苷酸的方法。该方法使用孔及XPD解旋酶。解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的移动。
背景技术
当前需要一种适合于各种应用的快速且廉价的多核苷酸(例如DNA或RNA)测序和鉴定的技术。现有技术很慢并且昂贵，这主要是因为它们依赖于扩增技术来产生大量的多核苷酸并需要大量专门的荧光化学物质来检测信号。
当跨膜孔(纳米孔)具有极大的用作聚合物及多种小分子的直接的电生物传感器的潜力。特别是，最近关注的是将纳米孔作为潜在的DNA测序技术。
当跨纳米孔施加电势时，当分析物，如核苷酸，在桶内短暂停留一定时间段后，电流会发生变化。纳米孔检测核苷酸得到已知标志(signature)的电流变化和持续时间。在“链测序”(“Strand Sequencing”)方法中，使单个多核苷酸链穿过孔，得到对该核苷酸的鉴定。链测序可包括，使用核苷酸调控蛋白来控制多核苷酸穿过孔的运动。
发明内容
本发明已经证明了XPD解旋酶可控制多核苷酸穿过孔的运动，尤其是当对所述孔施加电势，例如电压时。解旋酶能够以可控和逐步的方式逆着或顺着由施加电压得到的场移动目标多核苷酸。出人意料的是，解旋酶能够在高盐浓度下起作用，所述高盐浓度对表征多核苷酸有利，特别是对使用链测序确定其序列有利。这将在下面更详细地讨论。
因此，本发明提供了一种表征目标多核苷酸的方法，包括：
(a)使目标多核苷酸与跨膜孔及XPD解旋酶接触，使得目标多核苷酸移动穿过所述跨膜孔，并使XPD解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动；和
(b)当所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔移动时，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
本发明还提供了：
-一种形成用于表征目标多核苷酸的传感器的方法，包括在孔和XPD解旋酶之间形成复合体并从而形成用于表征目标多核苷酸的传感器；
-XPD解旋酶在控制目标多核苷酸穿过孔的运动中的应用；
-一种表征目标多核苷酸的试剂盒，其包括(a)孔和(b)XPD解旋酶；和
-一种用于表征样本中目标多核苷酸的分析装置，包括多个孔和多个XPD解旋酶；
-一种表征目标多核苷酸的方法，包括：
(a)使目标多核苷酸与XPD解旋酶接触，使得XPD解旋酶控制所述目标多核苷酸的运动；和
(b)当XPD解旋酶控制所述目标多核苷酸的运动时，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并从而表征所述目标多核苷酸；
-XPD解旋酶在表征目标多核苷酸过程中控制目标多核苷酸的运动中的应用；
-XPD解旋酶在对目标多核苷酸的一部分或全部进行测序的过程中，控制目标多核苷酸的运动中的应用；
-一种用于表征样本中目标多核苷酸的分析装置，其特征在于其包括XPD解旋酶；和
-一种表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)用于表征所述目标多核苷酸的分析装置和(b)XPD解旋酶。
附图说明
图1A)为使用解旋酶控制DNA移动穿过纳米孔的实施例的示意图。反侧的箭头显示了DNA的运动方向。顺侧的箭头显示了解旋酶相对于DNA的运动方向。从左到右，具有含胆固醇标签的退火引物的单链DNA底物(图1B)被添加到双分子层的顺侧。胆固醇标签结合到双分子层，将所述底物富集在双分子层表面。添加到顺式隔室(cis compartment)的解旋酶结合到DNA。在二价金属离子和NTP底物存在时，解旋酶沿着DNA移动。在施加的电压下，所述DNA底物经DNA上的前导区部分被纳米孔捕获。在施加的电势的力的作用下，所述DNA被牵拉穿过所述纳米孔直到结合到DNA上的解旋酶与所述孔的顶部接触，防止进一步的不受控的DNA移位。所述解旋酶沿着所述DNA以5’到3’的方向运动，便于使螺旋状(threaded)DNA顺着施加的电场受控移位而穿过所述纳米孔。所述解旋酶促使DNA移位穿过纳米孔，使其进入反式隔室。穿过纳米孔的DNA的最后部分为3’端。当解旋酶已促使DNA穿过纳米孔的移位完成时，该解旋酶从该链上解离。图1B为在本实施例中使用的DNA底物设计之一。
图2显示了解旋酶能够以受控方式使DNA移动穿过纳米孔，随着DNA移动穿过纳米孔，电流发生逐步变化。示例解旋酶-DNA事件(140mV,400mM NaCl,Hepes pH8.0,0.6nM400mer DNA,100nM XPD Mbu,1mM DTT,1mM ATP,1mM MgCl2)。上部)为，获得的XPD400mer DNA事件穿过MspA B2纳米孔的电流对时间的分图。开孔电流为～95pA。在施加的电势(+140mV)的力的情况下，DNA被纳米孔捕获。连接有酶的DNA得到长的模块(block)(在该条件下，在～25pA)，随着酶使DNA移动穿过所述纳米孔，该模块显示出逐步变化的电流。下部)，该下分图显示了解旋酶控制DNA运动事件之一的放大图，示出了DNA-酶的捕获、当DNA被牵拉出所述纳米孔时电流的逐步变化。
图3显示了解旋酶控制DNA运动事件的另一个例子。下部)为，所述事件的一部分的放大图，示出了当DNA链不同部分移动穿过纳米孔时电流的逐步变化。
图4显示了解旋酶至少以两种操作模式控制DNA的移动。解旋酶沿着DNA的5’到3’的方向运动，而DNA在纳米孔中的定向(取决于该DNA的哪一端被捕获)是指，所述酶能用于将DNA逆着施加的电场移出所述纳米孔，或者将DNA顺着该施加的电场移入所述纳米孔。左图)为，当DNA的3’端被捕获时，解旋酶逆着电压所施加的电场的方向起作用，将螺旋状DNA牵拉出纳米孔，并进入顺式隔室中。右图)为，当DNA的5’端(5’-down)向下被捕获到纳米孔中时，解旋酶沿着电场的方向将DNA移动到纳米孔中，并进入到双分子层的反侧。
图5显示了测试酶活性的荧光试验。A)使用常规的荧光底物来检测解旋酶用于置换(displace)杂交的双链DNA的能力。1)荧光底物链(50nM终浓度)具有5’单链DNA悬突，以及杂交的双链DNA的40个碱基部分。主链上部(major upper strand)在3’末端具有羧基荧光素碱基，并且所述杂交的互补链在5’末端具有黑洞淬灭剂(black-hole quencher(BHQ-1))碱基。当杂交时，荧光素的荧光被局部的BHQ-1淬灭，并且底物基本上是无荧光的。该试验中包括与荧光底物的较短链互补的1μM捕获链。2)在ATP(1mM)和MgCl2(10mM)的存在下，添加到底物的解旋酶(150nM)结合至荧光底物的5′尾部，沿着主链移动，并如所示置换互补链。3)具有BHQ-1的互补链完全被置换，主链上荧光素发荧光。4)过量的捕获链优选与互补链DNA退火以防止初始底物重新退火并防止丢失荧光。B)显示了在含有100mM至2M的不同浓度的KCl的缓冲溶液(100mM Hepes pH 8.0,1mM ATP,10mM MgCl2,50nM荧光底物DNA,1μM捕获DNA)中的Mbu XPD解旋酶活性的初始速率的图。
图6为实施例1中所用的垫片(spacer)iSp18的结构。
序列表的说明
SEQ ID NO:1示出了密码子优化的、编码MS-B1突变MspA单体的多核苷酸序列。该突变缺少信号序列并包括下列突变:D90N,D91N,D93N,D118R,D134R和E139K。
SEQ ID NO:2示出了MspA单体的MS-B1突变的成熟形式的氨基酸序列。该突变缺少信号序列并包括下列突变:D90N,D91N,D93N,D118R,D134R和E139K。
SEQ ID NO:3示出了编码α-溶血素-E111N/K147N(α-HL-NN；Stoddart etal.,PNAS,2009；106(19):7702-7707)的一个亚基的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:4示出了α-HL-NN的一个亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5至7示出了MspB、C和D的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8和9示出了XPD模序(motif)V和VI的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10至62示出了表5中XPD解旋酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:63至68示出了各实施例中使用的序列。
具体实施方案
应理解的是，公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的具体需求进行调整。还应理解的是，本文中使用的术语仅仅是为了描述本发明的具体实施方案，不意欲进行限制。
另外，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式的“一个”、“所述”包括复数指代物，除非文中另有明确说明。因此，例如，涉及“一个孔”时包括两个或多个这样的孔，涉及“一个解旋酶”时包括包括两个或多个这样的解旋酶，涉及“一个多核苷酸”时包括两个或多个多这样的多核苷酸，等。
所有在本文中引用的出版物、专利和专利申请，无论前文或后文，均以全文参考的方式纳入本文中。
本发明的方法
本发明提供了一种表征目标多核苷酸的方法。所述方法包括使目标多核苷酸与跨膜孔和XPD解旋酶接触，使得目标多核苷酸移动穿过孔，并使XPD解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动。然后当目标多核苷酸相对于孔移动时，使用本领域已知的标准方法测量该目标多核苷酸的一个或多个特征。所述目标多核苷酸的一个或多个特征优选在该多核苷酸移动穿过所述孔时进行测量。步骤(a)和(b)优选通过跨所述孔施加电势而实施。如下文更详细的论述，施加电势通常导致在所述孔和解旋酶之间形成复合体。所施加的电势可以是电压电势。替代地，所施加的电势可以是化学电势。其一个例子是在跨两性分子层中使用盐梯度。Holden等人,J Am Chem Soc.2007Jul11；129(27):8650-5中公开了盐梯度。
在一些情形中，当多核苷酸相对于所述孔而移动时，使用穿过所述孔的电流来确定目标多核苷酸的序列。这就是链测序。
所述方法具有多个优势。首先，本发明人出乎意料地发现XPD解旋酶具有出乎意料的高的盐耐受性，因此本发明方法可以在高的盐浓度下实施。在链测序中，电荷载体，诸如盐，是产生导电溶液必须的，所述导电溶液用于施加补偿电压以捕获和异位目标多核苷酸以及当目标多核苷酸相对于孔移动时测定产生的序列依赖性电流变化。由于测量信号依赖于盐浓度，因此有利的是使用高的盐浓度以提高获得信号的强度。高的盐浓度提供了高信噪比，并使得在正常电流波动的背景下，代表核苷酸存在的电流能被识别。对于链测序，超过100mM的盐浓度是理想的，例如超过400mM,600mM或800mM的盐浓度。本发明人出乎意料地发现XPD解旋酶能在极高的盐浓度下有效发挥作用，例如1M的盐浓度下。本发明包括在超过1M的盐浓度下，例如2M盐浓度下有效发挥作用的解旋酶。
第二，当施加电压时，XPD解旋酶能出乎意料地朝两个方向，即逆着或顺着由施加的电压产生的电场而移动目标多核苷酸。因此，本发明的方法可以一种或两种优选方式实施。根据目标多核苷酸相对所述孔移动的方向，即顺着或逆着电场的方向，获得不同的信号。下面将对这进行更详细地论述。
第三，XPD解旋酶通常每次移动目标多核苷酸中的一个核苷酸穿过所述孔。XPD解旋酶由此能起到类似单碱基棘齿(ratchet)的作用。当然，这在测序目标多核苷酸时是有利的，因为使用所述孔可以鉴定目标多核苷酸中的基本全部的——如果不是全部的话——核苷酸。
第四，XPD解旋酶能够控制单链多核苷酸和双链多核苷酸的移动。这意味着根据本发明能够表征多种不同的目标多核苷酸。
第五，XPD解旋酶对施加的电压产生的电场表现出极大的耐受性。本发明人发现在“解链”(“unzipping”)状态下多核苷酸几乎不发生移动。解链状态通常是在缺乏核苷酸，例如缺乏ATP时候出现。当所述解旋酶在解链模式下操作时，其作用类似闸，防止目标序列在所施加电压的影响下太快地移动穿过所述孔。这是很重要的，因为这意味着，当逆着所施加电压产生的电场移动多核苷酸时，不会发生由不希望的“向后”移动而产生的问题。
第六，XPD解旋酶容易制备和容易操控。因此它们适合用于直接且便宜的测序方法。
本发明方法是用于表征目标多核苷酸。多核苷酸，例如核酸，是一种含有两个或多个核苷酸的大分子。所述多核苷酸或核酸可以包含任何核苷酸的任何组合。所述核苷酸可以是天然存在的或人工合成的。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被氧化或甲基化。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被破坏。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被修饰，例如使用标记或标签。所述目标核苷酸可以包括一个或多个间隔物。
核苷酸通常含有核碱基、糖和至少一个磷酸基团。核苷碱基通常是杂环的。核碱基包括，但不限于，嘌呤和嘧啶，以及更具体地，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶。所述糖通常为戊糖。核苷酸糖包括，但不限于，核糖和脱氧核糖。所述核苷酸通常为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述核苷酸通常含有单磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸可以连接在核苷酸的5’或3’端。
核苷酸包括，但不限于，腺苷单磷酸(AMP)、鸟苷单磷酸(GMP)、胸苷单磷酸(TMP)、尿苷单磷酸(UMP)、胞苷单磷酸(CMP)、环状腺苷单磷酸(cAMP),环状鸟苷单磷酸(cGMP)、脱氧腺苷单磷酸(dAMP)、脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)、脱氧胸苷单磷酸(dTMP)、脱氧尿苷单磷酸(dUMP)和脱氧胞苷单磷酸(dCMP)。所述核苷酸优选选自AMP,TMP,GMP,CMP,UMP,dAMP,dTMP,dGMP或dCMP。
核苷酸可以是脱碱基的(即缺少核碱基)。
所述多核苷酸可以是单链或双链的。至少多核苷酸的一部分优选是双链的。
所述多核苷酸可以是核酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。所述目标多核苷酸可包括与一条DNA链杂交的一条RNA链。所述多核苷酸可以是本领域已知的任何人造核酸，诸如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(locked nucleic acid，LNA)，或其他具有核苷酸侧链的合成聚合物。
目标多核苷酸的整体或仅部分可以使用该方法表征。所述目标多核苷酸可具有任何长度。例如，所述目标多核苷酸可以具有至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少400或至少500个核苷酸对的长度。所述目标多核苷酸可以具有1000或更多核苷酸对、5000或更多核苷酸对的长度或100000或更多核苷酸对的长度。
目标多核苷酸存在于任何合适的样本中。本发明通常针对已知含有或怀疑含有目标多核苷酸的样本而实施。替代地，对样本实施本发明可以是为了确认一个或多个目标多核苷酸的同一性，所述目标多核苷酸已知或预期存在于所述样本中。
所述样本可以是生物样本。本发明可以针对由任何有机体或微生物体获得或提取的样本在体外实施。所述有机体或微生物体通常是古核的(archaean)、原核的或真核的，并通常属于以下五界之一：植物界、动物界、真菌界、无核原生物界和原生生物界。本发明可以针对由任何病毒获得或提取的样本在体外实施。所述样本优选为液体样本。所述样本通常包括患者的体液。所述样本可以是尿液、淋巴液、唾液、粘液或羊水，但优选为血液、血浆或血清。通常，所述样本来自人，但替代地，其可以是来自其他哺乳动物，例如来自商购的家畜，如马、牛、羊或猪，或可替代地，为宠物，如猫或狗。替代地，源自植物的样本通常获得自经济作物，例如谷类、豆类、水果或蔬菜，如小麦、大卖、燕麦、油菜、玉米、大豆、稻、香蕉、苹果、西红柿、马铃薯、葡萄、烟草、黄豆、扁豆、甘蔗、可可、棉花。
所述样本可以是非生物样本。所述非生物样本优选为液体样本。所述非生物样本的实例包括外科手术液体、水，例如饮用水、海水或河水，以及用于实验室测试的试剂。
通常在分析前对所述样本进行处理，例如，通过离心或通过膜过滤掉不需要的分子或细胞，诸如红血细胞。所述样本可以在获取后立即进行检测。所述样本通常也可以在分析前储存，优选在低于-70℃储存。
跨膜孔是一种能在一定程度上跨膜的结构。其能使离子，例如水合离子，在被施加的电势驱动下而流经所述膜或在所述膜内中流动。跨膜孔通常跨整个膜，使得离子可以从膜的一侧流到膜的另一侧。但是，跨膜孔不一定必须跨所述膜。其可以是一端封闭的。例如，所述孔可以是可使离子流经或流入的膜中的一个孔。
本发明可使用任何膜。合适的膜是本领域已知的。所述膜优选为两性分子层。两性分子层是一种由具有至少一个亲水性部分和至少一个亲脂性或疏水性部分的两性分子，例如磷脂，形成的层。所述两性分子层可以是单分子层或双分子层。两性分子层通常为平面脂质双分子层或支撑双分子层。
所述两性分子层通常为脂质双分子层。脂质双分子层是细胞膜的模型并被用作多种实验研究的优良平台。例如，脂质双分子层能被用于通过单通道记录在体外研究膜蛋白。替代地，脂质双分子层可以用作生物传感器，以检测多种物质的存在。所述脂质双分子层可以是任何的脂质双分子层。合适的脂质双分子层包括但不限于，平面脂质双分子层、支撑双分子层或脂质体。所述脂质双分子层优选为平面脂质双分子层。合适的脂质双分子层在国际申请号PCT/GB08/000563(公布号WO2008/102121)、国际申请号PCT/GB08/004127(公布号WO2009/077734)和国际申请号PCT/GB2006/001057(公布号WO2006/100484)中有公开。
形成脂质双分子层的方法是本领域已知的。合适的方法公开在实施例中。脂质双分子层通常通过Montal和Mueller(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1972；69:3561-3566)的方法形成，其中脂质单分子层穿过孔的任一侧负载在水溶液/空气界面上，所述孔垂直于所述界面。
所述Montal & Mueller的方法被普遍应用，因为其成本经济并是一种相对直接的用于形成适合蛋白质孔嵌入(protein pore insertion)的质量良好的脂质双分子层的方法。其他常用的形成双分子层的方法包括脂质体双分子层的尖端浸渍(tip-dipping)、涂覆双分子层(painting bilayers)和膜片钳(patch-clamping)方法。
在一个优选实施方案中，所述脂质双分子层如国际申请号PCT/GB08/004127(公布号WO2009/077734)中所述而形成。
在另一个优选实施方案中，所述膜为固态层。固态层不来源于生物体。换言之，固态层不是由生物环境获得或分离出的，所述生物环境诸如有机体或细胞，或是生物学可获得的结构的合成制备产物(synthetically manufacturedversion)。固态层可以由有机和无机材料形成，所述有机和无机材料包括但不限于，微电子材料、绝缘材料，如Si3N4、A12O3和SiO，有机和无机聚合物，如聚酰胺、塑料，如或弹性体，如双组分加成固化硅橡胶，以及玻璃。所述固态层可以由单原子层形成，如石墨烯，或者只有几个原子厚的层形成。适合的石墨烯层在国际申请号PCT/US2008/010637(公布号WO2009/035647)中有公开。
所述方法通常使用以下物质而实施：(i)含有孔的人工两性分子层，(ii)分离出的天然存在的含有孔的脂质双分子层，或(iii)含有孔嵌入其中的细胞。所述方法通常使用人工两性分子层，诸如人工脂质双分子层而实施。所述层除孔之外还可以含有其他跨膜和/或膜内蛋白以及其他分子。适合的设备和条件如下所述。本发明的方法通常在体外实施。
所述多核苷酸可以偶联到所述膜。这可使用任何已知方法完成。如果所述膜是两性分子层，如脂质双分子层(如上文详细描述的)，则所述多核苷酸优选通过存在于所述膜中的多肽或存在于所述膜中的疏水锚(anchor)偶联到所述膜。所述疏水锚优选为脂质、脂肪酸、固醇、碳纳米管或氨基酸。
所述多核苷酸可以直接偶联到所述膜。所述多核苷酸优选通过连接体(linker)偶联到所述膜。优选的连接体包括但不限于，聚合物如多核苷酸，聚乙二醇(PEG)和多肽。如果多核苷酸直接偶联到所述膜，则由于所述膜与所述解旋酶之间的距离，表征不能持续进行到所述多核苷酸的末端，因此将丢失一些数据。如果使用连接体，则所述多核苷酸能够被表征完全。如果使用连接体，则连接体可以在任何位置连接到所述多核苷酸。所述连接体优选在尾部聚合物连接到所述多核苷酸。
所述偶联可以是稳定的或暂时的。对于某些应用，暂时性的偶联是优选的。如果稳定偶联的分子直接连接到多核苷酸的5’或3’端，则由于所述双分子层与所述解旋酶的活性位点之间的距离，表征不能持续进行到所述多核苷酸的末端，因此将丢失一些数据。如果所述偶联是暂时性的，则当偶联的末端随机地变为双分子层的自由端时，所述多核苷酸能被表征完全。与膜形成稳定或暂时性的连接的化学基团在下面更详细的描述。所述多核苷酸可以使用胆固醇或脂肪酰链暂时性地偶联到两性分子层，例如脂质双分子层。可以使用具有6-30个碳原子长度的任何脂肪酰链，例如十六烷酸。
在优选实施方案中，将多核苷酸偶联到两性分子层。多核苷酸与合成的脂质双分子层的偶联已预先用多种不同的拴系策略(tethering strategies)实施。这些策略概述于下表1中。
表1
多核苷酸可以在合成反应中使用经修饰的亚磷酰胺官能化，使其能容易的与反应基团的加成兼容，所述反应基团诸如硫醇、胆固醇、脂质和生物素基团。这些不同的连接化学成分为多核苷酸提供了一系列连接选择。每个不同的修饰基团以稍微不同的方式栓系所述多核苷酸并且所述偶联不总是永久性的，从而使得多核苷酸到所述双分子层有不同的停留时间。暂时性偶联的优点如上所述。
多核苷酸的偶联还能通过很多其他手段实现，只要反应性基团能够被添加到所述多核苷酸。之前已经报道了，将反应性基团添加到DNA的任一端。可以使用多核苷酸激酶和ATPγS在单链DNA的5’端添加硫醇基团(Grant,G.P.和P.Z.Qin(2007)."A facile method for attaching nitroxide spinlabels at the5′terminus of nucleic acids."Nucleic Acids Res35(10):e77)。可以使用末端转移酶添加多种不同选择的化学基团，如生物素、硫醇和荧光团，以将经修饰的寡核苷酸添加到单链DNA的3’端(Kumar,A.,P.Tchen,等人(1988)."Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminaldeoxynucleotidyl transferase."Anal Biochem169(2):376-82)。
替代地，反应性基团可以被认为是DNA短片段互补性添加到已经偶联至所述双分子层的DNA短片段，使得所述连接可以通过杂交实现。据报道，单链DNA的短片段的连接是使用T4RNA连接酶I(Troutt,A.B.,M.G.McHeyzer-Williams,等人(1992)."Ligation-anchored PCR:a simpleamplification technique with single-sided specificity."Proc Natl Acad Sci U S A89(20):9823-5)。替代地，单链DNA或双链DNA可以连接到天然双链DNA，然后通过加热变性或化学变性分开这两条链。对于天然双链DNA，可以向该双链的一个或两个末端添加一段单链DNA或双链DNA。然后当双链被解链(melted)时，如果使用单链DNA进行连接，则每条单链将具有5’端或3’端修饰，或者，如果使用双链DNA进行连接，则每条单链将具有5’端修饰、3’端修饰、或这两端修饰。如果多核苷酸是合成链，所述偶联化学成分能在该多核苷酸的化学合成过程中引入。例如，所述多核苷酸能使用具有反应性基团连接其上的引物来合成。
一种常规的用于扩增基因组DNA片段的技术是使用聚合酶链反应(PCR)。这里，使用两个合成的寡核苷酸引物，可生成相同DNA片段的大量拷贝，其中对于每个拷贝，双链的每条链的5’将是一个合成的多核苷酸。通过使用具有反应性基团例如胆固醇、硫醇、生物素或脂质的反义引物，扩增的目标DNA的每个拷贝将含有用于偶联的反应性基团。
跨膜孔优选为跨膜蛋白孔。跨膜蛋白孔是在一定程度上跨膜的蛋白质结构。其允许在被施加的电势驱动下离子流经所述膜或在所述膜内流动。跨膜蛋白孔通常为多肽或多个多肽的组合，其允许离子，例如分析物，从膜的一侧流到膜的另一侧。但是，跨膜蛋白孔不一定必须跨所述膜。其可以是一端封闭的。例如，所述跨膜孔可以在膜中形成可使离子流经或流入的孔。所述跨膜蛋白孔优选允许分析物，例如核苷酸，流经膜或在膜内流动，所述膜例如脂质双分子层。所述跨膜蛋白孔能使多核苷酸，如DNA或RNA，移动穿过所述孔。
所述跨膜蛋白孔可以是单体或寡聚物。所述孔优选由多个重复亚基，如6、7或8个亚基构成。所述孔优选为六聚体、七聚体、八聚体或九聚体的孔。
所述跨膜蛋白孔通常含有可使离子流经的桶状结构或通道。所述孔的亚基通常围绕一中心轴并为跨膜β桶状结构或通道或跨膜α-螺旋束或通道贡献链。
所述跨膜蛋白孔的桶状结构或通道通常含有能促进与分析物的相互作用的氨基酸，所述分析物例如核苷酸、多核苷酸或核酸。这些氨基酸优选位于所述桶状结构或通道的缢痕(constriction)附近。所述跨膜蛋白孔通常包含一个或多个带正电荷的氨基酸，如精氨酸、赖氨酸或组氨酸，或芳香族氨基酸，如酪氨酸或色氨酸。这些氨基酸通常促进所述孔与核苷酸、多核苷酸或核酸之间的相互作用。
在本发明中使用的跨膜蛋白孔可源自β-桶状孔或α-螺旋束孔。β-桶状孔包括由β-链形成的桶状结构或通道。合适的β-桶状孔包括但不限于，β-毒素，如α-溶血素、炭疽毒素和杀白细胞素，以及细菌的外膜蛋白/孔蛋白，所述细菌如耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白(Msp)，例如MspA，外膜孔蛋白F(OmpF)、外膜孔蛋白G(OmpG)、外膜磷酯酶A和奈瑟氏菌(Neisseria)自转运脂蛋白(NalP)。α-螺旋束孔包括由α-螺旋形成的桶状结构或通道。合适的α-螺旋束孔包括但不限于，内膜蛋白和α外膜蛋白，如WZA和ClyA毒素。跨膜孔可以源自Msp或源自α-溶血素(α-HL)。
所述跨膜蛋白孔优选源自Msp，优选源自MspA。这类孔将是寡聚物孔并通常包括7、8、9或10个源自Msp的单体。所述孔可以是源自含相同单体的Msp的同源寡聚物孔。替代地，所述孔可以是源自含有至少一个不同于其他的单体的Msp的异源寡聚物孔。优选所述孔源自MspA或其同源物或旁系同源物(paralog)。
源自Msp的单体含有SEQ ID NO:2中所示序列或其变体。SEQ ID NO:2是MspA单体的MS-(B1)8突变体。其包括以下突变:D90N、D91N、D93N、D118R、D134R和E139K。SEQ ID NO:2的变体是具有由SEQ IDNO:2的氨基酸序列变化而来并保留有其形成孔的能力的氨基酸序列的多肽。所述变体形成孔的能力可使用本领域任何已知方法检测。例如，所述变体可以与其他适合的亚基一起插入两性分子层中，并且其寡聚形成孔的能力可以被检测。本领域中将亚基插入膜，如两性分子层的方法是已知的。例如，亚基可以纯化的形式悬浮在含有脂质双分子层的溶液中，使得亚基扩散到脂质双分子层，并通过结合到所述脂质双分子层和装配成为功能状态而插入。替代地，亚基可以使用M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005,127,6502-6503和国际申请号PCT/GB2006/001057(公布号WO2006/100484)中描述的“拾取与放置(pick and place)”方法而直接插入所述膜中。
在SEQ ID NO:2的氨基酸序列的整个长度上，基于氨基酸同一性，变体优选与该序列具有至少50％的同一性。更优选地，基于氨基酸同一性，所述变体相比于SEQ ID NO:2的氨基酸序列，在整个序列上，可具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％并且更优选至少95％、97％或99％的同一性。在100或更长，例如125、150、175或200或更长的长度上，可具有至少80％，例如至少85％、90％或95％的氨基酸同一性，即连续的氨基酸(“严格同一性”)。
可使用本领域的标准方法测定同一性。例如UWGCG包提供了BESTFIT程序，其能用于计算同一性，例如使用其默认设置(Devereux等人(1984)Nucleic Acids Research12,p387-395)。PILEUP和BLAST算法可以用于计算同一性或比对序列(line up sequence)(例如鉴定等价残基或对应的序列(通常根据其默认设置))，例如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol36:290-300；Altschul,S.F et al(1990)J Mol Biol215:403-10中所描述的。用于执行BLAST分析的软件可通过National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)而公开获得。
SEQ ID NO:2是MspA单体的MS-(B1)8突变体。相比于MspA，所述变体可以含有MspB,C或D单体的突变中的任一个。成熟形式的MspB,C和D示于SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:7。特别是，所述变体可以包含存在于MspB中的以下置换：A138P。所述变体可以包括存在于MspC中的以下置换中的一个或多个:A96G,N102E和A138P。所述变体可以包括存在于MspD中的以下突变中的一个或多个：G1,L2V,E5Q,L8V,D13G,W21A,D22E,K47T,I49H,I68V,D91G,A96Q,N102D,S103T,V104I,S136K和G141A的缺失。所述变体可以包括一个或多个来自于Msp B,C和D的突变和置换的组合。所述变体优选含有突变L88N。SEQ ID NO:2的变体除了MS-B1的所有突变之外还具有突变L88N，被称为MS-B2。在本发明中使用的孔优选为MS-(B2)8。
除了以上所论述的之外，氨基酸的置换还可以发生在SEQ ID NO:2的氨基酸序列上，例如高达1,2,3,4,5,10,20或30个置换。保守置换使用其他相似化学结构、相似化学性质或相似侧链体积的氨基酸来置换氨基酸。引入的氨基酸可具有与被置换的氨基酸相似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性和电荷。替代地，所述保守置换可以引入芳香族或脂肪族的其他氨基酸，替代之前存在的芳香族或脂肪族氨基酸。保守氨基酸的改变是本领域已知的，并可以根据下表2中定义的20个主要氨基酸的性质进行选择。其中，各氨基酸具有相似的极性，这也可以参考表3的氨基酸侧链亲水性大小来确定。
表2–氨基酸的化学性质
表3-亲水性大小
另外，SEQ ID NO:2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基可以从上述多肽中缺失。可以缺失多达1,2,3,4,5,10,20或30或更多个残基。
所述变体可以包括SEQ ID NO:2的片段。这类片段保留有形成孔的活性。所述片段可以至少为50、100、150或200个氨基酸长度。这类片段可用于产生孔。片段优选包括SEQ ID NO:2的形成孔的结构域。各片段必须含有SEQ ID NO:2的88,90,91,105,118和134残基中一个。通常，各片段含有SEQ ID NO:2的88,90,91,105,118和134残基的全部。
一个或多个氨基酸可以替代地或另外地添加到上述的多肽。可以在SEQID NO:2或其多肽变体或其片段的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端提供一延伸。所述延伸可以是非常短的例如1-10个氨基酸长度。替代地，所述延伸可以更长，例如多达50或100个氨基酸长度。载体蛋白可以融合到本发明的氨基酸序列。其他融合蛋白在下面进行更详细论述。
如上所述，变体是具有由SEQ ID NO:2的氨基酸序列变化而来并保留有其形成孔的能力的氨基酸序列的多肽。变体通常含有SEQ ID NO:2的用于形成孔的区域。含有β-桶状结构的Msp的孔形成能力是由每个亚基中的β-片层(β-sheet)提供的。SEQ ID NO:2的变体通常包括SEQ ID NO:2中形成β-片层的区域。可以在SEQ ID NO:2中形成β-片层的区域进行一个或多个修饰，只要获得的变体保留有其形成孔的能力即可。SEQ ID NO:2的变体优选在其α-螺旋和/或环形区域中包括一个或多个修饰，诸如置换、添加或缺失。
源自Msp的单体可以被修饰以有助于它们的鉴定或纯化，所述修饰例如通过下述进行：通过添加组氨酸残基(hist标签)、天冬氨酸残基(asp标签)、链霉亲和素标签或flag标签，或通过添加信号序列来促进它们从细胞的分泌——当多肽并不天然含有该序列时。引入遗传标签的替换方案是通过化学反应将标签连接到所述孔上的天然或工程位点。其一个例子为将凝胶迁移试剂与工程连接在所述孔外部的半胱氨酸进行反应。这被证明是一种用于分离溶血素异源寡聚体的方法(Chem Biol.1997Jul；4(7):497-505)。
源自Msp的单体可以用显示标记物(revealing label)标记。所述显示标记物可以是允许对孔进行检测的任何适宜标记物。适宜标记物包括但不限于，荧光分子、放射性同位素，如125I、35S、酶、抗体、抗原、多核苷酸和配体，如生物素。
源自Msp的单体也可以使用D-氨基酸制备。例如，源自Msp的单体可以含有L-氨基酸和D-氨基酸的混合物。这是本领域制备这类蛋白质或肽的常规方式。
源自Msp的单体含有一个或多个特异性修饰，以促进对核苷酸的辨别。源自Msp的单体也可以含有其他非特异性修饰，只要它们不影响孔的形成。很多非特异性侧链修饰是本领域已知的，并可以针对源自Msp的单体的侧链进行。这类修饰包括，例如，通过与醛进行反应然后用NaBH4还原而进行的氨基酸的还原性烷基化，用甲基乙酰亚胺酯(methylacetimidate)进行的脒基化，或用乙酸酐进行的酰化。
源自Msp的单体可以使用本领域已知的标准方法制备。所述源自Msp的单体可以合成或通过重组的方式制备。例如，所述孔可以通过体外翻译和转录(IVTT)进行合成。用于制备孔的适宜方法在国际申请号PCT/GB09/001690(公布号WO 2010/004273)、PCT/GB09/001679(公布号WO 2010/004265)或PCT/GB10/000133(公布号WO 2010/086603)中有论述。对将孔插入膜中的方法进行了论述。
所述跨膜蛋白孔还优选源自α-溶血素(α-HL)。野生型α-HL孔由7个相同单体或亚基形成(即其是七聚体类型的)。α-溶血素-NN的一个单体或亚基的序列示于SEQ ID NO:4中。所述跨膜蛋白孔优选包含7个单体，每个单体含有SEQ ID NO:4所示的序列或其变体。SEQ ID NO:4的1,7至21,31至34,45至51,63至66,72,92至97,104至111,124至136,149至153,160至164,173至206,210至213,217,218,223至228,236至242,262至265,272至274,287至290和294位氨基酸形成环形区域。SEQ ID NO:4的残基113和147形成α-HL的桶状结构或通道的缢痕部分。
在本发明的方法中，在这类实施方案中，优选使用包括7个蛋白质或单体的孔，且每个孔包括SEQ ID NO:4所示的序列或其变体。所述7个蛋白质可以相同(同源七聚体)或不同(异源七聚体)。
SEQ ID NO:4的变体是具有从SEQ ID NO:4的氨基酸序列变化而来并保留有其形成孔的能力的氨基酸序列的蛋白质。变体形成孔的能力可以使用本领域任何已知方法检测。例如，所述变体可以与其他适合的亚基一起插入两性分子层诸如脂质双分子层中，并且其寡聚形成孔的能力可以被检测。将亚基插入两性分子层，如脂质双分子层的方法是本领域已知的。合适的方法如上文所述。
所述变体可以包括促进与解旋酶共价连接或相互作用的修饰。所述变体优选含有一个或多个反应性的半胱氨酸残基，所述残基能促进与解旋酶的连接。例如，所述变体可以在8,9,17,18,19,44,45,50,51,237,239和287位中的一个或多个处和/或在SEQ ID NO:4的氨基或羧基末端上含有半胱氨酸。优选的变体包括用半胱氨酸(A8C,T9C,N17C,K237C,S239C或E287C)置换在SEQ ID NO:4的8,9,17,237,239和287位的残基。所述变体优选为国际申请号PCT/GB09/001690(公布号WO2010/004273)、PCT/GB09/001679(公布号WO2010/004265)或PCT/GB10/000133(公布号WO2010/086603)中描述的变体中的任一个。
所述变体也可以包括能促进与核苷酸的任何相互作用的修饰。
所述变体可以是天然存在的变体，该天然存在的变体由有机体例如葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌天然表达。替代地，所述变体可以在体外表达或通过诸如大肠杆菌(Escherichia coli)的细菌重组表达。变体还包括非天然存在的由重组技术获得的变体。在SEQ ID NO:4的氨基酸序列的整个长度上，基于氨基酸的同一性，变体优选与所述序列具有至少50％的同源性。更优选地，基于氨基酸的同一性，变体多肽与SEQ ID NO:4的氨基酸序列，在整个序列上，可具有至少55％,至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％且更优选至少95％,97％或99％的同一性。在200或更长,例如230,250,270或280或更长的长度上，可以具有至少80％，例如至少85％,90％或95％的氨基酸同一性，即连续的氨基酸(“严格同一性”)。同一性可如上所述进行测定。
除了如上所述的，可以对SEQ ID NO:4的氨基酸序列进行氨基酸置换，例如多达1,2,3,4,5,10,20或30个置换。可以如上所述进行保守置换。
SEQ ID NO:4的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基可以另外从上述多肽中缺失。可以缺失多达1,2,3,4,5,10,20或30或更多个残基。
变体可以是SEQ ID NO:4的片段。该片段保留有形成孔的活性。所述片段可以具有至少50,100,200或250个氨基酸长度。该片段优选包括SEQID NO:4的形成孔的结构域。各片段通常包括SEQ ID NO:4的119,121,135，113和139位残基。
一个或多个氨基酸可以替代地或另外地添加到上述多肽。可以在SEQID NO:4或其变体或片段的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端提供一个延伸。所述延伸可以是非常短的例如1-10个氨基酸长度。替代地，所述延伸可以更长，例如长达50或100个氨基酸。载体蛋白可以融合到孔或其变体。
如上所述，SEQ ID NO:4的变体为具有从SEQ ID NO:4的氨基酸序列变化而来并且保留有其形成孔的能力的氨基酸序列的亚基。变体通常含有SEQ ID NO:4的用于形成孔的区域。含有β-桶状结构的α-HL的孔形成能力由每个亚基中的β-链提供。SEQ ID NO:4的变体通常含有SEQ ID NO:4中形成β-链的区域。形成β-链的SEQ ID NO:4的氨基酸如上所述。在SEQ IDNO:4的形成β-链的区域可以进行一个或多个修饰，只要得到的变体保留其形成孔的能力。可以如上所述对SEQ ID NO:4的β-链区域进行的特异性修饰。
SEQ ID NO:4的变体优选在其α-螺旋和/或环形区域中包括一个或多个修饰，如置换、添加或缺失。形成α-螺旋和环的氨基酸如上所述。
所述变体可以进行修饰以帮助对其进行如上所述的鉴定或纯化。
源自α-HL的孔可以如上所述参考由Msp获得孔进行制备。
在一些实施方案中，对所述跨膜蛋白孔进行化学修饰。所述孔可以在任何位点以任何方式进行化学修饰。所述跨膜蛋白孔优选通过下述进行化学修饰：将分子连接到一个或多个半胱氨酸(半胱氨酸连接)、将分子连接到一个或多个赖氨酸、将分子连接到一个或多个非天然氨基酸、表位的酶修饰或末端修饰。适于进行这些修饰的方法是本领域已知的。所述跨膜蛋白孔可以通过任何分子的连接而进行化学修饰。例如，所述孔可通过连接染料或荧光团而进行化学修饰。
孔中任意数目的单体都可以进行化学修饰。优选按如上所述对一个或多个，如2,3,4,5,6,7,8,9或10个所述单体进行化学修饰。
半胱氨酸残基的反应性可以通过对相邻残基的修饰而提高。例如，侧翼精氨酸、组氨酸或赖氨酸残基的碱性基团将使半胱氨酸硫醇基团的pKa变成更大反应性的S-基团的pKa。半胱氨酸残基的反应性可以通过硫醇保护基团，如dTNB来保护。这些半胱氨酸残基可以在连接体连接之前与孔的一个或多个半胱氨酸残基反应。
所述分子(用其对孔进行化学修饰)可以直接连接到所述孔或通过连接体连接到所述孔，如国际申请号PCT/GB09/001690(公布号WO2010/004273)、PCT/GB09/001679(公布号WO2010/004265)或PCT/GB10/000133(公布号WO2010/086603)中所公开。
根据本发明可以使用任何XPD解旋酶。XPD解旋酶也称为Rad3解旋酶，这这两个术语可以互换使用。
XPD解旋酶的结构是本领域已知的(Cell.2008May30；133(5):801-12.Structure of the DNA repair helicase XPD.Liu H,Rudolf J,Johnson KA,McMahon SA,Oke M,Carter L,McRobbie AM,Brown SE,Naismith JH,WhiteMF)。XPD解旋酶通常含有氨基酸模序X1-X2-X3-G-X4-X5-X6-E-G(下文称为XPD模序V；SEQ ID NO:8)。X1,X2,X5和X6独立地选自除D,E,K和R之外的任意氨基酸。X1,X2,X5和X6独立地选自G,P,A,V,L,I,M,C,F,Y,W,H,Q,N,S和T。X1,X2,X5和X6优选不带电。X1,X2,X5和X6优选不为H。X1更优选为V,L,I,S或Y。X5更优选为V,L,I,N或F。X6更优选为S或A。X3和X4可为任意氨基酸残基。X4优选为K,R或T。
所述XPD解旋酶通常含有氨基酸模序Q-Xa-Xb-G-R-Xc-Xd-R-(Xe)3-Xf-(Xg)7-D-Xh-R(下文称为XPD模序VI；SEQ ID NO:9)。Xa,Xe和Xg可为任意氨基酸残基。Xb,Xc和Xd独立地选自除D,E,K和R之外的任意氨基酸。Xb,Xc和Xd通常独立地选自G,P,A,V,L,I,M,C,F,Y,W,H,Q,N,S和T。Xb,Xc和Xd优选不带电。Xb,Xc和Xd优选不为H。Xb更优选为V,A,L,I或M。Xc更优选为V,A,L,I,M或C。Xd更优选为I,H,L,F,M或V。Xf可为D或E。(Xg)7为Xg1,Xg2,Xg3,Xg4,Xg5,Xg6和Xg7。Xg2优选为G,A,S或C。Xg5优选为F,V,L,I,M,A,W或Y。Xg6优选为L,F,Y,M,I或V。Xg7优选为A,C,V,L,I,M或S。
XPD解旋酶优选含有XPD模序V和VI。最优选的XPD模序V和VI示于下表5中。
所述XPD解旋酶优选在Walker A和B模序(模序I和II)之间还含有黄铁矿(FeS)芯(core)。FeS芯通常含有在半胱氨酸残基的硫化物基团之间配位的铁原子。FeS芯通常是四面体型。
XPD解旋酶优选为下表4所示解旋酶之一或其变体。
表4–优选的XPD解旋酶
XPD解旋酶更优选为下表5所示解旋酶之一或其变体。XPD解旋酶更优选含有表5所示解旋酶之一的序列，即SEQ ID NO:10,13,16,18,20,22,25,28,31,33,35,38,41,43,44,46,49,52,55,57,59,61和62中的一个的序列，或其变体。
表5–更优选的XPD解旋酶和最优选的XPD模序V和VI
XPD解旋酶最优选包含SEQ ID NO:10所示序列或其变体。
XPD解旋酶的变体为具有从野生型解旋酶变化而来的氨基酸序列并保留有多核苷酸的结合活性的酶。特别是，SEQ ID NO:10,13,16,18,20,22,25,28,31,33,35,38,41,43,44,46,49,52,55,57,59,61和62中任一个的变体为具有由SEQ ID NO:10,13,16,18,20,22,25,28,31,33,35,38,41,43,44,46,49,52,55,57,59,61和62中任一个的氨基酸序列变化而来并保留有多核苷酸的结合活性的氨基酸序列的酶。SEQ ID NO:10的变体为具有由SEQ ID NO:10变化而来的氨基酸序列且保留有多核苷酸的结合活性的酶。所述变体保留有解旋酶活性。测定解旋酶活性的方法是本领域已知的。解旋酶活性也可按实施例中所述测定。所述变体必须以下述两种模式中的至少一种模式工作。优选地，所述变体以两种模式工作。所述变体可以含有促进对编码解旋酶的多核苷酸的处理的修饰和/或促进其在高的盐浓度和/或室温下的活性的修饰。变体通常在上述XPD模序V和VI外的区域不同于野生型解旋酶。然而，变体可以在所述模序之一或这两者中含有修饰。
SEQ ID NO:10,13,16,18,20,22,25,28,31,33,35,38,41,43,44,46,49,52,55,57,59,61和62中任一个，例如SEQ ID NO:10的氨基酸序列，基于氨基酸的同一性，变体优选与整个长度上的所述序列具有至少10％、优选30％的同一性。更优选地，基于氨基酸的同一性，变体多肽可以与整个长度上的SEQ ID NO:10,13,16,18,20,22,25,28,31,33,35,38,41,43,44,46,49,52,55,57,59,61和62中任一个，例SEQ ID NO:10的氨基酸序列，具有至少40％,至少45％,至少50％,至少55％,至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％且更优选至少95％,97％或99％的同一性。在150或更长,例如200,300,400,500,600,700,800,900或1000或更长的长度上，可以具有至少70％，例如至少80％,至少85％,至少90％或至少95％的氨基酸同一性，即连续的氨基酸(“严格同一性”)。同一性按上文所述进行确定。所述变体可用上文针对SEQ ID NO:2和4所论述的方式中的任一种与野生型序列进行区分。
特别是，变体可以包括SEQ ID NO:10,13,16,18,20,22,25,28,31,33,35,38,41,43,44,46,49,52,55,57,59,61和62的片段。这类片段保留有多核苷酸的结合活性。各片段可以具有至少约200,至少约300,至少约400,至少约500,至少约600或至少约700个氨基酸长度。所述片段的长度通常取决于野生型序列的长度。如下文更详细描述的，各片段优选含有相关野生型序列的XPD模序V和/或XPD模序VI。
可对SEQ ID NO:10,13,16,18,20,22,25,28,31,33,35,38,41,43,44,46,49,52,55,57,59,61or 62的氨基酸序列进行氨基酸置换，例如多达1,2,3,4,5,10,20或30个氨基酸置换。所述置换优选为上文所述的保守置换。
变体，例如SEQ ID NO:10,13,16,18,20,22,25,28,31,33,35,38,41,43,44,46,49,52,55,57,59,61和62中任一个的片段，优选含有相关野生型序列的XPD模序V和/或XPD模序VI。变体，例如SEQ ID NO:10,13,16,18,20,22,25,28,31,33,35,38,41,43,44,46,49,52,55,57,59,61和62中任一个的片段，更优选含有相关野生型序列的XPD模序V和XPD模序VI。例如，SEQ ID NO:10的变体优选含有SEQ ID NO:10的XPD模序V(YLWGTLSEG；SEQ ID NO:11)和/或SEQ ID NO:10的XPD模序VI(QAMGRVVRSPTDYGARILLDGR；SEQ ID NO:12)。SEQ ID NO:10的变体更优选含有SEQ ID NO:10的XPD模序V和VI。SEQ ID NO:10,13,16,18,20,22,25,28,31,33,35,38,41,43,44,46,49,52,55,57,59,61和62中每一个的XPD模序V和VI示于表5中。但是，SEQ ID NO:10,13,16,18,20,22,25,28,31,33,35,38,41,43,44,46,49,52,55,57,59,61和62中任一个的变体可含有来自不同野生型序列的XPD模序V和/或VI。例如，SEQ ID NO:10的变体可含有SEQ ID NO:13的XPD模序V(SLWGTLAEG；SEQ ID NO:14)和/或SEQ ID NO:13的XPD模序VI(QAIGRVVRGPDDFGVRILADRR；SEQ ID NO:15)。SEQ ID NO:10,13,16,18,20,22,25,28,31,33,35,38,41,43,44,46,49,52,55,57,59,61和62中任一个的变体可含有表5所示优选模序中的任一个。SEQ ID NO:10,13,16,18,20,22,25,28,31,33,35,38,41,43,44,46,49,52,55,57,59,61和62种的任一个的变体也可包括相关野生型序列的XPD模序V和/或XPD模序VI内的修饰。当限定这两种模序时，对这些模序的适宜修饰如上文所述。
所述解旋酶可共价连接到所述孔。所述解旋酶优选不共价连接到所述孔。对所述孔和解旋酶施加电压通常导致形成能够对目标多核苷酸进行测序的传感器。这在下文进行更详细论述。
本文所述的任何蛋白质，即跨膜蛋白孔或XPD解旋酶，可以经修饰以帮助对它们进行鉴定或纯化，所述修饰例如通过下述进行：通过添加组氨酸残基(his标签)、天冬氨酸残基(asp标签)、链霉亲和素标签或flag标签、SUMO标签、GST标签或MBP标签，或通过添加信号序列来促进它们从细胞的分泌——当多肽并不天然含有该序列时。引入遗传标签的一个替换方案是通过化学反应将标签连接到所述孔或解旋酶上的天然或工程位点。其一个例子为将凝胶迁移试剂与工程连接在所述孔外部上的半胱氨酸进行反应。这被证明是一种用于分离溶血素异源寡聚体的方法(Chem Biol.1997Jul；4(7):497-505)。
所述孔和/或解旋酶可以使用显示标记物标记。所述显示标记物可以是允许所述孔被检测的任何适宜标记物。适合的标记物包括但不限于荧光分子、放射性同位素，例如125I、35S、酶、抗体、抗原、多核苷酸和配体，如生物素。
蛋白质可以合成或通过重组手段制备。例如，所述孔和/或解旋酶可以通过体外翻译和转录(IVTT)进行合成。所述孔和/或解旋酶的氨基酸序列可以被修饰为包括非天然形成的氨基酸或被修饰为用以提高蛋白质的稳定性。当通过合成手段制备蛋白质时，可以在制备过程引入所述氨基酸。所述孔和/或解旋酶也可以在合成或重组制备后被改变。
所述孔和/或解旋酶也可以使用D-氨基酸制备。例如，所述孔或解旋酶可以含有L-氨基酸和D-氨基酸的混合物。这是本领域制备这类蛋白质或肽的常规方式。
所述孔和/或解旋酶也可以含有其他非特异性的修饰，只要所述修饰不影响孔的形成或解旋酶功能。许多非特异性侧链修饰均是本领域已知的并且可以对蛋白质侧链进行非特异性侧链修饰。所述修饰包括，例如，通过与醛进行反应然后用NaBH4进行还原的氨基酸的还原性烷基化，用甲基乙酰亚胺酯进行的脒基化，或用乙酸酐进行的酰化。
所述孔和解旋酶可以使用本领域已知的标准方法制备。编码孔或解旋酶的多核苷酸序列可以使用本领域标准方法获得并复制。编码孔或解旋酶的多核苷酸序列可以使用本领域标准技术在细菌宿主细胞中进行表达。所述孔和/或解旋酶可以在细胞中通过重组表达载体得到的多肽的原位表达进行制备。所述表达载体可选地携带有诱导型启动子以控制所述多肽的表达。这些方法在Sambrook,J.and Russell,D.(2001).Molecular Cloning:A LaboratoryManual,3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY中有描述。
所述孔和/或解旋酶可以从制备蛋白质的生物体或在重组表达后，通过任何蛋白质液相色谱系统进行纯化，而大规模制备。通常的蛋白质液相色谱系统包括FPLC、AKTA系统、Bio-Cad系统、Bio-Rad生物系统和GilsonHPLC系统。
本发明的方法涉及测定目标多核苷酸的一个或多个特征。所述方法可包括测定目标多核苷酸的两个、三个、四个或五个或更多个特征。所述一个或多个特征优选选自(i)目标多核苷酸的长度，(ii)目标多核苷酸的同一性，(iii)目标多核苷酸的序列，(iv)目标多核苷酸的二级结构，和(v)目标多核苷酸是否被修饰。(i)到(v)的任何组合均可以根据本发明进行测定。
对于(i)，多核苷酸的长度可以利用目标多核苷酸与所述孔之间的多次相互作用进行测定。
对于(ii)，多核苷酸的同一性可以通过多种方式进行测定。多核苷酸的同一性可以联合或不联合目标多核苷酸序列的测定而进行测定。前者是直接的；对所述多核苷酸进行测序，并由此进行鉴定。后者可以多种方式完成。例如，可以测定多核苷酸中特定模序的存在(不需要测定多核苷酸的其余序列)。替代地，在所述方法中特定电和/或光信号的测定可以鉴定来自特定来源的目标多核苷酸。
对于(iii)，多核苷酸的序列可以如前文所述进行测定。适合的测序方法，特别是那些使用电测量的方法，在Stoddart D等人,Proc Natl Acad Sci,12；106(19):7702-7，Lieberman KR等人,J Am Chem Soc.2010；132(50):17961-72，以及国际申请WO2000/28312中有描述。
对于(iv)，二级结构可以多种方式测定。例如，如果所述方法涉及电测量，则二级结构可以利用穿过孔的停留时间的变化或电流的变化进行测定。这使得能够对单链和双链多核苷酸区域进行鉴定。
对于(v)，可以测定任何修饰的存在与否。所述方法优选包括确定所述目标多核苷酸是否用一个或多个蛋白质或一个或多个标记物、标签或间隔物通过甲基化、氧化、损伤，进行了修饰。特定的修饰将导致与孔的特定的相互作用，这可使用下述方法测定。例如，可以基于孔与每个核苷酸的相互作用过程中穿过所述孔的电流，来区分胞嘧啶与甲基胞嘧啶。
可以进行多种不同类型的测量。所述测量包括但不限于：电测量和光学测量。可行的电测量包括：电流测量、阻抗测量、隧道测量(tunnellingmeasurement)(Ivanov AP等人,Nano Lett.2011Jan12；11(1):279-85)和FET测量(国际申请WO2005/124888)。光学测量可与电测量组合使用(Soni GV等人,Rev Sci Instrum.2010Jan；81(1):014301)。所述测量可以是跨膜电流测量，例如测量穿过孔的离子电流。
电测量可以使用标准单通道记录设备进行，如Stoddart D等人,Proc NatlAcad Sci,12；106(19):7702-7,Lieberman KR等人,J Am Chem Soc.2010；132(50):17961-72，和国际申请WO-2000/28312中所述。替代地，电测量可以利用多通道系统进行，例如国际申请WO-2009/077734和国际申请WO-2011/067559中所述。
在优选的实施方案中，所述方法包括：
(a)使目标多核苷酸与跨膜孔和XPD解旋酶接触，使得所述目标多核苷酸移动穿过所述跨膜孔并且XPD解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动；和
(b)当所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔而移动时，测量穿过所述跨膜孔的电流，其中所述电流代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标多核苷酸。
所述方法可以使用任何适于研究膜/孔系统(其中孔嵌入膜中)的设备实施。所述方法可以使用任何适于感测跨膜孔的设备实施。例如，所述设备包括含有水溶液的室和将该室分隔为两部分的屏障(barrier)。所述屏障具有孔穴，其中含有孔的膜形成在孔穴中。
所述方法可以使用国际申请号PCT/GB08/000562(WO2008/102120)中描述的设备实施。
所述方法可以包括在多核苷酸相对于孔移动时测量穿过该孔的电流。因此所述设备还可以包括能跨膜和孔施加电势并测量穿过该膜和孔的电信号的电路。所述方法可以使用膜片钳或电压钳实施。所述方法优选包括使用电压钳。
本发明方法可包括当多核苷酸相对于孔移动时测量穿过该孔的电流。用于测量穿过跨膜蛋白孔的离子电流的适宜条件是本领域已知的并在实施例中公开。所述方法通常通过跨膜和孔施加电压来实施。使用的电压通常为+2V到-2V,通常为-400mV到+400mV。使用的电压优选在具有以下下限和上限的范围内，所述下限选自-400mV,-300mV,-200mV,-150mV,-100mV,-50mV,-20mV和0mV，所述上限独立地选自+10mV,+20mV,+50mV,+100mV,+150mV,+200mV,+300mV和+400mV。使用的电压更优选在100mV到240mV范围内，最优选在120mV到220mV范围内。可通过对孔施加提高的电势来增加对不同核苷酸的鉴定力。
所述方法通常在任何载荷子诸如金属盐(如碱金属盐)，卤盐(如氯化物盐(如碱金属氯化物盐))的存在下实施。载荷子可包括离子液体或有机盐，例如四甲基氯化铵、三甲基苯基氯化铵、苯基三甲基氯化铵或1-乙基-3-甲基咪唑鎓氯。在上述示例性设备中，所述盐存在于所述室的水溶液中。通常使用氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)或氯化铯(CsCl)。优选KCl。所述盐浓度可以是饱和的。所述盐浓度可以是3M或更低并且通常为0.1-2.5M,0.3-1.9M,0.5-1.8M,0.7-1.7M,0.9-1.6M或1M-1.4M。所述盐浓度优选为150mM-1M。如上所述，XPD解旋酶出人意料地能在高的盐浓度下工作。所述方法优选使用至少0.3M，例如至少0.4M,至少0.5M,至少0.6M,至少0.8M,至少1.0M,至少1.5M,至少2.0M,至少2.5M或至少3.0M的盐浓度而实施。高的盐浓度提供高的信噪比并使得能在正常电流波动的背景下来识别代表核苷酸存在的电流。
所述方法通常在缓冲剂的存在下实施。在上述示例性设备中，所述缓冲剂存在于所述室的水溶液中。任何缓冲剂均可用在本发明方法中。通常，所述缓冲剂为HEPES。另一个适宜的缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)缓冲液。所述方法通常在4.0-12.0,4.5-10.0,5.0-9.0,5.5-8.8,6.0-8.7或7.0-8.8或7.5-8.5的pH下实施。所用pH优选约为7.5。
所述方法可在0℃-100℃,15℃-95℃,16℃-90℃,17℃-85℃,18℃-80℃,19℃-70℃,或20℃-60℃实施。所述方法通常在室温实施。所述方法可选地在能支持酶功能的温度下，例如约37℃实施。
所述方法通常在游离核苷酸或游离核苷酸类似物以及促进解旋酶起作用的酶辅因子存在下实施。所述游离核苷酸可以是上述各多核苷酸中的任意一个或多个。所述游离核苷酸包括但不限于,腺苷单磷酸(AMP),腺苷二磷酸(ADP),腺苷三磷酸(ATP),鸟苷单磷酸(GMP),鸟苷二磷酸(GDP),鸟苷三磷酸(GTP),胸苷单磷酸(TMP),胸苷二磷酸(TDP),胸苷三磷酸(TTP),尿苷单磷酸(UMP),尿苷二磷酸(UDP),尿苷三磷酸(UTP),胞苷单磷酸(CMP),胞苷二磷酸(CDP),胞苷三磷酸(CTP),环状腺苷单磷酸(cAMP),环状鸟苷单磷酸(cGMP),脱氧腺苷单磷酸(dAMP),脱氧腺苷二磷酸(dADP),脱氧腺苷三磷酸(dATP),脱氧鸟苷单磷酸(dGMP),脱氧鸟苷二磷酸(dGDP),脱氧鸟苷三磷酸(dGTP),脱氧胸苷单磷酸(dTMP),脱氧胸苷二磷酸(dTDP),脱氧胸苷三磷酸(dTTP),脱氧尿苷单磷酸(dUMP),脱氧尿苷二磷酸(dUDP),脱氧尿苷三磷酸(dUTP),脱氧胞苷单磷酸(dCMP),脱氧胞苷二磷酸(dCDP)和脱氧胞苷三磷酸(dCTP)。所述游离核苷酸优选选自AMP,TMP,GMP,CMP,UMP,dAMP,dTMP,dGMP或dCMP。所述游离核苷酸优选为腺苷三磷酸(ATP)。所述酶辅因子为使解旋酶发挥功能的因子。所述酶辅因子优选为一个或多个二价金属阳离子。适宜的二价金属阳离子包括但不限于，Mg2+,Mn2+,Ca2+,Co2+和Fe2+。所述酶辅因子优选为Fe2+或Mg2+。所述酶辅因子最优选为Fe2+和Mg2+。
所述目标多核苷酸可以与XPD解旋酶及孔以任何顺序接触。优选的是，当所述目标多核苷酸与XPD解旋酶及孔接触时，所述目标多核苷酸首先与所述解旋酶形成复合体。然后，当对所述孔施加电压时，所述目标多核苷酸/解旋酶复合体与所述孔形成复合体并控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的运动。
如上所述，XPD解旋酶可以相对于所述孔以两种模式工作。首先，所述方法优选使用XPD解旋酶实施，使所述XPD解旋酶顺着由施加的电压产生的电场的方向移动目标序列穿过所述孔。在这种模式中，DNA的5’端首先被捕获到所述孔中，然后所述酶移动所述DNA进入所述孔，使得目标序列顺着电场的方向穿过所述孔直到其最终移位到所述双分子层的反侧。替代地，所述方法优选以下述模式实施：使得所述酶逆着由施加的电压产生的电场的反向移动所述目标序列穿过所述孔。在这种模式下，DNA的3’端首先被捕获到所述孔中，然后所述酶移动所述DNA穿过所述孔，使得目标序列逆着施加的电场，被从所述纳米孔中拉出，直到其最终退回到所述双分子层的顺侧。
本发明方法最优选涉及源自MspA的孔和包括SEQ ID NO:8中所示序列或其变体的解旋酶。上述关于MspA和SEQ ID NO:8的任何实施方式可以组合使用。
其他方法
本发明还包括形成用于表征目标多核苷酸的传感器的方法。所述方法包括在孔和XPD解旋酶之间形成复合体。所述复合体可以通过使所述孔和所述解旋酶在目标多核苷酸的存在下相接触，然后跨所述孔施加电势而形成。所施加的电势可以如上所述是化学电势或电压电势。替代地，所述复合体可以通过使孔共价连接到所述解旋酶而形成。共价连接的方法是本领域已知的并例如，在国际申请号PCT/GB09/001679(公布号WO2010/004265)和PCT/GB10/000133(公布号WO2010/086603)中有公开。所述复合体是用于表征目标多核苷酸的传感器。所述方法优选包括在源自Msp的孔与XPD解旋酶之间形成复合体。上述关于本发明方法的任何实施方案同样适用于该方法。
试剂盒
本发明还提供了用于表征目标多核苷酸的试剂盒。所述试剂盒包括(a)孔和(b)XPD解旋酶。上文针对本发明方法论述的任何实施方案同样适用于该试剂盒。
所述试剂盒可进一步包括膜的组分，例如形成两性分子层如脂质双分子层所需要的磷脂质。
本发明的试剂盒可另外包括一种或多种能实施上述任何实施方案的其他试剂或仪器。所述试剂或仪器包括以下的一种或多种：合适的缓冲剂(水溶液)、用于从受体获得样本的工具(诸如导管或含有针的仪器)、用于扩增和/或表达多核苷酸的工具、上文定义的膜，或者电压钳或膜片钳设备。可以存在于所述试剂盒中的试剂可以是干态的，使得液体样本使该试剂重悬(resuspend)。可选地，所述试剂盒还可包括使该试剂盒能在本发明方法中使用的仪器或关于该方法可以用于哪种病人的说明书。可选地，所述试剂盒可包括核苷酸。
设备
本发明还提供了用于表征目标多核苷酸的设备。所述设备包括多个孔和多个XPD解旋酶。所述设备优选进一步包括用于实施本发明方法的说明书。所述设备可以是任何用于多核苷酸分析的常规设备，例如阵列(array)或芯片。上面论述的关于本发明方法的任何实施方案同样适用于本发明的设备。
所述设备优选被设置成用于实施本发明方法。
所述设备优选包括：
传感器装置，能支撑所述膜和多个孔，并可操作地使用所述孔和解旋酶来表征多核苷酸；
至少一个存储器，容纳用于进行表征的材料；
流体系统，配置成从至少一个存储器可控地向所述传感器装置供应材料；以及
多个容器，用于接收各样本，所述流体系统被配置成，选择性地从所述容器向所述传感器装置供应样本。所述设备可以是那些在国际申请号PCT/GB08/004127(公布号WO2009/077734)、PCT/GB10/000789(公布号WO2010/122293)、国际申请号PCT/GB10/002206(尚未公布)或国际申请号PCT/US99/25679(公布号WO00/28312)中描述的任何设备。
不使用孔时的表征
在一些实施方案中，使用XPD解旋酶但不使用孔对目标多核苷酸进行表征，例如进行部分测序或完全测序。特别地，本发明还提供了一种表征目标多核苷酸的方法，包括使目标多核苷酸与XPD解旋酶接触，从而使XPD解旋酶控制目标多核苷酸的移动。在该方法中，所述目标多核苷酸优选不与孔，例如跨膜孔接触。该方法包括在XPD解旋酶控制目标多核苷酸移动时获取一种或多种测量值，从而表征所述目标多核苷酸。所述测量值代表目标多核苷酸的一个或多个特征。根据本发明可以获取任何所述测量值。所述测量值包括但不限于：电测量值和光学测量值。这些在前文已详细论述。上述关于本发明的基于孔的方法的任何实施方案均可用在不使用孔的方法中。例如，可以使用上述的任何XPD解旋酶。
本发明还提供了包括XPD解旋酶的分析设备。本发明还提供了用于表征目标多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包括(a)用于表征目标多核苷酸的分析设备，和(b)XPD解旋酶。这些设备和试剂盒优选不包含孔，例如跨膜孔。适宜设备已在上文进行了论述。
以下实施例用于描述本发明。
实施例1
本实施例举例说明使用XPD解旋酶(XPD MBu)控制整个DNA链穿过纳米孔的移动。在该实施例中使用的总的方法和物质示于图1中并在图片说明中有描述。
材料和方法
设计能扩增PhiX174的～400bp片段的引物。这些引物的每一个5’端包括一50个核苷酸的非互补区域(non-complimentary region)，可以是10个核苷酸的均聚物延伸或者重复单元。它们用作链受控移位而穿过纳米孔的标识物(identifier)，以及确定移位的方向。另外，正向引物的5’端为“加帽的(capped)”以包括四个2′-O-甲基-尿嘧啶(mU)核苷酸，并且反向引物的5’端为化学磷酸化的。然后这些引物的修饰使得可以使用λ核酸外切酶主要仅对反义链进行受控酶解。所述mU帽保护正义链不被核酸酶酶解，同时在反义链5’的PO4促进该酶解。因此，在用λ核酸外切酶培育(incubation)后，仅双链的正义链保持完整，现成为单链DNA(ssDNA)。产生的ssDNA然后按如上所述进行PAGE纯化。
在本文所述的所有实验中使用的DNA底物的设计如图1B所示。所述DNA底物由来自PhiX的ssDNA的一400个碱基部分所组成，具有一个50T5’-前导区用以帮助通过纳米孔(SEQ ID NO:63)进行的捕获。含有3’的胆固醇标签的引物(SEQ ID NO:64)刚好在位于50T前导区之后的该链部分与该链进行退火，以使DNA富集在双分子层的表面，并由此提高捕获效率。对该链的3’端使用另外的引物(SEQ ID NO:65)，以帮助对该链在3’端的捕获。
缓冲溶液:400mM NaCl,10mM Hepes pH8.0,1mM ATP,1mM MgCl2,1mM DTT
纳米孔:大肠杆菌MS(B2)8MspA ONLP3476MS-(L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K)8
酶:XPD Mbu(ONLP3696,～6.2μM)16.1μl->100nM终浓度。
由嵌入1,2-二植烷酰-甘油基-3-磷酸胆碱脂质(Avanti极性脂质)双分子层的单个MspA纳米孔获得电测量值。通过Montal-Mueller技术，跨20μm厚的PTFE膜中的～100μm直径的孔穴形成双分子层(在传统的Delrin室中)，隔开两个1mL的缓冲溶液。所有实验在所述缓冲溶液中进行。使用装配有1440A数字转换器的Axopatch200B放大器(分子装置)测定单通道电流。将Ag/AgCl电极连接到所述缓冲液中，使得顺式隔室(纳米孔和酶/DNA均被添加到其中)连接到Axopatch headstage的接地端，并且反式隔室连接到所述headstage的活性电极。
在所述双分子层中实现单孔之后，将DNA多核苷酸和解旋酶添加到100μL缓冲液中并预培育5分钟(DNA＝6nM,Enzyme＝1μM))。将该经预培育的混合物添加到电生理学室的顺式隔室中的900μL缓冲液中，以引发解旋酶-DNA复合体在所述MspA纳米孔中的捕获(得到DNA＝0.6nM，酶＝0.1μM的终浓度)。根据需要通过向所述顺式隔室中添加二价金属(1mMMgCl2)和NTP(1mM ATP)激活解旋酶ATP酶的活性。在+140mV的恒定电势下进行实验。
结果和论述
如图1所示添加解旋酶-DNA底物到MspA纳米孔，产生了如图2和3所示的特征电流模块。没有与解旋酶复合的DNA短暂地与所述纳米孔相互作用，产生短期的电流模块(<<1秒)。结合有解旋酶并且活动的(即在ATP酶作用下沿着DNA链移动)的DNA，产生如图2和3所示电流逐步变化的长特征模块水平。纳米孔中不同的DNA模序均得到唯一的电流模块水平。对于给定的底物，我们观察到反映DNA序列的电流转变的特征图案。
在图1显示的实施例中，当DNA被解旋酶沿着该DNA链在随机位点捕获时，从随机的起始点对该DNA链进行测序。
盐耐受性
这种类型的纳米孔链测序实验一般需要离子盐。所述离子盐是产生导电溶液所必需的，所述导电溶液用于施加补偿电压以捕获和移位DNA，并且是测定DNA穿过所述纳米孔时产生的序列依赖性电流变化所必需的。由于测量信号依赖于离子的浓度，因此使用高浓度的离子盐以提高所获得的信号的强度是有利的。对于纳米孔测序，超过100mM KCl的盐浓度是理想的，，超过400mM的盐浓度是优选的。
然而，很多酶(包括一些解旋酶和DNA马达蛋白)不能耐受高的盐条件。在高的盐条件下，所述酶打开(unfold)或失去结构完整性，或不能正常工作。已知的和所研究的解旋酶的现有文献显示，几乎所有的解旋酶均不能在高于约100mM KCl/NaCl的盐浓度下工作，并且没有报道表明，解旋酶能在400mM KCl以上的条件下显示合适的活性。即使存在来自耐盐物种的相似酶的潜在耐盐变体，它们也极难在标准的表达系统(即大肠杆菌)中表达和纯化。
出人意料地，我们发现，在实施例中，来自Mbu的XPD显示出的对盐的耐受性达到极高的水平。我们发现，所述酶在400mM KCl到1M KCl的盐浓度下仍保持功能，无论是在荧光实验中，还是在纳米孔实验中。
正向和反向操作模式
大多数解旋酶以单向方式沿着单链多核苷酸底物移动，为每次NTP酶的转运和移动特定数目的碱基。虽然图1显示了使用这种移动将螺旋状DNA沿着所施加电势的同一方向，通过纳米孔输送到反室内，但是也可以其他方式来利用解旋酶的运动，从而以受控方式输送DNA穿过纳米孔。图4显示了“正向”和“反向”两种基本的操作模式。在正向模式中，以与在所施加电场的力的作用下DNA移动相同的方向，通过解旋酶向所述孔中输送DNA。DNA的移动方向由反向箭头表示。对于XPD Mbu，其为5’-3’解旋酶，这需要将DNA的5’端捕获到纳米孔中，直到解旋酶与所述纳米孔的顶部接触，然后在施加的电势产生的电场下，在解旋酶控制下，向所述纳米孔中输送所述DNA，其从顺侧到反侧移动。反向模式需要捕获DNA的3’端，之后所述解旋酶逆着所施加电势产生的电场将螺旋状DNA从所述纳米孔牵拉出，所述DNA按箭头所指从顺侧到反侧移动。图4示出了使用XPD Mbu而进行的两种操作模式。
实施例2
该实施例利用荧光试验检测酶活性来说明XPD解旋酶(XPD Mbu)的盐耐受性。
使用常规的荧光底物检测解旋酶置换杂交双链DNA的能力(图5A)，如图5A中的1)所示，荧光底物链(终浓度50nM)具有5’端单链DNA悬突，以及一40个碱基的杂交双链DNA部分。主链上部在3’端具有羧基荧光素碱基，并且杂交的互补链在5’端具有黑洞淬灭剂(BHQ-1)碱基。当杂交时，来自荧光素的荧光被局部的BHQ-1淬灭，并且所述底物基本无荧光。所述试验中还包括，与荧光底物的较短链互补的1μM的捕获链。如2)所示，在ATP(1mM)和MgCl2(10mM)存在下，添加到所述底物中的解旋酶(150nM)连接到所述荧光底物的5’尾部，沿着所述主链移动，并置换所述互补链，如所示的。如3)所示，一旦具有BHQ-1的互补链完全被置换，主链上荧光素发荧光。如4)所示，过量的捕获链优先与互补DNA退火以防止初始底物重新退火与丢失荧光。
底物DNA：靠近3’端的具有羧基荧光素的SEQ ID NO:66和5’端的具有黑洞淬灭剂-1的SEQ ID NO:67。
捕获DNA：靠近3’端的具有羧基荧光素的SEQ ID NO:68。
图5B的照片示出了含有100mM至1M的不同浓度的KCl的缓冲溶液中的初始活性速率(100mM Hepes pH8.0,1mM ATP,10mM MgCl2,50nM荧光底物DNA,1μM捕获DNA)。所述解旋酶在1M下工作。

Claims (36)

1.一种表征目标多核苷酸的方法，包括：
(a)使目标多核苷酸与跨膜孔及XPD解旋酶接触，使得目标多核苷酸移动穿过所述跨膜孔，并使XPD解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动；和
(b)当所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔移动时，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个特征选自(i)目标多核苷酸的长度，(ii)目标多核苷酸的同一性，(iii)目标多核苷酸的序列，(iv)目标多核苷酸的二级结构，和(v)目标多核苷酸是否被修饰。
3.根据权利要求2所述的方法，其中对所述目标多核苷酸用一个或多个蛋白质或一个或多个标记物、标签或间隔物通过甲基化、氧化、损伤，进行了修饰。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述目标多核苷酸的一个或多个特征通过电测量和/或光学测量进行测量。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述电测量为电流测量、阻抗测量、隧道测量或场效应晶体管(FET)测量。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：
(a)使目标多核苷酸与跨膜孔和XPD解旋酶接触，使得所述目标多核苷酸移动穿过所述跨膜孔并使XPD解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动；和
(b)当所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔而移动时，测量穿过所述跨膜孔的电流，其中所述电流代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标多核苷酸。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括当所述目标多核苷酸移动穿过所述跨膜孔时获取一个或多个测量值。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括跨所述跨膜孔施加电压以在所述跨膜孔和所述解旋酶之间形成复合体的步骤。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少所述目标多核苷酸的一部分是双链的。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述跨膜孔为跨膜蛋白孔或固态孔。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述跨膜蛋白孔选自溶血素、杀白细胞素、耻垢分枝杆菌膜孔蛋白A(MspA)、外膜蛋白F(OmpF)、外膜蛋白G(OmpG)、外膜磷脂酶A、奈瑟氏菌自转运脂蛋白(NalP)和WZA。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述跨膜蛋白由下述物质形成：(a)SEQ ID NO:2中所示八个相同的亚基；或(b)所述亚基的变体，其中，基于氨基酸的同一性，七个亚基中的一个或多个与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少50％的同一性，且保留有孔活性。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述跨膜蛋白为：(a)SEQ IDNO:4中所示由七个相同亚基形成的α-溶血素；或(b)所述亚基的变体，其中，基于氨基酸的的同一性，所述七个亚基中的一个或多个与SEQ ID NO:4的整个序列具有至少50％的同一性，且保留有孔活性。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述XPD解旋酶包括：
(a)氨基酸模序X1-X2-X3-G-X4-X5-X6-E-G(SEQ ID NO:8)，其中X1,X2,X5和X6独立地选自除D,E,K和R之外的任意氨基酸，且其中X3和X4可为任意氨基酸残基；和/或
(b)氨基酸模序Q-Xa-Xb-G-R-Xc-Xd-R-(Xe)3-Xf-(Xg)7-D-Xh-R(SEQ IDNO:9)，其中Xa,Xe和Xg可为任意氨基酸残基，且其中Xb,Xc和Xd独立地选自除D,E,K和R之外的任意氨基酸。
15.根据权利要求14所述的方法，其中X1,X2,X5及X6和/或Xb,Xc及Xd独立地选自G,P,A,V,L,I,M,C,F,Y,W,H,Q,N,S和T。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述解旋酶包括以下模序：
(a)YLWGTLSEG(SEQ ID NO:11)和/或
QAMGRVVRSPTDYGARILLDGR(SEQ ID NO:12)；
(b)SLWGTLAEG(SEQ ID NO:14)和/或
QAIGRVVRGPDDFGVRILADRR(SEQ ID NO:15)；
(c)YLWGTLSEG(SEQ ID NO:11)和/或
QAMGRVVRSPGDFGVRILLDAR(SEQ ID NO:17)；
(d)YLWGTLSEG(SEQ ID NO:11)和/或
QAMGRVVRSPSDYGARILLDGR(SEQ ID NO:19)；
(e)SLWGTLAEG(SEQ ID NO:14)和/或
QALGRVVRSPTDFGVRVLVDER(SEQ ID NO:21)；
(f)VTGGVFAEG(SEQ ID NO:23)和/或
QAAGRVLRTPEDRGVIALLGRR(SEQ ID NO:24)；
(g)LGTGAFWEG(SEQ ID NO:26)和/或
QGVGRLIRDERDRGVLILCDNR(SEQ ID NO:27)；
(h)YIWGTLSEG(SEQ ID NO:29)和/或
QAMGRVVRSPTDYGARILIDGR(SEQ ID NO:30)；
(i)YLWGTLSEG(SEQ ID NO:11)和/或
QAMGRIVRSPDDYGVRILLDSR(SEQ ID NO:32)；
(j)SLWGTLAEG(SEQ ID NO:14)和/或
QALGRVIRAPDDFGVRVLADKR(SEQ ID NO:34)；
(k)VSGGRLSEG(SEQ ID NO:36)和/或QEIGRLIRSAEDTGACVILDKR(SEQ ID NO:37)；
(l)VMGGRNSEG(SEQ ID NO:39)和/或
QAAGRVHRSEEEKGAVVVLDYR(SEQ ID NO:40)；
(m)VMGGRNSEG(SEQ ID NO:39)和/或
QAAGRVHRSEEEKGSIVILDYR(SEQ ID NO:42)；
(n)SLWGTLAEG(SEQ ID NO:14)和/或
QAMGRVIRSPEDFGVRMLVDRR(SEQ ID NO:45)；
(o)LATGRFAEG(SEQ ID NO:47)和/或
QMIGRLIRTENDYGVVVIQDKR(SEQ ID NO:48)；
(p)IARGKLAEG(SEQ ID NO:50)和/或
QSIGRAIRGPTDNATIWLLDKR(SEQ ID NO:51)；
(q)VGKGKLAEG(SEQ ID NO:53)和/或
QAIGRAIRDVNDKCNVWLLDKR(SEQ ID NO:54)；
(r)VMGGRNSEG(SEQ ID NO:39)和/或
QAAGRVHRSAEEKGAIIILDYR(SEQ ID NO:56)；
(s)SLWGTLAEG(SEQ ID NO:14)和/或
QALGRVIRSPEDVGVRALLDRR(SEQ ID NO:58)；
(t)SLWGTLAEG(SEQ ID NO:14)和/或
QALGRVIRSPEDFGVRILLDKR(SEQ ID NO:60)；或
(u)YLWGTLSEG(SEQ ID NO:11)和/或
QAMGRVVRSPGDFGVRILLDAR(SEQ ID NO:17)。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述XPD解旋酶为表4或5中所示解旋酶之一或其变体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述XPD解旋酶含有(a)SEQ IDNO:10,13,16,18,20,22,25,28,31,33,35,38,41,43,44,46,49,52,55,57,59,61和62种任一个所示的序列，或(b)所述序列的变体，基于氨基酸的同一性，该变体与相关序列的整个序列具有至少30％的同一性，且保留有解旋酶活性。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述XPD解旋酶含有(a)SEQ IDNO:10中所示的序列，或(b)所述序列的变体，基于氨基酸的同一性，该变体与SEQ ID NO:10的整个序列具有至少40％的同一性，且保留有解旋酶活性。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法使用至少0.3M的盐浓度实施，并且所述盐可选地为KCl。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述盐浓度至少为1.0M。
22.一种形成表征目标多核苷酸用传感器的方法，包括在孔和XPD解旋酶之间形成复合体并由此形成用于表征目标多核苷酸的传感器。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述复合体通过下述形成：(a)在目标多核苷酸的存在下使所述孔和解旋酶接触，和(b)跨所述孔施加电势。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述电势为电压电势或化学电势。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述复合体通过将所述孔共价连接到所述解旋酶而形成。
26.XPD解旋酶在控制目标多核苷酸移动穿过孔中的应用。
27.一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)孔和(b)XPD解旋酶。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括含两性分子层的芯片。
29.一种用于表征样本中目标多核苷酸的分析设备，包括多个孔和多个XPD解旋酶。
30.根据权利要求29所述的分析设备，其中所述分析设备包括：
传感器装置，能支撑所述多个孔，并可操作地使用所述孔和解旋酶来表征多核苷酸；
至少一个存储器，容纳用于进行表征的材料；
流体系统，配置成从至少一个存储器可控地向所述传感器装置供应材料；以及
多个容器，用于接收各样本，所述流体系统被配置成，选择性地从所述容器向所述传感器装置供应样本。
31.一种表征目标多核苷酸的方法，包括：
(a)使目标多核苷酸与XPD解旋酶接触，使得所述XPD解旋酶控制所述目标多核苷酸的移动；和
(b)当所述XPD解旋酶控制所述目标多核苷酸移动时，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
32.根据权利要求31所述的方法，其中：
(a)所述一个或多个特征如权利要求2中所限定；
(b)所述目标多核苷酸如权利要求3或9中所限定；
(c)所述一个或多个特征按权利要求4或5中限定的进行测量；
(d)所述XPD如权利要求14至19中任一项所限定；或
(e)所述方法按按权利要求20或21中限定的来实施。
33.XPD解旋酶在表征目标多核苷酸过程中控制该目标多核苷酸的移动中的应用。
34.XPD解旋酶在对目标多核苷酸进行部分或完整测序过程中控制该目标多核苷酸的移动中的应用。
35.一种用于表征样本中目标多核苷酸的分析设备，其特征在于，所述分析设备包含XPD解旋酶。
36.一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)用于表征目标多核苷酸的分析设备，和(b)XPD解旋酶。
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