CN101343665B

CN101343665B - 一种快速检测转基因抗虫水稻的方法

Info

Publication number: CN101343665B
Application number: CN2008100542847A
Authority: CN
Inventors: 王永; 兰青阔; 程奕; 朱珠; 赵新
Original assignee: Central Laboratory of Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Central Laboratory of Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2008-08-26
Filing date: 2008-08-26
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2028-08-26
Also published as: CN101343665A; WO2010022551A1

Abstract

本发明公开了一种转基因抗虫水稻的快速检测方法。其原理是采用4条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63～65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增出大量产物。其鉴定采用肉眼直接观察反应管内沉淀的混浊度或者通过加入SYBR Green颜色变化判断扩增与否。本发明的检测方法具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点。

Description

一种快速检测转基因抗虫水稻的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因产品的检测方法，具体说是一种快速检测转基因抗虫水稻的方法，通过肉眼观察反应管浊度或观察加入1000×SYBR Green后颜色变化或观察琼脂糖凝胶电泳来判断扩增情况。

背景技术

转基因工程自20世纪70年代诞生以来，已经取得迅速的发展。在1996～1999年全球共有12个国家种植转基因农作物。美国是转基因农作物种植面积最大的国家，中国居第4位，但种植面积仅占全球总面积的1％。目前，转基因生物技术的研究，大多分布在抗虫基因工程、抗病基因工程、抗逆基因工程、品质基因工程、品质改良基因工程、控制发育的基因工程等领域。如抗虫基因工程将Bt基因导入棉花、玉米、水稻、烟草、马铃薯等作物，毒杀害虫；或将胶蛋白酶抑制剂基因导入作物，干扰害虫消化作用，而导致害虫死亡。中国农科院、中国农业大学、中国科学院、河南农科院等许多科研单位和高校将几丁质酶和葡聚糖酶双价基因导入小麦育成抗病转基因小麦、转基因烟草、转基因水稻等等。英国爱丁堡大学将水母发光基因导入烟草、芹菜、马铃薯等作物，获得发光作物，驱赶害虫。目前在其它转基因工程方面也取得了许多成果，在此不能一一例举。总之在作物种类方面，大多集中在大豆、玉米、棉花、油菜、马铃薯、南瓜、木瓜、西葫芦七大类作物。

转基因水稻获得成功始于1986年，Uchimiya等首先获得了卡那霉素抗性的转基因水稻愈伤组织，相隔2年，世界上就有3个实验室分别获得了转基因水稻植株。纵观转基因水稻的发展历程，利用转基因技术开展水稻遗传改良主要集中在下列几个方面：

1抗虫性

应用于水稻抗虫性改良的外源基因主要有3种，一是从苏云金杆菌分离的苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因(Bt基因)，二是从植物中分离出的昆虫蛋白酶抑制剂(PI基因)，三是植物凝集素基因。科学家分别应用基因枪法、农杆菌介导法、电击法等成功地将cryIA(b)、cryIA(c)基因导入水稻中，获得了转基因植株，经抗虫性检测，转基因植株对二化螟、三化螟、大螟、稻纵卷叶螟等具有明显的致死效应。美国康奈尔大学1993年将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CPT导入水稻获得转基因植株，对二化螟、三化螟具有一定的抗性。Vain等将半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因导入水稻所得的转基因植株使线虫的孵化率下降了55％。浙江大学应用Bt基因转化育成的“克螟稻”已通过了浙江省科技厅的鉴定，1999年获准开展环境释放试验。

2抗病性

日本国家农业环境所成功地将水稻条纹叶枯病毒外壳蛋白基因RS VCP导入水稻获得转基因植株，接种后2～3周发现转基因植株只有2％～3％发病，而对照则有95％～100％发病。

Christou等将Xa21基因导入水稻后，显著提高了水稻对白叶枯病和稻瘟病的抗性。何迎春等将烟草几丁质酶基因导入水稻获得了高抗纹枯病和稻瘟病转基因植株。四川农业大学将抗病和抗虫基因导入杂交稻的恢复系中，获得了转基因的双抗杂交稻等。

3抗除草剂

20世纪80年代，美国孟山都公司以其拥有广谱、高效除草剂农达(草甘膦)的优势，率先开展除草剂抗菌性基因的转移研究与抗性品种的开发，随后，美国艾格福公司(AgrEvo)抗广谱除草剂草铵膦转基因水稻和美国氰胺公司的抗咪唑啉酮类除草剂转基因水稻相继问世。中国用于水稻抗除草剂的基因主要是PPT乙酰转移酶基因，即抗Basta基因(bar)，目前也已获得抗Basta水稻。

4抗逆性

由于有关水稻抗逆基因的定位、克隆和分离工作难度较大，抗逆转基因水稻的研究报道还不多。目前已经导入水稻的抗逆基因主要有烟草中的CMO基因、甜菜碱生物合成酶基因codA和水稻耐淹能力有关的基因(pdc，pdc，pdc)，将其转入水稻中分别获得了具有抗旱、耐碱、耐盐和耐渍的转基因水稻植株。

5高产和优质性状

产量和品质是由多基因控制的综合性状，个别外源基因的导入只能使其组成成分中单一因子的水平获得提高，而对其综合水平没有明显的影响。目前提高水稻产量的基因工程主要设想是将高光效C4植物的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和二磷酸核酮糖羧化酶基因(RuB pC)导入水稻中，在水稻叶片的叶绿体中表达以提高水稻光合效率，达到增加产量的目的。虽然Ku等将PEPC基因导入水稻，获得了光合效率提高近50％的转基因水稻，但离获得高产品种还相距甚远，只是为水稻大幅度增产带来了新的希望。在品质改良方面，富脯氨酸基因、富甲硫氨酸和赖氨酸基因、八氢番茄合成酶及其脱氢酶基因、大豆球蛋白基因和高赖氨酸基因等都已被成功地导入水稻并获得了转基因植株，对于开发特用稻米产品具有非常重要的意义。

随着大量转基因作物逐步走向市场，转基因作物和转基因作物加工的食物的安全性问题也开始受到人们的关注。从本质上讲，转基因作物和常规育成的作物品种没有差别。常规育种一般是通过有性杂交来实现，而植物基因工程则是用农杆菌、基因枪、电激、微注射等技术将外源重组DNA导入植物基因组中。尽管从理论上讲，转基因的遗传特性及表型应该可以更加精确的预测，在应用上更加安全，但对转基因作物进行安全性评估仍然很有必要。

欧盟最早提出对转基因食品进行标识管理。1999年，要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1％的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到0.9％。日本、澳大利亚、新西兰对转基因成分的最低含量做了不同规定，域值从1-5％不等。

我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。

转基因成分检测方法有Western blots、ELISA、试纸条、竞争性PCR、实时定量PCR和PCR-ELISA等。转基因作物的检测主要是检测样品是否含有外源蛋白质(基因表达产物)和是否含有外源基因(DNA)。转基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫学原理的酶联免疫吸附法(ELISA)、试纸条检测、Western杂交等方法检测，主要从待测样品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基质，利用抗体与目的蛋白(抗原)特异结合的特性，通过偶联抗体与抗原抗体复合物的作用产生可检测的信号。转基因作物的核酸检测方法主要有两种：核酸分子杂交技术(Sourthern blot)，PCR检测技术。

目前，PCR检测方法是最主要、最准确地检测转基因作物的方法，包括定性PCR方法、复合PCR方法、巢式PCR方法、竞争性定量PCR方法、荧光定量PCR方法等。国内外推广使用的是定性PCR和实时定量PCR检测方法：

定性PCR方法技术成熟，稳定，但反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；所需PCR仪价格在5万元左右，扩增时间2-3小时，扩增结果电泳时间需1小时左右；电泳常用染料EB是强致癌物，有较强毒性。实时荧光定量PCR技术先进，灵敏度更高，扩增时间在1小时左右，扩增结果实时在电脑上显示；能检测出样品中外源基因的数量信息(拷贝数)稳定性、体系和操作同定性PCR相当，但仪器和耗材价格较高；一台定量PCR在50万元左右，不宜大范围推广。

发明内容

本发明的目的在于公开一种快速检测转基因抗虫水稻的方法及根据外源基因与内源基因接合处序列设计一套引物对其进行扩增，通过肉眼观察浊度或观察加入SYBR Green后颜色的变化或观察琼脂糖凝胶电泳结果判断扩增情况。

本发明的技术方案如下：

一种用于检测转基因抗虫水稻的特异性引物，其中外引物正向序列：AGGATTCACTGGTGGAGA，外引物反向序列：GATTATCCAAGGAGGTAGCT；内引物正向序列：TGGGAAGTGAATTGGAACTTCAATACCTCGTTAGACTCAACAGC，内引物反向序列TCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGAAGATGGATGAATTACCCCAA。

每条引物分别配制成浓度为100μM的母液，然后取外引物各1μL，内引物各8μL，灭菌去离子水2μL，充分混合，为引物混合溶液。

本发明采用上述一套引物进行快速检测转基因抗虫水稻的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)采用权利要求1所述的4条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在63-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，4℃保存；

其中的扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer2.5μL，4M甜菜碱6.25μL，0.2M MgSO40.25μL，混合引物1μL，10μM dNTPs3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-5μL，模板DNA1-5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL；

(2)扩增反应结束，取体系液3-25μL，采用不同方法判断扩增与否，包括：直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green，通过颜色变化观察有无扩增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来观察有无扩增反应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。

本发明所述的检测方法，其中所述的链置换活性的DNA聚合酶为8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2μL。

本发明所述的嵌入剂1000倍SYBR Green加入量为1-2μL。

本发明所述的检测方法，模板DNA指的待测样品采用CTAB法提取纯化得到的DNA。

为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。

1、原理

本方法应用一种新型的核酸扩增方法，其原理是采用4条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63℃-65℃对核酸进行扩增，短时间扩增效率可达到10⁹-10¹⁰个拷贝。具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点。

2、引物设计

本研究依据转基因抗虫水稻外源基因与内源基因结合处序列设计了4条引物。引物由大连宝生物公司合成。

表1引物序列表如下：

3、反应条件

反应试剂需要链置换型DNA聚合酶、dNTPs、转基因抗虫水稻特异性引物、甜菜碱、MgSO₄和反应缓冲液。反应在恒温条件下进行，反应时间依据引物的效率和模板DNA质量变化，一般为1h或更少。加入模板DNA，在63-65℃进行45-60min，并且在80℃，持续2min而终止。

这项技术的优点就是不需要热循环。由于扩增是在恒温条件下进行的，因此仅需要恒温水浴锅或金属加热块维持反应温度，不需要PCR仪等昂贵的仪器。

材料与方法：

(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；特异性引物；甜菜碱溶液；MgSO₄溶液；dNTPs；

(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：10×Buffer 2.5μL，4M甜菜碱6.25μL，0.2M MgSO₄ 0.25μL，引物混合液1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2μL，模板DNA1-5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL。

(3)扩增反应过程：在63-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，4℃保存；

(4)扩增反应结束，取体系液3-25μL用不同的检测方法判断扩增与否。

4、扩增结果观察

有三种观察方法，适合不同情况下进行：

1)使用2％琼脂糖凝胶，加入EB染色剂，100V电泳50min，在紫外灯下观察。反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱中显示为从点样孔处开始的弥散和阶梯状条带现象。结果见图1。

2)由于反应形成大量双链DNA产物，所以可直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green，紫外灯下或肉眼观察，无扩增反应的管子呈橙色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图2。

3)检测还可以通过评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来进行。在反应中，在核酸大量合成时，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可以用肉眼观察或浊度仪检测反应管中的沉淀浊度就能够判断扩增与否。

本发明用于转基因抗虫水稻检测的扩增方法，具有以下优点：

1)操作简便：不需要复杂的仪器，只需一恒定温度就能反应，不需要预先进行双链DNA的变性。

2)高特异性：该技术由4条引物扩增靶序列的6个区段，因此具有高度特异性。

3)快速高效：整个扩增不到1h即可完成，产量可达到10⁹-10¹⁰个拷贝；

4)灵敏度高：扩增模板可仅为10拷贝甚至更少。

5)鉴定简便：可以用肉眼直接观察反应管内沉淀的混浊度或者通过SYBR Green颜色变化判断扩增与否。

附图说明

图1为扩增产物的电泳分析图谱。自左向右依次为Marker、阴性对照、阴性样品1、阴性样品2、阳性对照和阳性样品。

图2为扩增产物加入SYBR Green结果图。左为阳性对照，右为阴性对照。

图3为扩增产物加入SYBR Green结果图。从左边依次为阳性对照、待测样品、阴性对照。

图4为扩增产物加入SYBR Green结果图。由左至右为阴性对照、待测样品1、阳性对照和待测样品2。

图5为扩增产物的电泳分析图谱。由左至右：DL2000 DNA Marker、待测样品1、待测样品2、阴性对照、阳性对照。

图6为实施例4，采用本发明方法扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察结果，其中M，DL2000DNA，Marker；1，5％；2，1％；3，0.5％；4，0.1％；5，0.05％；6，0.01％；7，0.005％；8，阴性对照。

图7为实施例4，常规定性PCR方法扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察结果。其中M，DL2000 DNA Marker；1，5％；2，1％；3，0.5％；4，0.1％；5，0.05％；6，0.01％；7，0.005％；8，阴性对照。

为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明，在此需加以说明的是：

1本发明所述的引物序列见表1。

2水稻模板DNA的提取：常规CTAB法提取(见附件)。

实施例1

(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；特异性引物混合液；4M甜菜碱溶液；0.2M MgSO4溶液；

(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer2.5μL，4M甜菜碱6.25μL，0.2M MgSO40.25μL，混合引物1μL，10μM dNTPs3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1μL，模板DNA1μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后离心；

(3)扩增反应程序：在63℃进行60min，并且在80℃保温2min，4℃，保存；

(4)扩增反应结束，取体系液10μL，直接向扩增管中加入嵌入剂1μL1000×SYBR Green，振荡混匀，肉眼观察结果。无扩增反应的管子呈橙黄色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图3，由图可见，待测样品为阳性样品，含有转基因抗虫水稻成份。

实施例2

(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer 2.5μL，4M甜菜碱6.25μL，0.2M MgSO4，混合引物0.25μL，10μM dNTPs3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2μL，模板DNA2μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后离心；

(3)扩增反应程序：在65℃进行45min，并且在80℃保温2min，4℃，保存；

(4)扩增反应结束，取体系液15μL，直接向扩增管中加入嵌入剂2μL1000×SYBR Green，震荡混匀，肉眼观察结果。无扩增反应的管子呈橙黄色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图4，由图可以看出，待测样品1为阴性样品，不含有转基因抗虫水稻成分，样品2含有转基因抗虫水稻成分。

实施例3

(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer2.5μL，4M甜菜碱6.25μL，0.2M MgSO4，混合引物0.25μL，10μM dNTPs3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2μL，模板DNA5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后离心；

(4)扩增反应结束，取体系液25μL经2％琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察结果。无扩增反应的管子无明显条带，有扩增反应的管子出现阶梯状条带。结果见图5，样品不含有转基因抗虫水稻成分。

实施例4

对比实验：转基因抗虫水稻的定性PCR测定方法与本发明的测定方法的对比：

(1)本发明方法试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；特异性引物混合液；4M甜菜碱溶液；0.2MMgSO4溶液；DNA模板包括含有转基因抗虫水稻成份5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％的样品。

(2)本发明扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer2.5μL，4M甜菜碱6.25μL，0.2M MgSO4 0.25μL，混合引物1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2μL，模板DNA5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后离心；

(3)本发明扩增反应程序：在63℃进行60min，并且在80℃保温2min，4℃，保存；

(4)本发明扩增反应结束，取体系液3μL，经2％琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察结果。无扩增反应的管子无明显条带，有扩增反应的管子出现阶梯状条带。结果见图6：M，DL2000 DNA，Marker；1，5％；2，1％；3，0.5％；4，0.1％；5，0.05％；6，0.01％；7，0.005％；8，阴性对照。

PCR方法：反应引物采用本发明反应中一对外引物F3和B3。PCR反应为25μL体系，10×PCR buffer(Promega)2.5μL，10mM dNTPs(Promega)0.5μL，上游和下游引物(10mM)各0.5μL，Taq酶(5U/μL，Promega)0.5μL，DNA模板1μL，灭菌去离子水19.5μL。反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸7min。PCR产物取10μL于2％琼脂糖凝胶电泳，100V电压下40min，通过凝胶成像分析仪观察，结果见图7：M，DL2000 DNA，Marker；1，5％；2，1％；3，0.5％；4，0.1％；5，0.05％；6，0.01％；7.0.005％；8，阴性对照。

由两种方法比较可以看出，本发明的方法灵敏度明显高于PCR方法的敏感度，能检测出转基因抗虫水稻含量更低的样品。

附件：常规CTAB法提取水稻DNA

(1)取转基因抗虫水稻，约100mg，放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎。液氮反复加入3～4次，磨碎成粉末为止；

(2)加入1.5mL预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样(依试样不同，可适当增加缓冲液的用量)，65℃保育30min，期间不停颠倒混匀；

(3)约12000g离心10min。转移上清至一新离心管，加入1倍体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；

(4)加入1倍体积的氯仿：异戊醇(24：1)，充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；

(5)加入2倍体积CTAB沉淀缓冲液，室温静置保育60min；12000g离心15min，弃上清；加入350μL氯化钠溶液溶解沉淀；12000g离心10min，转移上清至一新离心管。

(6)加入0.6倍体积异丙醇，倒置离心管轻柔混合，室温放置20min。12000g离心15min。弃上清。加入500μL70％乙醇溶液，并颠倒离心管数次。12000g离心10min。弃上清。

(7)干燥DNA沉淀，加100μL水或TE缓冲液溶解DNA。

序列表

<110>天津市农业科学院中心实验室

<120>一种快速检测转基因抗虫水稻的方法

<160>4

<210>1

<211>18bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

<210>3

<211>44bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

<210>4

<211>47bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

Claims

1.用于检测苏云金杆菌杀虫结晶蛋白转基因抗虫水稻的特异性引物，其特征在于，包括外引物正向序列：AGGATTCACTGGTGGAGA，外引物反向序列：GATTATCCAAGGAGGTAGCT；内引物正向序列：TGGGAAGTGAATTGGAACTTCAATACCTCGTTAGACTCAACAGC，内引物反向序列TCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGAAGATGGATGAATTACCCCAA。

2.一种采用权利要求1所述特异性引物快速检测苏云金杆菌杀虫结晶蛋白转基因抗虫水稻方法，其特征在于包括如下步骤：

其中的扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer 2.5μL，4M甜菜碱6.25μL，0.2M MgSO4 0.25μL，引物混合液1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-5μL，模板DNA 1-5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL；

(2)扩增反应结束，取体系液3-25μL，采用不同方法判断扩增与否，包括：直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green，通过颜色变化观察有无扩增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁白色沉淀物的量来观察有无扩增反应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。

3.如权利要求2所述的检测方法，其中所述的引物混合溶液指的是将合成的引物粉末分别配成浓度为100μM的母液，然后取外引物各1μL，内引物各8μL，加灭菌去离子水2μL，充分混合，制得引物混合溶液。

4.如权利要求2所述的检测方法，其中嵌入剂SYBR Green加入量为1-2μL。

5.如权利要求2所述的检测方法，其中所述的链置换活性的DNA聚合酶为8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2μL。