CN101358236B - 一种快速检测转基因玉米品系Mon810的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转基因玉米Mon810的快速检测方法及所用引物。其原理是采用5条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在64℃左右对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到10⁹-10¹⁰个拷贝。其鉴定采用肉眼直接观察反应管内沉淀的混浊度或者通过加入SYBR Green颜色变化判断扩增与否。本发明的检测方法具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点，为转基因作物的检测开辟了广阔的前景。

Description

一种快速检测转基因玉米品系Mon810的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因产品的检测方法，更具体说是一种快速检测转基因玉米品系Mon810的方法，通过肉眼观察反应管浊度或观察加入1000×SYBR Green后颜色变化或观察琼脂糖凝胶电泳来判断扩增情况。

背景技术

21世纪是生物科技的世纪，转基因生物正飞速发展。目前，世界各国已进行田间试验的转基因作物超过5000种，批准商品化的转基因作物有160多种，包括玉米、大豆、油菜、番茄、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、香石竹、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜、菊苣等。我国转基因生物研究始于20世纪80年代初期，主要是转基因抗虫棉。近年来，政府不断加大对生物技术研究的支持力度，积极促进农业生物技术的研究与产业化开发。

目前全世界转基因作物种植面积中转基因玉米占31％，其中转基因玉米Mon810的面积最广。Mon810型转基因玉米由美国孟山都公司研发，在自然生长过程中会产生一种名为Bt的毒素，后者能够杀死长期困扰农场的害虫玉米螟，从而使农户省下喷洒农药的成本开支。这种玉米的安全性一直是科学家以及法国乃至欧洲民众争论的焦点。法国政府宣布要在2008年暂停种植MON 810型转基因玉米。原因是“严重怀疑”MON 810型转基因玉米的安全性，并声称“存在一些新的科学事实”，证明转基因玉米对“动植物存在不利影响”。

转基因作物安全性主要集中在转基因作物释放的环境安全性和由转基因作物生产出的食品的安全性上。包括对人和动物健康的风险、对生态环境与农业的风险、对非目标生物的风险。针对第一种风险，联合国经济发展与合作组织提出了食品安全性评估的“实质等同性”原则。如果转基因作物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。

欧盟最早提出对转基因食品进行标识管理。1999年，要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1％的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到0.9％。日本、澳大利亚、新西兰对转基因成分的最低含量做了不同规定，域值从1-5％不等。

我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。

转基因成分检测方法有Western blots、ELISA、试纸条、竞争性PCR、实时定量PCR和PCR-ELISA等。转基因作物的检测主要是检测样品是否含有外源蛋白质(基因表达产物)和是否含有外源基因(DNA)。转基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫学原理的酶联免疫吸附法(ELISA)、试纸条检测、Western杂交等方法检测，主要从待测样品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基质，利用抗体与目的蛋白(抗原)特异结合的特性，通过偶联抗体与抗原抗体复合物的作用产生可检测的信号。转基因作物的核酸检测方法主要有两种：核酸分子杂交技术(Sourthern blot)，PCR检测技术。

目前，PCR检测方法是最主要、最准确地检测转基因作物的方法，包括定性PCR方法、复合PCR方法、巢式PCR方法、竞争性定量PCR方法、荧光定量PCR方法等。国内外推广使用的是定性PCR和实时定量PCR检测方法：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。通过聚合酶的作用，在体外快速特异地扩增目的片段，使微量、特定的目的DNA片段在几小时内迅速扩增到百万倍。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后很容易观察，因而具有快速、灵敏等优点。

目前国际和国内转基因检测标准主要是定性PCR和实时荧光定量PCR检测。定性PCR方法技术成熟，稳定，但反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；所需PCR仪价格在5万元左右，扩增时间2-3小时，扩增结果电泳时间需1小时左右；电泳常用染料EB是强致癌物，有较强毒性。实时荧光定量PCR技术先进，灵敏度更高，扩增时间在1小时左右，扩增结果实时在电脑上显示；能检测出样品中外源基因的数量信息(拷贝数)稳定性、体系和操作同定性PCR相当，但仪器和耗材价格较高；一台定量PCR在50万元左右，不宜大范围推广。

发明内容

本发明的目的在于公开一种快速检测转基因玉米品系Mon810的方法及根据外源基因序列设计一套引物对其进行扩增，通过肉眼观察浊度或观察加入SYBR Green后颜色的变化或观察琼脂糖凝胶电泳结果判断扩增情况。

本发明基于转基因玉米品系Mon810的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因特异性引物进行多聚酶链式反应(PCR)，从而提供检测转基因玉米品系Mon810的方法。

本发明的技术方案如下：

一种用于检测转基因玉米品系Mon810的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因特异性引物，其中外引物正向序列为：CTGCGTTGAACTCTAGGCC，反向序列为：CTGGAACGTTTCCCTGTTGT；内引物正向序列为TTCCCGAGCTCATGGCGAAAAATGCAAGACTAGCAAATGGGT，反向序列为AGCTTGAAGGGTTGAGCCAGAGGCTCAGCCAGTCTAGTAGGA，环引物为CACTAAGACCTGAAGTCAGACGA。引物分别配制浓度为100μM的母液，然后取外引物各8μL，内引物各1μL，环引物2μL，充分混合，为引物混合溶液。

本发明采用上述一套引物进行快速检测转基因玉米品系Mon810的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)采用权利要求1所述的5条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在63-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，4℃保存，使扩增达到10⁹-10¹⁰个拷贝；

其中的扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer 2.5μL，4M BSA 6.25μL，0.2M MgSO₄ 0.25μL，混合引物1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2μL，模板DNA 1-5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL；

(2)扩增反应结束，取体系液3-25μL，采用不同方法判断扩增与否，包括：直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green，通过颜色变化观察有无扩增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来观察有无扩增反应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。

本发明所述的嵌入剂SYBR Green加入量为1-2μL。

本发明所述的检测方法，模板DNA指的待测样品采用CTAB法提取纯化得到的DNA。

为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。

1、原理

本方法应用一种新型的核酸扩增方法，其原理是采用5条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63℃-65℃对核酸进行扩增，短时间扩增效率可达到10⁹-10¹⁰个拷贝。具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点。

2、引物设计

本研究依据转基因玉米品系Mon810外源基因与内源基因结合处序列设计了5条引物。引物由大连宝生物公司合成。

包括正向内引物FIP、正向外引物F3、反向内引物BIP、反向外引物B3、正向环引物LF、反向环引物LB。内引物长度通常超过40个碱基，外引物短些，为25个碱基左右。

表1引物序列表如下：

3、反应条件

反应试剂需要链置换型DNA聚合酶、dNTPs、Mon810品系特异性引物、BSA、MgSO₄和反应缓冲液。反应在恒温条件下进行，反应时间依据引物的效率和模板DNA质量变化，一般为1h或更少。加入模板DNA，在63-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min而终止。这项技术的优点就是不需要热循环。由于扩增是在恒温条件下进行的，因此仅需要恒温水浴锅或金属加热块维持反应温度，不需要PCR仪等昂贵的仪器。

材料与方法：

(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；Mon810品系特异性引物；BSA溶液；MgSO₄溶液；dNTPs；

(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：10×Buffer 2.5μL，4M BSA 6.25μL，0.2M MgSO₄ 0.25μL，引物混合液1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2μL，模板DNA 1-5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL。

(3)扩增反应过程：在63-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，4℃保存；

(4)扩增反应结束，取体系液5-25μL用不同的检测方法判断扩增与否。

4、扩增结果观察

有三种观察方法，适合不同情况下进行：

1)使用2％琼脂糖凝胶，加入EB染色剂，100V电泳50min，在紫外灯下观察。反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱中显示为从点样孔处开始的弥散和条带现象。由于EB是致癌剂，因此该方法应用不是很广范。结果见图1。

2)由于反应形成大量双链DNA产物，可以直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green，紫外灯下或肉眼观察，无扩增反应的管子呈橙色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图2。

3)检测还可以通过评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来进行。在反应中，在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀。它有极高的特异性，可以用肉眼观察或浊度仪检测反应管中的沉淀浊度就能够判断扩增与否。

本发明的用于转基因玉米品系Mon810检测的扩增方法，具有以下优点：

1)操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需一恒定温度就能反应，不需要预先进行双链DNA的变性。

2)高特异性：该技术由5条引物扩增靶序列的6个区段，因此具有高度特异性。

3)快速高效：整个扩增不到1h即可完成，产量可达到10⁹-10¹⁰个拷贝；

4)灵敏度高：扩增模板可仅为10拷贝甚至更少。

5)鉴定简便：可以用肉眼直接观察反应管内沉淀的混浊度或者通过SYBR Green颜色变化判断扩增与否。

附图说明

图1为扩增产物的电泳分析图谱。自左向右依次为阴性对照、阴性样品、Marker、阳性对照和阳性样品。

图2为扩增产物加入SYBR Green结果图。左为Mon810阳性对照，右为阴性对照。

图3为扩增产物加入SYBR Green结果图。从左边依次为阳性对照、待测样品、阴性对照。

图4为扩增产物加入SYBR Green结果图。由左至右为阴性对照、待测样品1、阳性对照和待测样品2。

图5为扩增产物的电泳分析图谱。由左至右：Marker、阳性对照1、阳性对照2、待测样品1、待测样品2、阴性对照。

图6为实施例4对比实验琼脂糖凝胶电泳结果。其中M，DL2000 DNA，Marker；1，5％；2，1％；3，0.5％；4，0.1％；5，0.05％；6，0.01％；7，0.005％；8，阴性对照

为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明，在此需加以说明的是：

(1)本发明所述的引物序列见表1。

(2)转基因玉米Mon810模板DNA的提取：常规CTAB法提取(见附件)

实施例1

(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；Mon810特异性引物混合液；4M BSA溶液；0.2M MgSO₄溶液；

(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer 2.5μL，4M BSA 6.25μL，0.2M MgSO₄ 0.25μL，混合引物1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1μL，模板DNA1μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后离心；

(3)扩增反应程序：在63℃进行60min，并且在80℃保温2min，4℃，保存；

(4)扩增反应结束，取体系液5μL，直接向扩增管中加入嵌入剂1μL 1000×SYBR Green，震荡混匀，肉眼观察结果。无扩增反应的管子呈橙黄色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图3，由图可见，待测样品位阳性样品，还有Mon810成份。

实施例2

(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍BuffeT溶液；Mon810特异性引物混合液；4M BSA溶液；0.2M MgSO₄溶液；

(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer 2.5μL，4M BSA 6.25μL，0.2M MgSO₄，混合引物0.25μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2μL，模板DNA 2μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后离心；

(3)扩增反应程序：在65℃进行45min，并且在80℃保温2min，4℃，保存；

(4)扩增反应结束，取体系液15μL，直接向扩增管中加入嵌入剂2μL 1000×SYBR Green，震荡混匀，肉眼观察结果。无扩增反应的管子呈橙黄色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图4，由图可以看出，待测样品1为阴性样品，不含有Mon810成分，样品2还有Mon810成分。

实施例3

(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；Mon810特异性引物混合液；4M BSA溶液；0.2M MgSO₄溶液；

(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer 2.5μL，4M BSA 6.25μL，0.2M MgSO₄，混合引物0.25μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2μL，模板DNA 5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后离心；

(3)扩增反应程序：在63℃进行60min，并且在80℃保温2min，4℃，保存；

(4)扩增反应结束，取体系液25μL经2％琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察结果。无扩增反应的管子无明显条带，有扩增反应的管子出现阶梯状条带。结果见图5，样品1和2豆含有Mon810成分。

实施例4

对比实验：转基因玉米Mon810的定性PCR测定方法与本发明的测定方法的对比：

(1)本发明试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；BT176特异性引物混合液；4M BSA溶液；0.2M MgSO4溶液；DNA模板包括含有转基因玉米BT176成份5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％的样品。

(2)本发明扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer 2.5μL，4M BSA 6.25μL，0.2M MgSO4 0.25μL，混合引物1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2μL，模板DNA 5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后离心；

(3)本发明扩增反应程序：在63℃进行60min，并且在80℃保温2min，4℃，保存；

(4)本发明扩增反应结束，取体系液3μL，经2％琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察结果。无扩增反应的管子无明显条带，有扩增反应的管子出现阶梯状条带。结果见图6(A)：M，DL2000 DNA，Marker；1，5％；2，1％；3，0.5％；4，0.1％；5，0.05％；6，0.01％；7，0.005％；8，阴性对照。

(5)PCR反应引物采用本发明反应中一对外引物F3和B3。PCR反应为25μL体系，10×PCR buffer(Promega)2.5μL，10mM dNTPs(Promega)0.5μL，上游和下游引物(10mM)各0.5μL，Taq酶(5U/μL，Promega)0.5μL，DNA模板1μL，灭菌去离子水19.5μL。反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸7min。PCR产物取10μL于2％琼脂糖凝胶电泳，100V电压下40min，通过凝胶成像分析仪观察结果图6(B)：M，DL2000 DNA，Marker；1，5％；2，1％；3，0.5％；4，0.1％；5，0.05％；6，0.01％；7.0.005％；8，阴性对照。

由两种方法比较可以看出，本发明的方法灵敏度明显高于PCR方法的敏感度，能检测出Mon810含量更低的样品。

附件：常规CTAB法提取转基因玉米Mon810 DNA的方法

(1)取转基因玉米Mon810，约100mg，放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎。液氮反复加入3～4次，磨碎成粉末为止。

(2)加入1.5mL预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样(依试样不同，可适当增加缓冲液的用量)，65℃保育30min，期间不停颠倒混匀；

(3)约12000g离心10min。转移上清至一新离心管，加入1倍体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；

(4)加入1倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；

(5)加入2倍体积CTAB沉淀缓冲液，室温静置保育60min；12000g离心15min，弃上清；加入350μL氯化钠溶液溶解沉淀；12000g离心10min，转移上清至一新离心管。

(6)加入0.6倍体积异丙醇，倒置离心管轻柔混合，室温放置20min。12000g离心15min。弃上清。加入500μL70％乙醇溶液，并颠倒离心管数次。12000g离心10min。弃上清。

(7)干燥DNA沉淀，加100μL水或TE缓冲液溶解DNA

序列表

<110>天津市农业科学院中心实验室

<120>一种快速检测转基因玉米品系Mon810的方法及所用引物

<160>5

<210>1

<211>19bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ctgcgttgaa ctctaggcc    19

<210>2

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ctggaacgtt tccctgttgt                             20

<210>3

<211>42bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ttcccgagct catggcgaaa aatgcaagac tagcaaatgg gt    42

<210>4

<211>42bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

agcttgaagg gttgagccag aggctcagcc agtctagtag ga    42

<210>5

<211>23bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cactaagacc tgaagtcaga cga                         23

Claims (3)

1.用于检测转基因玉米品系Mon810的特异性引物，其特征在于，它是由外引物正向序列：CTGCGTTGAACTCTAGGCC，反向序列：CTGGAACGTTTCCCTGTTGT  ；内引物正向序列：TTCCCGAGCTCATGGCGAAAAATGCAAGACTAGCAAATGGGT  ，反向序列AGCTTGAAGGGTTGAGCCAGAGGCTCAGCCAGTCTAGTAGGA  ，环引物CACTAAGACCTGAAGTCAGACGA组成。

2.一种采用权利要求1所述特异性引物快速检测转基因玉米Mon810的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)采用权利要求1所述的5条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在63-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，4℃保存，使扩增达到10⁹-10¹⁰个拷贝；

其中的扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer 2.5μL，4M BSA 6.25μL，0.2M MgSO₄ 0.25μL，混合引物1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2μL，模板DNA 1-5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL；

(2)扩增反应结束，取体系液3-25μL，采用不同方法判断扩增与否，包括：直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green，通过颜色变化观察有无扩增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来观察有无扩增反应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。

3.如权利要求2所述的检测方法，其中嵌入剂SYBR Green加入量为1-2μL。

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